Summary
在这里，我们描述了使用孟加拉玫瑰和激光引导视网膜成像显微镜系统进行视网膜静脉阻塞的优化方案，并建议最大限度地提高其在转基因菌株中的可重复性。
Abstract
视网膜静脉阻塞（RVO）的小鼠模型通常用于眼科研究神经视网膜中的缺氧缺血损伤。在本报告中，提供了一种详细的方法，指出了关键步骤，并提供了优化建议，以在不同转基因小鼠品系中实现一致的成功闭塞率。RVO小鼠模型主要包括静脉内施用光敏剂染料，然后使用连接到眼科引导激光的视网膜成像显微镜进行激光光凝。三个变量被确定为遮挡一致性的决定因素。通过调整孟加拉玫瑰给药后的等待时间并平衡基线和实验激光输出，可以限制实验之间的变异性，并获得更高的遮挡成功率。该方法可用于研究以视网膜水肿和缺氧缺血性损伤为特征的视网膜疾病。此外，由于该模型诱导血管损伤，它也可以应用于研究神经脉管系统、神经元死亡和炎症。
Introduction
视网膜静脉阻塞 （RVO） 是一种常见的视网膜血管疾病，2015 年影响了全球约 2800 万人1。RVO导致工作的老年人和老年人视力下降和丧失，这是一种持续的视力威胁疾病，估计在近十年内会增加。RVO 的一些不同病变包括缺氧缺血性损伤、视网膜水肿、炎症和神经元丢失2。目前，这种疾病的一线治疗是通过给予血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂。虽然抗VEGF治疗有助于改善视网膜水肿，但许多患者仍面临视力下降3。为了进一步了解这种疾病的病理生理学并测试潜在的新治疗线，需要为不同的小鼠品系构建功能性和详细的RVO小鼠模型方案。
已经开发了小鼠模型，实现了与人类患者相同的激光设备，并与缩放到鼠标正确尺寸的成像系统配对。这种RVO小鼠模型于2007年首次报道4，并由Ebneter等人4，5进一步建立。最终，Fuma等人对该模型进行了优化，以复制RVO的关键临床表现，例如视网膜水肿6。自该模型首次报道以来，许多研究已经使用它，使用光敏染料，然后用激光对视网膜主要静脉进行光凝。然而，在使用这种方法的研究中，施用染料的数量和类型、激光功率和暴露时间差异很大。这些差异通常会导致模型的可变性增加，使其难以复制。迄今为止，还没有已发表的研究详细说明其优化的潜在途径。
本报告介绍了 C57BL/6J 菌株中的 RVO 小鼠模型的详细方法和他莫昔芬诱导的内皮半胱天冬酶 9 敲除 （iEC Casp9KO） 菌株，具有 C57BL/6J 背景，与 RVO 病理学相关，作为转基因小鼠的参考菌株。先前的一项研究表明，内皮半胱天冬酶-9的非凋亡激活会引起视网膜水肿并促进神经元死亡8。使用该菌株的经验有助于确定并提供对潜在修改的见解，以定制RVO小鼠模型，该模型可适用于其他转基因菌株。
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Protocol
该协议遵循视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿动物实验由哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准和监测。
注意：所有实验都使用重约20g的两个月大的雄性小鼠。
1.他莫昔芬用于絮状基因诱导遗传消融的制备和给药
注意：视网膜血管直径可能受动物体重的影响。确保用于实验的所有动物的体重相似。
- 将他莫昔芬在玉米油中稀释至20mg / mL的浓度。
注意：他莫昔芬是一种有毒物质，对光敏感。避光，例如用铝箔。 - 涡旋溶液几秒钟。
- 在55°C的烤箱中放置15分钟。
注意：确保他莫昔芬已完全溶解。可能需要额外的涡旋。 - 将溶液在4°C下储存长达1周。
- 使用装有 26 G 针头的 1 mL 注射器进行他莫昔芬注射。用70%乙醇清洁注射区域。 根据特定的诱导性Cre线，每天一次腹膜内（IP）给予2mg他莫昔芬（100μL的20mg / mL），在确定的时间内。
- 在开始实验之前，让动物休息两天。
2. 激光光凝试剂的制备
- 孟加拉玫瑰
注意：孟加拉玫瑰对光敏感。在黑暗中存放直至使用，并准备新鲜以获得最佳效果。- 通过在无菌盐水中将其稀释至5mg / mL来制备孟加拉玫瑰，并通过0.2μm注射器过滤器过滤。
- 准备装有26 G针头的1 mL注射器，其中装有孟加拉玫瑰。
- 氯胺酮/甲苯噻嗪
- 在无菌盐水中相应地稀释氯胺酮和甲苯噻嗪，浓度如下：氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（5-10mg / kg）。
- 卡洛芬
- 在无菌盐水中将卡洛芬稀释至 1 mg/mL。
- 准备装有 26 G 卡洛芬针头的 1 mL 注射器。
- 无菌生理盐水
- 准备装有无菌盐水的 26 G 针头的 5 mL 注射器。
3. 激光设置
- 轻轻处理光纤电缆并将其连接到视网膜成像显微镜的激光控制盒和激光适配器。
- 打开视网膜成像显微镜灯盒。
- 打开计算机并打开映像程序。
- 使用一张白纸将其放在鼠标目镜前，然后单击成像程序中的 “调整”来调整 白平衡。
- 通过转动钥匙并按照激光控制盒屏幕上的说明打开激光控制盒。
注意：本实验中使用的激光是3B级，可能会造成眼睛损伤。操作激光器时佩戴护目镜。 - 验证基线激光功率。
- 使用激光功率计。
- 将激光控制盒的屏幕调整为以下参数：50 mW 和 2，000 ms。
- 打开激光并将功率计放在目镜前面。
注意：在测试基线激光功率时，请确保显微镜灯关闭。 - 踩下脚踏踏板以激活激光。
- 目标是激光功率读数为 13-15 mW。
注意：激光功率读数将决定视网膜静脉阻塞的成功率。如果激光功率读数太低，可以调整激光曝光的功率和时间。有关建议，请参阅 表 1 。
- 通过为以下参数设置激光 控制盒的屏幕 来调整实验激光功率：100 mW，1，000 ms。
- 关闭激光。
注意：为了安全起见并防止过热，最好在鼠标之间关闭激光。
4.鼠尾静脉注射孟加拉玫瑰
- 将 300 mL 水倒入 500 mL 烧杯中。
- 在微波炉中加热烧杯1分钟。
- 将纱布放入烧杯的温水中。
- 将鼠标放入约束器中。
- 将纱布轻轻按入鼠标尾巴，寻找扩张的静脉。温水扩张后，使用酒精擦拭对注射部位进行消毒。
- 将针头插入注射部位并拉动注射器以确保您在静脉中。然后，注射小鼠尾静脉，根据动物的体重（37.5mg / kg）施用正确的量。在注射部位施加压力以避免血肿或出血。擦除站点。
- 将鼠标从约束器中释放并放回笼子中。
- 在注射麻醉剂之前，让孟加拉玫瑰循环8分钟。
注意：这将在孟加拉玫瑰注射和激光照射之间提供总共10分钟。
5.大静脉闭塞
- 打开加热的鼠标平台。
- 每只眼睛加入一滴去氧肾上腺素和托吡卡胺。
- 注射 150 μL 麻醉剂、氯胺酮 （80-100 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （5-10 mg/kg） IP。
注意：在此过程中，鼠标被给予两次IP注入。因此，双方交替进行。麻醉用腹腔注射至右下腹，生理盐水注射至左下腹。建议在注射前拉动注射器，以确保针头在腹部而不是任何器官。 - 用脚趾捏住动物以确定麻醉深度，然后等到它没有反应。
- 每只眼睛加入一滴盐酸丙帕卡因（镇痛药）。
- 在双眼中添加凝胶软膏。
- 在耳朵之间皮下注射 150 μL 卡洛芬。
- 将鼠标放在平台上。
- 调整平台，直到视网膜眼底的视野清晰且聚焦。
- 计数视网膜静脉并拍摄眼底图像。
注意：视网膜静脉比动脉更暗更宽。静脉和动脉交替;然而，有时可能有一个靠近视神经的分支动脉，因此有两个相邻的动脉。 - 打开激光，对准距离视盘约375μm的视网膜静脉。
- 通过按下脚踏开关并将激光束稍微移动到 100 μm 来照射容器。重复此步骤三次，并在每个脉冲后移动激光束，以使照射不会聚焦在一个点上。
- 对其他主要血管重复照射，以达到2-3次闭塞。
6. 确定第 0 天阻塞的静脉数量
- 照射容器后关闭灯并等待10分钟。
注意：光照会导致视网膜损伤和炎症;在等待期间关闭灯，以尽量减少暴露7. - 重新打开灯并计算阻塞的静脉数量。
- 拍摄眼底图像。
7. 善后
- 注入 1 mL 无菌盐水 IP。
注意：请参阅第 5 节步骤 3 中的 IP 注入详细信息。 - 在双眼中添加润滑性眼药水。
- 在双眼中添加凝胶软膏。
- 观察小鼠从麻醉中恢复，并且在完全恢复之前不要将其与其他动物一起放回笼子。卡洛芬（5毫克/千克）可以在手术后2天内每天服用。如果应用于人类，疼痛不是RVO的症状。
注意：在动物从麻醉中完全恢复之前，不要让它们无人看管。
8. 通过光学相干断层扫描（OCT）评估视网膜水肿
注意：此步骤可以在调查员感兴趣的时间点完成。C57BL / 6J小鼠的视网膜水肿峰值是RVO手术后1天。此时间点可能因鼠标的背景而异。
- 打开视网膜成像显微镜灯箱、OCT机和加热鼠标平台。
- 遮挡后的第二天，按照步骤5.2至5.7准备动物。
- 打开映像和 OCT 软件程序。
- 在 OCT 程序中，将微移调整为 5。
- 在烧伤远端75μm处取OCT或点击4次。
- 在视网膜的四个象限拍摄OCT图像。
- 使用跟踪软件分析 OCT 图像。
- 将预照射测量的视网膜厚度与RVO后1天或感兴趣的时间点进行比较。
注意：在分析数据时，请考虑照射的静脉数量，因为这会影响视网膜水肿的发展。然后通过施用麻醉剂然后进行灌注非生存手术对动物实施安乐死。
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Representative Results
RVO小鼠模型旨在成功实现视网膜静脉闭塞，导致缺氧缺血损伤，血液视网膜屏障破裂，神经元死亡和视网膜水肿8。 图1 显示了确保可重复性的步骤时间表，实验设计的示意图，并概述了可以根据实验问题进一步优化的步骤。可以修改的三个主要步骤是孟加拉玫瑰给药后的等待时间、基线激光功率和实验激光输出。在本报告中，C57BL / 6J小鼠以及来自诱导性内皮细胞半胱天冬酶-9敲除小鼠系（iEC Casp9）的WT和KO同窝小鼠用于确定不同菌株的最佳设置。
从孟加拉玫瑰注射到激光照射的等待时间可以改变静脉光凝的成功率。等待时间太短可能导致静脉内孟加拉玫瑰浓度低，而等待时间过长会导致孟加拉玫瑰从视网膜循环中清除。这两种情况都可能导致光凝不良和闭塞不成功。当测试激光照射后立即获得的遮挡次数时，比较孟加拉玫瑰给药后10和20分钟激光照射的动物发现，实现的遮挡数量没有差异（图2B）。然而，在与基因型无关的孟加拉玫瑰给药后20分钟激光照射的动物中，RVO后长达1天的闭塞数量显着减少。这一结果表明，在研究急性RVO诱导的损伤时，孟加拉玫瑰给药后的等待时间会影响闭塞稳定性。静脉早期再灌注（受伤后24小时之前）可能会影响视网膜水肿的发展，因此，应通过确定从孟加拉玫瑰给药到激光照射的正确等待时间来控制。
原则上，成功的光凝导致闭塞是由激光功率驱动的。尽管这是流程中如此重要的部分，但它也是模型中可变性的最大来源之一，应进行优化以实现一致性。为此，建议在向小鼠注射孟加拉玫瑰之前在设置期间测量激光输出。基准激光功率的推荐输出在 13.0 和 15.0 mW 之间。低基线激光功率，例如11.5 mW，而不改变实验功率（100 mW），导致没有遮挡，如图 3所示。相比之下，基线激光输出为13.5 mW，实验功率为100 mW，导致成功遮挡。在激光输出低于13.0 mW的情况下，实验功率增加到110 mW，以实现与较高基线激光输出相同的成功遮挡。通常，100 mW 是标准实验功率;但是，如果激光输出低于13.0 mW，则可以通过使用 表1中推荐的范围修改实验功率来补偿。
已经注意到四种主要类型的闭塞发生在静脉的激光光凝后。这些类型的闭塞总结在 图4A 中，并根据血流量进行分类;血管完全闭塞（无血流）、部分闭塞血管（大部分阻塞，偶尔血流阻塞）、部分再灌注（不间断的稳定血流受阻）和完全再灌注血管（无明显梗阻）。为了研究遮挡类型是否根据基因型而变化，并确定每个遮挡状态所花费的时间，评估了激光照射后10分钟的视频。该评估有助于确定iEC Casp9小鼠的辐照脉管系统在部分再灌注和部分闭塞状态下花费的时间比C57BL6 / J更长，C57BL6 / J在完全闭塞状态下花费的时间更长（图4B）。
图5 显示了血管的闭塞状态如何在激光光凝后的前10分钟内迅速变化。一旦这最初的10分钟过去，闭塞就会稳定下来并保持24小时的时间点。因此，为了评估每只眼睛准确的初始遮挡次数，建议在照射后等待10分钟。先前对该模型的评估确定，大多数遮挡在照射后 8 天重新灌注8;然而，每天再灌注的闭塞率可能因菌株而异，必须在每个实验模型中确定。这里介绍的模型是急性损伤，旨在用于了解导致水肿的途径，水肿在闭塞后24小时内发展。RVO的另一个特征是火焰状出血，可以在受伤后24小时观察到，如图 5所示。
RVO后24小时的随访可能会揭示RVO方法可能导致的其他眼科病变。有些包括但不限于视网膜下出血（以持续血斑为特征）、视网膜脱离、完全缺血性视网膜（静脉和动脉无血流）和白内障。图 6 显示了具有相应OCT的眼底图像作为示例，除了形成白内障的眼睛（图6F），因为在存在白内障的情况下无法进行OCT。 图6A 显示了未受伤的眼睛的眼底图像和OCT的示例，以供参考。
该模型中RVO的主要形态病理学是视网膜水肿。为了评估视网膜水肿的水平，建议在RVO程序当天之前和感兴趣的时间点拍摄OCT图像以进行基线读数。图7显示了受伤眼睛视网膜水肿的OCT定量。用于确定神经元层状态的另一种方法是评估视网膜内层（DRIL）的紊乱。这是临床环境中使用的一种测量，代表毛细血管非灌注，这是RVO5，9，10的另一个标志。这种评估的一个例子可以在图7B中找到。图7C显示了OCT图像的示例，每个视网膜层都有相应的标签。
图 1：RVO 鼠标模型的时间线和示意图。 （A）从孟加拉玫瑰给药到闭塞静脉成像的事件时间表。（B）实现成功视网膜静脉光凝的方法的总结表示。红框代表过程中的重要步骤，这些步骤是高度可变的，可以根据鼠标模型和感兴趣的问题进行优化。（C）与动脉（A）相比，视网膜大静脉（V）更宽更暗。每个主要静脉将用 532 nm、光斑尺寸 50 μm、功率 100 mW、持续时间 1 秒、总能量 0.3 J 和辐射曝光 15278.87 J/cm2 照射，距离视神经的平均距离为 375 μm。（D）激光应用导致眼底成像上可见约150μm的汽化气泡，并覆盖视网膜总面积的<4%。数字表示照射血管时激光束的建议位置和运动方向（箭头）。缩写：A = 动脉;V = 静脉;ON = 视神经。请点击此处查看此图的大图。
图 2：相对于孟加拉玫瑰给药的光遮挡时间对于成功的光凝至关重要。 （A）孟加拉玫瑰给药后10和20分钟光遮挡的iEC Casp9 WT和iEC Casp9 KO的眼底视网膜图像。白色圆圈代表成功闭塞的静脉。（B）照射后（0小时）和照射后1天立即闭塞的次数，照射10分钟和20分钟后玫瑰孟加拉注射联合基因型。韦尔奇t检验，误差线表示SEM。 （C）按基因型分隔的闭塞数。双向方差分析和费舍尔LSD测试;误差线表示 SEM。 缩写：WT = 野生类型;KO = 淘汰赛;SEM = 平均值的标准误差;方差分析 = 方差分析;LSD = 差异最小;ns = 不显著;P-RVO = 视网膜后静脉阻塞。请点击此处查看此图的大图。
图 3：测量基线和实验激光输出是成功光凝的关键步骤。 光凝后10分钟iEC Casp9 WT和iEC Casp9 KO的眼底视网膜图像;具有不同基线和实验激光输出水平的光遮挡。低基线激光输出可以通过实验激光输出（12.8 mW，110 mW）进行补偿。白色圆圈代表成功闭塞的静脉。缩写：WT = 野生类型;KO = 淘汰赛。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：RVO 方法会产生不同类型的遮挡。 （A）C57BL / 6J，iEC Casp9 WT和iEC Casp9 KO的视网膜眼底图像 10 分钟后，具有不同类型的闭塞：完全闭塞，部分闭塞，部分再灌注和完全再灌注。插图显示了导致光凝后特定类型闭塞的静脉聚焦视图。（B）在照射后的前10分钟内，量化每种基因型在不同闭塞状态下阻塞的静脉的百分比。十分钟的视频由两名对基因型不知情的研究人员进行评估，他们将数字分配给不同的闭塞状态（完全闭塞（-2），部分闭塞（-1），完全再灌注（2）和部分再灌注（1））。缩写：RVO = 视网膜静脉阻塞;WT = 野生型;KO = 淘汰赛。请点击此处查看此图的大图。
图 5：RVO 后遮挡的时间线。 激光照射后 C57BL/6J、iEC Casp9 WT 和 iEC Casp9 KO 的眼底视网膜图像 0、5 分钟、10 分钟和 24 小时。前 10 分钟对于闭塞状态至关重要，可能会迅速变化。初始10分钟后，闭塞稳定至少24小时。白色圆圈代表成功闭塞的静脉，黄色箭头代表火焰状出血。缩写：RVO = 视网膜静脉阻塞;WT = 野生型;KO = 淘汰赛。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：RVO 后可能发生不同的眼科病变。 （A-E） 显示眼底视网膜图像和相应的 OCT。 （A） 未接受 RVO 过程的未受伤眼睛的示例。（B）视网膜下出血，显示血液从眼底图像中的血管中泄漏出来。（C）OCT中眼底模糊的褶皱和视网膜的抬起可见的视网膜脱离。 （D）OCT中大量肿胀显示过度水肿。 （E）完全缺血的眼睛，血流完全受损，导致视网膜白色。（F）两种不同的白内障眼例，无法获得清晰的眼底图像和OCT。OCT 比例尺：100 μm。缩写：RVO = 视网膜静脉阻塞;OCT = 光学相干断层扫描。请点击此处查看此图的大图。
图 7：OCT 图像的量化。（A）检查未激光对照眼和经过RVO程序的眼睛中的层厚度和DRIL。GCL、IPL、INL、OPL、ONL、外段和整个视网膜测量。统计，曼-惠特尼检验 p 值：GCL：0.0070，IPL：0.0205，INL：<0.0001，OPL：0.0014，ONL：0.5582，外段：0.44852，整个视网膜：0.0019。误差条显示SEM。 （B）从未激光对照和RVO WT和KO iEC Casp9小鼠以及具有RVO的c57 / BL6J小鼠的OCT图像测量的DRIL定量。误差线显示SEM。 （C）带有每个视网膜层标签的示例OCT。缩写：DRIL = 视网膜内层的紊乱;RVO = 视网膜静脉阻塞;WT = 野生型;KO = 淘汰赛;GCL = 神经节细胞层;IPL = 内层丛状层;INL = 内核层;OPL = 外层丛状层;ONL = 外核层;SEM = 平均值的标准误差;OCT = 光学相干断层扫描;ns = 不显著。 请点击此处查看此图的大图。
| 基线激光输出（毫瓦） | 推荐的实验激光输出 （mW） | 推荐时间曝光（毫秒） |
| <11.0 或 >15.0 | 关闭激光器并调整连接到激光控制盒的一端的光纤。拧下它并稍微向右或向左移动。再次测量结果，直到达到更高或更低的值。 | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
表 1：低基线激光输出可以用较高的实验激光输出进行补偿。 基线激光输出和推荐的实验激光输出和曝光时间的变化。
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Discussion
小鼠RVO模型为进一步了解RVO病理学和测试潜在治疗方法提供了途径。虽然鼠标RVO模型在该领域被广泛使用，但需要模型的当前详细协议来解决其可变性并描述模型的优化。在这里，我们提供了一个指南，其中包含经验示例，说明可以改变哪些内容，以便在一组实验动物中获得最一致的结果，并提供可靠的数据。
RVO小鼠模型的两个最重要的元素是光敏染料的激光输出和成功静脉注射。当激光对准特定静脉时，为了产生诱导凝血所需的功率，必须适当调整激光输出。虽然这可以使用方法中建议的技术来实现，但重要的是要考虑每个实验室系统设置的差异。光纤电缆的变化以及它如何适应与设备和室温的关系是可以解释低激光输出的一些变量。建议对系统设置进行独立调整，以增加激光输出。
然而，如果没有适当的尾脉技术来输送光敏染料，这项工作是无法操作的。尾静脉注射可能很难实现，这是一项需要时间培养的技能。注射不良会导致无阻塞;在这种情况下，孟加拉玫瑰可以通过IP进行管理。通过IP给予孟加拉玫瑰已被用于模拟RVO，但激光照射时间更长（3秒）和孟加拉玫瑰浓度更高（40mg / mL）11。为了限制长时间的激光照射并专门针对脉管系统，尾静脉是首选的给药方式。
该模型也可以使用其他光活化染料（如Y伊红和荧光素钠12，13，14）来完成，尽管孟加拉玫瑰是最常用的光活化染料4，5，6，8。所有染料均已被证明可产生临床疾病的早期特征，例如视网膜出血和视网膜水肿15。光活化染料已被证明对动物没有不利影响，因此显示出微不足道的系统毒性15，16。还应该注意的是，选择的染料应具有与所用激光波长相容的最大吸收率。孟加拉玫瑰在525nm17处具有激发，荧光素钠在475-490nm 18处具有激发，Y曙红在490 nm19处具有激发。
该模型中变异性的主要来源是相对于孟加拉玫瑰给药的光遮挡时间以及基线和实验激光输出。虽然 图2 显示了光遮挡的10分钟和20分钟时间点，但也进行了少量5分钟和15分钟的实验（数据未显示），产生的遮挡不像10分钟时间点那样一致。因此，选择10 min作为该方法从孟加拉玫瑰给药和光遮挡之间的最佳等待时间。然而，有研究报道，RVO也可以在给予孟加拉玫瑰5后3分钟诱导。确定从孟加拉玫瑰到光遮挡的小鼠品系特异性最佳等待时间的另一种方法是使用带有四甲基罗丹明（TRITC）滤光片的荧光成像模式监测相对孟加拉玫瑰浓度。然而，这里描述的方案可以使用没有TRITC滤光片的视网膜成像显微镜进行。
该模型中高可变性的另一个来源是基线激光输出。由于基线激光输出的日常水平可能大不相同，因此在每次实验之前评估水平非常重要。标准化研究中的基线激光输出有助于增强和扩展RVO小鼠模型的使用。重新调整光缆足以修改基线水平;但是，如果无法达到13.0 mW的测量值，表 1 提供了使用实验功率进行补偿的指南。需要注意的是，由于视网膜是一个封闭系统，因此确定阻塞的静脉比例（阻塞的静脉数除以照射的静脉数）对于理解、控制和预测RVO模型中损伤的严重程度至关重要。先前对受损读数（DRIL 和视网膜厚度）的分析与 RVO8 后 8 天闭塞和预测的视网膜萎缩的静脉比例相关。因此，应考虑和评估阻塞的静脉比例。目前尚不清楚其他中间闭塞状态，例如部分再灌注，部分闭塞或曾经被阻塞并在10分钟内再灌注的静脉，如何促进视网膜水肿和萎缩的发展。
对这些类型遮挡的眼睛的进一步研究可以帮助调查持续遮挡对于实质性损伤是否必要，或者甚至短暂的遮挡在该模型中是否很重要。根据所提出的实验问题，不同的闭塞率将是最佳的。在大多数情况下，40-50%的闭塞率是理想的，这意味着在有六条静脉的眼睛中有两个或三个闭塞。这确保了实质性损伤，但视网膜完好无损，可以解剖以进行免疫组织化学和生化分析。
为了确定这一点，区分RVO特征成功和代表性闭塞的病理学观点是相关的。RVO呈现的自然闭塞包括火焰形出血20（不要与视网膜下出血混淆），可以在受伤后24 小时在该模型中观察到。如果不谨慎控制RVO模型的参数，还可能导致不必要的视网膜损伤（不是RVO病理学的特征），例如 图6B-F所示。除了调节孟加拉玫瑰的浓度和实验激光功率外，可以采取的一种避免这些的方法是停止照射在第一次或第二次照射后具有明显血栓形成的血管。
采用此模型并决定阻塞哪些静脉时要考虑的其他因素是小鼠菌株和血管直径。一些小鼠品系，如BALB / c，通常被称为白化病，容易受到光损伤21。此外，他们有视网膜发育缺陷，导致视交叉和视力的脱落缺陷22，23。建议全面评估未受伤对照组的基础视网膜和血管完整性，以用于RVO研究的小鼠品系。研究表明，静脉宽度可以干扰视网膜水肿和疾病病理的发展24。因此，应使用体重相似的动物以避免进一步的变异。在研究中使用哪种眼睛的排除因素也将取决于实验问题。明智的做法是包括任何曾经被遮挡的眼睛，即使它在后续时间点重新灌注以发出信号。但是，如果需要稳定的遮挡，这些眼睛将被排除在外。 图6 显示了可用于病理分析的可能的排除标准或眼睛的示例。
为了证明这些激光设置不会造成损害，并且看到的效果确实是由遮挡本身驱动的，在以前的研究中进行了假控制8。假小鼠仍然接受孟加拉玫瑰的尾静脉注射，但在主要血管之间的实质空间中照射而不是在静脉上照射。这是确保模型复制患者身上看到的RVO损伤而不是简单地用激光损伤组织的重要一步。这些假手术没有显示半胱天冬酶-9或-7的激活，也没有在接受正常激光照射到血管的小鼠中看到的任何水肿，表明激光没有任何不良反应。拥有这些控制至关重要，特别是如果使用更高的激光设置来确保所建模的伤害准确表示所需的损伤8。
RVO小鼠模型可用于研究由视网膜和大脑缺氧缺血损伤引起的其他疾病，例如糖尿病视网膜病变，早产儿视网膜病变和中风。此外，它可以作为一个模型来研究与血管损伤发展相关的信号通路，并测试改善中枢神经系统神经变性的潜在治疗方法。本报告中定制的优化可以限制小鼠RVO模型中的变异性，并阐明RVO的病理生理学。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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- Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
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