Summary
Her beskriver vi en optimeret protokol til retinal veneokklusion ved hjælp af rose bengal og et laserstyret retinal billeddannelsesmikroskopsystem med anbefalinger for at maksimere dets reproducerbarhed i genetisk modificerede stammer.
Abstract
Musemodeller af retinal veneokklusion (RVO) bruges ofte i oftalmologi til at studere hypoxisk-iskæmisk skade i nethinden i nethinden . I denne rapport gives en detaljeret metode, der påpeger kritiske trin, med anbefalinger til optimering for at opnå konsekvent vellykkede okklusionshastigheder på tværs af forskellige genetisk modificerede musestammer. RVO musemodellen består primært af intravenøs administration af et fotosensibiliserende farvestof efterfulgt af laserfotokoagulation ved hjælp af et retinal billedmikroskop fastgjort til en oftalmisk guidet laser. Tre variabler blev identificeret som determinanter for okklusionskonsistens. Ved at justere ventetiden efter administration af rosenbengalen og afbalancere baseline og eksperimentel laseroutput kan variabiliteten på tværs af eksperimenter begrænses, og der opnås en højere succesrate for okklusioner. Denne metode kan bruges til at studere retinale sygdomme, der er karakteriseret ved retinal ødem og hypoxisk-iskæmisk skade. Derudover, da denne model inducerer vaskulær skade, kan den også anvendes til at studere neurovaskulaturen, neuronal død og betændelse.
Introduction
Retinal veneokklusion (RVO) er en almindelig retinal vaskulær sygdom, der ramte ca. 28 millioner mennesker verden over i 20151. RVO fører til synstab og tab hos voksne og ældre i den erhvervsaktive alder, hvilket repræsenterer en igangværende synstruende sygdom, der anslås at stige i løbet af det nærmeste årti. Nogle af de forskellige patologier af RVO omfatter hypoxisk-iskæmisk skade, retinal ødem, inflammation og neuronalt tab2. I øjeblikket er den første behandlingslinje for denne lidelse gennem administration af vaskulære endotelvækstfaktorhæmmere (VEGF). Mens anti-VEGF-behandling har hjulpet med at forbedre nethindeødem, står mange patienter stadig over for synsfald3. For yderligere at forstå patofysiologien af denne sygdom og for at teste potentielle nye behandlingslinjer er der behov for at udgøre en funktionel og detaljeret RVO musemodelprotokol for forskellige musestammer.
Musemodeller er blevet udviklet til implementering af den samme laserenhed, der anvendes til menneskelige patienter, parret med et billeddannelsessystem, der er skaleret til den korrekte størrelse for en mus. Denne musemodel af RVO blev først rapporteret i 2007 4 og yderligere etableret af Ebneter og andre 4,5. Til sidst blev modellen optimeret af Fuma et al. til at replikere vigtige kliniske manifestationer af RVO såsom nethindeødem6. Siden modellen først blev rapporteret, har mange undersøgelser anvendt den ved hjælp af administration af et fotosensibiliserende farvestof efterfulgt af fotokoagulation af større retinale vener med en laser. Imidlertid varierer mængden og typen af farvestoffet, der administreres, laserkraft og eksponeringstid betydeligt på tværs af undersøgelser, der har brugt denne metode. Disse forskelle kan ofte føre til øget variation i modellen, hvilket gør den vanskelig at replikere. Til dato er der ingen offentliggjorte undersøgelser med specifikke detaljer om potentielle muligheder for optimering.
Denne rapport præsenterer en detaljeret metodologi for RVO musemodellen i C57BL/6J stammen og en tamoxifen-inducerbar endotel-caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stamme med en C57BL/6J baggrund og af relevans for RVO patologi som referencestamme for en genetisk modificeret mus. En tidligere undersøgelse havde vist, at ikke-apoptotisk aktivering af endotel-caspase-9 anstifter retinal ødem og fremmer neuronal død8. Erfaring med at bruge denne stamme hjalp med at bestemme og give indsigt i potentielle ændringer for at skræddersy RVO musemodellen, som kan anvendes til andre genetisk modificerede stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger erklæringen fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) om brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. Gnaverforsøg blev godkendt og overvåget af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Columbia University.
BEMÆRK: Alle forsøg brugte to måneder gamle hanmus, der vejede ca. 20 g.
1. Forberedelse og administration af tamoxifen til inducerbar genetisk ablation af floxede gener
BEMÆRK: Nethindebeholderens diameter kan påvirkes af dyrets vægt. Sørg for, at alle dyr, der anvendes til et forsøg, har samme vægt.
- Fortynd tamoxifen i majsolie til en koncentration på 20 mg / ml.
BEMÆRK: Tamoxifen er et giftstof og er lysfølsomt. Beskyt mod lys, f.eks. med aluminiumsfolie. - Vortex opløsningen i et par sekunder.
- Lad stå i ovnen ved 55 °C i 15 min.
BEMÆRK: Sørg for, at tamoxifen er opløst helt. Yderligere hvirvel kan være nødvendig. - Opbevar opløsningen ved 4 °C i op til 1 uge.
- Brug en 1 ml sprøjte forsynet med en 26 G kanyle til tamoxifen injektion. Rengør injektionsområdet med 70% ethanol. Administrer 2 mg tamoxifen (100 μL af 20 mg / ml) intraperitonealt (IP) en gang dagligt i den etablerede tid i henhold til den specifikke inducerbare Cre-linje.
- Lad dyrene hvile to dage, inden forsøgene påbegyndes.
2. Fremstilling af reagenser til laserfotokoagulation
- Rose bengal
BEMÆRK: Rose bengal er lysfølsom. Opbevares mørkt indtil brug og tilberedes frisk for at opnå de bedste resultater.- Forbered rose bengal ved at fortynde det til 5 mg / ml i sterilt saltvand og filtrer det gennem et 0,2 μm sprøjtefilter.
- Klargør en 1 ml sprøjte forsynet med en 26 G kanyle med bengalrosen.
- Ketamin / xylazin
- Ketamin og xylazin fortyndes i sterilt saltvand i overensstemmelse hermed for følgende koncentrationer: ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (5-10 mg/kg).
- Carprofen
- Carprofen fortyndes til 1 mg/ml i sterilt saltvand.
- Klargør en 1 ml sprøjte forsynet med en 26 G kanyle med carprofen.
- Sterilt saltvand
- Klargør en 5 ml sprøjte forsynet med en 26 G kanyle med sterilt saltvand.
3. Laser opsætning
- Håndter forsigtigt det fiberoptiske kabel, og tilslut det til laserkontrolboksen og laseradapteren i retinalbilledmikroskopet.
- Tænd lampeboksen til retinal billedmikroskop.
- Tænd computeren, og åbn billedbehandlingsprogrammet.
- Juster hvidbalancen ved at bruge et stykke hvidt papir og sætte det foran museøjestykket og klikke på Juster i billedbehandlingsprogrammet.
- Tænd laserkontrolboksen ved at dreje nøglen og følge instruktionerne på skærmen i laserkontrolboksen.
BEMÆRK: Den laser, der anvendes i dette eksperiment, er klasse 3B og kan forårsage øjenskade. Brug beskyttelsesbriller, når du betjener laseren. - Kontroller baseline-lasereffekten.
- Brug en lasereffektmåler.
- Juster skærmen på laserkontrolboksen til følgende parametre: 50 mW og 2.000 ms.
- Tænd laseren, og placer effektmåleren foran okularet.
BEMÆRK: Sørg for, at mikroskoplyset er slukket, mens du tester baseline lasereffekt. - Tryk på fodkontaktpedalen for at aktivere laseren.
- Målet er, at lasereffektudlæsningen skal være 13-15 mW.
BEMÆRK: Lasereffektaflæsningen bestemmer succesraten for retinale veneokklusioner. Hvis lasereffektudlæsningen er for lav, kan der foretages justeringer af effekten og tiden for lasereksponering. Se anbefalingerne i tabel 1 .
- Juster den eksperimentelle lasereffekt ved at indstille skærmen på laserkontrolboksen til følgende parametre: 100 mW, 1.000 ms.
- Sluk for laseren.
BEMÆRK: Af sikkerhedsmæssige årsager og for at forhindre overophedning er det bedst at holde laseren slukket mellem mus.
4. Musehaleveneinjektion af rose bengal
- Hæld 300 ml vand i et 500 ml bægerglas.
- Bægerglasset opvarmes i en mikrobølgeovn i 1 min.
- Sæt gasbind i varmt vand i bægerglasset.
- Sæt musen i en fastholdelse.
- Tryk forsigtigt gasbindet ind i musehalen og kig efter de udvidede vener. Desinficer injektionsstedet med en spritserviet efter varmtvandsudvidelsen.
- Indsæt kanylen på injektionsstedet og træk i sprøjten for at sikre, at du er i venen. Derefter injiceres musens halevene, idet den korrekte mængde administreres i henhold til dyrets vægt (37,5 mg / kg). Påfør tryk på injektionsstedet for at undgå hæmatom eller blødning. Tør webstedet.
- Slip musen fra fastholdelsen og returner den til buret.
- Tillad 8 minutter for rosen bengal at cirkulere før injektion af anæstetika.
BEMÆRK: Dette giver i alt 10 minutter mellem rosenbengalinjektionen og laserbestrålingen.
5. Okklusion af større vener
- Tænd for den opvarmede museplatform.
- Tilsæt en dråbe phenylephrin og tropicamid i hvert øje.
- Injicer 150 μL af anæstetika, ketamin (80-100 mg / kg) og xylazin (5-10 mg / kg) IP.
BEMÆRK: Under denne procedure fik musen to IP-injektioner. Derfor blev siderne skiftet. IP-injektionen til anæstesien blev givet i den nederste højre abdominale kvadrant, og saltvandet blev injiceret intp den nederste venstre abdominale kvadrant. Det anbefales at trække i sprøjten før injektion for at sikre, at nålen er i maven og ikke i nogen organer. - Toe-pinch dyret for at bestemme dybden af anæstesi og vente, indtil det ikke reagerer.
- Tilsæt en dråbe proparacainhydrochlorid pr. Øje (smertestillende).
- Tilsæt gelsalve til begge øjne.
- Der injiceres 150 μL carprofen subkutant mellem ørerne.
- Tilpas musen på platformen.
- Juster platformen, indtil visningen af retinal fundus er klar og fokuseret.
- Tæl retinale vener og tag et billede af fundus.
BEMÆRK: Nethindevener er mørkere og bredere end arterier. Vener og arterier veksler; Men nogle gange kan der være en forgrenet arterie tæt på synsnerven, og derfor to tilstødende arterier. - Tænd laseren, og sigt mod en retinal vene ca. 375 μm fra synsskiven.
- Bestråle beholderen ved at trykke på fodkontakten og bevæge laserstrålen let op til 100 μm. Gentag dette trin tre gange, og flyt laserstrålen efter hver puls, så bestrålingen ikke er fokuseret på ét sted.
- Gentag bestråling på andre større fartøjer for at opnå 2-3 okklusioner.
6. Fastlæggelse af antallet af vener, der er okkluderet på dag 0
- Sluk lampen efter bestråling af karrene, og vent i 10 min.
BEMÆRK: Lyseksponering kan forårsage retinal skade og betændelse; Sluk lampen i ventetiden for at minimere eksponeringen7. - Tænd lampen igen, og tæl antallet af tilhørte vener.
- Tag et billede af fundus.
7. Efterbehandling
- Injicer 1 ml steril saltvand IP.
BEMÆRK: Se oplysninger om IP-injektion i afsnit 5, trin 3. - Tilsæt smøremiddel øjendråber til begge øjne.
- Tilsæt gelsalve til begge øjne.
- Se musen, når den kommer sig efter anæstesi, og returner den ikke til buret med de andre dyr, før den er helt genoprettet. Carprofen (5 mg/kg) kan gives dagligt op til 2 dage efter indgrebet. Hvis det anvendes på mennesker, er smerte ikke et symptom på RVO.
BEMÆRK: Lad ikke dyrene være uden opsyn, før de er helt kommet sig efter anæstesi.
8. Vurdering af retinal ødem ved optisk kohærenstomografi (OCT)
BEMÆRK: Dette trin kan udføres på investigators interessepunkt. Toppen af retinal ødem for en C57BL/6J mus er 1 dag efter RVO proceduren. Dette tidspunkt kan variere afhængigt af musens baggrund.
- Tænd for retinal imaging mikroskop lysboks, OCT-maskinen og den opvarmede museplatform.
- Dagen efter okklusionen skal du følge trin 5.2 til 5.7 for at forberede dyret.
- Åbn billedbehandlings- og OCT-softwareprogrammerne.
- I OCT-programmet skal du justere skubbet til 5.
- Tag OCT ved 75 μm distal fra brændingen eller 4 klik.
- Tag OCT-billeder ved fire kvadranter i nethinden.
- Analyser OCT-billederne ved hjælp af sporingssoftware.
- Sammenlign retinaltykkelsen af præbestrålede foranstaltninger med 1 dag efter RVO eller på tidspunktet for interessepunktet.
BEMÆRK: Når du analyserer dataene, skal du tage hensyn til antallet af bestrålede vener, da dette kan påvirke udviklingen af nethindeødem. Dyr aflives derefter ved at administrere bedøvelsesmiddel efterfulgt af perfusion ikke-overlevelseskirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RVO musemodellen sigter mod med succes at opnå okklusioner i retinale vener, hvilket fører til hypoxisk-iskæmisk skade, nedbrydning af blodets retinale barriere, neuronal død og retinal ødem8. Figur 1 viser en tidslinje med trin for at sikre reproducerbarhed, et skema over det eksperimentelle design og skitserer trin, der kan optimeres yderligere afhængigt af de eksperimentelle spørgsmål. De tre vigtigste trin, der kan ændres, er ventetiden efter rosenbengaladministration, baseline laserkraft og eksperimentel laserudgang. I denne rapport blev C57BL/6J-mus samt WT- og KO-kuldkammerater fra en inducerbar endotelcelle caspase-9 knockout-muselinje (iEC Casp9) brugt til at bestemme de optimale indstillinger på tværs af forskellige stammer.
Ventetiden fra rosenbengalinjektion til laserbestråling kan ændre succesen med fotokoagulation i venerne. For kort ventetid kan resultere i lav rosenbengalkoncentration i venerne, mens for lang ventetid kan føre til, at rosenbengal ryddes fra nethindecirkulationen. Begge situationer kan føre til dårlig fotokoagulation og mislykkede okklusioner. Ved test af antallet af okklusioner opnået umiddelbart efter laserbestråling afslørede sammenligning af dyr, der blev laseret 10 og 20 minutter efter administration af rosenbengalen, at der ikke var nogen forskelle i antallet af opnåede okklusioner (figur 2B). Antallet af okklusioner, der blev opretholdt op til 1 dag efter RVO, faldt imidlertid signifikant hos dyr, der blev laseret 20 minutter efter administration af rosenbengal uafhængigt af genotype. Dette resultat tyder på, at når man studerer akut RVO-induceret skade, kan ventetiden efter administration af rosenbengalen påvirke okklusionsstabiliteten. Tidlig reperfusion af vener (før 24 timer efter skade) kan påvirke udviklingen af nethindeødem og bør derfor kontrolleres ved at bestemme den korrekte ventetid fra rosenbengaladministration til laserbestråling.
I princippet drives vellykket fotokoagulation, der fører til okklusion, af laserkraft. Selvom dette er en så vigtig del af processen, er det også en af de største kilder til variabilitet i modellen og bør optimeres for konsistens. For at opnå dette anbefales det at måle laseroutputtet under opsætningen, før musene injiceres med rose bengal. Den anbefalede effekt for basislasereffekten er mellem 13,0 og 15,0 mW. Lav baseline lasereffekt, såsom 11,5 mW, uden at ændre den eksperimentelle effekt (100 mW), resulterede i ingen okklusioner, som vist i figur 3. I modsætning hertil resulterede en baseline laserudgang på 13,5 mW med en eksperimentel effekt på 100 mW i vellykkede okklusioner. I tilfælde, hvor laseroutputtet var under 13,0 mW, blev forsøgseffekten øget til 110 mW for at opnå de samme vellykkede okklusioner som med højere baseline laseroutput. Typisk er 100 mW standard eksperimentel effekt; Men hvis laserudgangen er under 13,0 mW, kan den kompenseres ved at ændre den eksperimentelle effekt med de anbefalede intervaller i tabel 1.
Fire hovedtyper af okklusioner er blevet bemærket at forekomme efter laser fotokoagulation af venerne. Disse typer okklusioner er opsummeret i figur 4A og er klassificeret efter mængden af blodgennemstrømning; fuldt okkluderede kar (ingen blodgennemstrømning), delvist okkluderede kar (for det meste blokeret med lejlighedsvis strømning), delvist reperfuseret (uafbrudt stabil blodgennemstrømning med hindring) og fuldt reperfunderede kar (ingen åbenlys obstruktion overhovedet). For at undersøge, om typerne af okklusioner ændrer sig i henhold til genotypen og bestemme tidsforbruget pr. okklusionstilstand, blev 10 minutters videoer efter laserbestråling evalueret. Denne vurdering bidrog til at fastslå, at den bestrålede vaskulatur hos iEC Casp9-mus tilbringer mere tid i delvist reperfunderede og delvist okkluderede tilstande end C57BL6/J, som tilbringer mere tid i fuldt okkluderede tilstande (figur 4B).
Figur 5 viser, hvordan karrenes okklusionstilstand ændrer sig hurtigt inden for de første 10 minutter efter laserfotokoagulation. Når disse første 10 minutter er gået, stabiliseres okklusionerne og opretholdes op til et 24 timers tidspunkt. For at vurdere det nøjagtige indledende antal okklusioner pr. øje anbefales det således at vente i 10 minutter efter bestråling. En tidligere vurdering af denne model fastslog, at de fleste okklusioner reperfuse 8 dage efter bestråling8; Imidlertid kan hastigheden af okklusioner, der reperfuse pr. Dag, variere efter belastning og skal bestemmes i hver eksperimentel model. Modellen, der præsenteres her, er af akut skade og beregnet til at blive brugt til at forstå veje, der fører til ødem, som udvikler sig inden for 24 timer efter okklusioner. Et andet kendetegn ved RVO er flammeformede blødninger, som kan observeres 24 timer efter skade, som afbildet i figur 5.
Opfølgning 24 timer efter RVO kan afsløre andre oftalmiske patologier, der kan opstå som følge af RVO metoden. Nogle omfatter, men er ikke begrænset til, subretinal blødning (karakteriseret ved kontinuerlig blodplaster), nethindeløsning, fuldt iskæmisk nethinden (ingen blodgennemstrømning i vener og arterier) og grå stær. Figur 6 viser fundusbilleder med tilsvarende OLT som eksempler på disse, undtagen i øjne, hvor grå stær dannes (figur 6F), da OLT ikke kan udføres ved tilstedeværelse af grå stær. Figur 6A viser eksempler på, hvordan et fundusbillede og OCT af et uskadt øje ser ud som reference.
Den vigtigste morfologiske patologi af RVO i denne model er retinal ødem. For at vurdere niveauet af retinal ødem anbefales det at tage OCT-billeder før dagen for RVO-proceduren for en baseline-læsning og på tidspunktet af interesse. Figur 7 viser OCT-kvantificering af nethindeødem i skadede øjne. En anden foranstaltning, der bruges til at bestemme tilstanden af neuronale lag, er at vurdere desorganiseringen af retinale indre lag (DRIL). Dette er et mål, der anvendes i den kliniske indstilling, der repræsenterer kapillær nonperfusion, et andet kendetegn ved RVO 5,9,10. Et eksempel på denne vurdering findes i figur 7B. Figur 7C viser et eksempel på et OCT-billede med de tilsvarende etiketter for hvert nethindelag.
Figur 1: Tidslinje og skema for RVO musemodellen . (A) Tidslinje over begivenheder fra administration af rosenbengal til billeddannelse af okkluderede vener. (B) Opsummeret repræsentation af metoden til opnåelse af vellykket retinal venefotokoagulation. Røde bokse repræsenterer vigtige trin i processen, der er meget variable, og som kan optimeres pr. Musemodel og spørgsmål af interesse. (C) Retinale hovedvener (V) er bredere og mørkere sammenlignet med arterier (A). Hver større vene vil blive bestrålet med en guidet laser på 532 nm, spotstørrelse 50 μm, effekt 100 mW, varighed 1 s, total energi 0,3 J og strålingseksponering 15278,87 J / cm2 i en gennemsnitlig afstand på 375 μm fra synsnerven. (D) Laserapplikation forårsager en fordampningsboble, der er synlig på fundusbilleddannelse på ca. 150 μm og dækker <4% af det samlede retinale areal. Tal repræsenterer laserstrålens foreslåede placering og bevægelsesretning (pile) ved bestråling af kar. Forkortelser: A = arterie; V = vene; ON = optisk nerve. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tidspunktet for fotookklusion i forhold til rosenbengalsk administration er kritisk for vellykket fotokoagulation . (A) Fundus retinale billeder af iEC Casp9 WT og iEC Casp9 KO fotookkluderet 10 og 20 minutter efter administration af rosenbengalen. Hvide cirkler repræsenterer vener, der havde vellykkede okklusioner. B) Antal okklusioner umiddelbart efter bestråling (0 timer) og 1 dag efter bestråling i 10 minutter og 20 minutter efter rosenbengalinjektion af kombinerede genotyper. Welchs t-test, fejlbjælker angiver SEM. (C) Antal okklusioner adskilt efter genotype. tovejs ANOVA og Fishers LSD-test; fejlbjælker angiver SEM. Forkortelser: WT = vildtype; KO = knockout; SEM = standardfejl i middelværdien; ANOVA = variansanalyse; LSD = mindst signifikant forskel ns = ikke signifikant; P-RVO = post retinal veneokklusion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Måling af baseline og eksperimentel laseroutput er kritiske trin for vellykket fotokoagulation. Fundus retinale billeder af iEC Casp9 WT og iEC Casp9 KO 10 min efter fotokoagulation; foto-okkluderet med forskellige baseline og eksperimentelle laserudgangsniveauer. Lav baseline laseroutput kan kompenseres med eksperimentel laserudgang (12,8 mW, 110 mW). Hvide cirkler repræsenterer vener, der havde vellykkede okklusioner. Forkortelser: WT = vildtype; KO = knockout. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: RVO-metoden resulterer i forskellige typer okklusioner. (A) Fundus retinale billeder af C57BL/6J, iEC Casp9 WT og iEC Casp9 KO 10 min efter fotokoagulation med forskellige typer okklusioner: fuldt okkluderet, delvist okkluderet, delvist reperfuseret og fuldt reperfuseret. Indsatser viser et fokuseret billede af en vene, der resulterede i en bestemt type okklusion efter fotokoagulation. (B) Kvantificering af procentdelen af vener, der er okklusionstilstande i de forskellige okklusionstilstande for hver genotype i løbet af de første 10 minutter efter bestråling. Ti minutters videoer blev evalueret af to efterforskere, blindet for genotyper, der tildelte numre til de forskellige okklusionstilstande (fuldt okkluderet (-2), delvist okkluderet (-1), fuldt reperfuseret (2) og delvist reperfuseret (1)) pr. varighed. Forkortelser: RVO = retinal veneokklusion; WT = vildtype; KO = knockout. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Tidslinje for okklusioner efter RVO. Fundus retinale billeder af C57BL/6J, iEC Casp9 WT og iEC Casp9 KO 0, 5 min, 10 min og 24 timer efter laserbestråling. De første 10 minutter er kritiske for okklusionernes tilstand og kan ændre sig hurtigt. Efter de første 10 minutter er okklusionerne stabile op til mindst 24 timer. Hvide cirkler repræsenterer vener, der havde vellykkede okklusioner, og gule pilespidser skildrer flammeformede blødninger. Forkortelser: RVO = retinal veneokklusion; WT = vildtype; KO = knockout. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Forskellige oftalmiske patologier kan forekomme efter RVO. (A-E) viser fundus retinale billeder og tilsvarende OCT. (A) Et eksempel på et uskadt øje, der ikke gennemgik RVO-processen. (B) Subretinal blødning, der viser blod, der lækker ud af karrene i fundusbilledet. (C) Nethindeløsning set ved den slørede fold i fundus og løft af nethinden i OLT. (D) Overdreven ødem vist ved en stor mængde hævelse i OLT. (E) Et fuldt iskæmisk øje med fuldstændig nedsat blodgennemstrømning, der resulterer i en hvid nethinde. F) To forskellige eksempler på grå stær øje, hvor der ikke kunne opnås et klart fundusbillede og OLT. OCT skala barer: 100 μm. Forkortelser: RVO = retinal veneokklusion; OCT = optisk kohærenstomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Kvantificering af OLT-billeder. (A) Undersøgelse af lagtykkelsen og DRIL i ikke-laserede kontroløjne og øjne, der gennemgik RVO-proceduren. GCL, IPL, INL, OPL, ONL, Ydre segment og Whole Retina målinger. Statistik, Mann-Whitney test p-værdier: GCL: 0,0070, IPL: 0,0205, INL: <0,0001, OPL: 0,0014, ONL: 0,5582, ydre segment: 0,44852, hel nethinden: 0,0019. Fejlbjælker viser SEM. (B) DRIL-kvantificering målt fra OCT-billeder fra ikke-laserede kontroller og RVO WT- og KO iEC Casp9-mus samt c57/BL6J-mus, der havde RVO. Fejlbjælker viser SEM. (C) Eksempel OCT med etiketterne for hvert nethindelag. Forkortelser: DRIL = Disorganisering af de indre retinale lag; RVO = retinal veneokklusion; WT = vildtype; KO = knockout; GCL = ganglion cellelag; IPL = indre plexiformlag; INL = indre kernelag; OPL = ydre plexiformlag; ONL = ydre nukleare lag; SEM = standardfejl i middelværdien; OCT = optisk kohærenstomografi; ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Baseline laserudgang (mW) | Anbefalet eksperimentel laserudgang (mW) | Anbefalet tidseksponering (ms) |
| <11.0 eller >15.0 | Sluk for laseren, og juster fiberen i den ende, der er forbundet til laserkontrolboksen. Skru den af, og flyt den let mod højre eller venstre. Mål resultatet igen, indtil det når en højere eller lavere værdi. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Tabel 1: Lav baseline laseroutput kan kompenseres med højere eksperimentel laseroutput. Variationer i baseline laseroutput og anbefalet eksperimentel laserudgang og eksponeringstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Musens RVO-model giver en mulighed for yderligere at forstå RVO-patologi og teste potentielle terapi. Mens musens RVO-model er meget udbredt i marken, er der behov for en aktuel detaljeret protokol for modellen, der adresserer dens variabilitet og beskriver optimeringen af modellen. Her giver vi en guide med eksempler fra erfaringer på, hvad der kan ændres for at få de mest konsistente resultater på tværs af en kohorte af forsøgsdyr og give pålidelige data.
De to vigtigste elementer i RVO musemodellen er laseroutput og vellykket intravenøs injektion af fotosensibiliserende farvestof. For at producere den kraft, der er nødvendig for at inducere koagulation, når laseren er rettet mod en bestemt vene, skal laserudgangen justeres korrekt. Selvom dette kan opnås ved hjælp af de teknikker, der foreslås i metoden, er det vigtigt at overveje forskellene i hvert laboratoriums systemopsætning. Variationer af det fiberoptiske kabel, og hvordan det er indkvarteret i forhold til udstyret og stuetemperatur, er nogle af de variabler, der kan tegne sig for lav laserudgang. Uafhængige indstillinger til systemopsætningen anbefales for at øge laserudgangen.
Denne indsats er imidlertid ubrugelig uden en passende haleveneteknik til at levere fotosensibilisatorfarvestoffet. Haleveneinjektioner kan være vanskelige at opnå, og det er en færdighed, der tager tid at udvikle. Dårlige injektioner kan resultere i ingen okklusioner; i dette tilfælde kan rose bengal administreres via IP. Rose bengal administration via IP er blevet brugt til at modellere RVO men med en længere laserbestrålingstid (3 s) og højere rose bengal koncentration (40 mg / ml)11. For at begrænse langvarig laserbestråling og specifikt målrette vaskulaturen er halevener den foretrukne indgivelsesmåde.
Denne model kunne også opnås ved hjælp af andre fotoaktiverbare farvestoffer såsom Y eosin og natriumfluorescein12,13,14, selvom rose bengal er det mest anvendte fotoaktiverbare farvestof 4,5,6,8. Alle farvestoffer har vist sig at producere tidlige træk ved klinisk sygdom, såsom retinal blødning og retinal ødem15. Fotoaktiverbare farvestoffer har vist sig ikke at have nogen skadelige virkninger på dyrene og viser således ubetydelig systemtoksicitet15,16. Det skal også bemærkes, at det valgte farvestof skal have et absorptionsmaksimum, der er kompatibelt med bølgelængden af den anvendte laser. Rose Bengal har en excitation ved 525 nm17, natriumfluorescein ved 475-490 nm 18 og Y eosin ved 490 nm19.
De vigtigste kilder til variabilitet i denne model er tidspunktet for fotookklusion i forhold til rosenbengalsk administration og baseline og eksperimentel laserudgang. Mens figur 2 viser 10- og 20-minutters tidspunkter for foto-okklusion, blev der også udført et lille antal 5- og 15-minutters eksperimenter (data ikke vist), hvilket gav okklusioner, der ikke var så konsistente som 10 minutters tidspunktet. Derfor blev 10 min valgt til at være den optimale ventetid mellem rosenbengalsk administration og fotookklusion for denne metode. Undersøgelser har imidlertid rapporteret, at RVO også kan induceres så tidligt som 3 minutter efter administration af rose bengal5. En anden måde at bestemme musestammespecifik optimal ventetid fra rosenbengal til fotookklusion er at overvåge den relative rosenbengalkoncentration ved hjælp af fluorescensbilleddannelsestilstand med et tetramethylrhodamin (TRITC) filter. Imidlertid kan protokollen beskrevet her udføres ved hjælp af retinale billedmikroskoper, der ikke har et TRITC-filter.
Den anden kilde til høj variabilitet i denne model er baseline laseroutput. Da de daglige niveauer af baseline laseroutput kan være meget forskellige, er det vigtigt at vurdere niveauerne før hvert eksperiment. Standardisering af baseline-laseroutputtet på tværs af undersøgelser kan hjælpe med at forstærke og udvide brugen af RVO-musemodellen. Justering af fiberkablet kan være nok til at ændre basisniveauerne; Men hvis en måling på 13,0 mW ikke kan nås, giver tabel 1 en vejledning om kompensation ved hjælp af forsøgseffekten. Det er vigtigt at bemærke, at fordi nethinden er et lukket system, er det vigtigt at bestemme brøkdelen af vener okkluderet (antallet af vener udelukket divideret med antallet af bestrålede vener) for at forstå, kontrollere og forudsige sværhedsgraden af skaden i RVO-modellen. Tidligere analyse af beskadigede aflæsninger (DRIL og retinal tykkelse) korrelerede med den fraktion af vener, der var okkluderet, og forudsagt retinal atrofi 8 dage efter RVO8. Således bør fraktionen af vener okkluderet overvejes og evalueres. Det er stadig uklart, hvordan andre mellemliggende okklusionstilstande, såsom delvist reperfuserede, delvist okkluderede eller vener, der engang var okkluderet og reperfuseret med 10 minutter, bidrager til udviklingen af retinal ødem og atrofi.
Yderligere undersøgelser af øjnene med disse typer okklusioner kan hjælpe med at undersøge, om en vedvarende okklusion er nødvendig for væsentlig skade, eller om selv forbigående okklusioner er vigtige i denne model. Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål, der stilles, vil forskellige okklusionshastigheder være optimale. En okklusionshastighed på 40-50% er ideel i de fleste tilfælde, hvilket betyder to eller tre okklusioner i et øje med seks vener. Dette sikrer betydelig skade, men nethinden er intakt og kan dissekeres til immunhistokemiske og biokemiske analyser.
For at bestemme dette er det relevant at skelne mellem det patologiske syn på en vellykket og repræsentativ okklusion af RVO-signaturen. Den naturlige okklusion præsenteret af RVO inkluderer flammeformede blødninger 20 (ikke forveksles med subretinal blødning), som kan observeres i denne model24 timer efter skade. RVO -modellen kan også føre til uønskede retinale skader (ikke karakteristisk for RVO -patologi) som dem, der er vist i figur 6B-F, hvis dens parametre ikke kontrolleres forsigtigt. En tilgang, der kan tages for at undgå disse, udover at regulere koncentrationen af rosenbengal og den eksperimentelle laserkraft, er at stoppe bestråling af de kar, der har en klar dannelse af en trombose efter den første eller anden bestråling.
Andre faktorer, der skal overvejes, når man anvender denne model og beslutter, hvilke vener der skal okkluderes, er musestammen og beholderdiameteren. Nogle musestammer, såsom BALB / c, mest almindeligt kendt som albino, er modtagelige for lysskader21. Derudover har de retinale udviklingsunderskud, der fører til defekter i decussationen ved optisk chiasme og synsstyrke22,23. Det anbefales fuldt ud at evaluere basal retinal og vaskulær integritet af uskadte kontroller for den musestamme, der er valgt til RVO-undersøgelser. Undersøgelser har vist, at venebredde kan forstyrre udviklingen af retinal ødem og sygdomspatologi24. Derfor bør dyr med tilsvarende vægt anvendes for at undgå yderligere variabilitet. Udelukkelsesfaktorerne for, hvilke øjne der skal bruges i en undersøgelse, afhænger også af det eksperimentelle spørgsmål. Det kan være klogt at inkludere ethvert øje, der engang var okkluderet, selvom det reperfuseres på opfølgningstidspunktet for signalering. Men hvis der ønskes stabile okklusioner, vil disse øjne blive udelukket. Figur 6 viser eksempler på mulige eksklusionskriterier eller øjne, der kan bruges til patologisk analyse.
For at vise, at disse laserindstillinger ikke forårsagede skade, og at de observerede virkninger virkelig var drevet af selve okklusionerne, blev der udført falske kontroller i tidligere undersøgelser8. Skinmusene fik stadig en haleveneinjektion af rosenbengal, men blev bestrålet i parenkymrummet mellem de store kar i stedet for at blive bestrålet på venen. Dette var et vigtigt skridt i at sikre, at modellen replikerede RVO-skader, der ses hos patienter i stedet for blot at skade væv med en laser. Disse skam viser ingen aktivering af caspase-9 eller -7 eller noget af det ødem, der ses hos mus, der modtog normal laserbestråling til karrene, hvilket indikerer, at laseren ikke havde nogen bivirkninger. Det er vigtigt at have disse kontroller, især hvis højere laserindstillinger vil blive brugt til at sikre, at den skade, der modelleres, er en nøjagtig repræsentation af den ønskede skade8.
RVO musemodellen kan anvendes til at studere andre sygdomme, der skyldes hypoxisk-iskæmiske skader i nethinden og hjernen, såsom diabetisk retinopati, retinopati af præmaturitet og slagtilfælde. Derudover kan det tjene som en model, hvor man kan studere signalveje, der er relevante for udvikling af vaskulær skade og teste potentielle behandlinger, der forbedrer neurodegeneration i centralnervesystemet. Den optimering, der er skræddersyet i denne rapport, kan begrænse variabiliteten i musens RVO-model og kaste lys over RVO's patofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
- Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
- Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
- Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338 (2018).
- Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
- Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
- Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W.
- Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560 (2019).
- Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
- Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
- Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
- MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
- Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
- Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J.
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
