Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אופטימיזציה של מודל העכבר לחסימת ורידים ברשתית כדי להגביל את השונות

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62980
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1,3,4
1Department of Pathology & Cell Biology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Department of Neurology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 4The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי לחסימת ורידים ברשתית באמצעות ורד בנגלי ומערכת מיקרוסקופ הדמיית רשתית מונחה לייזר עם המלצות למקסם את יכולת השחזור שלה בזנים מהונדסים גנטית.

Abstract

מודלים עכבריים של חסימת ורידים ברשתית (RVO) משמשים לעתים קרובות ברפואת עיניים לחקר פגיעה היפוקסית-איסכמית ברשתית העצבית. בדו"ח זה, שיטה מפורטת המצביעה על צעדים קריטיים מסופקת עם המלצות לאופטימיזציה כדי להשיג שיעורי חסימה מוצלחים באופן עקבי על פני זני עכברים מהונדסים גנטית שונים. מודל עכבר RVO מורכב בעיקר ממתן תוך ורידי של צבע פוטונסיטייזר ואחריו פוטוקואגולציה בלייזר באמצעות מיקרוסקופ הדמיה רשתית המחובר ללייזר מונחה עיניים. שלושה משתנים זוהו כגורמים הקובעים עקביות חסימה. על ידי התאמת זמן ההמתנה לאחר מתן בנגל ואיזון תפוקת הלייזר הבסיסית והניסויית, ניתן להגביל את השונות בין הניסויים ולהשיג שיעור הצלחה גבוה יותר של חסימות. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מחלות רשתית המאופיינות בצקת רשתית ופגיעה היפוקסית-איסכמית. בנוסף, מכיוון שמודל זה גורם לפגיעה בכלי הדם, ניתן ליישם אותו גם כדי לחקור את כלי הדם העצביים, מוות עצבי ודלקת.

Introduction

חסימת ורידים ברשתית (RVO) היא מחלת כלי דם רשתית נפוצה שהשפיעה על כ -28 מיליון אנשים ברחבי העולם בשנת 20151. RVO מוביל לירידה בראייה ואובדן אצל מבוגרים בגיל העבודה וקשישים, המייצג מחלה מסכנת ראייה מתמשכת המוערכת בעלייה במהלך העשור הקרוב. חלק מהפתולוגיות המובהקות של RVO כוללות פגיעה היפוקסית-איסכמית, בצקת ברשתית, דלקת ואובדן עצבי2. נכון לעכשיו, קו הטיפול הראשון בהפרעה זו הוא באמצעות מתן מעכבי גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF). בעוד טיפול אנטי VEGF עזר לשפר בצקת ברשתית, חולים רבים עדיין מתמודדים עם ירידה בראייה3. כדי להבין עוד יותר את הפתופיזיולוגיה של מחלה זו ולבחון קווי טיפול חדשים פוטנציאליים, יש צורך ליצור פרוטוקול מודל עכבר RVO פונקציונלי ומפורט עבור זני עכברים שונים.

מודלים של עכברים פותחו תוך יישום אותו מכשיר לייזר המשמש בחולים אנושיים, בשילוב עם מערכת הדמיה המותאמת לגודל הנכון עבור עכבר. מודל עכבר זה של RVO דווח לראשונה בשנת 2007 4 והוקם עוד יותר על ידי Ebneter ואחרים 4,5. בסופו של דבר, המודל עבר אופטימיזציה על ידי Fuma et al. כדי לשכפל ביטויים קליניים מרכזיים של RVO כגון בצקת רשתית6. מאז שהמודל דווח לראשונה, מחקרים רבים השתמשו בו באמצעות מתן צבע פוטונסיטייזר ואחריו פוטוקואגולציה של ורידים רשתית מרכזיים באמצעות לייזר. עם זאת, כמות וסוג הצבע המנוהל, עוצמת הלייזר וזמן החשיפה משתנים באופן משמעותי בין מחקרים שהשתמשו בשיטה זו. הבדלים אלה יכולים לעתים קרובות להוביל לשונות מוגברת במודל, מה שמקשה על השכפול. נכון להיום, לא פורסמו מחקרים עם פרטים ספציפיים על אפיקים פוטנציאליים לאופטימיזציה שלה.

דוח זה מציג מתודולוגיה מפורטת של מודל עכבר RVO בזן C57BL/6J וזן caspase-9 אנדותל המושרה בטמוקסיפן (iEC Casp9KO) עם רקע C57BL/6J ורלוונטי לפתולוגיה של RVO כזן ייחוס לעכבר מהונדס גנטית. מחקר קודם הראה כי הפעלה לא אפופטוטית של קספאז-9 אנדותל מעוררת בצקת ברשתית ומקדמת מוות עצבי8. הניסיון בשימוש בזן זה עזר לקבוע ולספק תובנות לגבי שינויים אפשריים כדי להתאים את מודל עכבר RVO, אשר יכול להיות ישים לזנים מהונדסים גנטית אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. ניסויים במכרסמים אושרו ונוטרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קולומביה.

הערה: כל הניסויים השתמשו בעכברים זכרים בני חודשיים ששקלו בערך 20 גרם.

1. הכנה וניהול של טמוקסיפן עבור אבלציה גנטית מושרית של גנים floxed

הערה: קוטר כלי הרשתית יכול להיות מושפע ממשקל החיה. ודא שכל בעלי החיים המשמשים לניסוי הם בעלי משקל דומה.

  1. לדלל טמוקסיפן בשמן תירס לריכוז של 20 מ"ג/מ"ל.
    הערה: טמוקסיפן הוא רעיל והוא רגיש לאור. יש להגן מפני אור, למשל באמצעות רדיד אלומיניום.
  2. מערבל את הפתרון במשך כמה שניות.
  3. משאירים בתנור על 55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    הערה: יש לוודא שהטמוקסיפן התמוסס לחלוטין. ייתכן שיהיה צורך במערבולות נוספות.
  4. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
  5. השתמש מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 26 G להזרקת טמוקסיפן. נקו את אזור ההזרקה עם 70% אתנול.  יש לתת 2 מ"ג טמוקסיפן (100 מיקרוליטר של 20 מ"ג/מ"ל) תוך צפקית (IP) פעם ביום למשך הזמן שנקבע בהתאם לקו Cre המושרה הספציפי.
  6. אפשרו יומיים מנוחה לבעלי החיים לפני תחילת הניסויים.

2. הכנת ריאגנטים לפוטוקואגולציה בלייזר

  1. רוז בנגל
    הערה: ורד בנגל רגיש לאור. יש לאחסן בחושך עד לשימוש ולהכין טרי לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
    1. הכינו ורד בנגלי על ידי דילול ל-5 מ"ג/מ"ל במי מלח סטריליים וסננו אותו דרך מסנן מזרקים של 0.2 מיקרומטר.
    2. הכינו מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 26 גרם עם בנגל ורד.
  2. קטמין/קסילזין
    1. יש לדלל קטמין וקסילזין במי מלח סטריליים בהתאם לריכוזים הבאים: קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג).
  3. קרפרופן
    1. לדלל carprofen ל 1 מ"ג / מ"ל במי מלח סטריליים.
    2. הכן מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 26 G עם carprofen.
  4. מי מלח סטריליים
    1. הכינו מזרק 5 מ"ל מצויד מחט 26 גרם עם מלוחים סטריליים.

3. הגדרת לייזר

  1. טפל בעדינות בכבל הסיב האופטי וחבר אותו לקופסת בקרת הלייזר ולמתאם הלייזר של מיקרוסקופ הדמיית הרשתית.
  2. הפעל את קופסת המנורה של מיקרוסקופ הדמיה ברשתית.
  3. הפעל את המחשב ופתח את תוכנית ההדמיה.
  4. התאם את האיזון הלבן באמצעות פיסת נייר לבן והנחתו לפני פיסת עין העכבר ולחיצה על התאם בתוכנית ההדמיה.
  5. הפעל את תיבת בקרת הלייזר על-ידי סיבוב המקש וביצוע ההוראות שעל המסך של תיבת בקרת הלייזר.
    הערה: הלייזר המשמש בניסוי זה הוא Class 3B ועלול לגרום נזק לעיניים. יש להרכיב משקפי מגן בעת הפעלת הלייזר.
  6. אמת את עוצמת הלייזר הבסיסית.
    1. השתמש במד כוח לייזר.
    2. התאם את המסך של תיבת בקרת הלייזר לפרמטרים הבאים: 50 mW ו- 2,000 ms.
    3. הפעל את הלייזר והנח את מד החשמל מול העינית.
      הערה: ודא שאור המיקרוסקופ כבוי בעת בדיקת עוצמת הלייזר הבסיסית.
    4. לחץ על דוושת המתג כדי להפעיל את הלייזר.
    5. כוון שקריאת עוצמת הלייזר תהיה 13-15 mW.
      הערה: קריאת עוצמת הלייזר תקבע את שיעור ההצלחה של חסימות ורידים ברשתית. אם קריאת עוצמת הלייזר נמוכה מדי, ניתן לבצע התאמות בעוצמה ובזמן של החשיפה ללייזר. ראו טבלה 1 להמלצות.
  7. התאם את עוצמת הלייזר הניסיונית על-ידי הגדרת המסך של תיבת בקרת הלייזר עבור הפרמטרים הבאים: 100 mW, 1,000 ms.
  8. כבה את הלייזר.
    הערה: למען הבטיחות וכדי למנוע התחממות יתר, עדיף להרחיק את הלייזר בין עכברים.

4. הזרקת וריד זנב עכבר של ורד בנגל

  1. יוצקים 300 מ"ל מים לתוך 500 מ"ל.
  2. מחממים את הכד במיקרוגל למשך דקה.
  3. שים גזה במים החמים בכד.
  4. שים את העכבר בריסון.
  5. לחץ את הגזה לתוך זנב העכבר בעדינות ולחפש את הוורידים המורחבים. יש לחטא את אזור ההזרקה באמצעות מגבון אלכוהול לאחר התרחבות המים החמים.
  6. הכנס את המחט לאתר ההזרקה ומשוך את המזרק כדי לוודא שאתה נמצא בווריד. לאחר מכן, להזריק את וריד זנב העכבר, מתן הסכום הנכון על פי משקל החיה (37.5 מ"ג / ק"ג). הפעל לחץ על אתר ההזרקה כדי למנוע המטומה או דימום. מחק את האתר.
  7. שחררו את העכבר מהרסן והחזירו אותו לכלוב.
  8. יש להמתין 8 דקות עד שהוורד הבנגלי יסתובב לפני הזרקת חומרי ההרדמה.
    הערה: זה יספק סך של 10 דקות בין הזרקת ורד בנגל לבין הקרנת לייזר.

5. חסימת ורידים מרכזיים

  1. הפעל את פלטפורמת העכבר המחוממת.
  2. הוסף טיפה אחת של phenylephrine ו tropicamide בכל עין.
  3. הזריקו 150 מיקרוליטר של חומרי הרדמה, קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג) IP.
    הערה: במהלך הליך זה, העכבר קיבל שתי זריקות IP. לפיכך, הצדדים היו לסירוגין. זריקת ה-IP להרדמה ניתנה לרביע הבטן הימני התחתון, והמלח הוזרק לרביע הבטן השמאלי התחתון. מומלץ למשוך את המזרק לפני ההזרקה כדי לוודא שהמחט נמצאת בבטן ולא באיברים.
  4. צבטו את בעל החיים כדי לקבוע את עומק ההרדמה והמתינו עד שהוא לא יגיב.
  5. הוסף טיפה אחת של proparacaine hydrochloride לכל עין (משכך כאבים).
  6. יש להוסיף משחת ג'ל לשתי העיניים.
  7. להזריק 150 μL של carprofen תת עורית בין האוזניים.
  8. התאימו את העכבר לפלטפורמה.
  9. כוונן את הפלטפורמה עד שהתצוגה של פונדוס הרשתית תהיה ברורה וממוקדת.
  10. ספרו את ורידי הרשתית וצלמו את הפונדוס.
    הערה: ורידי הרשתית כהים ורחבים יותר מהעורקים. ורידים ועורקים לסירוגין; עם זאת, לעיתים יכול להיות עורק מסועף קרוב לעצב הראייה, ולכן שני עורקים סמוכים.
  11. הפעל את הלייזר וכוון לכיוון וריד הרשתית במרחק של כ-375 מיקרומטר מהדיסק האופטי.
  12. הקרין את הכלי על ידי לחיצה על מתג הרגל והזזת קרן הלייזר מעט עד 100 מיקרומטר. חזור על שלב זה שלוש פעמים והזז את קרן הלייזר לאחר כל פעימה, כך שהקרינה לא תתמקד בנקודה אחת.
  13. חזור על הקרנה על כלי דם גדולים אחרים כדי להשיג 2-3 חסימות.

6. קביעת מספר הוורידים החסומים ביום 0

  1. כבה את המנורה לאחר הקרנת הכלים והמתן 10 דקות.
    הערה: חשיפה לאור עלולה לגרום נזק לרשתית ולדלקת; כבו את המנורה בזמן ההמתנה כדי למזער את החשיפה7.
  2. הדליקו שוב את המנורה וספרו את מספר הוורידים החסומים.
  3. צלם תמונה של הקרן.

7. טיפול לאחר מכן

  1. להזריק 1 מ"ל של IP מלוחים סטרילי.
    הערה: ראה פרטי הזרקת IP בסעיף 5, שלב 3.
  2. יש להוסיף טיפות עיניים סיכה לשתי העיניים.
  3. יש להוסיף משחת ג'ל לשתי העיניים.
  4. צפו בעכבר כשהוא מתאושש מהרדמה, ואל תחזירו אותו לכלוב עם שאר בעלי החיים עד להחלמה מלאה. Carprofen (5 מ"ג / ק"ג) ניתן לתת מדי יום עד יומיים לאחר ההליך. אם מוחל על בני אדם, כאב אינו סימפטום של RVO.
    הערה: אין להשאיר את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם מתאוששים לחלוטין מההרדמה.

8. הערכה של בצקת ברשתית על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT)

הערה: שלב זה יכול להיעשות בנקודת הזמן של החוקר. שיא בצקת הרשתית עבור עכבר C57BL/6J הוא יום אחד לאחר הליך RVO. נקודת זמן זו עשויה להשתנות בהתאם לרקע של העכבר.

  1. הפעל את תיבת האור של מיקרוסקופ הדמיית הרשתית, את מכשיר ה-OCT ואת פלטפורמת העכבר המחומם.
  2. יום לאחר החסימה, בצע את שלבים 5.2 עד 5.7 כדי להכין את החיה.
  3. פתח את תוכנות ההדמיה וה-OCT.
  4. בתוכנית OCT, התאם את הנדנוד ל- 5.
  5. יש ליטול OCT ב-75 מיקרומטר דיסטלי מהכוויה או 4 לחיצות.
  6. צלם תמונות OCT בארבעה רבעים של הרשתית.
  7. נתח את תמונות OCT באמצעות תוכנת עקיבה.
  8. השווה את עובי הרשתית של אמצעים טרום הקרנה ליום אחד לאחר RVO או בנקודת הזמן של עניין.
    הערה: בעת ניתוח הנתונים, לקחת בחשבון את מספר הוורידים המוקרנים כמו זה יכול להשפיע על התפתחות בצקת ברשתית. לאחר מכן בעלי חיים מורדמים על ידי מתן חומר הרדמה ואחריו ניתוח זילוח שאינו הישרדותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל עכבר RVO שואף להשיג בהצלחה חסימות בוורידי הרשתית, המובילות לפגיעה היפוקסית-איסכמית, התמוטטות מחסום הרשתית בדם, מוות עצבי ובצקת רשתית8. איור 1 מציג ציר זמן של צעדים להבטחת יכולת השחזור, סכמה של תכנון הניסוי, ומתאר שלבים שניתן למטב עוד יותר בהתאם לשאלות הניסוי. שלושת השלבים העיקריים שניתן לשנות הם זמן ההמתנה לאחר מתן בנגל ורד, כוח הלייזר הבסיסי, ואת פלט לייזר ניסיוני. בדו"ח זה, עכברי C57BL/6J, כמו גם WT ו-KO littermates מקו עכבר נוקאאוט של תאי אנדותל מושרים קספאז-9 (iEC Casp9), שימשו כדי לקבוע את ההגדרות האופטימליות בין זנים שונים.

זמן ההמתנה מהזרקת ורד בנגל להקרנת לייזר יכול לשנות את הצלחת פוטוקואגולציה בוורידים. זמן המתנה קצר מדי עלול לגרום לריכוז בנגלי ורדים נמוך בתוך הוורידים, בעוד זמן המתנה ארוך מדי יכול להוביל לפינוי בנגל ורדים ממחזור הדם ברשתית. שני המצבים יכולים להוביל לפוטוקואגולציה לקויה ולחסימות לא מוצלחות. כאשר בחנו את מספר החסימות שהתקבלו מיד לאחר הקרנת לייזר, השוואה בין חיות שעברו לייזר 10 ו-20 דקות לאחר מתן בנגל ורדים גילתה שלא היו הבדלים במספר החסימות שהושגו (איור 2B). עם זאת, מספר החסימות שנמשכו עד יום אחד לאחר RVO ירד באופן משמעותי בבעלי חיים שעברו לייזר 20 דקות לאחר מתן בנגל ללא תלות בגנוטיפ. תוצאה זו מצביעה על כך שכאשר חוקרים פציעה חריפה הנגרמת על ידי RVO, זמן ההמתנה לאחר מתן רוז בנגלי יכול להשפיע על יציבות החסימה. פרפוזיה מוקדמת של ורידים (לפני 24 שעות לאחר הפציעה) עלולה להשפיע על התפתחות בצקת ברשתית ולכן יש לשלוט בה על ידי קביעת זמן ההמתנה הנכון ממתן ורד בנגלי להקרנת לייזר.

באופן עקרוני, פוטוקואגולציה מוצלחת המובילה לחסימה מונעת על ידי כוח לייזר. למרות שזה חלק כל כך חשוב של התהליך, זה גם אחד המקורות הגדולים ביותר של שונות במודל צריך להיות אופטימלי עבור עקביות. כדי להשיג זאת, מומלץ למדוד את תפוקת הלייזר במהלך ההתקנה לפני העכברים מוזרקים עם בנגל ורד. התפוקה המומלצת עבור עוצמת הלייזר הבסיסית היא בין 13.0 ל- 15.0 mW. עוצמת לייזר בסיסית נמוכה, כגון 11.5 mW, ללא שינוי הספק הניסוי (100 mW), לא גרמה לחסימות, כפי שמוצג באיור 3. לעומת זאת, תפוקת לייזר בסיסית של 13.5 mW עם הספק ניסיוני של 100 mW הביאה לחסימות מוצלחות. במקרים בהם תפוקת הלייזר הייתה מתחת ל-13.0 mW, הספק הניסוי הוגדל ל-110 mW כדי להשיג את אותן חסימות מוצלחות כמו עם תפוקת לייזר בסיסית גבוהה יותר. בדרך כלל, 100 mW הוא כוח הניסוי הסטנדרטי; עם זאת, אם תפוקת הלייזר נמוכה מ- 13.0 mW, ניתן לפצות על כך על ידי שינוי עוצמת הניסוי עם הטווחים המומלצים בטבלה 1.

ארבעה סוגים עיקריים של חסימות נצפו להתרחש לאחר פוטוקואגולציה בלייזר של הוורידים. סוגים אלה של חסימות מסוכמים באיור 4A וסווגו לפי כמות זרימת הדם; כלי דם חסומים לחלוטין (ללא זרימת דם), כלי דם חסומים חלקית (חסומים ברובם עם זרימה מזדמנת), רפרפורציה חלקית (זרימת דם יציבה ללא הפרעה עם הפרעה), וכלי דם עם פרפורציה מלאה (ללא חסימה ברורה כלשהי). כדי לחקור אם סוגי החסימות משתנים בהתאם לגנוטיפ ולקבוע את הזמן המושקע בכל מצב חסימה, הוערכו סרטונים של 10 דקות לאחר הקרנת לייזר. הערכה זו סייעה לקבוע כי כלי הדם המוקרנים של עכברי iEC Casp9 מבלים זמן רב יותר במצבים של רפרפולציה חלקית והסתרה חלקית מאשר C57BL6/J, אשר מבלים זמן רב יותר במצבים חסומים לחלוטין (איור 4B).

איור 5 מדגים כיצד מצב החסימה של כלי הדם משתנה במהירות במהלך 10 הדקות הראשונות לאחר פוטוקואגולציה בלייזר. לאחר שחלפו 10 הדקות הראשוניות הללו, החסימות מתייצבות ונשמרות עד לנקודת זמן של 24 שעות. לכן, כדי להעריך את המספר הראשוני המדויק של חסימות לכל עין, מומלץ לחכות 10 דקות לאחר הקרנה. הערכה קודמת של מודל זה קבעה כי רוב החסימות מתפוגגות עד 8 ימים לאחר ההקרנה8; עם זאת, שיעור החסימות החוזרות ביום יכול להשתנות לפי זן ויש לקבוע אותו בכל מודל ניסויי. המודל המוצג כאן הוא של פציעה חריפה ונועד לשמש להבנת מסלולים המובילים לבצקת, המתפתחת תוך 24 שעות לאחר חסימות. מאפיין נוסף של RVO הוא דימומים בצורת להבה, שניתן לצפות בהם 24 שעות לאחר הפציעה, כפי שמתואר באיור 5.

מעקב ב 24 שעות לאחר RVO עשוי לחשוף פתולוגיות אופתלמיות אחרות שיכולות להתרחש כתוצאה משיטת RVO. חלקם כוללים אך אינם מוגבלים לדימום תת-רשתית (המאופיין בטלאי דם רציף), היפרדות רשתית, רשתית איסכמית מלאה (ללא זרימת דם בוורידים ובעורקים) וקטרקט. איור 6 מראה תמונות פונדוס עם OCT תואם כדוגמאות לכך, למעט בעיניים שבהן נוצר קטרקט (איור 6F), מאחר שלא ניתן לבצע OCT בנוכחות קטרקט. איור 6A מראה דוגמאות של איך נראית תמונת פונדוס ו-OCT של עין לא פצועה לצורך התייחסות.

הפתולוגיה המורפולוגית העיקרית של RVO במודל זה היא בצקת רשתית. כדי להעריך את רמת בצקת הרשתית, מומלץ לצלם תמונות OCT לפני יום הליך RVO לקריאה בסיסית ובנקודת העניין בזמן העניין. איור 7 מראה כימות OCT של בצקת רשתית בעיניים פגועות. מדד נוסף המשמש לקביעת מצב השכבות העצביות הוא הערכת חוסר הארגון של שכבות פנימיות הרשתית (DRIL). זהו מדד המשמש בסביבה הקלינית המייצגת אי-זילוח נימי, סימן היכר נוסף של RVO 5,9,10. דוגמה להערכה זו ניתן למצוא באיור 7B. איור 7C מציג דוגמה של תמונת OCT עם התוויות המתאימות לכל שכבת רשתית.

Figure 1
איור 1: ציר הזמן והסכמה של מודל עכבר RVO. (A) ציר הזמן של האירועים ממתן רוז בנגלי להדמיית ורידים סתומים. (B) ייצוג מסכם של השיטה להשגת פוטוקואגולציה מוצלחת של ורידים ברשתית. תיבות אדומות מייצגות שלבים חשובים בתהליך שהם משתנים מאוד ושניתן לייעל אותם לכל דגם עכבר ושאלה מעניינת. (C) ורידים ראשיים ברשתית (V) רחבים וכהים יותר בהשוואה לעורקים (A). כל וריד מרכזי יוקרן בלייזר מונחה של 532 ננומטר, גודל ספוט 50 מיקרומטר, הספק 100 mW, משך 1 שניות, אנרגיה כוללת 0.3 J וחשיפה לקרינה 15278.87 J/cm2, במרחק ממוצע של 375 מיקרומטר מעצבים הראייה. (D) יישום לייזר גורם לבועת אידוי הנראית בהדמיית פונדוס של כ-150 מיקרומטר ומכסה <4% משטח הרשתית הכולל. מספרים מייצגים את המיקום וכיוון התנועה המוצעים (חיצים) של קרן הלייזר בעת הקרנת כלי שיט. קיצורים: A = עורק; V = וריד; ON = עצב הראייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זמן חסימת האור ביחס למתן בנגל ורדים הוא קריטי לפוטוקואגולציה מוצלחת . (A) תמונות רשתית פונדוס של iEC Casp9 WT ו- iEC Casp9 KO מוסתרות בצילום 10 ו -20 דקות לאחר מתן ורד בנגל. עיגולים לבנים מייצגים ורידים שהיו להם חסימות מוצלחות. (B) מספר החסימות מיד לאחר ההקרנה (0 שעות) ויום אחד לאחר ההקרנה למשך 10 דקות ו-20 דקות לאחר הזרקת גנוטיפים משולבים. מבחן t של וולש, פסי שגיאה מציינים SEM. (C) מספר החסימות המופרדות על ידי גנוטיפ. מבחן ANOVA דו-כיווני ומבחן LSD של פישר; קווי שגיאה מציינים SEM. קיצורים: WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; ANOVA = ניתוח שונות; LSD = ההבדל הכי פחות משמעותי; ns = לא משמעותי; P-RVO = חסימת ורידים לאחר הרשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידת תפוקת לייזר בסיסית וניסויית הם שלבים קריטיים לפוטוקואגולציה מוצלחת. תמונות רשתית פונדוס של iEC Casp9 WT ו- iEC Casp9 KO 10 דקות לאחר פוטוקואגולציה; מוסתר בצילום עם רמות פלט לייזר בסיסיות וניסיוניות שונות. ניתן לפצות על תפוקת לייזר בסיסית נמוכה באמצעות פלט לייזר ניסיוני (12.8 mW, 110 mW). עיגולים לבנים מייצגים ורידים שהיו להם חסימות מוצלחות. קיצורים: WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שיטת RVO גורמת לסוגים שונים של חסימות. (A) תמונות רשתית פונדוס של C57BL/6J, iEC Casp9 WT ו-iEC Casp9 KO 10 דקות לאחר פוטוקואגולציה עם סוגים שונים של חסימות: חסימה מלאה, חסימה חלקית, פרפורציה חלקית וreperfused מלא. כניסות מראות מבט ממוקד על וריד שהביא לסוג מסוים של חסימה לאחר פוטוקואגולציה. (B) כימות אחוז הוורידים החסומים במצבי החסימה השונים עבור כל גנוטיפ במהלך 10 הדקות הראשונות לאחר ההקרנה. סרטונים בני עשר דקות הוערכו על ידי שני חוקרים, עיוורים לגנוטיפים, שהקצו מספרים למצבי החסימה השונים (מוסתרים לחלוטין (-2), חסומים חלקית (-1), משוחזרים במלואם (2) ומשוחזרים חלקית (1)) לכל משך. קיצורים: RVO = חסימת ורידים ברשתית; WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ציר הזמן של חסימות לאחר RVO. תמונות רשתית Fundus של C57BL/6J, iEC Casp9 WT ו- iEC Casp9 KO 0, 5 דקות, 10 דקות ו- 24 שעות לאחר הקרנת לייזר. 10 הדקות הראשונות הן קריטיות למצב החסימות ועשויות להשתנות במהירות. לאחר 10 הדקות הראשונות, החסימות יציבות עד 24 שעות לפחות. עיגולים לבנים מייצגים ורידים שהיו להם חסימות מוצלחות, וראשי חץ צהובים מתארים דימומים בצורת להבה. קיצורים: RVO = חסימת ורידים ברשתית; WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: פתולוגיות אופתלמיות שונות עלולות להתרחש לאחר RVO. (A-E) הצג תמונות רשתית פונדוס ו- OCT. (A) דוגמה לעין לא פגועה שלא עברה את תהליך RVO. (B) דימום תת-רשתית המראה דם דולף מכלי הדם בתמונת הפונדוס. (C) היפרדות הרשתית הנראית על ידי הקפל המטושטש בפונדוס והרמת הרשתית ב- OCT. (D) בצקת מוגזמת המתבטאת בכמות גדולה של נפיחות ב- OCT. (E) עין איסכמית מלאה עם זרימת דם לקויה לחלוטין וכתוצאה מכך רשתית לבנה. (F) שתי דוגמאות שונות לעין קטרקט שבה לא ניתן היה להשיג תמונת פונדוס ברורה ו-OCT. פסי קנה מידה OCT: 100 מיקרומטר. קיצורים: RVO = חסימת ורידים ברשתית; OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: כימות תמונות OCT. (A) בדיקת עובי השכבה וה-DRIL בעיניים ובעיניי בקרה ללא לייזר שעברו את הליך RVO. מדידות GCL, IPL, INL, OPL, ONL, מקטע חיצוני ורשתית שלמה. סטטיסטיקה, ערכי p של מבחן מאן-ויטני: GCL: 0.0070, IPL: 0.0205, INL: <0.0001, OPL: 0.0014, ONL: 0.5582, קטע חיצוני: 0.44852, רשתית שלמה: 0.0019. קווי שגיאה מציגים SEM. (B) כימות DRIL נמדד מתמונות OCT מפקדים ללא לייזר ומעכברי RVO WT ו-KO iEC Casp9 וכן מעכברי c57/BL6J עם RVO. קווי שגיאה מציגים SEM. (C) OCT לדוגמה עם התוויות של כל שכבת רשתית. קיצורים: DRIL = חוסר ארגון של שכבות הרשתית הפנימיות; RVO = חסימת ורידים ברשתית; WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט; GCL = שכבת תא גנגליון ; IPL = שכבת פרספקס פנימית; INL = שכבה גרעינית פנימית; OPL = שכבת פרספקס חיצונית; ONL = שכבה גרעינית חיצונית; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית; ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פלט לייזר בסיסי (mW) פלט לייזר ניסיוני מומלץ (mW) חשיפה מומלצת לזמן (ms)
<11.0 או >15.0 כבה את הלייזר וכוונן את הסיב בקצה המחובר לקופסת בקרת הלייזר. פתח את הברגתו והזז אותו מעט ימינה או שמאלה. מדוד שוב את התוצאה, עד שהיא מגיעה לערך גבוה או נמוך יותר.
11.0-12.0 120 1,000
12.0-13.0 110 1,000
13.0-14.0 100 1,000
14.0-15.0 100 1,000

טבלה 1: ניתן לפצות על תפוקת לייזר בסיסית נמוכה באמצעות תפוקת לייזר ניסיונית גבוהה יותר. שינויים בתפוקת הלייזר הבסיסית ובתפוקת הלייזר הניסיונית המומלצת ובזמן החשיפה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל RVO העכבר מספק דרך להבין עוד יותר פתולוגיה RVO ולבחון טיפולים פוטנציאליים. בעוד מודל RVO העכבר נמצא בשימוש נרחב בתחום, יש צורך בפרוטוקול מפורט עדכני של המודל המתייחס לשונות שלו ומתאר את האופטימיזציה של המודל. כאן, אנו מספקים מדריך עם דוגמאות מניסיון על מה שניתן לשנות כדי לקבל את התוצאות העקביות ביותר על פני קבוצה של חיות ניסוי ולספק נתונים מהימנים.

שני המרכיבים החיוניים ביותר של מודל עכבר RVO הם פלט לייזר והזרקה תוך ורידית מוצלחת של צבע photoensitizer. כדי לייצר את הכוח הדרוש כדי לגרום לקרישה כאשר הלייזר מכוון לווריד מסוים, פלט הלייזר צריך להיות מותאם כראוי. בעוד שניתן להשיג זאת באמצעות הטכניקות המוצעות בשיטה, חשוב לקחת בחשבון את ההבדלים במערך המערכת של כל מעבדה. וריאציות של כבל הסיב האופטי וכיצד הוא מותאם ביחס לציוד ולטמפרטורת החדר הם חלק מהמשתנים שיכולים להסביר תפוקת לייזר נמוכה. מומלץ לבצע כוונונים עצמאיים להגדרת המערכת כדי להגדיל את תפוקת הלייזר.

עם זאת, מאמץ זה אינו ניתן להפעלה ללא טכניקת וריד זנב מתאימה כדי לספק את צבע photoensitizer. זריקות ורידים זנב יכול להיות קשה להשיג, וזה מיומנות שלוקח זמן לפתח. זריקות גרועות יכולות לגרום ללא חסימות; במקרה זה, ורד בנגל יכול להיות מנוהל באמצעות IP. מתן רוז בנגלי באמצעות IP שימש למדל RVO אך עם זמן הקרנת לייזר ארוך יותר (3 שניות) וריכוז בנגלי ורד גבוה יותר (40 מ"ג / מ"ל)11. כדי להגביל הקרנת לייזר ממושכת ולהתמקד באופן ספציפי בכלי הדם, וריד הזנב הוא אופן הניהול המועדף.

מודל זה יכול להתבצע גם באמצעות צבעים פוטואקטיביים אחרים כגון Y eosin ונתרן fluorescein12,13,14, אם כי ורד בנגל הוא הצבע הנפוץ ביותר photoactivatable 4,5,6,8. כל הצבעים הוכחו כמייצרים מאפיינים מוקדמים של מחלה קלינית כגון דימום ברשתית ובצקת רשתית15. צבעים פוטואקטיביים הוכחו כבעלי השפעות שליליות על בעלי החיים, ולכן הראו רעילות מערכת לא משמעותית15,16. כמו כן יש לציין כי הצבע שנבחר צריך להיות בעל מקסימום ספיגה התואם את אורך הגל של הלייזר המשמש. רוז בנגל יש עירור ב 525 ננומטר17, נתרן fluorescein ב 475-490 ננומטר 18, ו Y eosin ב 490 ננומטר19.

המקורות העיקריים לשונות במודל זה הם זמן חסימת האור ביחס למתן רוז בנגלי ופלט הלייזר הבסיסי והניסיוני. בעוד איור 2 מראה נקודות זמן של 10 ו-20 דקות לחסימת תמונות, מספר קטן של ניסויים בני 5 ו-15 דקות בוצעו גם כן (הנתונים לא הוצגו), והניבו חסימות שלא היו עקביות כמו נקודת הזמן של 10 דקות. לכן, 10 דקות נבחר להיות זמן ההמתנה האופטימלי בין מתן בנגל ורדים לבין חסימת פוטו בשיטה זו. עם זאת, מחקרים דיווחו כי RVO יכול גם להיות מושרה כבר 3 דקות לאחר הממשל של ורד בנגל5. דרך נוספת לקבוע את זמן ההמתנה האופטימלי הספציפי לזן עכבר מבנגל ורד לחסימת אור היא לנטר את הריכוז היחסי של ורד בנגלי באמצעות מצב הדמיה פלואורסצנטית עם מסנן טטרמתילרודאמין (TRITC). עם זאת, ניתן לבצע את הפרוטוקול המתואר כאן באמצעות מיקרוסקופ הדמיה רשתית שאין להם מסנן TRITC.

מקור נוסף לשונות גבוהה במודל זה הוא פלט הלייזר הבסיסי. מכיוון שהרמות היומיומיות של תפוקת הלייזר הבסיסית יכולות להיות שונות בתכלית, חשוב להעריך את הרמות לפני כל ניסוי. סטנדרטיזציה של פלט הלייזר הבסיסי בין מחקרים יכולה לעזור להגביר ולהרחיב את השימוש במודל עכבר RVO. התאמה מחדש של כבל הסיבים יכולה להספיק כדי לשנות את רמות הבסיס; עם זאת, אם לא ניתן להגיע למדידה של 13.0 mW, טבלה 1 מספקת מדריך לפיצוי באמצעות כוח הניסוי. חשוב לציין כי מכיוון שהרשתית היא מערכת סגורה, קביעת שבר הוורידים החסומים (מספר הוורידים החסומים חלקי מספר הוורידים המוקרנים) חיונית להבנה, בקרה וחיזוי חומרת הנזק במודל RVO. ניתוח קודם של קריאות פגומות (DRIL ועובי הרשתית) נמצא בקורלציה לשבר הוורידים שנחסם וחזה ניוון רשתית ב-8 ימים לאחר RVO8. לפיכך, יש לשקול ולהעריך את חלק הוורידים החבויים. עדיין לא ברור כיצד מצבי חסימה בינוניים אחרים, כגון reperfused חלקית, חסימה חלקית, או ורידים שהיו פעם חסומים ו reperfused על ידי 10 דקות, לתרום להתפתחות של בצקת רשתית וניוון.

מחקרים נוספים על העיניים עם סוגים אלה של חסימות יכולים לעזור לחקור אם חסימה מתמשכת נחוצה לנזק משמעותי או אם אפילו חסימות חולפות חשובות במודל זה. בהתאם לשאלת הניסוי שנשאלה, שיעורי חסימה שונים יהיו אופטימליים. שיעור חסימה של 40-50% הוא אידיאלי ברוב המקרים, כלומר שתיים או שלוש חסימות בעין עם שישה ורידים. זה מבטיח פגיעה משמעותית, אך הרשתית שלמה וניתן לנתח אותה לצורך ניתוחים אימונוהיסטוכימיים וביוכימיים.

כדי לקבוע זאת, הבחנה בין ההשקפה הפתולוגית של חסימה מוצלחת ומייצגת של חתימת RVO רלוונטית. החסימה הטבעית המוצגת על ידי RVO כוללת דימומים בצורת להבה 20 (לא להתבלבל עם דימום תת רשתית), אשר ניתן לראות במודל זה24 שעות לאחר פציעה. מודל RVO יכול גם להוביל לפגיעות רשתית לא רצויות (שאינן ייחודיות לפתולוגיה של RVO) כמו אלה שמוצגות באיור 6B-F, אם הפרמטרים שלו אינם מבוקרים בזהירות. גישה שניתן לנקוט כדי למנוע אלה, מלבד ויסות הריכוז של בנגל ורדים ואת כוח לייזר ניסיוני, היא להפסיק להקרין את כלי שיש להם היווצרות ברורה של פקקת לאחר ההקרנה הראשונה או השנייה.

גורמים נוספים שיש לקחת בחשבון בעת שימוש במודל זה ולהחליט אילו ורידים להסתיר הם זן העכבר וקוטר כלי הדם. זני עכברים מסוימים, כגון BALB/c, הידוע ביותר בשם לבקנים, רגישים לנזקי אור21. בנוסף, יש להם ליקויים התפתחותיים ברשתית המובילים לפגמים בכיאזמה האופטית וחדות הראייה22,23. מומלץ להעריך באופן מלא את שלמות הרשתית וכלי הדם הבסיסיים של בקרות שלא נפגעו עבור זן העכבר שנבחר למחקרי RVO. מחקרים הראו כי רוחב הוורידים יכול להפריע להתפתחות בצקת רשתית ופתולוגיה של מחלות24. לכן, בעלי חיים בעלי משקל דומה יש להשתמש כדי למנוע שונות נוספת. גורמי ההדרה באילו עיניים להשתמש במחקר יהיו תלויים גם בשאלת הניסוי. זה יכול להיות חכם לכלול כל עין שהייתה פעם חסומה, גם אם היא מחוררת בנקודת זמן המעקב לאיתות. עם זאת, אם חסימות יציבות רצויות, עיניים אלה יישללו. איור 6 מציג דוגמאות לקריטריוני אי-הכללה אפשריים או עיניים שיכולות לשמש לניתוח פתולוגי.

כדי להראות שהגדרות לייזר אלה לא גרמו נזק וההשפעות שנצפו באמת הונעו על ידי החסימות עצמן, בקרות דמה נעשו במחקרים קודמים8. עכברי הדמה עדיין קיבלו זריקת וריד זנב של ורד בנגל אך הוקרנו בחלל הפרנכימלי בין כלי הדם העיקריים במקום להיות מוקרנים על הווריד. זה היה צעד חשוב להבטיח שהמודל ישכפל פציעות RVO שנצפו בחולים במקום פשוט לפצוע רקמות בלייזר. בבומים אלה לא נראתה הפעלה של קספאז-9 או -7 או כל בצקת שנצפתה בעכברים שקיבלו הקרנת לייזר רגילה לכלי הדם, מה שמצביע על כך שללייזר לא היו תופעות לוואי. קיום בקרות אלה הוא חיוני, במיוחד אם הגדרות לייזר גבוהות יותר ישמשו כדי להבטיח כי הפציעה המדוללת היא ייצוג מדויק של הנזק הרצוי8.

מודל עכבר RVO יכול להיות מיושם כדי לחקור מחלות אחרות הנובעות מפציעות היפוקסיות-איסכמיות ברשתית ובמוח כגון רטינופתיה סוכרתית, רטינופתיה של פגות ושבץ. בנוסף, הוא יכול לשמש כמודל שבו ניתן לחקור מסלולי איתות רלוונטיים להתפתחות פגיעה בכלי הדם ולבחון טיפולים פוטנציאליים המשפרים ניוון עצבי במערכת העצבים המרכזית. האופטימיזציה המותאמת בדו"ח זה יכולה להגביל את השונות במודל RVO העכבר ולשפוך אור על הפתופיזיולוגיה של RVO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מלגות המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (ל- CCO), המכון הלאומי לעיניים (NEI) 5T32EY013933 (ל- AMP) והמכון הלאומי להזדקנות (NIA) R21AG063012 (ל- CMT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carprofen Rimadyl NADA #141-199 keep at 4 °C
Corn Oil Sigma-Aldrich C8267
Fiber Patch Cable Thor Labs M14L02
GenTeal Alcon 00658 06401
Ketamine Hydrochloride Henry Schein NDC: 11695-0702-1
Lasercheck Coherent 1098293
Phenylephrine Akorn NDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV with Meridian,  StreamPix, and OCT modules Phoenix Technology Group
Proparacaine Hydrochloride Akorn NDC: 17478-263-12 keep at 4 °C
Refresh Allergan 94170
Rose Bengal Sigma-Aldrich 330000-5G
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-5G light-sensitive
Tropicamide Akorn NDC: 174478-102-12
Xylazine Akorn NDCL 59399-110-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
  2. Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
  3. Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
  4. Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
  5. Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
  6. Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
  7. Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
  8. Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
  9. Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
  10. Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
  11. Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
  12. Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338 (2018).
  13. Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
  14. Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
  15. Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W. Animal models of retinal vein occlusion. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (14), 6175-6192 (2017).
  16. Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560 (2019).
  17. Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
  18. Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
  19. Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
  20. MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
  21. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  22. LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
  23. Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
  24. Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J. Albinism. Survey of Ophthalmology. 30 (2), 75-101 (1985).
  25. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).

Tags

מדעי המוח גיליון 174
אופטימיזציה של מודל העכבר לחסימת ורידים ברשתית כדי להגביל את השונות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colón Ortiz, C., Potenski, A.,… More

Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability. J. Vis. Exp. (174), e62980, doi:10.3791/62980 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter