Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enmolekylär avbildning av EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62974
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi användningen av den enmolekylära avbildningsmetoden, DNA-gardiner, för att studera den biofysiska mekanismen för EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA.

Abstract

Fusionsgenerna som härrör från kromosomal translokation har hittats i många solida tumörer eller leukemi. EWS-FLI1, som tillhör FUS / EWS / TAF15 (FET) -familjen av fusionsonkoproteiner, är en av de mest involverade fusionsgenerna i Ewing sarkom. Dessa FET-familjefusionsproteiner har vanligtvis en lågkomplexitetsdomän (LCD) av FET-protein vid deras N-terminal och en DNA-bindande domän (DBD) vid deras C-terminal. EWS-FLI1 har bekräftats bilda biomolekylära kondensat vid dess målbindande loci på grund av LCD-LCD och LCD-DBD-interaktioner, och dessa kondensat kan rekrytera RNA-polymeras II för att förbättra gentranskriptionen. Hur dessa kondensat monteras på sina bindningsställen är dock fortfarande oklart. Nyligen tillämpades en enmolekylär biofysikmetod-DNA-gardiner-för att visualisera dessa monteringsprocesser av EWS-FLI1-kondensat. Här diskuteras det detaljerade experimentella protokollet och dataanalysmetoderna för tillämpning av DNA-gardiner för att studera de biomolekylära kondensaten som monteras på mål-DNA.

Introduction

Transkriptionell reglering är ett avgörande steg för exakt genuttryck i levande celler. Många faktorer, såsom kromosommodifiering, transkriptionsfaktorer (TF) och icke-kodande RNA, deltar i denna komplicerade process 1,2,3. Bland dessa faktorer bidrar TF till specificiteten av transkriptionell reglering genom att känna igen och binda till specifika DNA-sekvenser som kallas promotorer eller förstärkare och därefter rekrytera andra funktionella proteiner för att aktivera eller undertrycka transkription 4,5,6,7. Hur dessa TFs lyckas söka efter sina målplatser i det mänskliga genomet och interagera med DNA belagt med histoner och icke-histon DNA-bindande proteiner har förvirrat forskare i årtionden. Under de senaste åren har flera klassiska modeller för målsökningsmekanismen för TFs byggts för att beskriva hur de "glider", "hoppar", "hoppar" eller "intersegmentöverföring" längs DNA-kedjan 8,9,10,11. Dessa modeller är inriktade på sökbeteendet på DNA från en enda TF-molekyl. Nya studier visar dock att vissa TF genomgår vätske-vätskefasseparation (LLPS) antingen ensam i kärnan eller med Mediator-komplexet12. De observerade dropparna av TF är associerade med promotorn eller förstärkarregionerna, vilket belyser rollen för biomolekylär kondensatbildning vid transkription och det tredimensionella genomet13,14,15. Dessa biomolekylära kondensat är kopplade till membranbristfack in vivo och in vitro. De bildas via LLPS, där modulära biomakromolekyler och inneboende oordnade regioner (IDR) av proteiner är två huvudsakliga drivkrafter för multivalenta interaktioner16. Således söker TF inte bara DNA utan fungerar också synergistiskt inom dessa kondensat 4,17,18. Hittills är den biofysiska egenskapen hos dessa transkriptionskondensat på DNA fortfarande oklar.

Därför syftade denna studie till att tillämpa en enmolekylär metod-DNA-gardiner-för att direkt avbilda bildandet och dynamiken hos transkriptionskondensaten som bildas av TF på DNA in vitro. DNA Curtains, en in vitro-bildplattform med hög genomströmning för att studera interaktionen mellan proteiner och DNA, har applicerats i DNA-reparation19,20,21, målsökning 22 och LLPS17,23,24. Flödescellen i DNA-gardiner är belagd med biotinylerade lipid-dubbelskikt för att passivera ytan och låta biomolekylerna diffundera på ytan. De nanofabricerade sicksackmönstren begränsar DNA-rörelsen. Biotinylerade Lambda DNA-substrat kan rikta sig längs barriärkanterna och sträckas ut av det orienterade buffertflödet. Samma start- och slutsekvenser av alla molekyler möjliggör spårning av proteinet på DNA och beskriver positionsfördelningen av bindningshändelserna25,26. Dessutom hjälper kombinationen av DNA-gardiner med total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) att minimera bakgrundsbruset och detektera signaler på en enda molekylnivå. Således kan DNA-gardiner vara en lovande metod för att undersöka dynamiken i transkriptionskondensatbildning på DNA-motiv. Detta dokument beskriver exemplet på en FUS / EWS / TAF15 (FET) familj fusion onkoprotein, EWS-FLI1, genererad av kromosomal translokation. Lambda-DNA innehållande 25× GGAA-bindningssekvensen för EWS-FLI127- användes som DNA-substrat i DNA-gardinerna för att observera hur EWS-FLI1-molekyler genomgår LLPS på DNA. Detta manuskript diskuterar det experimentella protokollet och dataanalysmetoderna i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av lipid-dubbelskiktshuvudblandningen

  1. Skölj glasflaskorna med dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och 99% etanol och torka dem i en 60 °C torkugn.
  2. Gör lipidmasterblandningen genom att lösa upp 1 g 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC), 100 mg polyetylenglykolreagerade (PEGylerade) lipider (18:1 av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[metoxi (polyetylenglykol)-2000] (ammoniumsalt) (PEG2000 DOPE) och 25 mg biotinylerade lipider (18:1 av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(cap biotinyl) (natriumsalt) (Biotinyl Cap DOPE)) till 10 ml kloroform.
  3. Förbered 1 ml alikvoter av lipidhuvudblandningen per injektionsflaska och förvara dem vid -20 °C i rena glasflaskor.
    OBS: Förvara den upplösta lipiden i glasflaskor och täck injektionsflaskans lock med parafilm under förvaring.

2. Beredning av liposomlösning

  1. Skölj en 2 ml injektionsflaska av glas med ddH2Ooch 99% etanol och torka den noggrant i en 60 °C torkugn.
  2. Skölj en 250 μl glasspruta med kloroform och överför sedan 200 μl av lipidhuvudblandningen till injektionsflaskan med torrt glas.
  3. Använd en kvävesprutpistol för att flöda N2 försiktigt medan injektionsflaskan kontinuerligt roteras i en riktning.
    OBS:N2 hjälper till att förånga kloroformen, och de återstående lipiderna kommer att bilda en tunn film på glasflaskans vägg. Justera kväveströmmen så att den är mycket mild först och öka flödet när en vit film visas i injektionsflaskan; Slutför denna avdunstningsprocess inom 5 minuter.
  4. Överför injektionsflaskan av glas till en vakuumtorkugn vid rumstemperatur (RT) i 16-24 timmar för fullständigt avlägsnande av kloroformen från lipiderna.
  5. Tillsätt 2 ml färsk lipidbuffert (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) och 100 mM NaCl) till injektionsflaskan av glas och lös upp lipiderna vid RT i 2 timmar. Vortex lösningen flera gånger och överför den till ett 5 ml polypropenodlingsrör.
  6. Sonicate lipidlösningen på is med en mikro-spets sonicator för att bilda små unilamellära vesiklar, med hjälp av följande inställningar: 6 s på-12 s off (20% amplitud) för 6 cykler, sedan 6 s på-6 s off (30% amplitud) för 3 cykler, slutligen 10 s på (40% amplitud).
    OBS: Temperaturökningen under ultraljudsbehandling kan resultera i sprängning av skum och förstöra liposomerna. Kontrollera därför skummets tillstånd och temperaturen och fyll på isen ofta.
  7. Filtrera liposomerna genom ett 0,22 μm nylonsprutfilter, alikvot, och förvara det vid 4 °C.
    OBS: Eftersom deras rörlighet minskar med långvarig lagring måste liposomerna användas inom 2-3 månader eller beredas nyligen före användning.

3. Sekvenskloning och biotinylering av Lambda-DNA

  1. Införande av bindningsmotiven i Lambda DNA
    1. Smält målfragmentet som innehåller bindningsmotiven och Lambda-DNA med NheI och XhoI. Ligate målfragmentet med Lambda DNA med T4-ligas över natten på RT.
    2. Odla E.coli VCS257-celler i antibiotikafritt LB-medium tills OD600 når 0,6. Förvara bakterierna vid 4 °C för senare användning.
    3. Värm ligeringslösningen vid 65 °C i 20 minuter för att denaturera T4-ligasen.
    4. Tina lambdafagextraktet, blanda det försiktigt med den ligerade produkten genom pipettering med trubbiga spetsar och inkubera blandningen vid RT i 2 timmar.
    5. Tillsätt 500 μl SM-buffert (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl och 8 mM MgCl2, filtrerat genom ett 0,22 μm-filter) och 20 μl kloroform i förpackningsblandningen från steg 3.1.4, blanda väl och centrifugera lösningen.
      OBS: Förpackningsextraktets aktivitet kan bibehållas vid 4 °C under längre perioder.
    6. Bered reaktionsblandningen genom att blanda 10 μl förpackningsextrakt med 90 μl SM-buffert och 100 μl VCS257-celler (från steg 3.1.2) tillsammans och inkubera blandningen vid 37 °C i 15 minuter.
      OBS: Förpackningslösningens koncentration beror på fagplackens densitet följande dag; Det kan spädas eller tillsättas efter behov.
    7. Ta ~ 5 ml smält toppagar (22 g / L NZCYM buljong med 15 g / L agar) i ett 15 ml rör. Så snart den övre agarn svalnar till ~ 42 ° C, tillsätt reaktionsblandningen (från steg 3.1.6) långsamt med en trubbig pipett och häll vätskan på en antibiotikafri LB-agarplatta. Förvara plattan i en 37 °C inkubator över natten.
    8. Bekräfta de positiva placken bland de transparenta fagplacken på den övre agarplattan med PCR. Överför de positiva placken till en ny övre agarplatta med pipett och förvara plattan i en 37 °C inkubator över natten.
    9. Tillsätt 400 μl VCS257-celler i 400 μl buffert innehållande 10 mM MgCl2 och 10 mM CaCl2, inokulera en plack i denna cellblandningoch inkubera den i en 37 °C shaker vid 250 rpm i 15 min.
    10. Tillsätt 800 μl av denna suspension innehållande fagplack till 200 ml NZCYM-buljong i en 2 L-kolv och inkubera den i en 37 °C-skakare vid 125 rpm.
    11. Mät OD600 av bakteriesuspensionen efter ~4 h odling. Tänk på att OD600-värdet kommer att stiga först och sedan sjunka till ett tråg vid ~ 0,2. Stoppa inkubationen när OD 600-värdet är på väg att stiga igen, tillsätt500 μl kloroform och skaka vid 80 rpm i ytterligare 5 minuter.
      OBS: Ökningen av OD600 efter tråget kommer att ske snabbt; därför måste OD600-värdet mätas oftare när det minskar till 0,3 för att undvika överdriven VCS257-celltillväxt i kulturen.
    12. Överför fagkulturen till en 500 ml flaska, tillsätt 11,7 g NaCl och skaka flaskan. Inkubera flaskan på is i 10 min.
    13. Överför suspensionen lika till fyra 50 ml rör. Centrifugera rören vid 12 000 x g i 10 min.
      OBS: Alla dessa centrifugeringssteg i avsnitt 3.1 måste göras vid 4 °C.
    14. Överför supernatanterna till fyra nya 50 ml rör och centrifugera igen med samma hastighet i 5 minuter.
    15. Samla supernatanterna, tillsätt 10% (w/v) PEG8000-pulver och rotera vid 4 °C för att inkubera i 30 minuter.
    16. Centrifugera suspensionerna från steg 3.1.15 vid 12 000 x g i 15 minuter för att erhålla fagpellets.
    17. Återsuspendera pelletsen i 1 ml fagutspädningsbuffert (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl och 10 mM MgCl2) i fyra rör och häll alla 4 ml av dessa blandningar i ett 50 ml rör.
    18. Tillsätt RNas A (10 mg/ml) och DNas I (4 mg/ml) till 20 μg/ml och 5 μg/ml slutkoncentrationer och inkubera vid 37 °C i 30 minuter för att bryta ned överskott av nukleinsyror.
    19. Tillsätt 4,5 ml 300 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,76 ml 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 1,67 ml 10% natriumdodecylsulfat (SDS) och 75 μl proteinas K (10 mg/ml) i röret och inkubera vid 65 °C i 10 minuter.
    20. Tillsätt 4,5 ml förkylt 3 M kaliumacetat och inkubera på is i 10 min.
    21. Centrifugera vid 8 000 x g i 10 minuter och snurra supernatanten i ytterligare 5 min vid 10 000 x g.
    22. Tillsätt 70 volymprocent isopropanol i den uppsamlade supernatanten (från steg 3.1.21) med tillräcklig blandning, inkubera vid RT i 2 minuter och centrifugera sedan vid 8 000 x g i 10 minuter. Kasta isopropanolen och snurra igen i 5 minuter.
      OBS: DNA-pelleten kommer att smutsas före den första 10 min centrifugeringen; pelleten kommer att koncentreras i botten av röret efter den andra 5 min centrifugeringen.
    23. Tvätta det utfällda DNA:t med 2-3 ml 70% etanol och snurra ner igen i 1 min. Torka pelleten vid 4 °C i 2 timmar och återsuspendera sedan DNA i 500 μl TE-buffert (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) och 1 mM EDTA) över natten vid RT.
    24. Överför DNA till ett 1,5 ml rör och snurra det vid 18 000 x g i 3 minuter. Överför DNA till ett nytt 1,5 ml rör. Alikvotera det renade Lambda-DNA:t och förvara det vid -20 °C.
  2. Biotin-Lambda DNA-preparat
    1. Smält 50 μl renat Lambda-DNA med klonade motiv vid 65 °C i 10 minuter.
      OBS: Eftersom Lambda DNA är ~ 48 kbp långt måste det värmas upp innan pipettering för att undvika DNA-brott.
    2. Blanda 50 μl lambda-DNA, 1 μl biotinprimer (5' - (fos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) och 54 μL ddH2O tillsammans. Saminkubera blandningen vid 65 °C i 5 minuter och låt den stå på bänken för att svalna till RT.
    3. Tillsätt 12 μL 10x T4-ligasbuffert och 3 μL T4-ligas och inkubera vid RT i flera timmar eller över natten.
    4. Tillsätt en lika stor mängd fenol-kloroformblandning (1:1) till ligeringsprodukten, blanda omedelbart väl och centrifugera vid 12 000 x g i 2 minuter vid RT.
    5. Överför den övre vattenfasen som innehåller DNA försiktigt till ett nytt rör, tillsätt en lika stor volym kloroform, blanda väl och centrifugera sedan vid 12 000 x g i 2 minuter.
    6. Överför den övre vattenfasen till ett nytt rör, tillsätt en lika stor volym isopropanol och 10% av volymen 3 M natriumacetat och inkubera vid RT i 2 min. Centrifugera blandningen vid 12 000 x g i 5 minuter.
    7. Ta bort supernatanten, tvätta pelleten med 75% etanol och centrifugera sedan vid 12 000 x g i 5 min.
    8. Ta bort 75% etanol, lufttorka DNA vid RT i 10 minuter och använd 120 μL TE-buffert för att lösa upp DNA.
    9. Tillsätt 60 μl buffert A (30 % (vikt/volym) PEG8000 och 30 mM MgCl2) till 120 μl av lösningen från steg 3.2.8 och rotera vid 4 °C i 20–24 timmar.
    10. Centrifugera blandningen vid 18 000 g i 5 minuter och avlägsna supernatanten.
    11. Använd 180 μl förkyld 75 % etanol för att tvätta pelleten och upprepa steg 3.2.10.
    12. Torka pelleten vid RT och använd 100 μl TE150-buffert för att lösa upp DNA:t.

4. Nanofabricerade sicksackbarriärer

  1. Rengör bilder i aceton för 20 min genom ultraljudsbehandling och överföra dem till en ny glasbehållare med 1 M NaOH för ultraljudsbehandling för ytterligare 20 min. Blanda 90 ml H2S04 med 30 mlH2O2och sänk ned objektglasen i denna blandning i 30 minuter. Skölj bilderna med aceton och isopropanol och torka glasrutschkanorna medN2.
    OBS: Blandning av H2S04 och H2O2är en exoterm process; vidta lämpliga säkerhetsåtgärder under driften.
  2. Täck den rengjorda bilden med polymetylmetakrylat (PMMA) 25 kDa, PMMA 49,5 kDa och det översta lagret av ledande skyddande beläggning i följd. Använd elektronstrålelitografi för att skriva sicksackbarriärerna (figur 1A).
  3. Tvätta objektglasen med ddH2O för att ta bort den ledande skyddande beläggningen och torka objektglasen medN2.
  4. Sätt in ett 30 nm lager krom (Cr) med en magnetronsputtringsmaskin och ta bort de återstående PMMA-skikten med aceton.
    OBS: En flowcell kan återanvändas för mer än 20 DNA-gardinexperiment. För att återanvända flödescellen, tvätta den med etanol, tvättmedel och NaOH.

5. Rening av EWS-FLI1-protein

OBS: Observationen av 500 nM EWS-FLI1 på Lambda DNA med 25× GGAA-motiv fungerar som ett bra exempel för applicering av DNA-gardiner för kondensatbildning. EWS-FLI1 är ett fusionsprotein som kombinerar N-terminalen för EWSR1 (1-265) och C-terminalen för FLI1 (220-453). En mCherry-tagg smältes samman med N-terminalen för EWS-FLI1-fusionsproteinet för visualisering.

  1. Klona EWS-FLI1-genen till en rekonstituerad pRSF-vektor eller någon annan lämplig prokaryotuttrycksvektor.
  2. Omvandla plasmiden som kodar för 7x His-mCherry-EWSFLI1 till E.coli BL21(DE3)-stammen; odla en enda koloni i 5 ml LB-medium vid 37 °C över natten. När OD600-värdet når 0,6-0,8 efter överföring till 2 L LB-medium, tillsätt 0,5 mM IPTG och skaka cellkulturen vid 18 ° C i 16-18 timmar.
  3. Centrifugera kulturen för att avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med lysbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M urea; 10 mM imidazol; 1,5 mM beta-merkaptoetanol (β-ME); och 5% glycerol).
  4. Efter ultraljudsbehandling och centrifugering vid 18000 × g för ~ 30 min, ladda supernatanten på Ni-NTA-hartset jämställt i en 5-faldig volym lysbuffert och tvätta sedan hartset med en 10-faldig volym tvättbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urea, 40 mM imidazol, 1,5 mM β-ME och 5% glycerol).
  5. Eluera det bundna proteinet med 15 ml elueringsbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urea, 500 mM imidazol, 1,5 mM β-ME och 5% glycerol) och koncentrera elueringen till ~ 500 μL.
  6. Ladda den koncentrerade proteinlösningen på en gelfiltreringskolonn och analysera produkterna med SDS-polyakrylamidgelelektrofores. Frys snabbt in det renade proteinet i flytande kväve och förvara vid -80 °C.

6. Beredning av en DNA-gardinflödescell

  1. Förbered en flowcell med sicksack nanofabricerade barriärer för ett DNA-gardinexperiment och bestäm flödesriktningen. För att göra detta, anslut ingångs- och utgångsrören i rätt riktning.
  2. Tvätta flödescellen med 2,5 ml lipidbuffert med två 3 ml sprutor. Se till att det inte finns någon bubbla i flowcellen.
  3. Ta bort sprutan från utdata och injicera 1 ml liposomlösning (40 μl liposomstam från sektion 2 och 960 μl lipidbuffert) tre gånger med 5 minuters inkubation efter varje injektion.
  4. För läkningssteget, tvätta flödescellen med 2,5 ml lipidbuffert långsamt och inkubera vid RT i 30 minuter.
    OBS: Läkningstiden kan vara längre om det behövs; Om några bubblor dyker upp, utför dubbelläkning genom att upprepa steg 5.3 och 5.4 för att ta bort bubblorna.
  5. Bered 30 ml bovint serumalbumin (BSA) buffert (40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol och 0,5 mg/ml BSA för ytpassivering). Efter 30 minuters läkning, tvätta flödescellen med 2,5 ml BSA-buffert från utgångssidan.
    OBS: BSA-stammen är en 20 mg/ml lösning som förvaras vid 4 °C och måste användas inom 1-2 veckor. BSA-koncentrationen i bufferten kan justeras efter ytförhållandet.
  6. Injicera 800 μl streptavidinbuffert (10 μl av en streptavidinstam på 1 mg/ml, 790 μl BSA-buffert) i flödescellen från ingångssidan i två steg med 10 minuters inkubation efter varje steg.
    OBS: Streptavidin förankrar DNA på lipiderna på grund av dess multivalens genom att överbrygga mellan de biotinylerade lipiderna och det biotinylerade DNA.
  7. Tvätta flödescellen med 2,5 ml BSA-buffert för att avlägsna alla fria streptavidinmolekyler.
  8. Späd Biotin-Lambda-DNA med klonade motiv från sektion 3 med BSA-buffert (2,5 μL DNA och 998 μL BSA-buffert). Injicera Lambda DNA 4 gånger långsamt med 5 minuters mellanrum.
  9. Slå på mikroskopet och det vetenskapliga komplementära metalloxidhalvledarsystemet (sCMOS) under injektionen. Tvätta slangen med 10 ml ddH2O. Skölj prisman och slangkontakten med vatten, 2% flytande kyvettrengörare och 99% etanol. Förbered bildbufferten genom att tillsätta KCl och dubbelsträngat DNA-färgämne i BSA-bufferten för att erhålla slutliga koncentrationer på 150 mM respektive 0,5 nM och ta upp minst 20 ml av bildbufferten i en 30 ml spruta.
  10. Ställ in flowcellen på mikroskopsteget och anslut den till det mikrofluidiska systemet.
  11. Använd en flödeshastighet på 0,03 ml/min för att spola DNA-molekylerna till barriären i 10 minuter, inkubera i 30 minuter med flödet stoppat och stäng sedan av det för att låta DNA:t diffundera i sidled.
    OBS: Syftet med denna 30 minuters inkubation är att låta DNA-molekylen fördelas jämnare framför barriären genom enkel diffusion eftersom DNA-molekyler tenderar att ackumuleras på den sida av barriären som är stängd för ingången där de spolas in. Inkubationstiden kan justeras vid behov.

7. Avbildning av EWS-FLI1-kondensbildning på DNA-gardiner

  1. Öppna bildprogramvaran, hitta och markera positionerna för 3 × 3 sicksackmönster under ljusfält.
  2. Slå på flödet vid 0,2 ml / min för att färga DNA med det dubbelsträngade DNA-färgämnet i 10 minuter.
  3. Späd mCherry-EWS-FLI1 med bildbufferten till koncentrationen 100 nM i 100 μl i röret.
  4. Ladda proteinprovet genom ventilen med en 100 μl glasspruta och ändra flödeshastigheten till 0,4 ml/min.
  5. Slå på 488 nm-lasern och förskanna varje region för att kontrollera DNA-distributionstillståndet; välj det område där DNA-molekylerna fördelar sig jämnt. Ställ in lasereffekten på 10% för 488 nm-lasern och 20% för 561 nm-lasern. Använd effektmätaren för att mäta den verkliga lasereffekten nära prisman: 4,5 mW för 488 nm-lasern och 16,0 mW för 561 nm-lasern.
  6. Bildförvärv
    1. Börja ta bilder med 2 s intervall med både 488 nm och 561 nm lasrar samtidigt.
    2. Byt ventil från manuellt läge till injektionsläge för att låta bildbufferten spola proteinprovet i flödescellen efter 60 s.
      OBS: Denna process kommer att ta ~ 30 s, och synfältet kommer att täckas med mCherry-signaler så snart EWS-FLI1-proteinerna når flödescellen.
    3. För att ta bort fri EWS-FLI1, fortsätt tvätta flödescellen med bildbufferten i 5 minuter med endast 561 nm lasern påslagen. Stoppa flödet och inkubera vid 37 °C i 10 minuter.
    4. Slå på flödet vid 0,4 ml/min för att låta DNA:t sträcka sig och hämta bilder med 2 s mellanrum mellan olika ramar för att få data med hög genomströmning av EWS-FLI1-kondensatbildning.

8. Intensitetsanalys för mCherry-EWS-FLI1

  1. Importera data som bildsekvenser till ImageJ-programvaran, välj ut puncta på 25× GGAA-webbplatser i en kvadrat på 8× 8 pixlar och spara bilden i .tif format.
  2. Beräkna intensiteten som summering av intensiteten i kvadraten på 8×8 pixlar, inklusive hela puncta, och ta bort bakgrunden genom att subtrahera bakgrundsintensiteten i ett område av samma storlek nära kvadraten på 8 x 8 pixlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Schemat för DNA-gardiner visas i figur 1A, figur 1B och figur 1D. Den klonade målsekvensen som innehåller 25 oavbrutna upprepningar av GGAA finns i NORB1-promotorn i Ewing sarkom. Denna målsekvens är avgörande för EWS-FLI1 rekrytering28. EWS-FLI1-molekyler visualiserades genom att detektera de mCherry-märkta EWS-FLI1-signalerna erhållna med en 561 nm laser (figur 1C och figur 1E). Efter att ett DNA-gardinexperiment hade inrättats kunde in vitro-bildningen av biomolekylära kondensat av EWS-FLI1 vid 25× GGAA-platserna i DNA-substratet visualiseras direkt (figur 1B-E). Specificiteten hos mCherry-EWS-FLI1 som används i DNA-gardiner bekräftades av en elektroforetisk mobilitetsskiftanalys med hjälp av en DNA-mall innehållande 25× GGAA och utan GGAA separat (figur 2A). Dessutom titrerades koncentrationen av EWS-FLI1 från 20 nM till 500 nM, och intensiteten hos puncta vid 25× GGAA-platserna bestämdes. Jämfört med intensiteten hos mCherry-FLI1DBD ökade intensiteten hos EWS-FLI1 dramatiskt, medan förändringen i intensiteten hos FLI1DBD var försumbar när proteinerna mättades för att täcka de 25× GGAA-platserna. Därför tyder dessa resultat starkt på att EWS-FLI1 bildade kondensat på DNA (figur 2B-E).

Figure 1
Figur 1: EWS-FLI1-kondensatbildning på Lambda-DNA innehållande 25× GGAA-motiv. (A) Schematisk av DNA-gardiner. (B och D) Två strategier för att detektera EWS-FLI1-kondensat (500 nM) montering på Lambda DNA: (B) Håll tvätten i 10 min;(D) inkubera i 10 min. (C och E) Representativ bredfält total intern reflektion fluorescensmikroskopi bild av DNA Gardiner: (C) Detektionsstrategi i B; E) Detektionsstrategi i D. C (ii) och E (ii) DNA zoomas in för att visa den distinkta puncta som bildas på ett enda DNA-substrat. DNA-substrat är Lambda-DNA med 25× GGAA-motiv. Siffrorna "1, 2, 3, 4" representerar olika positioner av puncta på ett Lambda-DNA, och "3" är där 25× GGAA-mikrosatellitsekvensen klonades. Skalstänger = 4,9 μm (C, E (i)) och 0,7 μm (C, E (ii)). Denna siffra har ändrats från 24. Förkortning: dsDNA = dubbelsträngat DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Bindningshändelser för den fristående domänen för mCherry-EWS-FLI1 den 25× GGAA upprepas. (A) (i) mCherry-EWS-FLI1. (ii) Elektroforetisk mobilitetsskiftanalys av mCherry-EWS-FLI1: 306-bp dsDNA märkt med 5' Quasar670 inkuberades med mCherry-EWS-FLI1 vid olika koncentrationer under rumstemperatur i 30 minuter i reaktionsbuffert innehållande 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM DTT och0,2 mg/ml bovint serumalbumin. Proverna laddades och kördes på 1,3% agarosgel i 25 min, 120 V. (B-D) Wide-field total intern reflektion fluorescensmikroskopibilder av 25× GGAA med DNA Gardiner efter inkubation med 500 nM mCherry (B), 500 nM mCherry-EWSLCD (C) eller 500 nM mCherry-FLI1DBD (D). (E) Intensitetsfördelning av EWSFLI1 (cyan) och FLI1DBD (svarta) signaler vid målplatsen (25× GGAA) region jämfört med proteinkoncentration. Denna siffra har ändrats från 24. Förkortningar: LCD = domän med låg komplexitet; DBD = DNA-bindande domän. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom enmolekylära metoder är extremt känsliga för innehållet i reaktionssystemet, måste extra ansträngning investeras för att säkerställa god kvalitet på alla material och lösningar under DNA-gardinerna, särskilt de lipider som framställts i sektionerna 1 och 2 och de buffertar som används i avsnitt 5. Reagenser av högre renhet måste användas för att framställa buffertar, och buffertar måste vara nyberedda för enmolekylanalysen

När 500 nM mCherry-märkt EWS-FLI1 spolades in i kammaren uppträdde flera magenta puncta på Lambda DNA som innehöll 25× GGAA-sekvenserna. Observera att det fanns en på varandra följande icke-specifik fördelning av magentasignaler genom hela DNA även efter 10 minuters tvättning med blankbuffert (figur 1B,C). Intressant nog omarrangerades EWS-FLI1-molekyler på DNA under 10 minuters inkubation utan buffertflödet och samlades i flera puncta (Figur 1D,E). En av dessa puncta bildades på den klonade 25× GGAA-platsen, medan alla andra bildades i regionerna som innehöll en hög densitet av på varandra följande GGAA-motiv. Detta fenomen tyder starkt på att inkubationsförfarandet utan flöde gör det möjligt för EWS-FLI1-molekyler att söka i loci och montera på DNA snabbare.

Flera kontrollexperiment måste utföras för att klargöra hur dessa kondensat bildades på DNA-gardiner. Vi renade mCherry, mCherry-EWSLCD och mCherry-FLI1DBD och följde samma procedur för att injicera dessa proteiner i kammaren. Varken mCherry (figur 2B) eller mCherry-EWSLCD (figur 2C) lämnade några signaler på DNA, vilket indikerar att FLI1DBD för EWS-FLI1 var nödvändig för interaktionen med DNA. För att bekräfta att fasseparation inträffade i DNA-gardiner vid så låga proteinkoncentrationer titrerades koncentrationen av mCherry-EWS-FLI1 från 25 nM till 500 nM, och intensiteten för varje puncta på en DNA-molekyl bestämdes vid klonplatsen (Figur 2E). En jämförelse med intensiteten av fusion TF FLI1DBD märkt med mCherry avslöjade att även om puncta-intensiteterna för EWS-FLI1 och FLI1-DBD var likartade vid låga proteinkoncentrationer, ökade intensiteten hos EWS-FLI1 dramatiskt medan FLI1DBD förblev låg även när koncentrationen nådde 500 nM. Dessa resultat tyder på att EWS-FLI1-molekyler binder till 25× GGAA-sekvensen och monteras till ett kondensat på den genom LCD-interaktioner. En enda FLI1DBD kan binda 2x GGAA-motiv, och oligomerer av högre ordning binder till mycket repetitiva sekvenser med låg affinitet27. mCherry-FLI1DBD-signalen på 25× GGAA-sekvensen var från ett proteinkluster snarare än en enskild proteinmolekyl. Även om mCherry-FLI1DBD kunde binda de 25× GGAA-platserna, misslyckades det med att monteras som ett kondensat på DNA, vilket bekräftade att LCD-LCD-interaktionen var nödvändig för fasseparation (figur 2D, E).

Enmolekylära metoder gör det möjligt för forskare att studera dynamiken inuti transkriptionsfaktorkondensat. DNA-gardinmetoden har vissa fördelar jämfört med andra enmolekylära metoder såsom enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET)29, superupplösningsavbildning 30 och optisk pincett31,32. För det första möjliggör DNA-gardinmetoden rekonstituering av transkriptionsmaskineriet på långt genomiskt DNA in vitro och realtidsobservation av transkriptionskondensatbildning med datainsamling med hög genomströmning. För det andra tillåter inriktade DNA-molekyler kartläggning av kondensatens position på varje DNA-sträng. Således kan de föredragna DNA-sekvenserna för puncta-bildning enkelt bestämmas.

Dessutom är långsiktigt förvärv möjligt med DNA-gardiner, vilket möjliggör mätning av on-rate (k on) och off-rate (koff) för en punctum. DNA-gardiner har dock vissa inneboende tekniska defekter, vilket kräver att bevisen från olika metoder undersöks kollektivt. Å ena sidan kan upplösningen av DNA-gardiner bara nå 0,18 μm eller ~ 1 000 bp eftersom den långa Lambda DNA-mallen har en begränsning med avseende på diffraktionsgränsen, vilket kan hindra differentieringen av två närliggande fluorescenssignaler. Å andra sidan används flödet för att förlänga dubbelsträngs-DNA (dsDNA), och kraften som appliceras på biomolekylen kan påverka diffusionsegenskapen hos proteinerna som binder till DNA. Dubbelbundna DNA-gardiner kan förankra båda ändarna av dsDNA och registrera rörelsen av proteiner utan flöde, vilket är en anmärkningsvärd lösning33. Sammanfattningsvis kommer en fördjupning av vår förståelse av den dynamiska sammansättningen av biomolekylära kondensat på DNA i realtid att belysa inte bara den biofysiska mekanismen för LLPS utan också den grundläggande biologin för LLPS-relaterade cellulära processer, såsom gentranskriptionsreglering24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS488LS
561 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS561LS
Agar Rhawn R003215-50g
biotinylated DOPE Avanti 870273P
Bovine Serum Albumin Sigma A7030
Chloroform Amresco 1595C027
Coating Electra 92 Allresist GmbH AR-PC 5090.02 The conductive protective coating
Deoxyribonuclease I bovine Sigma D5139-2MG
DOPC Avanti 850375P
DTT Sigma D9779
Glass coverslip Fisher Scientific 12-544-7
Hellmanex III Sigma Z805939-1EA
KCl Sigma 60130
Lambda DNA NEB N3013S
Lambda Packing Extracts Epicentre MP5120
MgCl2 Sigma M2670
NaCl Sigma s3014
Nanoport Idex N-333-01
NheI-HF NEB R3131S
Nikon Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
NZCYM Broth Sigma N3643-250G
PEG-2000 DOPE Avanti 880130P-1G
PEG-8000 Amresco 25322-68-3
PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% Allresist GmbH AR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2% Allresist GmbH AR-P 672.02
Prime 95B Scientific CMOS camera PHOTOMETRICS Prime95B
proteinase K NEB P8107S
Silica glass slide G.Finkenbeiner
Six-way injection valve Idex MXP9900-000
Streptavidin Thermo S888 Diluted with ddH2O
Syringe pump Harvard Apparatus Pump11 Elite
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Tris base Sigma T6066
XhoI NEB R0146V
YOYO-1 Iodide (491/509) Invitrogen Y3601 Diluted with DMSO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).

Tags

Biokemi utgåva 175
Enmolekylär avbildning av EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z.… More

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z. Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA. J. Vis. Exp. (175), e62974, doi:10.3791/62974 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter