Summary
Здесь мы описываем оптимизированный протокол окклюзии вен сетчатки с использованием розовой бенгальской розы и систему микроскопа визуализации сетчатки с лазерным наведением с рекомендациями по максимизации ее воспроизводимости в генетически модифицированных штаммах.
Abstract
Мышиные модели окклюзии вен сетчатки (RVO) часто используются в офтальмологии для изучения гипоксически-ишемического повреждения нервной сетчатки. В этом отчете подробный метод, указывающий на критические шаги, содержит рекомендации по оптимизации для достижения стабильно успешных показателей окклюзии у различных генетически модифицированных штаммов мышей. Модель мыши RVO состоит в основном из внутривенного введения красителя фотосенсибилизатора с последующей лазерной фотокоагуляцией с использованием микроскопа визуализации сетчатки, прикрепленного к офтальмологическому управляемому лазеру. Три переменные были идентифицированы как детерминанты консистенции окклюзии. Регулируя время ожидания после введения розовой бенгалии и балансируя исходный и экспериментальный лазерный выход, изменчивость между экспериментами может быть ограничена и достигнут более высокий уровень успеха окклюзий. Этот метод может быть использован для исследования заболеваний сетчатки, которые характеризуются отеком сетчатки и гипоксически-ишемическим поражением. Кроме того, поскольку эта модель вызывает повреждение сосудов, она также может быть применена для изучения нейроциркулятуры, гибели нейронов и воспаления.
Introduction
Окклюзия вен сетчатки (RVO) является распространенным сосудистым заболеванием сетчатки, которое затронуло около 28 миллионов человек во всем мире в 2015году 1. RVO приводит к снижению зрения и потере у людей трудоспособного возраста и пожилых людей, представляя собой продолжающееся угрожающее зрению заболевание, которое, по оценкам, увеличится в течение ближайшего десятилетия. Некоторые из различных патологий RVO включают гипоксически-ишемическое повреждение, отек сетчатки, воспаление и потерю нейронов2. В настоящее время первая линия лечения этого расстройства заключается в введении ингибиторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В то время как лечение анти-VEGF помогло улучшить отек сетчатки, многие пациенты все еще сталкиваются со снижением зрения3. Чтобы лучше понять патофизиологию этого заболевания и проверить потенциальные новые линии лечения, необходимо составить функциональный и подробный протокол мышиной модели RVO для различных штаммов мышей.
Мышиные модели были разработаны с реализацией того же лазерного устройства, которое используется у пациентов-людей, в сочетании с системой визуализации, масштабированной до правильного размера для мыши. Эта мышиная модель RVO была впервые зарегистрирована в 2007 году4 и далее установлена Ebneter и другими 4,5. В конце концов, модель была оптимизирована Fuma et al. для воспроизведения ключевых клинических проявлений RVO, таких как отек сетчатки6. С тех пор, как модель была впервые представлена, многие исследования использовали ее с использованием введения красителя фотосенсибилизатора с последующим фотокоагуляцией основных вен сетчатки с помощью лазера. Тем не менее, количество и тип вводимого красителя, мощность лазера и время воздействия значительно различаются в исследованиях, в которых использовался этот метод. Эти различия часто могут привести к увеличению изменчивости модели, что затрудняет ее тиражирование. На сегодняшний день нет опубликованных исследований с конкретными подробностями о потенциальных путях его оптимизации.
В настоящем отчете представлена подробная методология мышиной модели RVO в штамме C57BL/6J и тамоксифен-индуцируемом эндотелиальной каспазе-9 нокаутном штамме (iEC Casp9KO) с фоном C57BL/6J и имеющим отношение к патологии RVO в качестве эталонного штамма для генетически модифицированной мыши. Предыдущее исследование показало, что неапоптотическая активация эндотелиальной каспазы-9 вызывает отек сетчатки и способствует гибели нейронов8. Опыт использования этого штамма помог определить и дать представление о потенциальных модификациях для адаптации мышиной модели RVO, которая может быть применима к другим генетически модифицированным штаммам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Эксперименты на грызунах были одобрены и контролировались Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Колумбийского университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех экспериментах использовались двухмесячные самцы мышей, которые весили примерно 20 г.
1. Получение и введение тамоксифена для индуцируемой генетической абляции флоксированных генов
ПРИМЕЧАНИЕ: На диаметр сосуда сетчатки может влиять вес животного. Убедитесь, что все животные, используемые для эксперимента, имеют одинаковый вес.
- Развести тамоксифен в кукурузном масле до концентрации 20 мг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тамоксифен является токсичным веществом и светочувствительным. Защитите от света, например, алюминиевой фольгой. - Вихрь раствора на пару секунд.
- Оставить в духовке при 55 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тамоксифен полностью растворился. Может потребоваться дополнительное вихрь. - Хранить раствор при температуре 4 °C до 1 недели.
- Используйте шприц объемом 1 мл, снабженный иглой 26 г для инъекций тамоксифена. Очистите область инъекции 70% этанолом. Вводят 2 мг тамоксифена (100 мкл 20 мг/мл) внутрибрюшинно (IP) один раз в день в течение установленного времени в соответствии со специфической индуцируемой линией Cre.
- Дайте животным два дня отдыха перед началом экспериментов.
2. Подготовка реагентов к лазерной фотокоагуляции
- Роза бенгальская
ПРИМЕЧАНИЕ: Роза бенгальская светочувствительна. Хранить в темноте до использования и готовить свежим для достижения наилучших результатов.- Приготовьте бенгальскую розу, разбавляя ее до 5 мг/мл в стерильном физиологическом растворе и фильтруйте через шприцевой фильтр 0,2 мкм.
- Приготовьте шприц объемом 1 мл, снабженный иглой 26 г с розовой бенгальской розой.
- Кетамин/ксилазин
- Разбавляют кетамин и ксилазин в стерильном физиологическом растворе соответственно для следующих концентраций: кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазин (5-10 мг/кг).
- Карпрофен
- Развести карпрофен до 1 мг/мл в стерильном физиологическом растворе.
- Приготовьте шприц объемом 1 мл, снабженный иглой 26 г с карпрофеном.
- Стерильный физиологический раствор
- Приготовьте шприц объемом 5 мл, снабженный иглой 26 г со стерильным физиологическим раствором.
3. Настройка лазера
- Аккуратно обработайте оптоволоконный кабель и подключите его к лазерному блоку управления и лазерному адаптеру микроскопа визуализации сетчатки.
- Включите лампу микроскопа для визуализации сетчатки.
- Включите компьютер и откройте программу создания образов.
- Отрегулируйте баланс белого, используя лист белой бумаги, поместив его перед окуляром мыши и щелкнув Кнопка «Настроить » в программе обработки изображений.
- Включите лазерный блок управления, повернув ключ и следуя инструкциям на экране лазерного блока управления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер, используемый в этом эксперименте, относится к классу 3B и может вызвать повреждение глаз. Носите защитные очки при работе с лазером. - Проверьте базовую мощность лазера.
- Используйте лазерный измеритель мощности.
- Отрегулируйте экран лазерного блока управления на следующие параметры: 50 мВт и 2000 мс.
- Включите лазер и поместите измеритель мощности перед окуляром.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что свет микроскопа выключен при тестировании базовой мощности лазера. - Нажмите на педаль ножного переключателя, чтобы активировать лазер.
- Стремитесь к тому, чтобы показания мощности лазера составляли 13-15 мВт.
ПРИМЕЧАНИЕ: Считывание мощности лазера определит успешность окклюзии вен сетчатки. Если показания мощности лазера слишком низкие, можно внести коррективы в мощность и время воздействия лазера. Рекомендации см. в таблице 1 .
- Отрегулируйте мощность экспериментального лазера, настроив экран лазерного блока управления на следующие параметры: 100 мВт, 1000 мс.
- Выключите лазер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для безопасности и предотвращения перегрева лучше всего держать лазер выключенным между мышами.
4. Инъекция вену мышиного хвоста бенгальской розы
- Налейте 300 мл воды в стакан емкостью 500 мл.
- Разогрейте стакан в микроволновой печи в течение 1 мин.
- Положите марлю в теплую воду в стакан.
- Положите мышь в ограничитель.
- Осторожно вдавите марлю в хвост мыши и найдите расширенные вены. Продезинфицируйте место инъекции спиртовой салфеткой после расширения теплой воды.
- Вставьте иглу в место инъекции и потяните за шприц, чтобы убедиться, что вы находитесь в вене. Затем вводят в вену хвоста мыши, вводя правильное количество в соответствии с весом животного (37,5 мг / кг). Надавите на место инъекции, чтобы избежать гематомы или кровотечения. Очистите сайт.
- Отпустите мышь от ограничителя и верните ее в клетку.
- Дайте 8 мин, чтобы бенгальская роза циркулировала перед инъекцией анестетиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит в общей сложности 10 минут между инъекцией бенгальской розы и лазерным облучением.
5. Окклюзия крупных вен
- Включите нагретую платформу мыши.
- Добавьте по одной капле фенилэфрина и тропикамида в каждый глаз.
- Вводят 150 мкл анестетиков, кетамина (80-100 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг) ИП.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры мышке было дано две IP-инъекции. Следовательно, стороны чередовались. Инъекция ИП для анестезии вводилась в нижний правый брюшной квадрант, а физиологический раствор вводили в нижний левый брюшной квадрант. Натягивание шприца перед инъекцией рекомендуется для того, чтобы игла находилась в брюшной полости, а не в каких-либо органах. - Ущипните животное, чтобы определить глубину анестезии, и подождите, пока оно не перестанет реагировать.
- Добавьте по одной капле гидрохлорида пропаракаина на глаз (анальгетик).
- Добавить гелевую мазь на оба глаза.
- Вводят 150 мкл карпрофена подкожно между ушами.
- Разместите мышь на платформе.
- Отрегулируйте платформу до тех пор, пока вид глазного дна сетчатки не станет четким и сфокусированным.
- Подсчитайте вены сетчатки и сделайте снимок глазного дна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вены сетчатки темнее и шире, чем артерии. Вены и артерии чередуются; однако иногда может быть разветвленная артерия рядом с зрительным нервом, а значит, и две смежные артерии. - Включите лазер и направляйтесь в вену сетчатки примерно на расстоянии 375 мкм от диска зрительного нерва.
- Облучают сосуд нажатием на ножной переключатель и слегка перемещая лазерный луч до 100 мкм. Повторите этот шаг три раза и перемещайте лазерный луч после каждого импульса, чтобы облучение не было сфокусировано в одном месте.
- Повторное облучение на другие крупные сосуды для достижения 2-3 окклюзий.
6. Установление количества закупоренных вен на 0 день
- Выключите лампу после облучения сосудов и подождите 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие света может вызвать повреждение и воспаление сетчатки; выключите лампу во время ожидания, чтобы свести к минимуму экспозицию7. - Снова включите лампу и подсчитайте количество закупоренных вен.
- Сделайте снимок глазного дна.
7. Последующий уход
- Вводят 1 мл стерильного физиологического раствора IP.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. подробности внедрения IP в разделе 5, шаг 3. - Добавьте смазочные глазные капли в оба глаза.
- Добавить гелевую мазь на оба глаза.
- Наблюдайте за мышью, как она восстанавливается после анестезии, и не возвращайте ее в клетку с другими животными, пока она полностью не выздоровеет. Карпрофен (5 мг/кг) можно давать ежедневно до 2 дней после процедуры. При применении к людям боль не является симптомом RVO.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животных без присмотра до тех пор, пока они полностью не восстановятся после анестезии.
8. Оценка отека сетчатки методом оптической когерентной томографии (ОКТ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен в точке интереса следователя. Пик отека сетчатки у мыши C57BL/6J приходится на 1 день после процедуры RVO. Этот момент времени может варьироваться в зависимости от фона мыши.
- Включите световой короб микроскопа визуализации сетчатки, машину OCT и платформу мыши с подогревом.
- На следующий день после окклюзии выполните шаги с 5,2 по 5,7, чтобы подготовить животное.
- Откройте программное обеспечение для создания образов и центр развертывания Office.
- В программе центра развертывания Office отрегулируйте подталкивание на 5.
- Принимайте ОКТ на расстоянии 75 мкм дистально от ожога или 4 щелчка.
- Сделайте снимки OCT в четырех квадрантах сетчатки.
- Анализируйте изображения центра развертывания Office с помощью программного обеспечения трассировки.
- Сравните толщину сетчатки при предварительно облученных мерах с 1 днем после RVO или в точке интереса.
ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе данных учитывайте количество облученных вен, так как это может повлиять на развитие отека сетчатки. Затем животных усыпляют путем введения анестетика с последующей перфузионной операцией, не связанной с выживанием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышиная модель RVO направлена на успешное достижение окклюзии в венах сетчатки, приводящей к гипоксически-ишемическому повреждению, разрушению кровяного барьера сетчатки, гибели нейронов и отеку сетчатки8. На рисунке 1 показана временная шкала шагов для обеспечения воспроизводимости, схема экспериментального проекта и намечены этапы, которые могут быть дополнительно оптимизированы в зависимости от экспериментальных вопросов. Тремя основными шагами, которые могут быть изменены, являются время ожидания после введения розовой бенгалии, базовая мощность лазера и экспериментальный выход лазера. В этом отчете мыши C57BL/6J, а также однопометники WT и KO из индуцируемой линии нокаутирующих мышей с эндотелиальной клеткой каспазы-9 (iEC Casp9) использовались для определения оптимальных настроек для различных штаммов.
Время ожидания от инъекции бенгальской розы до лазерного облучения может изменить успех фотокоагуляции в венах. Слишком короткое время ожидания может привести к низкой концентрации розовой бенгалии в венах, тогда как слишком длительное время ожидания может привести к тому, что роза бенгальская может быть очищена от кровообращения сетчатки. Обе ситуации могут привести к плохой фотокоагуляции и неудачным окклюзиям. При тестировании количества окклюзий, полученных сразу после лазерного облучения, сравнение животных, которых лазеризировали через 10 и 20 мин после введения розовой бенгалии, показало, что различий в количестве достигнутых окклюзий не было (рисунок 2B). Тем не менее, количество окклюзий, выдерживаемых до 1 дня после RVO, значительно уменьшилось у животных, которых лазером вводили через 20 мин после введения розовой бенгалии независимо от генотипа. Этот результат говорит о том, что при изучении острой RVO-индуцированной травмы время ожидания после введения розовой бенгалии может повлиять на стабильность окклюзии. Ранняя реперфузия вен (до 24 ч после травмы) может повлиять на развитие отека сетчатки и, следовательно, должна контролироваться путем определения правильного времени ожидания от введения розовой бенгальской кислоты до лазерного облучения.
В принципе, успешная фотокоагуляция, приводящая к окклюзии, обусловлена мощностью лазера. Хотя это такая важная часть процесса, она также является одним из самых больших источников изменчивости модели и должна быть оптимизирована для согласованности. Для этого рекомендуется измерить выход лазера во время установки, прежде чем мышам вводят розу бенгальскую. Рекомендуемая выходная мощность для базовой мощности лазера составляет от 13,0 до 15,0 мВт. Низкая базовая мощность лазера, такая как 11,5 мВт, без изменения экспериментальной мощности (100 мВт), не приводила к окклюзии, как показано на рисунке 3. Напротив, базовая мощность лазера 13,5 мВт с экспериментальной мощностью 100 мВт привела к успешной окклюзии. В тех случаях, когда выходная мощность лазера была ниже 13,0 мВт, экспериментальная мощность была увеличена до 110 мВт для достижения тех же успешных окклюзий, что и при более высокой базовой мощности лазера. Как правило, 100 мВт является стандартной экспериментальной мощностью; однако, если мощность лазера ниже 13,0 мВт, это может быть компенсировано путем изменения экспериментальной мощности с рекомендуемыми диапазонами в таблице 1.
Было отмечено, что четыре основных типа окклюзий происходят после лазерной фотокоагуляции вен. Эти типы окклюзий обобщены на рисунке 4А и классифицированы в соответствии с количеством кровотока; полностью закупоренные сосуды (без кровотока), частично закупоренные сосуды (в основном заблокированные случайным течением), частично реперфузированные (непрерывный устойчивый кровоток с помехой) и полностью реперфузированные сосуды (без явной обструкции). Чтобы выяснить, изменяются ли типы окклюзий в соответствии с генотипом, и определить время, затраченное на состояние окклюзии, были оценены 10-минутные видео после лазерного облучения. Эта оценка помогла определить, что облученные сосудистая система мышей iEC Casp9 проводят больше времени в частично реперфузированных и частично закрытых состояниях, чем C57BL6/J, которые проводят больше времени в полностью закрытых состояниях (рисунок 4B).
На рисунке 5 показано, как состояние окклюзии сосудов быстро меняется в течение первых 10 мин после лазерной фотокоагуляции. Как только эти начальные 10 минут проходят, окклюзии стабилизируются и поддерживаются до 24-часовой временной точки. Таким образом, чтобы оценить точное начальное количество прикусов на глаз, рекомендуется подождать 10 мин после облучения. Предыдущая оценка этой модели определила, что большинство окклюзий отступают через 8 дней после облучения8; однако скорость окклюзий, которые повторяются в день, может варьироваться в зависимости от деформации и должна определяться в каждой экспериментальной модели. Модель, представленная здесь, имеет острую травму и предназначена для использования для понимания путей, которые приводят к отеку, который развивается в течение 24 часов после окклюзии. Другой характеристикой RVO являются пламенные кровоизлияния, которые можно наблюдать через 24 ч после травмы, как показано на рисунке 5.
Последующее наблюдение через 24 ч после РВО может выявить другие офтальмологические патологии, которые могут возникнуть в результате применения метода РВО. Некоторые из них включают, но не ограничиваются субретинальным кровоизлиянием (характеризуется непрерывным кровяным пятном), отслойкой сетчатки, полностью ишемизированной сетчаткой (отсутствие кровотока в венах и артериях) и катарактой. На рисунке 6 показаны изображения глазного дна с соответствующим оКТ в качестве примеров, за исключением глаз, где образуется катаракта (рисунок 6F), поскольку ОКТ не может быть выполнен при наличии катаракты. На рисунке 6A показаны примеры того, как выглядят изображение глазного дна и OCT неповрежденного глаза для справки.
Основной морфологической патологией РВО в данной модели является отек сетчатки. Чтобы оценить уровень отека сетчатки, рекомендуется делать снимки ОКТ до дня процедуры RVO для исходного показания и в точке интереса. На рисунке 7 показана количественная оценка ОКТ отека сетчатки в поврежденных глазах. Другой мерой, используемой для определения состояния нейронных слоев, является оценка дезорганизации внутренних слоев сетчатки (DRIL). Это мера, используемая в клинических условиях, которая представляет собой капиллярную неперфузию, еще одну отличительную черту RVO 5,9,10. Пример этой оценки можно найти на рисунке 7B. На рисунке 7C показан пример изображения центра развертывания Office с соответствующими метками для каждого слоя сетчатки.
Рисунок 1: Временная шкала и схема мышиной модели RVO. (A) Временная шкала событий от введения розовой бенгалии до визуализации закупоренных вен. (B) Обобщенное представление метода достижения успешной фотокоагуляции вен сетчатки. Красные поля представляют собой важные шаги в процессе, которые сильно варьируются и которые могут быть оптимизированы для модели мыши и интересующего вопроса. (C) Крупные вены сетчатки (V) шире и темнее по сравнению с артериями (A). Каждая крупная вена будет облучена управляемым лазером 532 нм, размером пятна 50 мкм, мощностью 100 мВт, продолжительностью 1 с, общей энергией 0,3 Дж и лучезарным воздействием 15278,87 Дж/см2, на среднем расстоянии 375 мкм от зрительного нерва. (D) Применение лазера вызывает пузырь испарения, видимый на снимке глазного дна приблизительно 150 мкм и покрывает <4% от общей площади сетчатки. Цифры представляют собой предполагаемое местоположение и направление движения (стрелки) лазерного луча при облучении сосудов. Сокращения: А = артерия; V = вена; ON = зрительный нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Время фотоокклюзии относительно введения розовой бенгалии имеет решающее значение для успешной фотокоагуляции. (A) Изображения сетчатки глазного дна iEC Casp9 WT и iEC Casp9 KO фотоокклюдированы через 10 и 20 мин после введения розовой бенгалии. Белые круги представляют вены, которые имели успешные окклюзии. (В) Количество прикусов сразу после облучения (0 ч) и через 1 день после облучения в течение 10 мин и 20 мин после инъекции бенгальской розы комбинированных генотипов. T-тест Уэлча, полосы ошибок указывают SEM. (C) Количество окклюзий, разделенных генотипом. Двусторонний тест ANOVA и ЛСД Фишера; полосы ошибок обозначают SEM. Сокращения: WT = дикий тип; НОКАУТ = нокаут; SEM = стандартная погрешность среднего значения; ANOVA = дисперсионный анализ; ЛСД = наименее значимая разница; ns = незначимый; P-RVO = окклюзия вен после сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерение исходного уровня и экспериментальный лазерный выход являются критическими шагами для успешной фотокоагуляции. Снимки глазного дна iEC Casp9 WT и iEC Casp9 KO через 10 мин после фотокоагуляции; фото-окклюд с различными базовыми и экспериментальными уровнями лазерного выхода. Низкая базовая мощность лазера может быть компенсирована экспериментальным лазерным выходом (12,8 мВт, 110 мВт). Белые круги представляют вены, которые имели успешные окклюзии. Сокращения: WT = дикий тип; НОКАУТ = нокаут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Метод RVO приводит к различным типам окклюзий. (A) Изображения сетчатки глазного дна C57BL/6J, iEC Casp9 WT и iEC Casp9 KO через 10 мин после фотокоагуляции с различными типами окклюзий: полностью окклюдированные, частично закупоренные, частично реперфузированные и полностью реперфузированные. Вставки показывают сфокусированный вид вены, который привел к определенному типу окклюзии после фотокоагуляции. (B) Количественная оценка процента вен, закупоренных в различных состояниях окклюзии для каждого генотипа в течение первых 10 мин после облучения. Десятиминутные видео были оценены двумя исследователями, слепыми к генотипам, которые присвоили номера различным состояниям окклюзии (полностью окклюзионным (-2), частично окклюдированным (-1), полностью реперфузированным (2) и частично реперфузированным (1)) за продолжительность. Сокращения: RVO = окклюзия вен сетчатки; WT = дикий тип; НОКАУТ = нокаут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Временная шкала окклюзий после RVO. Снимки глазного дна C57BL/6J, iEC Casp9 WT и iEC Casp9 KO 0, 5 мин, 10 мин и 24 ч после лазерного облучения. Первые 10 мин критически важны для состояния окклюзий и могут быстро меняться. После начальных 10 мин окклюзии стабильны по крайней мере до 24 ч. Белые круги представляют вены, которые имели успешные окклюзии, а желтые наконечники стрел изображают огневидные кровоизлияния. Сокращения: RVO = окклюзия вен сетчатки; WT = дикий тип; НОКАУТ = нокаут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Различные офтальмологические патологии могут возникать после того, как RVO. (A-E) показывают изображения глазного дна сетчатки и соответствующие OCT. (A) Пример неповрежденного глаза, который не подвергся процессу RVO. (B) Субретинальное кровоизлияние, показывающее утечку крови из сосудов на изображении глазного дна. (C) Отслоение сетчатки, наблюдаемое по размытой складке на глазном дне и подъему сетчатки в ОКТ. (D) Чрезмерный отек проявляется большим количеством отека в ОКТ. (Е) Полностью ишемизированный глаз с полностью нарушенным кровотоком, приводящим к белой сетчатке. (F) Два различных примера катарактированного глаза, когда не удалось получить четкое изображение глазного дна и ОКТ. Полосы ОКТ-шкалы: 100 мкм. Сокращения: RVO = окклюзия вен сетчатки; ОКТ = оптическая когерентная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Количественная оценка изображений OCT. (A) Изучение толщины слоя и DRIL в нелазерированных контрольных глазах и глазах, которые прошли процедуру RVO. Измерения GCL, IPL, INL, OPL, ONL, наружного сегмента и всей сетчатки. Статистика, тест Манна-Уитни p-значения: GCL: 0.0070, IPL: 0.0205, INL: <0.0001, OPL: 0.0014, ONL: 0.5582, Внешний сегмент: 0.44852, Вся сетчатка:0.0019. Полосы ошибок показывают SEM. (B) Количественное определение DRIL, измеренное по изображениям OCT от нелазерированных контрольных групп и мышей RVO WT и KO iEC Casp9, а также мышей c57 / BL6J, у которых был RVO. На панелях ошибок отображается SEM. (C) Пример центра развертывания Office с метками каждого слоя сетчатки. Сокращения: DRIL = Дезорганизация внутренних слоев сетчатки; RVO = окклюзия вен сетчатки; WT = дикий тип; НОКАУТ = нокаут; GCL = Ганглиозный клеточный слой; IPL = внутренний плексиформный слой; INL = внутренний ядерный слой; OPL = внешний плексиформный слой; ONL = внешний ядерный слой; SEM = стандартная погрешность среднего значения; ОКТ = оптическая когерентная томография; ns = незначимый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Базовый лазерный выход (мВт) | Рекомендуемый экспериментальный лазерный выход (мВт) | Рекомендуемое время экспозиции (мс) |
| <11,0 или >15,0 | Выключите лазер и отрегулируйте волокно на конце, подключенном к лазерному блоку управления. Открутите его и слегка переместите вправо или влево. Измерьте результат еще раз, пока он не достигнет более высокого или более низкого значения. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Таблица 1: Низкая базовая мощность лазера может быть компенсирована более высокой экспериментальной лазерной мощностью. Изменения в базовом лазерном выходе и рекомендуемом экспериментальном лазерном выходе и времени экспозиции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель RVO для мышей предоставляет возможность для дальнейшего понимания патологии RVO и тестирования потенциальных терапевтических средств. В то время как модель RVO мыши широко используется в полевых условиях, существует потребность в текущем подробном протоколе модели, который учитывает ее изменчивость и описывает оптимизацию модели. Здесь мы предоставляем руководство с примерами из опыта о том, что может быть изменено, чтобы получить наиболее последовательные результаты в когорте экспериментальных животных и предоставить надежные данные.
Двумя наиболее важными элементами мышиной модели RVO являются лазерный выход и успешная внутривенная инъекция красителя фотосенсибилизатора. Чтобы произвести мощность, необходимую для индуцирования коагуляции, когда лазер направлен на определенную вену, выход лазера должен быть правильно отрегулирован. Хотя это может быть достигнуто с использованием методов, предложенных в методе, важно учитывать различия в настройке системы каждой лаборатории. Вариации волоконно-оптического кабеля и то, как он размещен по отношению к оборудованию и комнатной температуре, являются одними из переменных, которые могут объяснить низкую выходную мощность лазера. Для увеличения мощности лазера рекомендуются независимые настройки системы.
Тем не менее, это усилие неработоспособно без техники подходящей хвостовой вены для доставки красителя фотосенсибилизатора. Инъекции в хвостовые вены могут быть трудными для достижения, и это навык, для развития которого требуется время. Плохие инъекции могут привести к отсутствию окклюзии; в этом случае роза бенгальская может администрироваться через IP. Введение бенгальской розы через IP использовалось для моделирования RVO, но с более длительным временем лазерного облучения (3 с) и более высокой концентрацией розовой бенгальской кислоты (40 мг / мл) 11. Чтобы ограничить длительное лазерное облучение и конкретно нацелиться на сосудистую систему, хвостовая жилка является предпочтительным способом введения.
Эта модель также может быть выполнена с использованием других фотоактивируемых красителей, таких как Y эозин и флуоресцеин натрия 12,13,14, хотя розовый бенгальский является наиболее используемым фотоактивируемым красителем 4,5,6,8. Было показано, что все красители вызывают ранние признаки клинического заболевания, такие как кровоизлияние в сетчатку и отек сетчатки15. Было показано, что фотоактивируемые красители не оказывают неблагоприятного воздействия на животных, тем самым демонстрируя незначительную системную токсичность15,16. Следует также отметить, что выбранный краситель должен иметь максимум поглощения, совместимый с длиной волны используемого лазера. Роза Бенгальская имеет возбуждение при 525 нм17, флуоресцеин натрия при 475-490 нм18 и Y эозин при 490 нм19.
Основными источниками изменчивости в этой модели являются время фотоокклюзии относительно введения розовой бенгальи и базовый и экспериментальный лазерный выход. В то время как на рисунке 2 показаны 10- и 20-минутные временные точки для фотоокклюзии, также было проведено небольшое количество 5- и 15-минутных экспериментов (данные не показаны), что дало окклюзии, которые были не такими последовательными, как 10-минутная точка времени. Поэтому было выбрано 10 минут, чтобы быть оптимальным временем ожидания между введением розовой бенгальской розы и фотоокклюзией для этого метода. Тем не менее, исследования показали, что RVO также может быть индуцирован уже через 3 мин после введения розовой бенгалии5. Другим способом определения оптимального времени ожидания от розовой бенгальской розы до фотоокклюзии является мониторинг относительной концентрации розовой бенгальской кислоты с использованием режима флуоресцентной визуализации с фильтром тетраметилродамина (TRITC). Тем не менее, протокол, описанный здесь, может быть выполнен с использованием микроскопов визуализации сетчатки, которые не имеют фильтра TRITC.
Другим источником высокой изменчивости в этой модели является базовый лазерный выход. Поскольку повседневные уровни базовой лазерной мощности могут сильно отличаться, важно оценивать уровни перед каждым экспериментом. Стандартизация базового лазерного выхода в исследованиях может помочь потенцировать и расширить использование мышиной модели RVO. Переналадки оптоволоконного кабеля может быть достаточно для изменения базовых уровней; однако, если измерение мощностью 13,0 мВт не может быть достигнуто, в таблице 1 приводится руководство по компенсации с использованием экспериментальной мощности. Важно отметить, что, поскольку сетчатка является замкнутой системой, определение доли закупоренных вен (количество закупоренных вен, деленное на количество облученных вен) имеет важное значение для понимания, контроля и прогнозирования тяжести повреждения в модели RVO. Предыдущий анализ поврежденных показаний (DRIL и толщина сетчатки) коррелировал с фракцией закупоренных вен и прогнозировал атрофию сетчатки через 8 дней после RVO8. Таким образом, следует учитывать и оценивать фракцию закупоренных вен. До сих пор неясно, как другие промежуточные состояния окклюзии, такие как частично реперфузированные, частично закупоренные или вены, которые когда-то были закупорены и реперфузированы на 10 минут, способствуют развитию отека и атрофии сетчатки.
Дальнейшие исследования глаз с этими типами окклюзий могут помочь выяснить, необходима ли устойчивая окклюзия для существенного повреждения или даже преходящие окклюзии важны в этой модели. В зависимости от заданного экспериментального вопроса оптимальными будут различные скорости окклюзии. В большинстве случаев идеальна частота окклюзии 40-50%, что означает две или три окклюзии в глазу с шестью венами. Это обеспечивает значительную травму, но сетчатка неповреждена и может быть рассечена для иммуногистохимического и биохимического анализа.
Для определения этого уместно выделить патологический взгляд на успешную и репрезентативную окклюзию подписи РВО. Естественная окклюзия, представленная РВО, включает пламенные кровоизлияния20 (не путать с субретинальным кровоизлиянием), которые можно наблюдать в данной модели через 24 ч после травмы. Модель RVO также может привести к нежелательным повреждениям сетчатки (не отличающимся от патологии RVO), таким как те, которые показаны на рисунке 6B-F, если ее параметры не контролируются осторожно. Подход, который может быть принят, чтобы избежать этого, помимо регулирования концентрации розовой бенгальской розы и экспериментальной мощности лазера, заключается в прекращении облучения сосудов, которые имеют четкое образование тромба после первого или второго облучения.
Другими факторами, которые следует учитывать при использовании этой модели и принятии решения о том, какие вены следует закупорить, являются штамм мыши и диаметр сосуда. Некоторые штаммы мышей, такие как BALB/c, наиболее известные как альбиносы, восприимчивы к легким повреждениям21. Кроме того, у них есть дефицит развития сетчатки, который приводит к дефектам декуссации при зрительной хиазме и остроте зрения22,23. Рекомендуется полностью оценить базальную целостность сетчатки и сосудов неповрежденного контроля для штамма мыши, выбранного для исследований RVO. Исследования показали, что ширина вен может мешать развитию отека сетчатки и патологии заболевания24. Таким образом, следует использовать животных аналогичного веса, чтобы избежать дальнейшей изменчивости. Факторы исключения того, какие глаза использовать в исследовании, также будут зависеть от экспериментального вопроса. Может быть разумно включить любой глаз, который когда-то был закрыт, даже если он реперфузирован в момент последующего времени для передачи сигналов. Однако, если желательны стабильные окклюзии, эти глаза будут исключены. На рисунке 6 показаны примеры возможных критериев исключения или глаз, которые могут быть использованы для патологического анализа.
Чтобы показать, что эти лазерные установки не вызывали повреждений, а наблюдаемые эффекты действительно были обусловлены самими окклюзиями, в предыдущих исследованиях8 были проведены фиктивные контрольные группы. Фиктивные мыши все еще получали инъекцию розовой бенгальской розы, но были облучены в паренхиматозном пространстве между основными сосудами вместо облучения на вену. Это было важным шагом в обеспечении того, чтобы модель воспроизводила травмы RVO, наблюдаемые у пациентов, а не просто травмировала ткани лазером. Эти шамы не показывают активации каспазы-9 или -7 или любого отека, наблюдаемого у мышей, которые получали нормальное лазерное облучение сосудов, что указывает на то, что лазер не имел никаких побочных эффектов. Наличие этих элементов управления имеет важное значение, особенно если будут использоваться более высокие настройки лазера, чтобы гарантировать, что моделируемая травма является точным представлением желаемого повреждения8.
Мышиная модель RVO может быть применена для изучения других заболеваний, которые являются результатом гипоксически-ишемических повреждений в сетчатке и головном мозге, таких как диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных и инсульт. Кроме того, он может служить моделью для изучения сигнальных путей, имеющих отношение к развитию сосудистых повреждений, и тестирования потенциальных методов лечения, которые улучшают нейродегенерацию в центральной нервной системе. Оптимизация, разработанная в этом отчете, может ограничить изменчивость мышиной модели RVO и пролить свет на патофизиологию RVO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
- Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
- Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
- Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338 (2018).
- Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
- Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
- Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W.
- Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560 (2019).
- Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
- Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
- Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
- MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
- Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
- Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J.
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
