Summary
여기에서는 장미 벵골을 사용한 망막 정맥 폐색에 최적화된 프로토콜과 유전자 변형 균주에서 재현성을 극대화하기 위한 권장 사항과 함께 레이저 유도 망막 영상 현미경 시스템에 대해 설명합니다.
Abstract
망막 정맥 폐색 (RVO)의 마우스 모델은 종종 신경 망막의 저산소 성 허혈성 손상을 연구하기 위해 안과에서 사용됩니다. 이 보고서에서는 다양한 유전자 변형 마우스 균주에서 일관되게 성공적인 폐색률을 달성하기 위한 최적화 권장 사항과 함께 중요한 단계를 지적하는 자세한 방법이 제공됩니다. RVO 마우스 모델은 주로 감광제 염료를 정맥 투여 한 후 안과 유도 레이저에 부착 된 망막 영상 현미경을 사용한 레이저 광 응고로 구성됩니다. 폐색 일관성의 결정 요인으로 세 가지 변수가 확인되었습니다. 장미 벵갈 투여 후 대기 시간을 조정하고 기준선과 실험 레이저 출력의 균형을 맞추면 실험 전반에 걸친 변동성을 제한하고 교합 성공률을 높일 수 있습니다. 이 방법은 망막 부종 및 저산소 성 허혈성 손상을 특징으로하는 망막 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 모델은 혈관 손상을 유발하므로 신경 혈관계, 신경 세포 사멸 및 염증을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다.
Introduction
망막 정맥 폐색(RVO)은 2015년에 전 세계적으로 약 2,800만 명에게 영향을 미친 일반적인 망막 혈관 질환입니다1. RVO는 근로 연령 성인과 노인의 시력 저하 및 상실로 이어지며, 이는 가까운 10년 동안 증가할 것으로 추정되는 지속적인 시력 위협 질병을 나타냅니다. RVO의 뚜렷한 병리 중 일부는 저산소 성 허혈성 손상, 망막 부종, 염증 및 신경 손실2을 포함합니다. 현재이 장애에 대한 치료의 첫 번째 라인은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제의 투여를 통한 것입니다. 항 -VEGF 치료가 망막 부종을 개선하는 데 도움이되었지만 많은 환자들이 여전히 시력 저하에 직면 해 있습니다3. 이 질환의 병태생리학을 더 이해하고 잠재적인 새로운 치료 라인을 테스트하기 위해, 상이한 마우스 균주에 대한 기능적이고 상세한 RVO 마우스 모델 프로토콜을 구성할 필요가 있다.
마우스 모델은 인간 환자에게 사용되는 것과 동일한 레이저 장치를 구현하여 개발되었으며, 마우스에 적합한 크기로 조정된 이미징 시스템과 쌍을 이룹니다. RVO의이 마우스 모델은 20074 년에 처음보고되었으며 Ebneter 및 기타 4,5에 의해 추가로 확립되었습니다. 결국, 이 모델은 망막 부종6과 같은 RVO의 주요 임상 증상을 복제하기 위해 Fuma et al.에 의해 최적화되었습니다. 이 모델이 처음보고 된 이래로, 많은 연구에서 광감작제 염료를 투여 한 후 레이저로 주요 망막 정맥의 광 응고를 사용하여이를 사용했습니다. 그러나 투여되는 염료의 양과 유형, 레이저 출력 및 노출 시간은이 방법을 사용한 연구에 따라 크게 다릅니다. 이러한 차이로 인해 모형의 변동성이 증가하여 복제가 어려워지는 경우가 많습니다. 현재까지 최적화를위한 잠재적 인 방법에 대한 구체적인 세부 정보가 포함 된 발표 된 연구는 없습니다.
이 보고서는 C57BL/6J 배경과 유전자 변형 마우스의 기준 균주로서 RVO 병리학과 관련이 있는 C57BL/6J 균주 및 타목시펜 유도성 내피 카스파제-9 녹아웃(iEC Casp9KO) 균주에서 RVO 마우스 모델의 자세한 방법론을 제시합니다. 이전 연구에 따르면 내피 카스파제-9의 비세포사멸 활성화는 망막 부종을 유발하고신경 세포 사멸을 촉진합니다8. 이 균주를 사용한 경험은 다른 유전자 변형 균주에 적용할 수 있는 RVO 마우스 모델을 맞춤화하기 위한 잠재적인 수정에 대한 통찰력을 결정하고 제공하는 데 도움이 되었습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서를 따릅니다. 설치류 실험은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 모니터링되었습니다.
참고: 모든 실험은 무게가 약 20g인 2개월 된 수컷 마우스를 사용했습니다.
1. 플록스드 유전자의 유도성 유전자 절제를 위한 타목시펜의 제조 및 투여
알림: 망막 혈관 직경은 동물의 무게에 영향을받을 수 있습니다. 실험에 사용 된 모든 동물의 무게가 비슷한지 확인하십시오.
- 옥수수 기름에 타목시펜을 20mg/mL의 농도로 희석합니다.
알림: 타목시펜은 독성 물질이며 빛에 민감합니다. 빛으로부터 보호하십시오(예: 알루미늄 호일). - 몇 초 동안 솔루션을 소용돌이치십시오.
- 55°C의 오븐에 15분 동안 그대로 둡니다.
알림: 타목시펜이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 추가 소용돌이가 필요할 수 있습니다. - 용액을 4 ° C에서 최대 1 주일 동안 보관하십시오.
- 타목시펜 주사에는 1G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 사용하십시오. 70 % 에탄올로 주사 부위를 청소하십시오. 특정 유도성 Cre 라인에 따라 정해진 시간 동안 1일 1회 2mg의 타목시펜(20mg/mL 중 100μL)을 복강내(IP)로 투여합니다.
- 실험을 시작하기 전에 동물에게 이틀간의 휴식을 허용하십시오.
2. 레이저 광응고용 시약의 제조
- 로즈 벵골
참고: 로즈 벵골은 빛에 민감합니다. 사용할 때까지 어두운 곳에 보관하고 최상의 결과를 위해 신선하게 준비하십시오.- 로즈 벵골을 멸균 식염수에 5mg/mL로 희석하여 준비하고 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
- 장미 벵골이 있는 1G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 준비합니다.
- 케타민/자일라진
- 케타민과 자일라진을 멸균 식염수에 따라 다음 농도로 희석하십시오: 케타민(80-100mg/kg) 및 자일라진(5-10mg/kg).
- 카프로 펜
- 멸균 식염수에서 카프로펜을 1mg/mL로 희석합니다.
- 카프로펜이 있는 1G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 준비합니다.
- 멸균 식염수
- 멸균 식염수가 있는 5G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 준비합니다.
3. 레이저 설정
- 광섬유 케이블을 부드럽게 다루고 레이저 컨트롤 박스와 망막 영상 현미경의 레이저 어댑터에 연결합니다.
- 망막 영상 현미경 램프 상자를 켭니다.
- 컴퓨터를 켜고 이미징 프로그램을 엽니다.
- 화이트 페이퍼를 사용하여 마우스 아이피스 앞에 놓고 이미징 프로그램에서 조정을 클릭하여 화이트 밸런스를 조정합니다.
- 키를 돌리고 레이저 컨트롤 박스 화면의 지시에 따라 레이저 컨트롤 박스를 켭니다.
알림: 이 실험에 사용된 레이저는 클래스 3B이며 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 레이저를 작동할 때는 보호용 고글을 착용하십시오. - 기준 레이저 출력을 확인합니다.
- 레이저 파워 미터를 사용하십시오.
- 레이저 컨트롤 박스의 화면을 50mW 및 2,000ms 매개 변수로 조정합니다.
- 레이저를 켜고 파워 미터를 접안 렌즈 앞에 놓습니다.
알림: 기준 레이저 출력을 테스트하는 동안 현미경 표시등이 꺼져 있는지 확인하십시오. - 풋스위치 페달을 밟아 레이저를 활성화합니다.
- 레이저 출력 판독값을 13-15mW로 목표로 합니다.
알림: 레이저 파워 판독값은 망막 정맥 폐색의 성공률을 결정합니다. 레이저 출력 판독값이 너무 낮으면 레이저 노출의 출력과 시간을 조정할 수 있습니다. 권장 사항은 표 1 을 참조하십시오.
- 레이저 컨트롤 박스의 화면을 100mW, 1,000ms 매개변수로 설정하여 실험용 레이저 출력을 조정합니다.
- 레이저를 끕니다.
알림: 안전과 과열을 방지하려면 마우스 사이에 레이저를 끄는 것이 가장 좋습니다.
4. 장미 벵골의 마우스 꼬리 정맥 주사
- 500mL 비커에 물 300mL를 붓습니다.
- 전자 레인지에서 비커를 1 분 동안 따뜻하게합니다.
- 비커의 따뜻한 물에 거즈를 넣으십시오.
- 마우스를 구속기에 넣으십시오.
- 거즈를 마우스 꼬리에 부드럽게 누르고 확장 된 정맥을 찾으십시오. 따뜻한 물 팽창 후 알코올 닦아를 사용하여 주사 부위를 소독하십시오.
- 주사 부위에 바늘을 삽입하고 주사기를 당겨 정맥에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 마우스 꼬리 정맥을 주사하여 동물의 무게에 따라 정확한 양 (37.5 mg / kg)을 투여합니다. 혈종이나 출혈을 피하기 위해 주사 부위에 압력을 가하십시오. 사이트를 닦습니다.
- 구속기에서 마우스를 풀고 케이지로 되돌립니다.
- 마취제를 주사하기 전에 장미 벵골이 순환할 때까지 8분 동안 기다립니다.
알림: 이것은 장미 벵골 주사와 레이저 조사 사이에 총 10 분을 제공합니다.
5. 주요 정맥의 폐색
- 가열된 마우스 플랫폼을 켭니다.
- 각 눈에 페닐에 프린과 트로피 아미드 한 방울을 넣으십시오.
- 150 μL의 마취제, 케타민 (80-100 mg / kg) 및 자일 라진 (5-10 mg / kg) IP를 주사하십시오.
참고: 이 절차 중에 마우스에 두 번의 IP 주입이 제공되었습니다. 따라서 측면이 번갈아 가며 사용되었습니다. 마취를 위한 IP 주사는 우측 하복부 사분면에 투여하였고, 식염수는 좌측 하복부 사분면에 주입하였다. 주사하기 전에 주사기를 당기는 것이 바늘이 장기가 아닌 복부에 있는지 확인하는 것이 좋습니다. - 동물을 발가락으로 꼬집어 마취 깊이를 결정하고 반응이 없을 때까지 기다리십시오.
- 눈 당 프로 파라카인 염산염 한 방울 (진통제)을 첨가하십시오.
- 양쪽 눈에 젤 연고를 첨가하십시오.
- 150 μL의 카프로펜을 귀 사이에 피하 주사합니다.
- 플랫폼에 마우스를 수용하십시오.
- 망막 안저의 시야가 명확하고 초점이 맞춰질 때까지 플랫폼을 조정하십시오.
- 망막 정맥을 세고 안저의 이미지를 찍습니다.
참고: 망막 정맥은 동맥보다 어둡고 넓습니다. 정맥과 동맥이 번갈아 나타납니다. 그러나 때로는 시신경 가까이에 분지 동맥이있을 수 있으므로 두 개의 인접한 동맥이있을 수 있습니다. - 레이저를 켜고 시신경 디스크에서 약 375μm의 망막 정맥을 조준합니다.
- 풋 스위치를 누르고 레이저 빔을 최대 100μm까지 약간 움직여 용기를 조사하십시오. 이 단계를 세 번 반복하고 각 펄스 후에 레이저 빔을 움직여 조사가 한 지점에 집중되지 않도록합니다.
- 다른 주요 혈관에 조사를 반복하여 2-3 개의 폐색을 달성합니다.
6. 0 일에 폐색 된 정맥 수 설정
- 용기를 조사한 후 램프를 끄고 10 분 동안 기다리십시오.
알림: 빛에 노출되면 망막 손상과 염증이 발생할 수 있습니다. 노출을 최소화하기 위해 대기 시간 동안 램프를 끄십시오7. - 램프를 다시 켜고 폐색 된 정맥의 수를 세십시오.
- 안저의 이미지를 찍습니다.
7. 애프터 케어
- 1mL의 멸균 식염수 IP를 주입합니다.
노트: 섹션 5, 3단계에서 IP 주입 세부 정보를 참조하십시오. - 양쪽 눈에 윤활제 점안액을 첨가하십시오.
- 양쪽 눈에 젤 연고를 첨가하십시오.
- 마우스가 마취에서 회복되는 것을 지켜보고 완전히 회복 될 때까지 다른 동물과 함께 새장으로 돌려 보내지 마십시오. 카프로펜(5mg/kg)은 시술 후 최대 2일까지 매일 투여할 수 있습니다. 사람에게 적용하면 통증은 RVO의 증상이 아닙니다.
알림: 마취에서 완전히 회복 될 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
8. 광간섭단층촬영(OCT)에 의한 망막부종 평가
참고: 이 단계는 조사자의 관심 시점에서 수행할 수 있습니다. C57BL/6J 마우스의 망막 부종 피크는 RVO 시술 후 1일입니다. 이 시점은 마우스의 배경에 따라 달라질 수 있습니다.
- 망막 영상 현미경 라이트 박스, OCT 기계 및 가열된 마우스 플랫폼을 켭니다.
- 폐색 다음 날, 동물을 준비하기 위해 5.2에서 5.7 단계를 따르십시오.
- 이미징 및 OCT 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
- OCT 프로그램에서 넛지를 5로 조정합니다.
- 화상에서 75 μm 원위 또는 4 번의 클릭으로 OCT를 취하십시오.
- 망막의 4 사분면에서 OCT 이미지를 촬영합니다.
- 추적 소프트웨어를 사용하여 OCT 이미지를 분석합니다.
- 사전 조사 된 측정의 망막 두께를 RVO 후 1 일 또는 관심 시점과 비교하십시오.
알림: 데이터를 분석할 때 망막 부종의 발병에 영향을 줄 수 있으므로 조사된 정맥의 수를 고려하십시오. 이어서, 동물은 마취제를 투여한 후 관류 비생존 수술에 의해 안락사된다.
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Representative Results
RVO 마우스 모델은 망막 정맥의 폐색을 성공적으로 달성하여 저산소 허혈성 손상, 혈액 망막 장벽 파괴, 신경 세포 사멸 및 망막 부종8을 유발하는 것을 목표로 합니다. 그림 1 은 재현성을 보장하기 위한 단계의 타임라인, 실험 설계의 개략도를 보여주고 실험 질문에 따라 추가로 최적화할 수 있는 단계를 간략하게 설명합니다. 수정할 수있는 세 가지 주요 단계는 장미 벵갈 투여 후 대기 시간, 기준 레이저 출력 및 실험용 레이저 출력입니다. 이 보고서에서는 C57BL/6J 마우스와 유도성 내피 세포 카스파제-9 녹아웃 마우스 라인(iEC Casp9)의 WT 및 KO 배지를 사용하여 다양한 균주에서 최적의 설정을 결정했습니다.
장미 벵골 주사에서 레이저 조사까지의 대기 시간은 정맥에서 광응고의 성공을 바꿀 수 있습니다. 대기 시간이 너무 짧으면 정맥 내 장미 벵골 농도가 낮아질 수 있지만 대기 시간이 너무 길면 장미 벵골이 망막 순환에서 제거될 수 있습니다. 두 상황 모두 광 응고가 불량하고 교합에 실패 할 수 있습니다. 레이저 조사 직후에 얻은 폐색 횟수를 테스트 할 때, 장미 벵골 투여 후 10 분과 20 분 후에 레이저로 촬영 된 동물을 비교하면 달성 된 폐색 수에 차이가 없음을 알 수있었습니다 (그림 2B). 그러나 RVO 후 1 일까지 지속 된 폐색 횟수는 유전자형과 독립적으로 장미 벵골 투여 후 20 분 동안 레이저로 촬영 된 동물에서 유의하게 감소했습니다. 이 결과는 급성 RVO 유발 손상을 연구할 때 장미 벵골 투여 후 대기 시간이 폐색 안정성에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 정맥의 조기 재관류 (부상 후 24 시간 이전)는 망막 부종의 발병에 영향을 미칠 수 있으므로 장미 벵골 투여에서 레이저 조사까지의 정확한 대기 시간을 결정하여 제어해야합니다.
원칙적으로 폐색으로 이어지는 성공적인 광응고는 레이저 출력에 의해 구동됩니다. 이는 공정에서 매우 중요한 부분이지만 모델에서 가장 큰 변동성 원인 중 하나이기도 하며 일관성을 위해 최적화되어야 합니다. 이를 위해서는 마우스에 장미 벵골을 주입하기 전에 설정 중에 레이저 출력을 측정하는 것이 좋습니다. 기준 레이저 출력에 대한 권장 출력은 13.0에서 15.0mW 사이입니다. 그림 3과 같이 실험 출력(100mW)을 수정하지 않고 11.5mW와 같은 낮은 기준 레이저 출력으로 폐색이 발생하지 않았습니다. 대조적으로, 100mW의 실험 출력으로 13.5mW의 기준 레이저 출력은 성공적인 폐색을 초래했습니다. 레이저 출력이 13.0mW 미만인 경우 실험 출력을 110mW로 증가시켜 더 높은 기준 레이저 출력과 동일한 성공적인 폐색을 달성했습니다. 일반적으로 100mW가 표준 실험 전력입니다. 그러나 레이저 출력이 13.0mW 미만인 경우 표 1의 권장 범위로 실험력을 수정하여 보정할 수 있습니다.
네 가지 주요 유형의 폐색은 정맥의 레이저 광응고 후에 발생하는 것으로 나타났습니다. 이러한 유형의 폐색은 그림 4A 에 요약되어 있으며 혈류량에 따라 분류되었습니다. 완전히 폐색된 혈관(혈류 없음), 부분적으로 폐색된 혈관(대부분 간헐적인 흐름으로 막힘), 부분적으로 재관류됨(방해가 있는 중단 없는 안정적인 혈류) 및 완전히 재관류된 혈관(명백한 장애물 없음). 유전자형에 따라 폐색의 유형이 변하는지 조사하고 교합 상태당 소요 시간을 결정하기 위해 레이저 조사 후 10분 비디오를 평가했습니다. 이 평가는 iEC Casp9 마우스의 조사된 혈관구조가 완전히 폐색된 상태에서 더 많은 시간을 보내는 C57BL6/J보다 부분적으로 재관류 및 부분적으로 폐색된 상태에서 더 많은 시간을 소비한다는 것을 결정하는 데 도움이 되었습니다(그림 4B).
그림 5 는 레이저 광응고 후 처음 10분 이내에 혈관의 폐색 상태가 어떻게 빠르게 변하는지를 보여줍니다. 이러한 초기 10분이 지나면 폐색이 안정화되고 최대 24시간 시점까지 유지됩니다. 따라서 눈 당 정확한 초기 폐색 횟수를 평가하려면 조사 후 10 분 동안 기다리는 것이 좋습니다. 이 모델에 대한 이전 평가에서는 대부분의 폐색이 조사 후 8일까지 재관류하는 것으로 확인되었습니다8; 그러나 하루에 재관류하는 폐색 비율은 변형률에 따라 다를 수 있으며 각 실험 모델에서 결정되어야 합니다. 여기에 제시된 모델은 급성 손상이며 폐색 후 24 시간 이내에 발생하는 부종으로 이어지는 경로를 이해하는 데 사용하기위한 것입니다. RVO의 또 다른 특징은 그림 5와 같이 부상 후 24 시간에 관찰 할 수있는 화염 모양의 출혈입니다.
RVO 후 24 시간의 추적 관찰은 RVO 방법의 결과로 발생할 수있는 다른 안과 병리를 나타낼 수 있습니다. 일부는 망막하 출혈(지속적인 혈액 패치를 특징으로 함), 망막 박리, 완전 허혈성 망막(정맥과 동맥에 혈류 없음) 및 백내장을 포함하지만 이에 국한되지 않습니다. 그림 6 은 백내장이 있는 상태에서 OCT를 수행할 수 없기 때문에 백내장이 형성되는 눈(그림 6F)을 제외하고 해당 OCT가 있는 안저 이미지를 보여줍니다. 그림 6A 는 참고용으로 다치지 않은 눈의 안저 이미지 및 OCT가 어떻게 보이는지에 대한 예를 보여줍니다.
이 모델에서 RVO의 주요 형태 병리학은 망막 부종입니다. 망막 부종의 수준을 평가하려면 기준 판독을 위해 RVO 시술 당일 및 관심 시점에 OCT 이미지를 촬영하는 것이 좋습니다. 도 7은 손상된 눈에서 망막 부종의 OCT 정량화를 나타낸다. 뉴런 층의 상태를 결정하는 데 사용되는 또 다른 척도는 망막 내부 층 (DRIL)의 해체를 평가하는 것입니다. 이것은 RVO 5,9,10의 또 다른 특징 인 모세관 비 관류를 나타내는 임상 환경에서 사용되는 측정입니다. 이 평가의 예는 그림 7B에서 찾을 수 있습니다. 도 7c는 각 망막층에 대응하는 라벨을 갖는 OCT 영상의 일 예를 도시한다.
그림 1: RVO 마우스 모델의 타임라인 및 개략도 . (A) 장미 벵골 투여에서 폐색 된 정맥의 이미징에 이르는 사건의 타임 라인. (B) 성공적인 망막 정맥 광응고를 달성하기 위한 방법의 요약된 표현. 빨간색 상자는 매우 가변적이며 마우스 모델 및 관심 있는 질문별로 최적화할 수 있는 프로세스의 중요한 단계를 나타냅니다. (C) 망막 주요 정맥 (V)은 동맥 (A)에 비해 넓고 어둡습니다. 각 주요 정맥은 시신경에서 평균 거리 375μm에서 532nm, 스폿 크기 50μm, 전력 100mW, 지속 시간 1초, 총 에너지 0.3J 및 복사 노출 15278.87J/cm2의 유도 레이저로 조사됩니다. (D) 레이저 적용은 약 150 μm의 안저 영상에서 볼 수있는 기화 기포를 유발하고 전체 망막 면적의 <4 %를 덮습니다. 숫자는 혈관을 조사 할 때 레이저 빔의 제안 된 위치와 이동 방향 (화살표)을 나타냅니다. 약어 : A = 동맥; V = 정맥; ON = 시신경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장미 벵골 투여에 대한 광폐색 시간은 성공적인 광응고에 매우 중요합니다. (A) 장미 벵골 투여 후 10분 및 20분 후에 iEC Casp9 WT 및 iEC Casp9 KO의 안저 망막 이미지. 흰색 원은 성공적인 폐색을 가진 정맥을 나타냅니다. (b) 방사선 조사 직후 폐색 횟수 (0 h) 및 1 일 후 10 분 및 20 분 동안 방사선 조사 후 10 분 및 20 분 동안 결합 된 유전자형의 벵골 주사. 웰치의 t-검정, 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. (C) 유전자형으로 분리된 폐색의 수. 양방향 분산 분석 및 피셔의 LSD 테스트; 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 약어 : WT = 야생형; KO = 녹아웃; SEM = 평균의 표준 오차; 분산 분석 = 분산 분석; LSD = 최하위 차이; ns = 유의하지 않음; P-RVO = 망막 후 정맥 폐색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기준선 및 실험용 레이저 출력 측정은 성공적인 광응고를 위한 중요한 단계입니다. 광응고 10분 후 iEC Casp9 WT 및 iEC Casp9 KO의 안저 망막 이미지; 다양한 기준선 및 실험용 레이저 출력 레벨로 사진 폐색. 낮은 베이스라인 레이저 출력은 실험용 레이저 출력(12.8mW, 110mW)으로 보정할 수 있습니다. 흰색 원은 성공적인 폐색을 가진 정맥을 나타냅니다. 약어 : WT = 야생형; KO = 녹아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: RVO 방법은 다양한 유형의 폐색을 초래 합니다. (A) C57BL/6J, iEC Casp9 WT, iEC Casp9 KO의 안저 망막 이미지 광응고 10분 후 다양한 유형의 교합: 완전 폐색, 부분 폐색, 부분 재관류 및 완전 재관류. 삽입물은 광응고 후 특정 유형의 폐색을 초래한 정맥의 집중된 보기를 보여줍니다. (B) 방사선 조사 후 처음 10분 동안 각 유전자형에 대해 서로 다른 폐색 상태에서 폐색된 정맥의 백분율 정량화. 10분짜리 비디오는 유전자형에 눈이 먼 두 명의 조사관에 의해 평가되었으며, 이들은 지속 시간당 다른 폐색 상태(완전 폐색(-2), 부분 폐색(-1), 완전 재관류(2) 및 부분 재관류(1))에 숫자를 할당했습니다. 약어 : RVO = 망막 정맥 폐색; WT = 야생형; KO = 녹아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: RVO 후 폐색의 타임라인. 레이저 조사 후 C57BL/6J, iEC Casp9 WT, 및 iEC Casp9 KO 0, 5분, 10분 및 24시간의 안저 망막 이미지. 처음 10분은 교합 상태에 매우 중요하며 빠르게 변할 수 있습니다. 초기 10분 후, 폐색은 최소 24시간까지 안정적입니다. 흰색 원은 성공적인 폐색을 가진 정맥을 나타내고 노란색 화살촉은 화염 모양의 출혈을 나타냅니다. 약어 : RVO = 망막 정맥 폐색; WT = 야생형; KO = 녹아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : RVO 후 다른 안과 병리가 발생할 수 있습니다. (A-E)는 안저 망막 이미지와 해당 OCT를 보여줍니다. (A) RVO 과정을 거치지 않은 다치지 않은 눈의 예. (B) 안저 이미지에서 혈관에서 혈액이 새는 것을 보여주는 망막 하 출혈. (C) 안저의 흐릿한 접힘과 OCT의 망막 리프팅으로 나타나는 망막 박리. (D) OCT에 많은 양의 부종으로 나타나는 과도한 부종. (E) 혈류가 완전히 손상되어 백색 망막이 생기는 완전 허혈성 눈. (F) 명확한 안저 이미지와 OCT를 얻을 수 없는 백내장 눈의 두 가지 다른 예. OCT 스케일 바: 100 μm. 약어 : RVO = 망막 정맥 폐색; OCT = 광학 간섭 단층 촬영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: OCT 이미지의 정량화. (A) RVO 절차를 거친 레이저가없는 제어 눈과 눈에서 층 두께와 DRIL을 검사합니다. GCL, IPL, INL, OPL, ONL, 외부 세그먼트 및 전체 망막 측정. 통계량, 만-휘트니 검정 p-값: GCL: 0.0070, IPL: 0.0205, INL: <0.0001, OPL: 0.0014, ONL: 0.5582, 외부 세그먼트: 0.44852, 전체 망막: 0.0019. 오차 막대는 SEM을 보여줍니다. (B) 레이저를 사용하지 않은 대조군과 RVO WT 및 KO iEC Casp9 마우스와 RVO가 있는 c57/BL6J 마우스의 OCT 이미지로부터 측정된 DRIL 정량화. 오차 막대는 SEM을 보여줍니다. (C) 각 망막 층의 레이블이있는 OCT의 예. 약어 : DRIL = 내부 망막 층의 무질서; RVO = 망막 정맥 폐색; WT = 야생형; KO = 녹아웃; GCL = 신경절 세포층; IPL = 내부 플렉시 폼 층; INL = 내부 핵층; OPL = 외부 플렉시 폼 층; ONL = 외부 핵층; SEM = 평균의 표준 오차; OCT = 광학 간섭 단층 촬영; ns = 유의하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 베이스라인 레이저 출력(mW) | 권장 실험용 레이저 출력(mW) | 권장 시간 노출 (밀리초) |
| <11.0 또는 >15.0 | 레이저를 끄고 레이저 컨트롤 박스에 연결된 끝에서 광섬유를 조정하십시오. 나사를 풀고 오른쪽이나 왼쪽으로 약간 움직입니다. 더 높거나 낮은 값에 도달할 때까지 결과를 다시 측정합니다. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
표 1: 낮은 베이스라인 레이저 출력은 더 높은 실험적 레이저 출력으로 보상할 수 있습니다. 기준 레이저 출력과 권장 실험 레이저 출력 및 노출 시간의 변화.
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Discussion
마우스 RVO 모델은 RVO 병리를 더 깊이 이해하고 잠재적인 치료법을 테스트할 수 있는 방법을 제공합니다. 마우스 RVO 모델이 현장에서 널리 사용되는 반면, 가변성을 해결하고 모델의 최적화를 설명하는 모델의 현재 세부 프로토콜이 필요합니다. 여기에서는 실험 동물 코호트에서 가장 일관된 결과를 얻고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하기 위해 변경할 수 있는 사항에 대한 경험의 예가 포함된 가이드를 제공합니다.
RVO 마우스 모델의 가장 필수적인 두 가지 요소는 레이저 출력과 감광제 염료의 성공적인 정맥 주사입니다. 레이저가 특정 정맥을 겨냥할 때 응고를 유도하는 데 필요한 전력을 생산하려면 레이저 출력을 적절하게 조정해야 합니다. 이 방법은 방법에서 제안한 기술을 사용하여 달성할 수 있지만 각 실험실의 시스템 설정에서 차이점을 고려하는 것이 중요합니다. 광섬유 케이블의 변형과 장비 및 실내 온도와 관련하여 수용되는 방법은 낮은 레이저 출력을 설명할 수 있는 몇 가지 변수입니다. 레이저 출력을 높이기 위해 시스템 설정을 독립적으로 조정하는 것이 좋습니다.
그러나, 이러한 노력은 광감작제 염료를 전달하는 적절한 꼬리 정맥 기술 없이는 작동하지 않는다. 꼬리 정맥 주사는 달성하기 어려울 수 있으며 개발하는 데 시간이 걸리는 기술입니다. 불쌍한 주사는 폐색을 초래할 수 없습니다. 이 경우 로즈 벵골은 IP를 통해 투여 할 수 있습니다. IP를 통한 장미 벵골 투여는 RVO를 모델링하는 데 사용되었지만 레이저 조사 시간이 더 길고(3초) 장미 벵골 농도(40mg/mL)가 더 높습니다11. 장기간의 레이저 조사를 제한하고 특히 혈관계를 표적으로 삼기 위해 꼬리 정맥이 선호되는 투여 방식입니다.
이 모델은 로즈 벵갈이 가장 많이 사용되는 광활성성 염료 4,5,6,8이지만 Y eosin 및 플루오레세인 나트륨 12,13,14와 같은 다른 광활성성 염료를 사용하여 달성할 수도 있습니다. 모든 염료는 망막 출혈 및 망막 부종과 같은 임상 질환의 초기 특징을 생성하는 것으로 나타났습니다15. 광활성제 염료는 동물에게 악영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 따라서 미미한 시스템 독성을 나타낸다15,16. 또한 선택된 염료는 사용되는 레이저의 파장과 호환되는 흡수 최대치를 가져야한다는 점에 유의해야합니다. 로즈 벵갈은 525nm17에서의 여기, 475-490nm18에서의 나트륨 플루오레세인, 및 490nm19에서의 Y 에오신 등을 갖는다.
이 모델에서 변동성의 주요 원인은 장미 벵골 투여에 대한 광 폐색 시간과 기준선 및 실험용 레이저 출력입니다. 그림 2 는 광 폐색에 대한 10분 및 20분 시점을 보여주지만, 소수의 5분 및 15분 실험도 수행되었으며(데이터는 표시되지 않음) 10분 시점만큼 일관되지 않은 폐색을 산출했습니다. 따라서, 10분은 이 방법에 대한 장미 벵골 투여와 광폐색 사이의 최적 대기 시간으로 선택되었다. 그러나 연구에 따르면 RVO는 로즈 벵골5 투여 후 빠르면 3 분 이내에 유도 될 수 있다고보고되었습니다. 장미 벵골에서 광 폐색까지 마우스 균주 별 최적 대기 시간을 결정하는 또 다른 방법은 테트라 메틸로 다민 (TRITC) 필터와 함께 형광 이미징 모드를 사용하여 상대적 장미 벵골 농도를 모니터링하는 것입니다. 그러나, 여기에 기술된 프로토콜은 TRITC 필터가 없는 망막 이미징 현미경을 사용하여 수행될 수 있다.
이 모델에서 높은 가변성의 또 다른 원인은 기준 레이저 출력입니다. 기준 레이저 출력의 일상적인 수준은 크게 다를 수 있으므로 각 실험 전에 수준을 평가하는 것이 중요합니다. 연구 전반에 걸쳐 기준 레이저 출력을 표준화하면 RVO 마우스 모델의 사용을 강화하고 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 광섬유 케이블을 재조정하면 기준 레벨을 수정하기에 충분할 수 있습니다. 그러나 13.0mW 측정에 도달할 수 없는 경우 표 1 은 실험 전력을 사용한 보상 가이드를 제공합니다. 망막은 폐쇄 시스템이기 때문에 폐색 된 정맥의 비율 (폐색 된 정맥의 수를 조사 된 정맥의 수로 나눈 값)을 결정하는 것은 RVO 모델에서 손상의 심각성을 이해, 제어 및 예측하는 데 필수적입니다. 손상된 판독값(DRIL 및 망막 두께)에 대한 이전 분석은 폐색된 정맥의 비율과 상관관계가 있으며 RVO 8 이후8일에 망막 위축을 예측했습니다. 따라서 폐색 된 정맥의 비율을 고려하고 평가해야합니다. 부분적으로 재관류, 부분적으로 폐색된 상태 또는 한 번 폐색되고 10분 동안 재관류된 정맥과 같은 다른 중간 폐색 상태가 망막 부종 및 위축의 발병에 어떻게 기여하는지는 여전히 불분명합니다.
이러한 유형의 폐색을 가진 눈에 대한 추가 연구는 상당한 손상에 지속적인 폐색이 필요한지 또는 이 모델에서 일시적인 폐색이 중요한지 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 묻는 실험적 질문에 따라 다른 폐색 속도가 최적입니다. 대부분의 경우 40-50%의 폐색률이 이상적이며, 이는 6개의 정맥이 있는 눈에 2-3개의 폐색이 있음을 의미합니다. 이것은 상당한 손상을 보장하지만 망막은 손상되지 않았으며 면역 조직 화학 및 생화학 분석을 위해 해부 될 수 있습니다.
이를 결정하기 위해서는 RVO 서명의 성공적이고 대표적인 폐색에 대한 병리학 적 견해를 구별하는 것이 적절합니다. RVO가 제시하는 자연 폐색에는 손상 후 24 시간 후에이 모델에서 관찰 할 수있는 화염 모양의 출혈20 (망막 하 출혈과 혼동하지 말 것)이 포함됩니다. RVO 모델은 매개 변수가 신중하게 제어되지 않으면 그림 6B-F에 표시된 것과 같은 원치 않는 망막 손상 (RVO 병리의 특징이 아님)을 유발할 수도 있습니다. 장미 벵골의 농도와 실험용 레이저 출력을 조절하는 것 외에도 이러한 것을 피하기 위해 취할 수있는 접근법은 첫 번째 또는 두 번째 조사 후 혈전이 명확하게 형성된 혈관에 조사를 중단하는 것입니다.
이 모델을 사용하고 폐색할 정맥을 결정할 때 고려해야 할 다른 요소는 마우스 변형과 혈관 직경입니다. 가장 일반적으로 알비노로 알려진 BALB/c와 같은 일부 마우스 균주는 가벼운 손상에 취약합니다21. 또한, 그들은 망막 발달 결손이있어 시신경 교차 및 시력22,23에서 탈락에 결함을 초래합니다. RVO 연구를 위해 선택된 마우스 균주에 대해 손상되지 않은 대조군의 기저 망막 및 혈관 완전성을 완전히 평가하는 것이 좋습니다. 연구에 따르면 정맥 폭은 망막 부종 및 질병 병리의 발달을 방해 할 수 있습니다24. 따라서 추가 변동성을 피하기 위해 비슷한 무게의 동물을 사용해야합니다. 연구에서 사용할 눈의 배제 요소는 실험 질문에 따라 달라집니다. 신호를 위한 후속 시점에서 재관류되더라도 한 번 폐색된 눈을 포함하는 것이 현명할 수 있습니다. 그러나 안정적인 폐색이 필요한 경우 이러한 눈은 제외됩니다. 도 6은 병리학적 분석에 사용될 수 있는 가능한 배제 기준 또는 눈의 예를 나타낸다.
이러한 레이저 설정이 손상을 일으키지 않고 보이는 효과가 실제로 폐색 자체에 의해 주도되었음을 보여주기 위해 이전 연구8에서 가짜 제어가 수행되었습니다. 가짜 마우스는 여전히 장미 벵골의 꼬리 정맥 주사를 받았지만 정맥에 조사되는 대신 주요 혈관 사이의 실질 공간에 조사되었습니다. 이것은 모델이 단순히 레이저로 조직을 손상시키는 대신 환자에서 볼 수 있는 RVO 부상을 복제하도록 하는 중요한 단계였습니다. 이 가짜는 caspase-9 또는 -7의 활성화 또는 혈관에 정상적인 레이저 조사를받은 마우스에서 보이는 부종을 나타내지 않아 레이저가 부작용이 없음을 나타냅니다. 특히 모델링되는 부상이 원하는 손상을 정확하게 표현하도록 보장하기 위해 더 높은 레이저 설정을 사용하는 경우 이러한 제어를 갖는 것이 필수적입니다8.
RVO 마우스 모델은 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증 및 뇌졸중과 같은 망막 및 뇌의 저산소성 허혈성 손상으로 인한 다른 질병을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 또한 혈관 손상 발달과 관련된 신호 경로를 연구하고 중추 신경계의 신경 퇴행을 개선하는 잠재적 치료법을 테스트하는 모델 역할을 할 수 있습니다. 이 보고서에 맞춤화된 최적화는 마우스 RVO 모델의 변동성을 제한하고 RVO의 병태생리학을 조명할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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