Summary
在这里，我们描述了使用单分子成像方法DNA窗帘来研究EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的生物物理机制。
Abstract
由染色体易位产生的融合基因已在许多实体瘤或白血病中发现。EWS-FLI1属于融合癌蛋白的FUS/EWS/TAF15（FET）家族，是尤文肉瘤中最常涉及的融合基因之一。这些FET家族融合蛋白通常在其N末端具有FET蛋白的低复杂性结构域（LCD），在其C末端具有DNA结合结构域（DBD）。由于LCD-LCD和LCD-DBD的相互作用，EWS-FLI1已被证实在其靶结合位点形成生物分子缩合物，这些缩合物可以募集RNA聚合酶II以增强基因转录。然而，这些冷凝物如何在其结合位点组装仍不清楚。最近，一种单分子生物物理学方法——DNA窗帘——被应用于可视化EWS-FLI1凝聚物的这些组装过程。本文讨论了DNA幕在靶DNA上生物分子凝聚物组装中应用的详细实验方案和数据分析方法。
Introduction
转录调控是活细胞中精确表达基因的关键步骤。许多因素，如染色体修饰、转录因子（TF）和非编码RNA，都参与了这一复杂的过程1，2，3。在这些因素中，TF通过识别和结合称为启动子或增强子的特定DNA序列并随后招募其他功能蛋白来激活或抑制转录4，5，6，7，从而有助于转录调控的特异性。几十年来，这些TF如何设法在人类基因组中搜索其靶位点并与涂有组蛋白和非组蛋白DNA结合蛋白的DNA相互作用，这一直困扰着科学家们。在过去的几年中，已经建立了几个用于TF目标搜索机制的经典模型来描述它们如何沿着DNA链8，9，10，11“滑动”，“跳跃”，“跳跃”或“片段间转移”。这些模型侧重于单个TF分子DNA上的搜索行为。然而，最近的研究表明，一些TF在细胞核中单独或与介质复合物一起进行液-液相分离（LLPS）12。观察到的TFs液滴与启动子或增强子区域相关，突出了生物分子冷凝物形成在转录和三维基因组中的作用13，14，15。这些生物分子缩合物与体内和体外缺乏膜的隔室相连。它们通过LLPS形成，其中模块化生物大分子和蛋白质的固有无序区域（IDR）是多价相互作用的两个主要驱动力16。因此，TF不仅可以搜索DNA，还可以在这些凝聚物4，17，18中协同发挥作用。迄今为止，这些转录凝聚物在DNA上的生物物理特性尚不清楚。
因此，本研究旨在应用单分子方法——DNA幕，在体外直接成像TFs在DNA上形成的转录凝聚物的形成和动力学。DNA窗帘是一种用于研究蛋白质和DNA之间相互作用的高通量体外成像平台，已应用于DNA修复19，20，21，靶标搜索22和LLPS17，23，24。DNA幕的流通池涂有生物素化的脂质双层，以钝化表面并允许生物分子在表面上扩散。纳米制造的锯齿形图案限制了DNA的运动。生物素化的Lambda DNA底物可以沿着屏障边缘排列，并被定向缓冲流拉伸。所有分子的相同起始序列和结束序列允许跟踪DNA上的蛋白质并描述结合事件的位置分布25，26。此外，DNA幕与全内反射荧光显微镜（TIRFM）的组合有助于最大限度地减少背景噪声并在单分子水平上检测信号。因此，DNA幕布可能是研究DNA基序上转录凝聚物形成的动力学的一种有前途的方法。本文描述了由染色体易位产生的FUS/EWS/TAF15（FET）家族融合癌蛋白EWS-FLI1的例子。含有25×GGAA（EWS-FLI127的结合序列）的Lambda DNA被用作DNA幕实验中的DNA底物，以观察EWS-FLI1分子如何在DNA上经历LLPS。本文详细讨论了实验方案和数据分析方法。
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Protocol
1. 脂质双层预混液的制备
- 用双蒸水（ddH2O）和99%乙醇冲洗玻璃小瓶，并在60°C干燥炉中干燥。
- 通过将 1 g 1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DOPC）、100 mg 聚乙二醇反应（聚乙二醇化）脂质（1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（PEG2000 原液）和 25 mg 生物素化脂质（1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（帽生物素基）（钠盐）（生物素帽原液）的 18：1）溶解到 10 mL 氯仿中，制成脂质预混液。
- 每瓶制备1mL等分的脂质预混液，并将其储存在-20°C的干净玻璃小瓶中。
注意：将溶解的脂质储存在玻璃小瓶中，并在储存期间用封口膜盖住小瓶盖。
2.脂质体溶液的制备
- 用ddH2O和99%乙醇冲洗2mL玻璃小瓶，并在60°C干燥炉中彻底干燥。
- 用氯仿冲洗250μL玻璃注射器，然后将200μL脂质预混液转移到干燥的玻璃小瓶中。
- 使用氮气喷枪轻轻流动N2 ，同时沿一个方向连续旋转小瓶。
注意：N2 将有助于蒸发氯仿，残留的脂质将在玻璃小瓶壁上形成薄膜。首先将氮气流调整为非常温和，当小瓶中出现白色薄膜时增加流量;在5分钟内完成此蒸发过程。 - 将玻璃小瓶转移到室温（RT）的真空干燥箱中16-24小时，以完全去除脂质中的氯仿。
- 向玻璃小瓶中加入2mL新鲜脂质缓冲液（10mM Tris-HCl（pH 7.5）和100mM NaCl），并在室温下溶解脂质2小时。将溶液涡旋数次并将其转移到 5 mL 聚丙烯培养管中。
- 使用以下设置，用微尖端超声仪在冰上超声处理脂质溶液以形成小的单层囊泡：6 s on-12 s off（20% 振幅）6 个周期，然后 6 s on-6 s 关闭（30% 振幅）3 个周期，最后 10 s 开启（40% 振幅）。
注意：超声处理过程中的温度升高可能导致泡沫破裂并破坏脂质体。因此，请检查泡沫的状态和温度，并经常补充冰块。 - 通过0.22μm尼龙注射器过滤器过滤脂质体，等分试样，并将其储存在4°C。
注意：由于它们的迁移率随着储存时间的延长而降低，因此脂质体必须在2-3个月内使用或在使用前新鲜制备。
3. Lambda DNA的序列克隆和生物素化
- 将结合基序插入 Lambda DNA 中
- 用NheI和XhoI消化含有结合基序和Lambda DNA的靶片段。在室温下使用 T4 连接酶用 Lambda DNA 连接靶片段过夜。
- 在无抗生素LB培养基中培养大 肠杆菌 VCS257细胞，直到OD600 达到0.6。将细菌储存在4°C以备后用。
- 将连接溶液在65°C下加热20分钟以使T4连接酶变性。
- 解冻Lambda噬菌体提取物，用钝头移液将其与连接产物轻轻混合，并将混合物在室温下孵育2小时。
- 将 500 μL SM 缓冲液（50 mM Tris-HCl （pH 7.5）、100 mM NaCl 和 8 mM MgCl2，通过 0.22 μm 过滤器过滤）和 20 μL 氯仿加入步骤 3.1.4 的包装混合物中，充分混合，然后离心溶液。
注意：包装提取物的活性可以长时间保持在4°C。 - 通过将 10 μL 包装提取物与 90 μL SM 缓冲液和 100 μL VCS257 细胞（来自步骤 3.1.2）混合在一起来制备反应混合物，并将混合物在 37 °C 下孵育 15 分钟。
注意：包装溶液浓度取决于第二天噬菌体斑块的密度;它可以根据需要稀释或添加。 - 在 15 mL 管中取 ~5 mL 融化的顶部琼脂（22 g/L NZCYM 肉汤和 15 g/L 琼脂）。一旦顶部琼脂冷却至~42°C，使用钝端移液管缓慢加入反应混合物（来自步骤3.1.6），并将液体倒入无抗生素LB琼脂平板上。将板在37°C培养箱中过夜。
- 通过PCR确认顶部琼脂平板上透明噬菌体斑块中的阳性斑块。用移液管将阳性斑块转移到新的顶部琼脂平板上，并将平板在37°C培养箱中保持过夜。
- 将 400 μL VCS257 细胞加入含有 10 mM MgCl 2 和 10 mM CaCl2 的 400 μL 缓冲液中，将一个噬菌斑接种到该细胞混合物中，并在 37 °C 振荡器中以 250 rpm 孵育 15 分钟。
- 将800μL含有噬菌体斑块的悬浮液加入200mL的NZCYM培养箱中，并在37°C振荡器中以125rpm孵育。
- 培养~4小时后测量细菌悬浮液的OD600 。请记住，OD600 值将首先上升，然后下降到 ~0.2 的低谷。当OD 600值即将再次上升时停止孵育，加入500μL氯仿，并以80rpm 再摇动5分钟。
注意：低谷后OD600 的增加将很快发生;因此，当OD 600值降至0.3时，必须更频繁地测量OD600 值，以避免培养物中VCS257细胞过度生长。 - 将噬菌体培养物转移到 500 mL 瓶中，加入 11.7 g NaCl，然后摇动瓶子。将瓶子在冰上孵育10分钟。
- 将悬浮液均匀地转移到四个 50 mL 管中。将试管以12，000 x g 离心10分钟。
注意：第3.1节中的所有离心步骤都需要在4°C下完成。 - 将上清液转移到四个新的 50 mL 管中，并以相同的速度再次离心 5 分钟。
- 收集上清液，加入10%（w / v）PEG8000粉末，并在4°C下旋转孵育30分钟。
- 将步骤3.1.15中的悬浮液以12，000×g 离心15分钟以获得噬菌体沉淀。
- 将沉淀重悬于四个试管中的 1 mL 噬菌体稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl （pH 7.5）、100 mM NaCl 和 10 mM MgCl2）中，并将所有 4 mL 这些混合物倒入 50 mL 管中。
- 将RNase A（10mg / mL）和DNase I（4mg / mL）加入20μg/ mL和5μg/ mL终浓度，并在37°C下孵育30分钟以降解过量的核酸。
- 向管中加入 4.5 mL 300 mM Tris-HCl （pH 7.5）、2.76 mL 0.5 M 乙二胺四乙酸 （EDTA）、1.67 mL 10% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 和 75 μL 蛋白酶 K （10 mg/mL），并在 65 °C 下孵育 10 分钟。
- 加入 4.5 mL 预冷的 3 M 乙酸钾，并在冰上孵育 10 分钟。
- 以8，000×g离心10分钟，并以10，000×g再旋转上清液5分钟。
- 将70%体积的异丙醇加入收集的上清液（来自步骤3.1.21）中，充分混合，在室温下孵育2分钟，然后在8，000×g 下离心10分钟。弃去异丙醇并再次旋转5分钟。
注意：DNA沉淀将在前10分钟离心前涂抹;第二次5分钟离心后，沉淀将浓缩在管底部。 - 用 2-3 mL 的 70% 乙醇洗涤沉淀的 DNA，然后再次旋转 1 分钟。将沉淀在4°C下干燥2小时，然后将DNA重悬于500μLTE缓冲液（10mM Tris-HCl（pH 8.0）和1mM EDTA）中过夜。
- 将 DNA 转移到 1.5 mL 管中，并以 18，000 x g 离心 3 分钟。将 DNA 转移到新的 1.5 mL 试管中。将纯化的LambdaDNA等分并储存在-20°C。
- 生物素-λDNA制备
- 在65°C下熔解50μL纯化的具有克隆基序的Lambda DNA，持续10分钟。
注意：由于 Lambda DNA 的长度为 ~48 kbp，因此必须在移液前对其进行加热以避免 DNA 断裂。 - 将 50 μL Lambda DNA、1 μL 生物素引物 （5' - （磷） - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3'） （100 μM） 和 54 μL ddH2O 混合在一起。将混合物在65°C下共孵育5分钟，并将其留在工作台上冷却至室温。
- 加入 12 μL 10x T4 连接酶缓冲液和 3 μL T4 连接酶，并在室温下孵育数小时或过夜。
- 向连接产物中加入等体积的苯酚 - 氯仿（1：1）混合物，立即充分混合，并在室温下以12，000×g 离心2分钟。
- 小心地将含有DNA的上层水相转移到新管中，加入等体积的氯仿，充分混合，然后以12，000×g 离心2分钟。
- 将上层水相转移到新管中，加入等体积的异丙醇和10%体积的3M乙酸钠，并在室温下孵育2分钟。将混合物以12，000×g 离心5分钟。
- 除去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀，然后以12，000×g 离心5分钟。
- 除去 75% 乙醇，在室温下风干 DNA 10 分钟，并使用 120 μL TE 缓冲液溶解 DNA。
- 将 60 μL 缓冲液 A（30% （w/v） PEG8000 和 30 mM MgCl 2）加入步骤3.2.8 中的 120 μL 溶液中，并在 4 °C 下旋转 20-24 小时。
- 将混合物以18，000g离心5分钟，并除去上清液。
- 使用 180 μL 预冷的 75% 乙醇洗涤沉淀，并重复步骤 3.2.10。
- 在室温下干燥沉淀，并使用 100 μL TE150 缓冲液溶解 DNA。
- 在65°C下熔解50μL纯化的具有克隆基序的Lambda DNA，持续10分钟。
4. 纳米制造的锯齿形屏障
- 通过超声处理在丙酮中清洁载玻片20分钟，然后将它们转移到具有1M NaOH的新玻璃容器中再超声处理20分钟。将 90 mL H 2 SO4 与 30 mL H2O2 混合，并将载玻片浸入该混合物中 30 分钟。用丙酮和异丙醇冲洗载玻片，并用N2干燥载玻片。
注意：混合 H 2 SO4 和 H2O2 是一个放热过程;在操作过程中采取足够的安全预防措施。 - 在清洁后的载玻片上连续涂覆聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 25 kDa、PMMA 49.5 kDa 和顶层导电保护涂层。使用电子束光刻技术写入锯齿形势垒（图1A）。
- 用ddH2O清洗载玻片以去除导电保护涂层，并用N2干燥载玻片。
- 使用磁控溅射机沉积 30 nm 铬 （Cr） 层，并用丙酮去除剩余的 PMMA 层。
注意：一个流通池可以重复用于 20 多个 DNA 幕实验。要重复使用流通池，请用乙醇、洗涤剂和 NaOH 清洗。
5. EWS-FLI1蛋白的纯化
注意：在具有 25× GGAA 基序的 Lambda DNA 上观察 500 nM EWS-FLI1 是应用 DNA 幕形成冷凝水的一个很好的例子。EWS-FLI1是一种融合蛋白，结合了EWSR1的N端（1-265）和FLI1的C端（220-453）。将mCherry标签融合到EWS-FLI1融合蛋白的N末端以进行可视化。
- 将 EWS-FLI1 基因克隆到重组的 pRSF 载体或任何其他合适的原核生物表达载体中。
- 将编码7x His-mCherry-EWSFLI1的质粒转化为 大肠杆菌 BL21（DE3）菌株;在37°C的5mLLB培养基中培养单个菌落过夜。当转移到2LLB培养基后OD600 值达到0.6-0.8时，加入0.5mM IPTG并在18°C下摇动细胞培养物16-18小时。
- 离心培养物以除去上清液，并用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5;1 M KCl;1 M 尿素;10 mM 咪唑;1.5 mM β-巯基乙醇（β-ME）;和5%甘油）重悬细胞。
- 超声处理并以18000 × g 离心~30分钟后，将上清液加载到在5倍体积的裂解缓冲液中平衡的Ni-NTA树脂上，然后用10倍体积的洗涤缓冲液（50mM Tris-HCl（pH 7.5），1M KCl，1M尿素，40mM咪唑，1.5mM β-ME和5%甘油）洗涤树脂。
- 用 15 mL 洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl （pH 7.5）、1 M KCl、1 M 尿素、500 mM 咪唑、1.5 mM β-ME 和 5% 甘油）洗脱结合的蛋白质，并将洗脱浓缩至 ~500 μL。
- 将浓缩的蛋白质溶液加载到凝胶过滤柱上，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析产物。将纯化的蛋白质在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。
6. DNA幕式流通池的制备
- 准备具有锯齿形纳米制造屏障的流通池，用于DNA幕实验并确定流动方向。为此，请以正确的方向连接输入管和输出管。
- 使用两个 3 mL 注射器用 2.5 mL 脂质缓冲液洗涤流通池。确保流通池中没有气泡。
- 从输出中取出注射器，并在每次注射后5分钟孵育5分钟，三次注入1mL脂质体溶液（来自第2节的40μL脂质体原液和960μL脂质缓冲液）。
- 对于愈合步骤，用 2.5 mL 脂质缓冲液缓慢洗涤流通池，并在室温下孵育 30 分钟。
注意：如有必要，愈合时间可以更长;如果出现任何气泡，请通过重复步骤5.3和5.4来去除气泡，从而执行双重修复。 - 制备 30 mL 牛血清白蛋白 （BSA） 缓冲液（40 mM Tris-HCl （pH 7.5）、2 mM MgCl2、1 mM 二硫苏糖醇和 0.5 mg/mL BSA 用于表面钝化）。愈合 30 分钟后，从输出侧用 2.5 mL BSA 缓冲液洗涤流通池。
注意：BSA储备液是储存在4°C的20mg / mL溶液，必须在1-2周内使用。缓冲液中的BSA浓度可以根据表面条件进行调整。 - 分两步从输入侧将 800 μL 链霉亲和素缓冲液（10 μL 1 mg/mL 链霉亲和素原液、790 μL BSA 缓冲液）从输入侧注入流通池，每步后孵育 10 分钟。
注意：链霉亲和素通过将生物素化脂质和生物素化DNA之间的桥接而具有多价性，将DNA锚定在脂质上。 - 用 2.5 mL BSA 缓冲液洗涤流通池以去除所有游离链霉亲和素分子。
- 使用 BSA 缓冲液（2.5 μL DNA 和 998 μL BSA 缓冲液）用第 3 节中的克隆基序稀释生物素-Lambda DNA。以 5 分钟的间隔缓慢注射 Lambda DNA 4 次。
- 在注射过程中打开显微镜和科学的互补金属氧化物半导体（sCMOS）系统。用 10 mL ddH2O 清洗管路，用水、2% 液体比色皿清洁剂和 99% 乙醇冲洗棱镜和管接头。通过将KCl和双链DNA染料添加到BSA缓冲液中来制备成像缓冲液，以分别获得150 mM和0.5 nM的最终浓度，并将至少20 mL的成像缓冲液摄取到30 mL注射器中。
- 在显微镜载物台上设置流通池并将其连接到微流体系统。
- 使用0.03mL / min的流速将DNA分子冲洗到屏障上10分钟，在流动停止的情况下孵育30分钟，然后将其关闭以使DNA横向扩散。
注意：这30分钟孵育的目的是让DNA分子通过简单的扩散更均匀地分布在屏障前面，因为DNA分子倾向于积聚在屏障的一侧，该屏障靠近它们被冲洗的输入。孵育时间可根据需要进行调整。
7. DNA幕上EWS-FLI1缩合形成的成像
- 打开成像软件，在明场下找到并标记3×3之字形图案的位置。
- 以 0.2 mL/min 的速度开启流动，用双链 DNA 染料染色 DNA 10 分钟。
- 用成像缓冲液将 mCherry-EWS-FLI1 稀释至管中 100 μL 中的 100 nM 浓度。
- 用 100 μL 玻璃注射器通过阀门加载蛋白质样品，并将流速更改为 0.4 mL/min。
- 打开488nm激光并预扫描每个区域以检查DNA分布状态;选择DNA分子均匀分布的区域。将 488 nm 激光器的激光功率设置为 10%，将 561 nm 激光器的激光功率设置为 20%。使用功率计测量棱镜附近的实际激光功率：488 nm 激光器为 4.5 mW，561 nm 激光器为 16.0 mW。
- 图像采集
- 开始以 2 秒的间隔同时使用 488 nm 和 561 nm 激光器采集图像。
- 将阀门从手动模式更改为进样模式，让成像缓冲液在60秒后将蛋白质样品冲洗到流通池中。
注意：此过程将需要~30秒，一旦EWS-FLI1蛋白到达流通池，视野将被mCherry信号覆盖。 - 要去除游离的 EWS-FLI1，请在仅打开 561 nm 激光的情况下，用成像缓冲液清洗流通池 5 分钟。停止流动并在37°C孵育10分钟。
- 以 0.4 mL/min 的速度开启流动以使 DNA 延伸，并在不同帧之间以 2 s 的间隔采集图像以获得 EWS-FLI1 凝合物形成的高通量数据。
8. m樱桃-EWS-FLI1的强度分析
- 将数据作为图像序列导入 ImageJ 软件，在 8×8 像素正方形中挑选出 25× GGAA 站点的点，并以.tif格式保存图像。
- 将强度计算为 8×8 像素正方形（包括整个标点）中强度的总和，并通过减去 8 x 8 像素正方形附近相同大小区域中的背景强度来去除背景。
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Representative Results
DNA幕的示意图如图1A、图1B和图1D所示。在尤因肉瘤的 NORB1 启动子中发现了包含 25 个不间断重复的 GGAA 的克隆靶序列。该目标序列对于EWS-FLI1招募至关重要28。通过检测用561nm激光获得的mCherry标记的EWS-FLI1信号来可视化EWS-FLI1分子（图1C和图1E）。在建立DNA幕实验后，可以直接可视化DNA底物25×GGAA位点处EWS-FLI1生物分子缩合物的体外形成（图1B-E）。DNA幕中使用的mCherry-EWS-FLI1的特异性通过电泳迁移率位移测定得到证实，该测定使用分别含有25× GGAA和不含GGAA的DNA模板（图2A）。此外，将EWS-FLI1的浓度从20 nM滴定至500 nM，并确定25× GGAA位点的点状强度。与mCherry-FLI1DBD的强度相比，EWS-FLI1的强度显著增加，而当蛋白质饱和以覆盖25× GGAA位点时，FLI1DBD强度的变化可以忽略不计。因此，这些结果强烈表明EWS-FLI1在DNA上形成缩合物（图2B-E）。
图 1：含有 25× GGAA 基序的 Lambda DNA 上的 EWS-FLI1 缩合物形成。 （A） DNA幕布示意图。（B和D）检测 Lambda DNA 上聚集的 EWS-FLI1 凝聚物 （500 nM） 的两种策略：（B） 保持洗涤 10 分钟;（D）孵育 10 分钟。 （C 和 E） DNA 窗帘的代表性宽场全内反射荧光显微镜图像： （C） B 中的检测策略;（五）D中的检测策略。 放大C（ii）和E（ii）DNA以显示在单个DNA底物上形成的独特点。DNA底物是具有25× GGAA基序的Lambda DNA。数字“1，2，3，4”代表一个Lambda DNA上点的不同位置，“3”是克隆25× GGAA微卫星序列的地方。比例尺 = 4.9 微米（C、E （i））和 0.7 μm（C、E （ii））。这个数字是从24修改的。缩写：dsDNA = 双链 DNA。请点击此处查看此图的大图。
图 2：mCherry-EWS-FLI1 分离域在 25 × GGAA 重复上的绑定事件。 （A） （i） mCherry-EWS-FLI1.（ii） mCherry-EWS-FLI1 的电泳迁移率转移测定：将用 5' Quasar670 标记的 306-bp dsDNA 与不同浓度的 mCherry-EWS-FLI1 在含有 40 mM Tris-HCl （pH 7.5）、150 mM KCl、2 mM MgCl 2、1 mM DTT 和0.2 mg/mL 牛血清白蛋白的反应缓冲液中孵育 30 分钟。将样品上样并在1.3%琼脂糖凝胶上运行25分钟，120 V.（B-D）与500 nM mCherry（B），500 nM mCherry-EWSLCD （C）或500 nM mCherry-FLI1DBD （D）孵育后，带有DNA幕的25× GGAA的宽场全内反射荧光显微镜图像。（E）靶位点（25× GGAA）区域的EWSFLI1（青色）和FLI1DBD（黑色）信号的强度分布与蛋白质浓度的关系。这个数字是从24修改的。缩写：LCD = 低复杂度域;DBD = DNA结合结构域。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
由于单分子方法对反应系统的内容物极其敏感，因此在DNA幕实验期间必须投入额外的精力来确保所有材料和溶液的良好质量，特别是在第1和第2节中制备的脂质以及第5节中使用的缓冲液。必须使用更高纯度的试剂来制备缓冲液，并且必须为单分子测定新鲜制备缓冲液
当500 nM mCherry标记的EWS-FLI1被冲洗到腔室中时，含有25×个GGAA序列的Lambda DNA上出现了几个洋红色点。请注意，即使在用空白缓冲液洗涤10分钟后，洋红色信号在整个DNA中也存在连续的非特异性分布（图1B，C）。有趣的是，在没有缓冲液流的情况下，在孵育10分钟期间，EWS-FLI1分子在DNA上重新排列并聚集成几个点（图1D，E）。其中一个点是在克隆的25× GGAA位点形成的，而所有其他点是在含有高密度连续GGAA基序的区域形成的。这种现象强烈表明，无流动孵育程序允许EWS-FLI1分子更快地搜索位点并在DNA上组装。
必须进行几个对照实验来阐明这些凝聚物如何在DNA幕上形成。我们纯化了mCherry，mCherry-EWSLCD和mCherry-FLI1DBD，并按照相同的程序将这些蛋白质注射到腔室中。mCherry（图2B）和mCherry-EWSLCD（图2C）都没有在DNA上留下任何信号，表明EWS-FLI1的FLI1DBD对于与DNA的相互作用是必需的。为了确认在如此低的蛋白质浓度下DNA幕中发生相分离，将mCherry-EWS-FLI1的浓度从25 nM滴定至500 nM，并在克隆位点测定一个DNA分子上每个点的强度（图2E）。与用mCherry标记的融合TF FLI1DBD的强度比较显示，尽管EWS-FLI1和FLI1-DBD的点状强度在低蛋白浓度下相似，但即使浓度达到500 nM，EWS-FLI1的强度也显着增加，而FLI1DBD的强度仍然很低。这些结果表明，EWS-FLI1分子与25× GGAA序列结合，并通过LCD相互作用在其上组装成冷凝物。单个FLI1DBD可以结合2x GGAA基序，高阶低聚物可结合高度重复的低亲和力序列27。25× GGAA序列上的mCherry-FLI1DBD信号来自蛋白质簇，而不是单个蛋白质分子。尽管mCherry-FLI1DBD可以结合25×个GGAA位点，但它未能在DNA上组装为缩合物，证实了LCD-LCD相互作用对于相分离是必要的（图2D，E）。
单分子方法使研究人员能够研究转录因子凝聚物内部的动力学。与其他单分子方法（如单分子荧光共振能量转移（smFRET）29、超分辨率成像30和光学镊子31，32）相比，DNA幕法具有一些优势。首先，DNA幕布方法允许 在体外重建 长基因组DNA上的转录机制，并通过高通量数据采集实时观察转录凝聚物的形成。其次，比对的DNA分子允许映射每条DNA链上凝聚物的位置。因此，可以很容易地确定点状形成的优选DNA序列。
此外，使用DNA幕进行长期采集是可行的，允许测量一个点点的通率（k开启）和关率（k关）。然而，DNA窗帘存在一些固有的技术缺陷，需要对来自不同方法的证据进行集体检查。一方面，DNA幕的分辨率只能达到0.18μm或~1，000-bp，因为长Lambda DNA模板对衍射极限有限制，这会阻碍两个相邻荧光信号的分化。另一方面，流动用于延伸双链DNA（dsDNA），施加在生物分子上的力可能会影响与DNA结合的蛋白质的扩散特性。双链DNA幕可以锚定dsDNA的两端，并记录蛋白质在没有流动的情况下的运动，这是一个值得注意的解决方案33。总而言之，加深我们对生物分子凝聚物在DNA上的实时动态组装的理解，不仅可以阐明LLPS的生物物理机制，还可以阐明LLPS相关细胞过程的基础生物学，例如基因转录调控24。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金第31670762号资助（Z.Q.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
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