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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62974
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, descrevemos o uso do método de imagem de molécula única, Cortinas de DNA, para estudar o mecanismo biofísico dos condensados EWS-FLI1 que se reúnem no DNA.

Abstract

Os genes de fusão resultantes da translocação cromossômica foram encontrados em muitos tumores sólidos ou leucemia. EWS-FLI1, que pertence à família FUS/EWS/TAF15 (FET) de oncoproteínas de fusão, é um dos genes de fusão mais frequentemente envolvidos no sarcoma de Ewing. Essas proteínas de fusão da família FET tipicamente abrigam um domínio de baixa complexidade (LCD) da proteína FET em seu terminal N e um domínio de ligação ao DNA (DBD) em seu terminal C. Foi confirmado que o EWS-FLI1 forma condensados biomoleculares em seus loci de ligação alvo devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, e esses condensados podem recrutar RNA polimerase II para melhorar a transcrição gênica. No entanto, como esses condensados são montados em seus locais de ligação ainda não está claro. Recentemente, um método biofísico de molécula única - Cortinas de DNA - foi aplicado para visualizar esses processos de montagem de condensados EWS-FLI1. Aqui, o protocolo experimental detalhado e as abordagens de análise de dados são discutidos para a aplicação de cortinas de DNA no estudo dos condensados biomoleculares que se reúnem no DNA alvo.

Introduction

A regulação transcricional é um passo crucial para a expressão gênica precisa em células vivas. Muitos fatores, como modificação cromossômica, fatores de transcrição (FTs) e RNAs não codificantes, participam desse complicado processo 1,2,3. Dentre esses fatores, os FTs contribuem para a especificidade da regulação transcricional, reconhecendo e ligando-se a sequências específicas de DNA conhecidas como promotores ou potenciadores e, posteriormente, recrutando outras proteínas funcionais para ativar ou reprimir a transcrição 4,5,6,7. Como esses TFs conseguem procurar seus locais-alvo no genoma humano e interagir com o DNA revestido com histonas e proteínas não vinculadoras de DNA de histonas tem deixado os cientistas perplexos há décadas. Nos últimos anos, vários modelos clássicos para o mecanismo de busca de alvos de FTs foram construídos para descrever como eles "deslizam", "saltam", "saltam" ou "transferem entre segmentos" ao longo da cadeia de DNA 8,9,10,11. Esses modelos são focados no comportamento de busca no DNA de uma única molécula de FT. No entanto, estudos recentes mostram que alguns FTs sofrem separação de fase líquido-líquido (LLPS) isoladamente no núcleo ou com o complexo Mediador12. As gotículas observadas dos FTs estão associadas às regiões promotoras ou potenciadoras, destacando o papel da formação de condensado biomolecular na transcrição e no genoma tridimensional13,14,15. Estes condensados biomoleculares estão ligados a compartimentos sem membrana in vivo e in vitro. Elas são formadas via LLPS, na qual biomacromoléculas modulares e regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) de proteínas são duas das principais forças motrizes das interações multivalentes16. Assim, os FTs não apenas buscam o DNA, mas também funcionam sinergicamente dentro desses condensados 4,17,18. Até o momento, a propriedade biofísica desses condensados de transcrição no DNA permanece obscura.

Portanto, este trabalho teve como objetivo aplicar um método de molécula única - Cortinas de DNA - para visualizar diretamente a formação e a dinâmica dos condensados de transcrição formados por TFs no DNA in vitro. DNA Curtains, uma plataforma de imagem in vitro de alto rendimento para estudar a interação entre proteínas e DNA, tem sido aplicada no reparo de DNA 19,20,21, busca de alvos22 e LLPS17,23,24. A célula de fluxo das cortinas de DNA é revestida com bicamadas lipídicas biotiniladas para passivar a superfície e permitir que as biomoléculas se difundam na superfície. Os padrões de zigue-zague nanofabricados limitam o movimento do DNA. Os substratos de DNA Lambda biotinilados podem se alinhar ao longo das bordas da barreira e ser esticados pelo fluxo tampão orientado. As mesmas sequências inicial e final de todas as moléculas permitem o rastreamento da proteína no DNA e descrevem a distribuição de posição dos eventos de ligação25,26. Além disso, a combinação de cortinas de DNA com microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) ajuda a minimizar o ruído de fundo e detectar sinais em um nível de molécula única. Assim, as cortinas de DNA podem ser um método promissor para investigar a dinâmica da formação de condensado de transcrição em motivos de DNA. Este artigo descreve o exemplo de uma oncoproteína de fusão da família FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, gerada por translocação cromossômica. DNA lambda contendo 25× GGAA - a sequência de ligação do EWS-FLI127 - foi usado como substrato de DNA nos experimentos de DNA Curtains para observar como as moléculas EWS-FLI1 sofrem LLPS no DNA. Este manuscrito discute detalhadamente o protocolo experimental e os métodos de análise de dados.

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Protocol

1. Preparação da mistura mestra de bicamada lipídica

  1. Enxaguar os frascos para injetáveis de vidro com água duplamente destilada (ddH2O) e etanol a 99% e seque-os numa estufa de secagem a 60 °C.
  2. Transformar a mistura mestre lipídica dissolvendo 1 g de lípidos 1,2-diololeil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 100 mg de lípidos reagidos a polietilenoglicol (PEGylated) (18:1 de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi (polietilenoglicol)-2000] (sal de amónio) (PEG2000 DOPE) e 25 mg de lípidos biotinilados (18:1 de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinyl) (sal de sódio) (Biotinyl Cap DOPE)) em 10 ml de clorofórmio.
  3. Preparar 1 ml de alíquotas da mistura mestra lipídica por frasco para injetáveis e guardá-las a -20 °C em frascos para injetáveis de vidro limpos.
    NOTA: Conservar o lípido dissolvido em frascos para injetáveis de vidro e cobrir a tampa do frasco para injetáveis com parafilme durante o armazenamento.

2. Preparação da solução lipossomótica

  1. Lave um frasco para injetáveis de vidro de 2 ml com ddH2O e etanol a 99% e seque-o completamente numa estufa de secagem a 60 °C.
  2. Lave uma seringa de vidro de 250 μL com clorofórmio e, em seguida, transfira 200 μL da mistura mestre lipídica para o frasco para injetáveis de vidro seco.
  3. Use uma pistola de pulverização de nitrogênio para fluir N2 suavemente enquanto gira continuamente o frasco para injetáveis em uma direção.
    NOTA: O N2 ajudará a evaporar o clorofórmio e os lípidos residuais formarão uma película fina na parede do frasco para injetáveis de vidro. Ajustar a corrente de azoto para ser muito suave no início e aumentar o fluxo quando aparecer uma película branca no frasco para injetáveis; completar este processo de evaporação dentro de 5 min.
  4. Transfira o frasco para injetáveis de vidro para uma estufa de secagem a vácuo à temperatura ambiente (RT) durante 16-24 h para remoção completa do clorofórmio dos lípidos.
  5. Adicionar 2 ml de tampão lipídico fresco (Tris-HCl de 10 mM (pH 7,5) e NaCl de 100 mM) ao frasco para injetáveis de vidro e dissolver os lípidos a RT durante 2 h. Vórtice a solução várias vezes e transfira-a para um tubo de cultura de polipropileno de 5 mL.
  6. Sonicate a solução lipídica no gelo com um sonicator de micro-ponta para formar pequenas vesículas unilamelares, usando as seguintes configurações: 6 s on-12 s off (amplitude de 20%) por 6 ciclos, depois 6 s on-6 s off (amplitude de 30%) por 3 ciclos, finalmente 10 s on (amplitude de 40%).
    NOTA: O aumento da temperatura durante a sonicação pode resultar no estouro de espuma e destruir os lipossomas. Portanto, verifique o estado da espuma e a temperatura e reabasteça o gelo com frequência.
  7. Filtrar os lipossomas através de um filtro de seringa de nylon de 0,22 μm, alíquota, e armazená-lo a 4 °C.
    NOTA: Como sua mobilidade diminui com o armazenamento prolongado, os lipossomas devem ser usados em 2-3 meses ou preparados recentemente antes do uso.

3. Sequência de clonagem e biotinilação do DNA Lambda

  1. Inserção dos motivos de ligação no ADN Lambda
    1. Digerir o fragmento alvo contendo os motivos de ligação e o ADN Lambda com NheI e XhoI. Ligate o fragmento alvo com DNA Lambda usando T4 ligase durante a noite em RT.
    2. Cultura de células E.coli VCS257 em meio LB livre de antibióticos até que a OD600 atinja 0,6. Conservar as bactérias a 4 °C para utilização posterior.
    3. Aquecer a solução de ligadura a 65 °C durante 20 minutos para desnaturar a ligase T4.
    4. Descongele o extrato de fago Lambda, misture-o com o produto ligado suavemente por pipetagem com pontas rombas e incube a mistura em RT por 2 h.
    5. Adicionar 500 μL de tampão SM (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl e 8 mM de MgCl2, filtrado através de um filtro de 0,22 μm) e 20 μL de clorofórmio na mistura de embalagem a partir da etapa 3.1.4, misturar bem e centrifugar a solução.
      NOTA: A actividade do extracto de embalagem pode ser mantida a 4 °C durante períodos prolongados.
    6. Preparar a mistura de reacção misturando 10 μL de extracto de embalagem com 90 μL de tampão SM e 100 μL das células VCS257 (a partir da fase 3.1.2) e incubar a mistura a 37 °C durante 15 minutos.
      NOTA: A concentração da solução de embalagem depende da densidade das placas de fagos no dia seguinte; pode ser diluído ou adicionado conforme necessário.
    7. Tome ~5 mL de ágar superior derretido (caldo NZCYM de 22 g/L com ágar de 15 g/L) em um tubo de 15 mL. Assim que o ágar superior arrefecer até ~42 °C, adicionar a mistura de reacção (a partir do passo 3.1.6) lentamente utilizando uma pipeta de extremidade romba e deitar o líquido numa placa de ágar LB isenta de antibióticos. Manter a placa numa incubadora a 37 °C durante a noite.
    8. Confirme as placas positivas entre as placas de fagos transparentes na placa superior de ágar por PCR. Transfira as placas positivas para uma nova placa de ágar superior com uma pipeta e mantenha a placa numa incubadora de 37 °C durante a noite.
    9. Adicionar 400 μL de células VCS257 em 400 μL de tampão contendo 10 mM MgCl 2 e 10 mM CaCl2, inocular uma placa nesta mistura celular e incubá-la num agitador de 37 °C a 250 rpm durante 15 min.
    10. Adicionar 800 μL desta suspensão contendo a placa de fago a 200 ml de caldo NZCYM num balão de 2 L e incubá-la num agitador de 37 °C a 125 rpm.
    11. Meça OD600 da suspensão bacteriana após ~4 h de cultivo. Tenha em mente que o valor OD600 aumentará primeiro e depois cairá para um mínimo em ~ 0,2. Pare a incubação quando o valor de OD600 estiver prestes a subir novamente, adicione 500 μL de clorofórmio e agite a 80 rpm por mais 5 min.
      NOTA: O aumento do OD600 após o cavado ocorrerá rapidamente; portanto, o valor de OD600 deve ser medido com mais frequência quando diminui para 0,3 para evitar o crescimento excessivo de células VCS257 na cultura.
    12. Transfira a cultura do fago para um frasco de 500 mL, adicione 11,7 g de NaCl e agite o frasco. Incube a garrafa no gelo por 10 min.
    13. Transfira a suspensão igualmente para quatro tubos de 50 ml. Centrifugar os tubos a 12.000 x g durante 10 minutos.
      NOTA: Todas estas etapas de centrifugação no ponto 3.1 têm de ser efectuadas a 4 °C.
    14. Transfira os sobrenadantes para quatro novos tubos de 50 mL e centrifugar novamente na mesma velocidade por 5 min.
    15. Recolher os sobrenadantes, adicionar 10% (p/v) de pó de PEG8000 e rodar a 4 °C para incubar durante 30 minutos.
    16. Centrifugar as suspensões da etapa 3.1.15 a 12.000 x g durante 15 minutos para obter os pellets de fago.
    17. Ressuscite os pellets em 1 mL de tampão de diluição de fagos (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl e 10 mM MgCl2) em quatro tubos e despeje todos os 4 mL dessas misturas em um tubo de 50 mL.
    18. Adicionar RNase A (10 mg/mL) e DNase I (4 mg/mL) a concentrações finais de 20 μg/mL e 5 μg/mL e incubar a 37 °C por 30 min para degradar o excesso de ácidos nucleicos.
    19. Adicionar 4,5 mL de Tris-HCl 300 mM (pH 7,5), 2,76 mL de ácido etilenodiamina tetraacético 0,5 M (EDTA), 1,67 mL de dodecilsulfato de sódio a 10% (SDS) e 75 μL de proteinase K (10 mg/mL) no tubo e incubar a 65 °C por 10 min.
    20. Adicione 4,5 mL de acetato de potássio 3 M pré-resfriado e incube no gelo por 10 min.
    21. Centrifugar a 8.000 x g por 10 min e girar o sobrenadante por mais 5 min a 10.000 x g.
    22. Adicionar 70% de volume de isopropanol ao sobrenadante recolhido (a partir do passo 3.1.21) com mistura suficiente, incubar a RT durante 2 min e, em seguida, centrifugar a 8.000 x g durante 10 min. Descarte o isopropanol e gire novamente por 5 min.
      NOTA: O pellet de DNA será manchado antes da primeira centrifugação de 10 minutos; o pellet será concentrado no fundo do tubo após a segunda centrifugação de 5 minutos.
    23. Lave o DNA precipitado com 2-3 mL de etanol a 70% e gire novamente por 1 min. Secar o pellet a 4 °C durante 2 h e, em seguida, ressuspender o ADN em 500 μL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) e 1 mM EDTA) durante a noite no RT.
    24. Transfira o DNA para um tubo de 1,5 mL e gire-o a 18.000 x g por 3 min. Transfira o DNA para um novo tubo de 1,5 mL. Aliquotar o ADN Lambda purificado e armazená-lo a -20 °C.
  2. Preparação de DNA Biotina-Lambda
    1. Derreter 50 μL de ADN Lambda purificado com motivos clonados a 65 °C durante 10 min.
      NOTA: Como o DNA Lambda tem ~ 48 kbp de comprimento, ele deve ser aquecido antes da pipetagem para evitar quebras de DNA.
    2. Misture 50 μL de DNA lambda, 1 μL de primer de biotina (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) e 54 μL de ddH2O juntos. Co-incubar a mistura a 65 °C durante 5 min e deixá-la na bancada para arrefecer até ao RT.
    3. Adicione 12 μL de 10x tampão ligase T4 e 3 μL de ligase T4 e incube no RT por várias horas ou durante a noite.
    4. Adicionar um volume igual de mistura fenol-clorofórmio (1:1) ao produto de ligadura, misturar bem imediatamente e centrifugar a 12.000 x g durante 2 min a RT.
    5. Transfira a fase aquosa superior contendo o DNA cuidadosamente para um novo tubo, adicione um volume igual de clorofórmio, misture bem e, em seguida, centrifugar a 12.000 x g por 2 min.
    6. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo, adicione um volume igual de isopropanol e 10% do volume de acetato de sódio 3 M e incube em RT por 2 min. Centrifugar a mistura a 12.000 x g durante 5 min.
    7. Retire o sobrenadante, lave o pellet com etanol a 75% e, em seguida, centrifugar a 12.000 x g por 5 min.
    8. Remova o etanol a 75%, seque o DNA ao ar livre no RT por 10 minutos e use 120 μL de tampão TE para dissolver o DNA.
    9. Adicionar 60 μL de tampão A (30% (p/v) PEG8000 e 30 mM MgCl 2) a 120 μL da solução a partir do passo3.2.8 e rodar a 4 °C durante 20-24 h.
    10. Centrifugar a mistura a 18.000 g durante 5 minutos e remover o sobrenadante.
    11. Use 180 μL de etanol a 75% pré-resfriado para lavar o pellet e repita a etapa 3.2.10.
    12. Seque o pellet no RT e utilize 100 μL de tampão do TE150 para dissolver o ADN.

4. Barreiras em zigue-zague nanofabricadas

  1. Limpe as lâminas em acetona por 20 minutos por sonicação e transfira-as para um novo recipiente de vidro com 1 M de NaOH para sonicação por mais 20 minutos. Misture 90 mL de H 2 SO4 com 30 mL de H 2 O2e mergulhe as lâminas nesta mistura por 30 min. Enxaguar as lâminas com acetona e isopropanol e secar as lâminas com N2.
    NOTA: A mistura de H 2 SO4 e H 2 O2 éum processo exotérmico; tomar as precauções de segurança adequadas durante a operação.
  2. Revestir a lâmina limpa com polimetilmetacrilato (PMMA) 25 kDa, PMMA 49,5 kDa, e a camada superior de revestimento protetor condutor em sucessão. Use a litografia por feixe de elétrons para escrever as barreiras em zigue-zague (Figura 1A).
  3. Lave as lâminas com ddH2 O para remover o revestimento protetor condutor e seque as lâminas com N2.
  4. Deposite uma camada de 30 nm de cromo (Cr) usando uma máquina de pulverização de magnetron e remova as camadas restantes de PMMA com acetona.
    NOTA: Uma célula de fluxo pode ser reutilizada para mais de 20 experimentos de cortinas de DNA. Para reutilizar a célula de fluxo, lave-a com etanol, detergente e NaOH.

5. Purificação da proteína EWS-FLI1

NOTA: A observação de 500 nM EWS-FLI1 no DNA Lambda com motivos GGAA de 25× serve como um bom exemplo para a aplicação de cortinas de DNA na formação de condensado. EWS-FLI1 é uma proteína de fusão que combina o N-terminal de EWSR1 (1-265) e o C-terminal de FLI1 (220-453). Uma tag mCherry foi fundida ao N-terminal da proteína de fusão EWS-FLI1 para visualização.

  1. Clone o gene EWS-FLI1 em um vetor pRSF reconstituído ou qualquer outro vetor de expressão procariota adequado.
  2. Transformar o plasmídeo que codifica 7x His-mCherry-EWSFLI1 na cepa E.coli BL21(DE3); cultivar uma única colônia em 5 mL de meio LB a 37 °C durante a noite. Quando o valor de OD600 atingir 0,6-0,8 após a transferência para 2 L de meio LB, adicionar 0,5 mM IPTG e agitar a cultura celular a 18 °C por 16-18 h.
  3. Centrifugar a cultura para remover o sobrenadante e ressuspender as células com tampão de lise (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M de ureia; 10 mM de imidazol; 1,5 mM de beta-mercaptoetanol (β-ME); e 5% de glicerol).
  4. Após sonicação e centrifugação a 18000 × g por ~30 min, carregue o sobrenadante na resina Ni-NTA equilibrada em um volume de 5 vezes de tampão de lise e, em seguida, lave a resina com um volume de 10 vezes de tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M de ureia, 40 mM imidazol, 1,5 mM β-ME e 5% de glicerol).
  5. Eluir a proteína ligada com 15 mL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M de ureia, 500 mM de imidazol, 1,5 mM β-ME e 5% de glicerol) e concentrar a eluição a ~500 μL.
  6. Carregar a solução proteica concentrada em uma coluna de filtração em gel e analisar os produtos por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. Congelar rapidamente a proteína purificada em azoto líquido e conservar a -80 °C.

6. Preparação de uma célula de fluxo de cortinas de DNA

  1. Prepare uma célula de fluxo com barreiras nanofabricadas em zigue-zague para um experimento de cortinas de DNA e determine a direção do fluxo. Para fazer isso, conecte os tubos de entrada e saída na direção correta.
  2. Lavar a célula de fluxo com 2,5 ml de tampão lipídico utilizando duas seringas de 3 ml. Certifique-se de que não há bolha na célula de fluxo.
  3. Remova a seringa da saída e injete 1 ml da solução lipossómica (40 μL de caldo de lipossoma da secção 2 e 960 μL de tampão lipídico) três vezes com 5 minutos de incubação após cada injeção.
  4. Para a etapa de cicatrização, lave a célula de fluxo com 2,5 mL de tampão lipídico lentamente e incube no RT por 30 min.
    NOTA: O tempo de cura pode ser maior, se necessário; se aparecerem bolhas, execute a dupla cicatrização repetindo as etapas 5.3 e 5.4 para remover as bolhas.
  5. Preparar 30 mL de tampão de albumina sérica bovina (BSA) (Tris-HCl de 40 mM (pH 7,5), 2 mM de MgCl2, 1 mM de ditiotreitol e 0,5 mg/mL de BSA para passivação superficial). Após 30 minutos de cicatrização, lave a célula de fluxo com 2,5 mL de tampão BSA do lado de saída.
    NOTA: A unidade populacional de BSA é uma solução de 20 mg/ml armazenada a 4 °C e deve ser utilizada no prazo de 1-2 semanas. A concentração de BSA no tampão pode ser ajustada de acordo com a condição da superfície.
  6. Injetar 800 μL de tampão estreptavidina (10 μL de um estoque de estreptavidina de 1 mg/mL, 790 μL de tampão BSA) na célula de fluxo do lado de entrada em duas etapas com 10 minutos de incubação após cada etapa.
    NOTA: A estreptavidina ancora o DNA nos lipídios devido à sua multivalência, fazendo a ponte entre os lipídios biotinilados e o DNA biotinilado.
  7. Lave a célula de fluxo com 2,5 mL de tampão BSA para remover todas as moléculas livres de estreptavidina.
  8. Diluir o ADN Biotina-Lambda com motivos clonados da secção 3 utilizando tampão BSA (2,5 μL de ADN e 998 μL de tampão BSA). Injete DNA Lambda 4 vezes lentamente em intervalos de 5 minutos.
  9. Ligue o microscópio e o sistema científico Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) durante a injeção. Lave a tubulação com 10 mL de ddH 2 O. Lave o prisma e o conector da tubulação com água, limpador de cuvete líquido a2% e etanol a 99%. Prepare o tampão de imagem adicionando KCl e corante de DNA de fita dupla ao tampão BSA para obter concentrações finais de 150 mM e 0,5 nM, respectivamente, e absorva pelo menos 20 mL do tampão de imagem em uma seringa de 30 mL.
  10. Configure a célula de fluxo no estágio do microscópio e conecte-a ao sistema microfluídico.
  11. Use uma taxa de fluxo de 0,03 mL / min para liberar as moléculas de DNA para a barreira por 10 min, incubar por 30 min com o fluxo interrompido e, em seguida, desligá-lo para deixar o DNA se difundir lateralmente.
    NOTA: O objetivo desta incubação de 30 minutos é deixar a molécula de DNA se distribuir mais uniformemente na frente da barreira através de difusão simples, porque as moléculas de DNA tendem a se acumular no lado da barreira que é fechada para a entrada onde elas são liberadas. O tempo de incubação pode ser ajustado conforme necessário.

7. Imagem da formação de condensação EWS-FLI1 em cortinas de DNA

  1. Abra o software de imagem, encontre e marque as posições dos padrões de 3 × 3 em zigue-zague sob campo brilhante.
  2. Ligue o fluxo a 0,2 mL/min para manchar o DNA com o corante de DNA de fita dupla por 10 min.
  3. Diluir mCherry-EWS-FLI1 com o tampão de imagem até à concentração de 100 nM em 100 μL no tubo.
  4. Carregue a amostra de proteína através da válvula com uma seringa de vidro de 100 μL e altere a taxa de fluxo para 0,4 mL/min.
  5. Ligue o laser de 488 nm e faça a pré-varredura de cada região para verificar o estado de distribuição do DNA; selecione a região na qual as moléculas de DNA se distribuem uniformemente. Defina a potência do laser para 10% para o laser de 488 nm e 20% para o laser de 561 nm. Use o medidor de potência para medir a potência real do laser perto do prisma: 4,5 mW para o laser de 488 nm e 16,0 mW para o laser de 561 nm.
  6. Aquisição de imagens
    1. Comece a adquirir imagens em intervalos de 2 s com lasers de 488 nm e 561 nm simultaneamente.
    2. Mude a válvula do modo manual para o modo de injeção para permitir que o tampão de imagem libere a amostra de proteína na célula de fluxo após 60 s.
      NOTA: Este processo levará ~ 30 s, e o campo de visão será coberto com sinais mCherry assim que as proteínas EWS-FLI1 atingirem a célula de fluxo.
    3. Para remover o EWS-FLI1 livre, continue lavando a célula de fluxo com o buffer de imagem por 5 minutos com apenas o laser de 561 nm ligado. Parar o fluxo e incubar a 37 °C durante 10 minutos.
    4. Ligue o fluxo a 0,4 mL/min para deixar o DNA se estender e adquira imagens em intervalos de 2 s entre diferentes quadros para obter dados de alto rendimento da formação de condensado EWS-FLI1.

8. Análise de intensidade para mCherry-EWS-FLI1

  1. Importe os dados como sequências de imagens para o software ImageJ, escolha o puncta em 25× sites GGAA em um quadrado de 8× 8 pixels e salve a imagem no formato .tif.
  2. Calcule a intensidade como a soma da intensidade no quadrado ×8 pixels, incluindo toda a puncta, e remova o plano de fundo subtraindo a intensidade do plano de fundo em uma área do mesmo tamanho perto do quadrado de 8 x 8 pixels.

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Representative Results

O esquema das cortinas de DNA é mostrado na Figura 1A, Figura 1B e Figura 1D. A sequência alvo clonada contendo 25 repetições ininterruptas de GGAA é encontrada no promotor NORB1 no sarcoma de Ewing. Essa sequência-alvo é crucial para o recrutamento do EWS-FLI128. As moléculas EWS-FLI1 foram visualizadas detectando-se os sinais EWS-FLI1 marcados com mCherry obtidos com laser de 561 nm (Figura 1C e Figura 1E). Após a instalação de um experimento de cortinas de DNA, a formação in vitro de condensados biomoleculares de EWS-FLI1 nos sítios GGAA 25× do substrato de DNA pôde ser visualizada diretamente (Figura 1B-E). A especificidade do mCherry-EWS-FLI1 utilizado em Cortinas de DNA foi confirmada por um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética utilizando um molde de DNA contendo 25× GGAA e sem GGAA separadamente (Figura 2A). Além disso, a concentração de EWS-FLI1 foi titulada de 20 nM a 500 nM, e a intensidade da puncta nos sítios de AGGA de 25× foi determinada. Em comparação com a intensidade do mCherry-FLI1DBD, a intensidade do EWS-FLI1 aumentou dramaticamente, enquanto a mudança na intensidade do FLI1DBD foi insignificante quando as proteínas foram saturadas para cobrir os locais de GGAA 25×. Portanto, esses resultados sugerem fortemente que o EWS-FLI1 formou condensados no DNA (Figura 2B-E).

Figure 1
Figura 1: Formação de condensado EWS-FLI1 no DNA Lambda contendo 25× motivos GGAA. (A) Esquema das cortinas de DNA. (B e D) Duas estratégias para detecção de condensados EWS-FLI1 (500 nM) montados no DNA Lambda: (B) Manter a lavagem por 10 min;(D)incubar por 10 min. (C e E) Imagem representativa de fluorescência de reflexão interna total de campo largo de cortinas de DNA: (C) Estratégia de detecção em B; (E) Estratégia de detecção em D. O DNA C (ii) e E (ii) é ampliado para mostrar os pontos distintos formados em um único substrato de DNA. Os substratos de DNA são DNA Lambda com motivos GGAA de 25×. Os números "1, 2, 3, 4" representam diferentes posições de puncta em um DNA Lambda, e "3" é onde a sequência de microssatélites GGAA de 25× foi clonada. Barras de escala = 4,9 μm (C, E (i)) e 0,7 μm (C, E (ii)). Este número foi modificado de 24. Abreviação: dsDNA = DNA de fita dupla. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Eventos de ligação do domínio desanexado de mCherry-EWS-FLI1 em 25× GGAA se repete. (A) (i) mCherry-EWS-FLI1. (ii) O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética de mCherry-EWS-FLI1: dsDNA de 306 pb marcado com Quasar670 de 5' foi incubado com mCherry-EWS-FLI1 em diferentes concentrações sob temperatura ambiente por 30 min em tampão de reação contendo 40 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2, 1 mM de DTT e0,2 mg/mL de albumina sérica bovina. As amostras foram carregadas e executadas em gel de agarose a 1,3% por 25 min, 120 V. (B-D) Imagens de microscopia de fluorescência de reflexão interna total de campo largo de 25× GGAA com cortinas de DNA após incubação com 500 nM mCherry (B), 500 nM mCherry-EWSLCD (C) ou 500 nM mCherry-FLI1DBD (D). (E) Distribuição de intensidade dos sinais EWSFLI1 (ciano) e FLI1DBD (preto) na região do local alvo (25× GGAA) versus concentração de proteínas. Este número foi modificado de 24. Abreviaturas: LCD = domínio de baixa complexidade; DBD = domínio de ligação ao DNA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Como as abordagens de molécula única são extremamente sensíveis ao conteúdo do sistema de reação, um esforço extra deve ser investido para garantir a boa qualidade de todos os materiais e soluções durante os experimentos de cortinas de DNA, especialmente os lipídios preparados nas seções 1 e 2 e os tampões usados na seção 5. Reagentes de maior pureza devem ser usados para preparar tampões, e os tampões devem ser preparados recentemente para o ensaio de molécula única

Quando o EWS-FLI1 marcado com mCherry de 500 nM foi despejado na câmara, vários puncta magenta apareceram no DNA Lambda contendo as sequências GGAA de 25×. Observe que houve uma distribuição inespecífica consecutiva de sinais magenta em todo o DNA, mesmo após 10 minutos de lavagem com tampão em branco (Figura 1B,C). Curiosamente, as moléculas de EWS-FLI1 foram rearranjadas no DNA durante a incubação de 10 minutos sem o fluxo tampão e reunidas em vários puncta (Figura 1D,E). Um desses puncta foi formado no local clonado de 25× GGAA, enquanto todos os outros foram formados nas regiões contendo uma alta densidade de motivos consecutivos do GGAA. Esse fenômeno sugere fortemente que o procedimento de incubação sem fluxo permite que as moléculas EWS-FLI1 pesquisem os loci e se reúnam no DNA mais rapidamente.

Vários experimentos de controle devem ser realizados para esclarecer como esses condensados se formaram nas cortinas de DNA. Purificamos mCherry, mCherry-EWSLCD e mCherry-FLI1DBD e seguimos o mesmo procedimento para injetar essas proteínas na câmara. Nem mCherry (Figura 2B) nem mCherry-EWSLCD (Figura 2C) deixaram sinais no DNA, indicando que o FLI1DBD do EWS-FLI1 era necessário para a interação com o DNA. Para confirmar que a separação de fases ocorreu em cortinas de DNA em concentrações tão baixas de proteína, a concentração de mCherry-EWS-FLI1 foi titulada de 25 nM a 500 nM, e a intensidade de cada puncta em uma molécula de DNA foi determinada no local do clone (Figura 2E). Uma comparação com a intensidade da fusão TF FLI1DBD marcada com mCherry revelou que, embora as intensidades puncta de EWS-FLI1 e FLI1-DBD fossem semelhantes em baixas concentrações de proteína, a intensidade de EWS-FLI1 aumentou dramaticamente, enquanto a de FLI1DBD permaneceu baixa mesmo quando a concentração atingiu 500 nM. Estes resultados sugerem que as moléculas EWS-FLI1 se ligam à sequência GGAA de 25× e se reúnem em um condensado sobre ela através de interações LCD. Um único FLI1DBD pode ligar 2x motivos GGAA, e oligômeros de ordem superior se ligam a sequências de baixa afinidade altamente repetitivas27. O sinal mCherry-FLI1DBD na sequência GGAA de 25× foi de um cluster de proteínas e não de uma molécula de proteína individual. Embora o mCherry-FLI1DBD pudesse se ligar aos sítios GGAA 25×, ele não conseguiu se reunir como um condensado no DNA, confirmando que a interação LCD-LCD era necessária para a separação de fases (Figura 2D,E).

Os métodos de molécula única permitem que os pesquisadores estudem a dinâmica dentro dos condensados do fator de transcrição. O método das cortinas de DNA apresenta algumas vantagens em comparação com outros métodos de molécula única, como transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET)29, imagem de super-resolução 30 e pinça óptica31,32. Primeiro, o método de cortinas de DNA permite a reconstituição da maquinaria de transcrição em DNA genômico longo in vitro e a observação em tempo real da formação de condensado de transcrição com aquisição de dados de alto rendimento. Em segundo lugar, as moléculas de DNA alinhadas permitem o mapeamento da posição dos condensados em cada cadeia de DNA. Assim, as sequências de DNA preferidas para a formação de puncta podem ser facilmente determinadas.

Além disso, a aquisição a longo prazo é viável com cortinas de DNA, permitindo a medição da taxa on-rate (k on) e off-rate (koff) de um punctum . No entanto, as cortinas de DNA têm alguns defeitos técnicos inerentes, exigindo que as evidências de diferentes métodos sejam examinadas coletivamente. Por um lado, a resolução das cortinas de DNA só pode atingir 0,18 μm ou ~1.000 pb porque o longo molde de DNA Lambda tem uma restrição em relação ao limite de difração, o que pode dificultar a diferenciação de dois sinais de fluorescência vizinhos. Por outro lado, o fluxo é usado para estender o DNA de fita dupla (dsDNA), e a força aplicada sobre a biomolécula pode influenciar a propriedade de difusão das proteínas que se ligam ao DNA. Cortinas de DNA duplamente amarradas podem ancorar ambas as extremidades do dsDNA e registrar o movimento de proteínas sem fluxo, o que é uma solução notável33. Para resumir, aprofundar nossa compreensão da montagem dinâmica de condensados biomoleculares no DNA em tempo real lançará luz não apenas sobre o mecanismo biofísico do LLPS, mas também sobre a biologia básica dos processos celulares relacionados ao LLPS, como a regulação da transcrição gênica24.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS488LS
561 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS561LS
Agar Rhawn R003215-50g
biotinylated DOPE Avanti 870273P
Bovine Serum Albumin Sigma A7030
Chloroform Amresco 1595C027
Coating Electra 92 Allresist GmbH AR-PC 5090.02 The conductive protective coating
Deoxyribonuclease I bovine Sigma D5139-2MG
DOPC Avanti 850375P
DTT Sigma D9779
Glass coverslip Fisher Scientific 12-544-7
Hellmanex III Sigma Z805939-1EA
KCl Sigma 60130
Lambda DNA NEB N3013S
Lambda Packing Extracts Epicentre MP5120
MgCl2 Sigma M2670
NaCl Sigma s3014
Nanoport Idex N-333-01
NheI-HF NEB R3131S
Nikon Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
NZCYM Broth Sigma N3643-250G
PEG-2000 DOPE Avanti 880130P-1G
PEG-8000 Amresco 25322-68-3
PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% Allresist GmbH AR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2% Allresist GmbH AR-P 672.02
Prime 95B Scientific CMOS camera PHOTOMETRICS Prime95B
proteinase K NEB P8107S
Silica glass slide G.Finkenbeiner
Six-way injection valve Idex MXP9900-000
Streptavidin Thermo S888 Diluted with ddH2O
Syringe pump Harvard Apparatus Pump11 Elite
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Tris base Sigma T6066
XhoI NEB R0146V
YOYO-1 Iodide (491/509) Invitrogen Y3601 Diluted with DMSO

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Bioquímica Edição 175
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Zuo, L., Ding, J., Qi, Z.… More

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z. Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA. J. Vis. Exp. (175), e62974, doi:10.3791/62974 (2021).

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