Summary
Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für den retinalen Venenverschluss unter Verwendung von Rose Bengal und einem lasergesteuerten retinalen Bildgebungsmikroskopsystem mit Empfehlungen zur Maximierung der Reproduzierbarkeit in gentechnisch veränderten Stämmen.
Abstract
Mausmodelle des retinalen Venenverschlusses (RVO) werden häufig in der Augenheilkunde verwendet, um hypoxisch-ischämische Verletzungen in der neuralen Netzhaut zu untersuchen. In diesem Bericht wird eine detaillierte Methode, die kritische Schritte aufzeigt, mit Empfehlungen zur Optimierung bereitgestellt, um konsistent erfolgreiche Okklusionsraten über verschiedene genetisch veränderte Mausstämme hinweg zu erreichen. Das RVO-Mausmodell besteht hauptsächlich aus der intravenösen Verabreichung eines Photosensibilisator-Farbstoffs, gefolgt von einer Laser-Photokoagulation unter Verwendung eines Netzhaut-Bildgebungsmikroskops, das an einem ophthalmogesteuerten Laser befestigt ist. Drei Variablen wurden als Determinanten der Okklusionskonsistenz identifiziert. Durch die Anpassung der Wartezeit nach der Verabreichung von Rosenbengalen und das Ausbalancieren der Basislinie und der experimentellen Laserleistung kann die Variabilität zwischen den Experimenten begrenzt und eine höhere Erfolgsrate von Okklusionen erreicht werden. Mit dieser Methode können Netzhauterkrankungen untersucht werden, die durch Netzhautödeme und hypoxisch-ischämische Verletzungen gekennzeichnet sind. Da dieses Modell Gefäßverletzungen induziert, kann es auch zur Untersuchung des Neurovaskulaturs, des neuronalen Todes und der Entzündung angewendet werden.
Introduction
Der retinale Venenverschluss (RVO) ist eine häufige retinale Gefäßerkrankung, von der im Jahr 2015 weltweit etwa 28 Millionen Menschen betroffen waren1. RVO führt bei Erwachsenen und älteren Menschen im erwerbsfähigen Alter zu einem Rückgang und Verlust der Sehkraft, was eine anhaltende sehgefährdende Krankheit darstellt, die im nächsten Jahrzehnt voraussichtlich zunehmen wird. Einige der unterschiedlichen Pathologien der RVO umfassen hypoxisch-ischämische Verletzungen, Netzhautödeme, Entzündungen und neuronalen Verlust2. Derzeit ist die erste Behandlungslinie für diese Erkrankung die Verabreichung von vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Inhibitoren (VEGF). Während die Anti-VEGF-Behandlung dazu beigetragen hat, Netzhautödeme zu verbessern, sind viele Patienten immer noch mit einem Rückgang des Sehvermögens konfrontiert3. Um die Pathophysiologie dieser Krankheit besser zu verstehen und mögliche neue Behandlungslinien zu testen, ist es notwendig, ein funktionelles und detailliertes RVO-Mausmodellprotokoll für verschiedene Mausstämme zu erstellen.
Es wurden Mausmodelle entwickelt, die das gleiche Lasergerät verwenden, das bei menschlichen Patienten verwendet wird, gepaart mit einem Bildgebungssystem, das auf die richtige Größe für eine Maus skaliert ist. Dieses Mausmodell der RVO wurde erstmals 20074 beschrieben und von Ebneter und anderen weiter etabliert 4,5. Schließlich wurde das Modell von Fuma et al. optimiert, um wichtige klinische Manifestationen von RVO wie das Netzhautödem6 zu replizieren. Seit das Modell zum ersten Mal berichtet wurde, haben viele Studien es mit der Verabreichung eines Photosensibilisator-Farbstoffs verwendet, gefolgt von der Photokoagulation der wichtigsten Netzhautvenen mit einem Laser. Die Menge und Art des verabreichten Farbstoffs, die Laserleistung und die Expositionszeit variieren jedoch signifikant zwischen den Studien, die diese Methode verwendet haben. Diese Unterschiede können oft zu einer erhöhten Variabilität des Modells führen, was die Replikation erschwert. Bis heute gibt es keine veröffentlichten Studien mit spezifischen Details über mögliche Wege zur Optimierung.
Dieser Bericht stellt eine detaillierte Methodik des RVO-Mausmodells im C57BL/6J-Stamm und einem Tamoxifen-induzierbaren endothelialen Caspase-9-Knockout-Stamm (iEC Casp9KO) mit einem C57BL/6J-Hintergrund vor, der für die RVO-Pathologie als Referenzstamm für eine genetisch veränderte Maus relevant ist. Eine frühere Studie hatte gezeigt, dass eine nicht-apoptotische Aktivierung der endothelialen Caspase-9 ein Netzhautödem auslöst und den neuronalen Tod fördert8. Die Erfahrung mit diesem Stamm half dabei, mögliche Modifikationen zu ermitteln und Einblicke in das RVO-Mausmodell zu geben, das auf andere genetisch veränderte Stämme anwendbar sein kann.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Nagetierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Columbia University genehmigt und überwacht.
HINWEIS: Alle Experimente verwendeten zwei Monate alte männliche Mäuse, die etwa 20 g wogen.
1. Herstellung und Verabreichung von Tamoxifen zur induzierbaren genetischen Ablation von gefloxten Genen
HINWEIS: Der Durchmesser des Netzhautgefäßes kann durch das Gewicht des Tieres beeinflusst werden. Stellen Sie sicher, dass alle Tiere, die für einen Versuch verwendet werden, ein ähnliches Gewicht haben.
- Verdünnen Sie Tamoxifen in Maisöl auf eine Konzentration von 20 mg / ml.
HINWEIS: Tamoxifen ist ein Giftstoff und ist lichtempfindlich. Vor Licht schützen, z.B. mit Alufolie. - Wirbeln Sie die Lösung für ein paar Sekunden vor.
- Im Ofen bei 55 °C 15 min ziehen lassen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich das Tamoxifen vollständig aufgelöst hat. Zusätzliches Wirbeln kann erforderlich sein. - Lagern Sie die Lösung bis zu 1 Woche bei 4 °C.
- Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel zur Tamoxifen-Injektion. Reinigen Sie den Injektionsbereich mit 70% Ethanol. Verabreichen Sie 2 mg Tamoxifen (100 μl von 20 mg/ml) intraperitoneal (IP) einmal täglich für die festgelegte Zeit gemäß der spezifischen induzierbaren Cre-Linie.
- Lassen Sie den Tieren zwei Tage Ruhe, bevor Sie mit den Versuchen beginnen.
2. Herstellung von Reagenzien für die Laser-Photokoagulation
- Rose Bengal
HINWEIS: Rose bengal ist lichtempfindlich. Bis zur Verwendung im Dunkeln aufbewahren und frisch zubereiten, um beste Ergebnisse zu erzielen.- Bereiten Sie Rosenbengalen vor, indem Sie es in steriler Kochsalzlösung auf 5 mg/ml verdünnen und durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtrieren.
- Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit Rosenbengalen versehen ist.
- Ketamin/Xylazin
- Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung entsprechend für folgende Konzentrationen verdünnen: Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg).
- Carprofen
- Verdünnen Sie Carprofen auf 1 mg/ml in steriler Kochsalzlösung.
- Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit Carprofen ausgestattet ist.
- Sterile Kochsalzlösung
- Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit steriler Kochsalzlösung versehen ist.
3. Laser-Setup
- Behandeln Sie das Lichtwellenleiterkabel vorsichtig und verbinden Sie es mit der Lasersteuerbox und dem Laseradapter des Netzhautmikroskops.
- Schalten Sie den Lampenkasten des Netzhautmikroskops ein.
- Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Imaging-Programm.
- Passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie es mit einem weißen Blatt Papier vor das Mausokular halten und im Bildgebungsprogramm auf Anpassen klicken.
- Schalten Sie die Lasersteuerbox ein, indem Sie den Schlüssel drehen und den Anweisungen auf dem Bildschirm der Lasersteuerbox folgen.
HINWEIS: Der in diesem Experiment verwendete Laser ist Klasse 3B und kann Augenschäden verursachen. Tragen Sie eine Schutzbrille, wenn Sie den Laser bedienen. - Überprüfen Sie die Basislaserleistung.
- Verwenden Sie einen Laserleistungsmesser.
- Stellen Sie den Bildschirm der Lasersteuerbox auf folgende Parameter ein: 50 mW und 2.000 ms.
- Schalten Sie den Laser ein und platzieren Sie den Leistungsmesser vor dem Okular.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Licht des Mikroskops ausgeschaltet ist, während Sie die Basislaserleistung testen. - Drücken Sie das Fußschalterpedal, um den Laser zu aktivieren.
- Die Laserleistung soll 13-15 mW betragen.
HINWEIS: Die Anzeige der Laserleistung bestimmt die Erfolgsrate bei Netzhautvenenverschlüssen. Wenn die Laserleistung zu niedrig ist, können Anpassungen an der Leistung und dem Zeitpunkt der Laserbelichtung vorgenommen werden. Empfehlungen finden Sie in Tabelle 1 .
- Passen Sie die experimentelle Laserleistung an, indem Sie den Bildschirm der Lasersteuerbox für die folgenden Parameter einrichten: 100 mW, 1.000 ms.
- Schalten Sie den Laser aus.
HINWEIS: Aus Sicherheitsgründen und um eine Überhitzung zu vermeiden, ist es am besten, den Laser zwischen den Mäusen ausgeschaltet zu lassen.
4. Mausschwanzvenen-Injektion von Rose Bengal
- Gießen Sie 300 ml Wasser in ein 500-ml-Becherglas.
- Erwärmen Sie das Becherglas in der Mikrowelle für 1 Min.
- Geben Sie Gaze in das warme Wasser im Becherglas.
- Setzen Sie die Maus in eine Rückhaltemaschine.
- Drücken Sie die Gaze vorsichtig in den Mausschwanz und suchen Sie nach den erweiterten Venen. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle nach der Warmwasserdilatation mit einem Alkoholtupfer.
- Führen Sie die Nadel in die Injektionsstelle ein und ziehen Sie an der Spritze, um sicherzustellen, dass Sie sich in der Vene befinden. Injizieren Sie dann die Mausschwanzvene und verabreichen Sie die richtige Menge entsprechend dem Gewicht des Tieres (37,5 mg/kg). Üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, um Hämatome oder Blutungen zu vermeiden. Löschen Sie die Website.
- Lösen Sie die Maus aus der Rückhalteeinrichtung und legen Sie sie wieder in den Käfig.
- Lassen Sie die Rose Bengal vor der Injektion von Anästhetika 8 Minuten lang zirkulieren.
HINWEIS: Dadurch liegen insgesamt 10 Minuten zwischen der Rose Bengal Injektion und der Laserbestrahlung.
5. Verschluss der Hauptvenen
- Schalten Sie die beheizte Mausplattform ein.
- Geben Sie einen Tropfen Phenylephrin und Tropicamid in jedes Auge.
- Injizieren Sie 150 μl der Anästhetika, Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg) IP.
HINWEIS: Während dieses Vorgangs erhielt die Maus zwei IP-Injektionen. Daher wechselten sich die Seiten ab. Die IP-Injektion für die Anästhesie wurde in den unteren rechten Bauchquadranten gegeben, und die Kochsalzlösung wurde in den unteren linken Bauchquadranten injiziert. Es wird empfohlen, vor der Injektion an der Spritze zu ziehen, um sicherzustellen, dass sich die Nadel im Bauch und nicht in den Organen befindet. - Kneifen Sie das Tier in die Zehen, um die Tiefe der Anästhesie zu bestimmen, und warten Sie, bis es nicht mehr reagiert.
- Fügen Sie einen Tropfen Proparacainhydrochlorid pro Auge (Analgetikum) hinzu.
- Fügen Sie Gelsalbe auf beide Augen hinzu.
- Injizieren Sie 150 μL Carprofen subkutan zwischen die Ohren.
- Platzieren Sie die Maus auf der Plattform.
- Passen Sie die Plattform an, bis die Sicht auf den retinalen Fundus klar und fokussiert ist.
- Zählen Sie die Netzhautvenen und machen Sie ein Bild des Fundus.
HINWEIS: Netzhautvenen sind dunkler und breiter als Arterien. Venen und Arterien wechseln sich ab; Manchmal kann sich jedoch eine verzweigte Arterie in der Nähe des Sehnervs und damit zwei benachbarte Arterien befinden. - Schalten Sie den Laser ein und zielen Sie auf eine Netzhautvene in ca. 375 μm Entfernung von der Sehscheibe.
- Bestrahlen Sie das Gefäß, indem Sie den Fußschalter drücken und den Laserstrahl leicht bis zu 100 μm bewegen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und bewegen Sie den Laserstrahl nach jedem Puls so, dass die Bestrahlung nicht auf eine Stelle fokussiert wird.
- Wiederholen Sie die Bestrahlung auf anderen großen Gefäßen, um 2-3 Verschlüsse zu erreichen.
6. Bestimmung der Anzahl der am Tag 0 verschlossenen Venen
- Schalten Sie die Lampe aus, nachdem Sie die Gefäße bestrahlt haben, und warten Sie 10 Minuten.
HINWEIS: Lichteinwirkung kann Netzhautschäden und Entzündungen verursachen. Schalten Sie die Lampe während der Wartezeit aus, um die Exposition zu minimieren7. - Schalten Sie die Lampe wieder ein und zählen Sie die Anzahl der verschlossenen Venen.
- Machen Sie ein Bild des Fundus.
7. Nachsorge
- Injizieren Sie 1 ml sterile Kochsalzlösung.
HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in Abschnitt 5, Schritt 3. - Fügen Sie Gleitmittel Augentropfen auf beide Augen hinzu.
- Fügen Sie Gelsalbe auf beide Augen hinzu.
- Beobachten Sie, wie sich die Maus von der Narkose erholt, und bringen Sie sie nicht mit den anderen Tieren in den Käfig zurück, bis sie sich vollständig erholt hat. Carprofen (5 mg/kg) kann täglich bis zu 2 Tage nach dem Eingriff verabreicht werden. Wenn sie auf Menschen angewendet werden, ist Schmerz kein Symptom von RVO.
HINWEIS: Lassen Sie die Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.
8. Beurteilung des Netzhautödems mittels optischer Kohärenztomographie (OCT)
HINWEIS: Dieser Schritt kann zum Zeitpunkt des Interesses des Prüfers durchgeführt werden. Der Höhepunkt des Netzhautödems für eine C57BL / 6J-Maus ist 1 Tag nach dem RVO-Verfahren. Dieser Zeitpunkt kann je nach Hintergrund der Maus variieren.
- Schalten Sie den Leuchtkasten des Netzhautbildmikroskops, das OCT-Gerät und die beheizte Mausplattform ein.
- Befolgen Sie am Tag nach dem Verschluss die Schritte 5.2 bis 5.7, um das Tier vorzubereiten.
- Öffnen Sie die Softwareprogramme für die Bildbearbeitung und das Office-Anpassungstool.
- Stellen Sie im OAT-Programm den Nudge auf 5 ein.
- Nehmen Sie OCT bei 75 μm distal von der Verbrennung oder 4 Klicks.
- Nehmen Sie OCT-Bilder an vier Quadranten der Netzhaut auf.
- Analysieren Sie die OAT-Abbilder mithilfe einer Ablaufverfolgungssoftware.
- Vergleichen Sie die Netzhautdicke von vorbestrahlten Messungen mit 1 Tag nach RVO oder zum interessierenden Zeitpunkt.
HINWEIS: Berücksichtigen Sie bei der Analyse der Daten die Anzahl der bestrahlten Venen, da dies die Entwicklung von Netzhautödemen beeinflussen kann. Die Tiere werden dann durch Verabreichung von Anästhetika eingeschläfert, gefolgt von einer Perfusionsoperation, die nicht überlebt.
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Representative Results
Das RVO-Mausmodell zielt darauf ab, erfolgreich Verschlüsse in den Netzhautvenen zu erreichen, die zu hypoxisch-ischämischen Verletzungen, einem Abbau der Netzhautbarriere im Blut, neuronalem Tod und Netzhautödem führen8. Abbildung 1 zeigt eine Zeitleiste der Schritte zur Sicherstellung der Reproduzierbarkeit, eine schematische Darstellung des experimentellen Designs und skizziert Schritte, die je nach experimenteller Fragestellung weiter optimiert werden können. Die drei Hauptschritte, die modifiziert werden können, sind die Wartezeit nach der Verabreichung von Rosenbengalen, die Basislaserleistung und die experimentelle Laserleistung. In diesem Bericht wurden C57BL/6J-Mäuse sowie WT- und KO-Wurfgeschwister aus einer induzierbaren Endothelzell-Caspase-9-Knockout-Mauslinie (iEC Casp9) verwendet, um die optimalen Einstellungen für verschiedene Stämme zu bestimmen.
Die Wartezeit von der Rosenbengal-Injektion bis zur Laserbestrahlung kann den Erfolg der Photokoagulation in den Venen verändern. Eine zu kurze Wartezeit kann zu einer niedrigen Konzentration von Rosenbengalen in den Venen führen, während eine zu lange Wartezeit dazu führen kann, dass Rosenbengalen aus dem Netzhautkreislauf entfernt werden. Beide Situationen können zu schlechter Photokoagulation und erfolglosen Verschlüssen führen. Beim Test der Anzahl der unmittelbar nach der Laserbestrahlung erhaltenen Okklusionen zeigte der Vergleich von Tieren, die 10 und 20 Minuten nach der Verabreichung von Rosenbengalen gelasert wurden, dass es keine Unterschiede in der Anzahl der erreichten Okklusionen gab (Abbildung 2B). Die Anzahl der Okklusionen, die bis zu 1 Tag nach RVO auftraten, nahm jedoch bei Tieren, die 20 Minuten nach der Verabreichung von Rosenbengalen gelasert wurden, unabhängig vom Genotyp signifikant ab. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass bei der Untersuchung akuter RVO-induzierter Verletzungen die Wartezeit nach der Verabreichung von Rosenbengalen die Okklusionsstabilität beeinflussen kann. Eine frühe Reperfusion der Venen (vor 24 h nach der Verletzung) könnte die Entwicklung eines Netzhautödems beeinflussen und sollte daher durch die Bestimmung der korrekten Wartezeit von der Verabreichung von Rosenbengalen bis zur Laserbestrahlung kontrolliert werden.
Prinzipiell wird eine erfolgreiche Photokoagulation, die zur Okklusion führt, durch Laserleistung angetrieben. Obwohl dies ein so wichtiger Teil des Prozesses ist, ist es auch eine der größten Quellen für Variabilität im Modell und sollte auf Konsistenz optimiert werden. Um dies zu erreichen, wird empfohlen, die Laserleistung während des Aufbaus zu messen, bevor den Mäusen Rosenbengalen injiziert werden. Die empfohlene Ausgangsleistung für die Basislaserleistung liegt zwischen 13,0 und 15,0 mW. Eine niedrige Basislaserleistung, z. B. 11,5 mW, ohne Änderung der Versuchsleistung (100 mW), führte zu keinen Okklusionen, wie in Abbildung 3 dargestellt. Im Gegensatz dazu führte eine Basislaserleistung von 13,5 mW bei einer experimentellen Leistung von 100 mW zu erfolgreichen Okklusionen. In Fällen, in denen die Laserleistung unter 13,0 mW lag, wurde die Versuchsleistung auf 110 mW erhöht, um die gleichen erfolgreichen Okklusionen wie bei einer höheren Basislaserleistung zu erzielen. In der Regel ist 100 mW die Standard-Versuchsleistung. Wenn die Laserleistung jedoch unter 13,0 mW liegt, kann dies durch Modifizierung der Versuchsleistung mit den in Tabelle 1 empfohlenen Bereichen kompensiert werden.
Es wurden vier Haupttypen von Verschlüssen festgestellt, die nach der Laser-Photokoagulation der Venen auftreten. Diese Arten von Verschlüssen sind in Abbildung 4A zusammengefasst und wurden nach der Menge des Blutflusses klassifiziert. vollständig verschlossene Gefäße (kein Blutfluss), teilweise verschlossene Gefäße (meist verstopft bei gelegentlichem Fluss), teilweise reperfundiert (ununterbrochener stetiger Blutfluss mit Behinderung) und vollständig reperfundierte Gefäße (keine offensichtliche Obstruktion). Um zu untersuchen, ob sich die Arten von Okklusionen je nach Genotyp ändern und die Zeit pro Okklusionszustand zu bestimmen, wurden 10-minütige Videos nach der Laserbestrahlung ausgewertet. Diese Bewertung trug dazu bei, festzustellen, dass das bestrahlte Gefäßsystem von iEC Casp9-Mäusen mehr Zeit in teilweise reperfundierten und teilweise verschlossenen Zuständen verbrachte als C57BL6/J, die mehr Zeit in vollständig verschlossenen Zuständen verbrachten (Abbildung 4B).
Abbildung 5 zeigt, wie sich der Okklusionszustand der Gefäße innerhalb der ersten 10 Minuten nach der Laserphotokoagulation schnell ändert. Sobald diese ersten 10 Minuten verstrichen sind, stabilisieren sich die Okklusionen und werden bis zu einem 24-Stunden-Zeitpunkt aufrechterhalten. Um die genaue anfängliche Anzahl der Okklusionen pro Auge zu beurteilen, wird daher empfohlen, 10 Minuten nach der Bestrahlung zu warten. Eine frühere Bewertung dieses Modells ergab, dass die meisten Okklusionen 8 Tage nach der Bestrahlung reperfundiert8; Die Rate der Okklusionen, die pro Tag reperfundiert werden, kann jedoch je nach Belastung variieren und muss in jedem experimentellen Modell bestimmt werden. Das hier vorgestellte Modell ist eine akute Verletzung und soll verwendet werden, um Wege zu verstehen, die zu Ödemen führen, die sich innerhalb von 24 Stunden nach Verschlüssen entwickeln. Ein weiteres Merkmal der RVO sind flammenförmige Blutungen, die 24 Stunden nach der Verletzung beobachtet werden können, wie in Abbildung 5 dargestellt.
Die Nachuntersuchung 24 Stunden nach der RVO kann andere ophthalmologische Pathologien aufdecken, die als Folge der RVO-Methode auftreten können. Einige umfassen, sind aber nicht beschränkt auf subretinale Blutungen (gekennzeichnet durch kontinuierliches Blutpflaster), Netzhautablösung, vollständig ischämische Netzhaut (kein Blutfluss in Venen und Arterien) und Katarakte. Abbildung 6 zeigt Fundusbilder mit entsprechender OCT als Beispiele dafür, außer in Augen, in denen sich Katarakte bilden (Abbildung 6F), da OCT nicht in Gegenwart eines Katarakts durchgeführt werden kann. Abbildung 6A zeigt Beispiele, wie ein Fundusbild und eine OCT eines unverletzten Auges als Referenz aussehen.
Die wichtigste morphologische Pathologie der RVO in diesem Modell ist das Netzhautödem. Um das Ausmaß des Netzhautödems zu beurteilen, wird empfohlen, OCT-Bilder vor dem Tag des RVO-Verfahrens für eine Baseline-Messung und zum Zeitpunkt des Interesses zu machen. Abbildung 7 zeigt die OCT-Quantifizierung des Netzhautödems bei verletzten Augen. Eine weitere Maßnahme, um den Zustand neuronaler Schichten zu bestimmen, ist die Beurteilung der Desorganisation der inneren Netzhautschichten (DRIL). Dies ist eine Maßnahme, die im klinischen Umfeld verwendet wird und die Kapillarnichtperfusion darstellt, ein weiteres Kennzeichen von RVO 5,9,10. Ein Beispiel für diese Bewertung ist in Abbildung 7B zu finden. Abbildung 7C zeigt ein Beispiel für ein OCT-Bild mit den entsprechenden Beschriftungen für jede Netzhautschicht.
Abbildung 1: Zeitleiste und schematische Darstellung des RVO-Mausmodells. (A) Zeitleiste der Ereignisse von der Verabreichung von Rosenbengalen bis zur Bildgebung von verschlossenen Venen. (B) Zusammengefasste Darstellung des Verfahrens zur Erzielung einer erfolgreichen Photokoagulation der Netzhautvene. Rote Kästchen stellen wichtige Schritte im Prozess dar, die sehr variabel sind und je nach Mausmodell und Fragestellung optimiert werden können. (C) Die Hauptvenen der Netzhaut (V) sind im Vergleich zu den Arterien (A) breiter und dunkler. Jede Hauptvene wird mit einem geführten Laser von 532 nm, einer Punktgröße von 50 μm, einer Leistung von 100 mW, einer Dauer von 1 s, einer Gesamtenergie von 0,3 J und einer Strahlungsexposition von 15278,87 J/cm2 in einem durchschnittlichen Abstand von 375 μm vom Sehnerv bestrahlt. (D) Die Laserapplikation bewirkt eine auf der Fundusbildgebung sichtbare Vaporisationsblase von ca. 150 μm und bedeckt <4% der gesamten Netzhautfläche. Zahlen stellen die vorgeschlagene Position und Bewegungsrichtung (Pfeile) des Laserstrahls bei der Bestrahlung von Gefäßen dar. Abkürzungen: A = Arterie; V = Vene; ON = Sehnerv. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Der Zeitpunkt der Photookklusion im Vergleich zur Verabreichung von Rosenbengalen ist entscheidend für eine erfolgreiche Photokoagulation . (A) Fundus-Netzhautbilder von iEC Casp9 WT und iEC Casp9 KO, die 10 und 20 Minuten nach der Verabreichung von Rosenbengalen photoverschlossen wurden. Weiße Kreise stellen Venen dar, die erfolgreiche Verschlüsse hatten. (B) Anzahl der Verschlüsse unmittelbar nach der Bestrahlung (0 h) und 1 Tag nach der Bestrahlung für 10 Minuten und 20 Minuten nach der bengalischen Injektion kombinierter Genotypen. Welchs t-Test, Fehlerbalken zeigen REM an. (C) Anzahl der Okklusionen, getrennt nach Genotyp. Zwei-Wege-ANOVA und Fisher's LSD-Test; Fehlerbalken zeigen SEM an. Abkürzungen: WT = Wildtyp; KO = K.O.; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; ANOVA = Varianzanalyse; LSD = geringster signifikanter Unterschied; ns = nicht signifikant; P-RVO = postretinaler Venenverschluss. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Messung der Basislinie und die experimentelle Laserleistung sind entscheidende Schritte für eine erfolgreiche Photokoagulation. Fundus-Netzhautaufnahmen von iEC Casp9 WT und iEC Casp9 KO 10 min nach Photokoagulation; photoverdeckt mit unterschiedlichen Basis- und experimentellen Laserleistungspegeln. Eine geringe Basislaserleistung kann mit einer experimentellen Laserleistung (12,8 mW, 110 mW) kompensiert werden. Weiße Kreise stellen Venen dar, die erfolgreiche Verschlüsse hatten. Abkürzungen: WT = Wildtyp; KO = Knockout. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die RVO-Methode führt zu verschiedenen Arten von Okklusionen. (A) Fundus-Netzhautbilder von C57BL/6J, iEC Casp9 WT und iEC Casp9 KO 10 min nach der Photokoagulation mit verschiedenen Arten von Verschlüssen: vollständig verschlossen, teilweise verschlossen, teilweise reperfundiert und vollständig reperfundiert. Einschübe zeigen eine fokussierte Ansicht einer Vene, die nach der Photokoagulation zu einer bestimmten Art von Verschluss geführt hat. (B) Quantifizierung des Prozentsatzes der Venen, die in den verschiedenen Okklusionszuständen für jeden Genotyp während der ersten 10 Minuten nach der Bestrahlung verschlossen sind. Zehnminütige Videos wurden von zwei auf Genotypen verblindeten Forschern ausgewertet, die den verschiedenen Okklusionszuständen (vollständig verdeckt (-2), teilweise verdeckt (-1), vollständig reperfundiert (2) und teilweise reperfundiert (1)) pro Dauer Nummern zuordneten. Abkürzungen: RVO = retinaler Venenverschluss; WT = Wildtyp; KO = Knockout. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Zeitleiste der Okklusionen nach RVO. Fundus-Netzhautbilder von C57BL/6J, iEC Casp9 WT und iEC Casp9 KO 0, 5 min, 10 min und 24 h nach der Laserbestrahlung. Die ersten 10 Minuten sind entscheidend für den Zustand der Okklusionen und können sich schnell ändern. Nach den ersten 10 Minuten sind die Okklusionen bis mindestens 24 h stabil. Weiße Kreise stellen Venen dar, die erfolgreiche Verschlüsse hatten, und gelbe Pfeilspitzen zeigen flammenförmige Blutungen. Abkürzungen: RVO = retinaler Venenverschluss; WT = Wildtyp; KO = Knockout. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Verschiedene ophthalmologische Pathologien können nach RVO auftreten. (A-E) zeigen Fundus-Netzhautbilder und entsprechende OCT. (A) Ein Beispiel für ein unverletztes Auge, das nicht dem RVO-Prozess unterzogen wurde. (B) Subretinale Blutung, die zeigt, dass Blut aus den Gefäßen im Fundusbild austritt. (C) Netzhautablösung, die durch die verschwommene Falte im Fundus und die Anhebung der Netzhaut in der OCT gesehen wird. (D) Übermäßiges Ödem, das sich in einer starken Schwellung in der OCT zeigt. (E) Ein vollständig ischämisches Auge mit vollständig gestörtem Blutfluss, was zu einer weißen Netzhaut führt. (F) Zwei verschiedene Beispiele für ein Kataraktauge, bei dem kein klares Fundusbild und keine OCT erhalten werden konnten. OCT-Maßstabsbalken: 100 μm. Abkürzungen: RVO = retinaler Venenverschluss; OCT = optische Kohärenztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Quantifizierung von OCT-Bildern. (A) Untersuchung der Schichtdicke und des DRIL in ungelaserten Kontrollaugen und Augen, die das RVO-Verfahren durchlaufen haben. GCL-, IPL-, INL-, OPL-, ONL-, äußeres Segment und gesamte Netzhautmessungen. Statistik, Mann-Whitney-Test p-Werte: GCL: 0,0070, IPL: 0,0205, INL: <0,0001, OPL: 0,0014, ONL: 0,5582, äußeres Segment: 0,44852, ganze Netzhaut: 0,0019. Die Fehlerbalken zeigen das REM an. (B) DRIL-Quantifizierung gemessen anhand der OCT-Bilder von ungelaserten Kontrollen und RVO WT- und KO iEC Casp9-Mäusen sowie c57/BL6J-Mäusen mit RVO. Fehlerbalken zeigen REM an. (C) Beispiel OCT mit den Beschriftungen jeder Netzhautschicht. Abkürzungen: DRIL = Desorganisation der inneren Netzhautschichten; RVO = retinaler Venenverschluss; WT = Wildtyp; KO = K.O.; GCL = Ganglienzellschicht; IPL = Innere plexiforme Schicht; INL = Innere Kernschicht; OPL = äußere plexiforme Schicht; ONL = äußere Kernschicht; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; OCT = optische Kohärenztomographie; ns = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Basis-Laserleistung (mW) | Empfohlene experimentelle Laserleistung (mW) | Empfohlene Belichtungszeit (ms) |
| <11.0 oder >15.0 | Schalten Sie den Laser aus und stellen Sie die Faser am Ende ein, die mit der Lasersteuerbox verbunden ist. Schrauben Sie es ab und bewegen Sie es leicht nach rechts oder links. Messen Sie das Ergebnis erneut, bis es einen höheren oder niedrigeren Wert erreicht. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Tabelle 1: Eine niedrige Ausgangslaserleistung kann durch eine höhere experimentelle Laserleistung kompensiert werden. Abweichungen in der Basislaserleistung und der empfohlenen experimentellen Laserleistung und Belichtungszeit.
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Discussion
Das Maus-RVO-Modell bietet eine Möglichkeit, die RVO-Pathologie besser zu verstehen und potenzielle Therapeutika zu testen. Während das Maus-RVO-Modell in der Praxis weit verbreitet ist, besteht ein Bedarf an einem aktuellen detaillierten Protokoll des Modells, das seine Variabilität adressiert und die Optimierung des Modells beschreibt. Hier stellen wir einen Leitfaden mit Beispielen aus der Praxis zur Verfügung, was geändert werden kann, um die konsistentesten Ergebnisse in einer Kohorte von Versuchstieren zu erzielen und zuverlässige Daten zu liefern.
Die beiden wichtigsten Elemente des RVO-Mausmodells sind die Laserleistung und die erfolgreiche intravenöse Injektion des Photosensibilisator-Farbstoffs. Um die Leistung zu erzeugen, die erforderlich ist, um die Koagulation zu induzieren, wenn der Laser auf eine bestimmte Vene gerichtet ist, muss die Laserleistung richtig eingestellt werden. Während dies mit den in der Methode vorgeschlagenen Techniken erreicht werden kann, ist es wichtig, die Unterschiede in der Systemeinrichtung jedes Labors zu berücksichtigen. Variationen des Glasfaserkabels und die Art und Weise, wie es in Bezug auf die Ausrüstung und die Raumtemperatur untergebracht ist, sind einige der Variablen, die für eine geringe Laserleistung verantwortlich sein können. Unabhängige Abstimmungen auf den Systemaufbau werden empfohlen, um die Laserleistung zu erhöhen.
Diese Bemühungen sind jedoch ohne eine geeignete Schwanzvenentechnik zur Abgabe des Photosensibilisatorfarbstoffs nicht funktionsfähig. Schwanzveneninjektionen können schwierig zu erreichen sein, und es ist eine Fähigkeit, die Zeit braucht, um sich zu entwickeln. Schlechte Injektionen können zu keinen Verschlüssen führen; In diesem Fall kann Rose Bengal über IP verabreicht werden. Die Verabreichung von Rosenbengalen über IP wurde verwendet, um RVO zu modellieren, jedoch mit einer längeren Laserbestrahlungszeit (3 s) und einer höheren Rosenbengalkonzentration (40 mg/ml)11. Um eine längere Laserbestrahlung zu begrenzen und gezielt auf das Gefäßsystem zu zielen, ist die Schwanzvenierung die bevorzugte Art der Verabreichung.
Dieses Modell könnte auch mit anderen photoaktivierbaren Farbstoffen wie Y-Eosin und Natriumfluorescein12,13,14 erreicht werden, obwohl Rosenbengalen der am häufigsten verwendete photoaktivierbare Farbstoff 4,5,6,8 ist. Es wurde gezeigt, dass alle Farbstoffe frühe Merkmale klinischer Erkrankungen wie Netzhautblutungen und Netzhautödeme hervorrufen15. Es wurde gezeigt, dass photoaktivierbare Farbstoffe keine nachteiligen Auswirkungen auf die Tiere haben und somit eine unbedeutende Systemtoxizität aufweisen15,16. Es sollte auch beachtet werden, dass der gewählte Farbstoff ein Absorptionsmaximum haben sollte, das mit der Wellenlänge des verwendeten Lasers kompatibel ist. Rose Bengal hat eine Anregung bei 525 nm17, Natriumfluorescein bei 475-490 nm 18 und Y-Eosin bei 490 nm19.
Die Hauptquellen der Variabilität in diesem Modell sind die Zeit der Photookklusion relativ zur Verabreichung von Rosenbengalen und die Basislinie und die experimentelle Laserleistung. Während Abbildung 2 10- und 20-minütige Zeitpunkte für die Photookklusion zeigt, wurde auch eine kleine Anzahl von 5- und 15-minütigen Experimenten durchgeführt (Daten nicht gezeigt), die zu Okklusionen führten, die nicht so konsistent waren wie der 10-Minuten-Zeitpunkt. Daher wurde 10 min als optimale Wartezeit zwischen der Verabreichung von Rosenbengalen und der Photookklusion für diese Methode gewählt. Studien haben jedoch berichtet, dass RVO auch bereits 3 Minuten nach der Verabreichung von Rose Bengal5 induziert werden kann. Eine weitere Möglichkeit, die für die Maus stammspezifisch optimale Wartezeit von Rosenbengalen bis zur Photookklusion zu bestimmen, besteht darin, die relative Rosenbengalkonzentration mit dem Fluoreszenzbildgebungsmodus mit einem Tetramethylrhodamin (TRITC)-Filter zu überwachen. Das hier beschriebene Protokoll kann jedoch mit Netzhautmikroskopen durchgeführt werden, die nicht über einen TRITC-Filter verfügen.
Die andere Quelle der hohen Variabilität in diesem Modell ist die Basislaserleistung. Da die täglichen Niveaus der Basislaserleistung sehr unterschiedlich sein können, ist es wichtig, die Werte vor jedem Experiment zu bewerten. Die Standardisierung der Baseline-Laserleistung in allen Studien kann dazu beitragen, die Verwendung des RVO-Mausmodells zu potenzieren und zu erweitern. Ein erneutes Einstellen des Glasfaserkabels kann ausreichen, um die Ausgangswerte zu ändern. Wenn jedoch eine Messung von 13,0 mW nicht erreicht werden kann, enthält Tabelle 1 einen Richtwert für die Kompensation mit der Versuchsleistung. Es ist wichtig zu beachten, dass, da die Netzhaut ein geschlossenes System ist, die Bestimmung des Anteils der verschlossenen Venen (die Anzahl der verschlossenen Venen geteilt durch die Anzahl der bestrahlten Venen) für das Verständnis, die Kontrolle und die Vorhersage der Schwere der Schädigung im RVO-Modell unerlässlich ist. Frühere Analysen von beschädigten Messwerten (DRIL und Netzhautdicke) korrelierten mit dem Anteil der verschlossenen Venen und der vorhergesagten Netzhautatrophie 8 Tage nach RVO8. Daher sollte der Anteil der verschlossenen Venen berücksichtigt und bewertet werden. Es ist noch unklar, wie andere intermediäre Okklusionszustände, wie z.B. teilweise reperfundiert, teilweise verschlossen oder Venen, die einmal verschlossen und nach 10 min reperfundiert wurden, zur Entwicklung von Netzhautödemen und -atrophie beitragen.
Weitere Untersuchungen der Augen mit solchen Okklusionen können helfen zu untersuchen, ob bei erheblichen Schäden eine anhaltende Okklusion notwendig ist oder ob sogar vorübergehende Okklusionen in diesem Modell wichtig sind. Abhängig von der experimentellen Fragestellung sind unterschiedliche Okklusionsraten optimal. Eine Okklusionsrate von 40-50% ist in den meisten Fällen ideal, d.h. zwei oder drei Okklusionen in einem Auge mit sechs Venen. Dies führt zu erheblichen Verletzungen, aber die Netzhaut ist intakt und kann für immunhistochemische und biochemische Analysen präpariert werden.
Um dies zu bestimmen, ist die Unterscheidung der pathologischen Sichtweise einer erfolgreichen und repräsentativen Okklusion der RVO-Signatur relevant. Die natürliche Okklusion, die von RVO präsentiert wird, umfasst flammenförmige Blutungen 20 (nicht zu verwechseln mit subretinalen Blutungen), die in diesem Modell24 Stunden nach der Verletzung beobachtet werden können. Das RVO-Modell kann auch zu unerwünschten Netzhautverletzungen (die nicht für die RVO-Pathologie charakteristisch sind) führen, wie sie in Abbildung 6B-F gezeigt werden, wenn seine Parameter nicht sorgfältig kontrolliert werden. Ein Ansatz, um diese zu vermeiden, besteht neben der Regulierung der Konzentration von Rosenbengalen und der experimentellen Laserleistung darin, die Bestrahlung der Gefäße einzustellen, die nach der ersten oder zweiten Bestrahlung eine deutliche Thrombusbildung aufweisen.
Andere Faktoren, die bei der Anwendung dieses Modells und bei der Entscheidung, welche Venen verschlossen werden sollen, zu berücksichtigen sind, sind der Mausstamm und der Gefäßdurchmesser. Einige Mausstämme, wie BALB/c, am häufigsten als Albino bekannt, sind anfällig für leichte Schäden21. Darüber hinaus weisen sie retinale Entwicklungsdefizite auf, die zu Defekten in der Decussation am Optikuschiasma und der Sehschärfe führen22,23. Es wird empfohlen, die basale Netzhaut- und Gefäßintegrität der unverletzten Kontrollen für den für RVO-Studien ausgewählten Mausstamm vollständig zu bewerten. Studien haben gezeigt, dass die Venenbreite die Entwicklung von Netzhautödemen und Krankheitspathologie beeinträchtigen kann24. Daher sollten Tiere mit ähnlichem Gewicht verwendet werden, um eine weitere Variabilität zu vermeiden. Die Ausschlussfaktoren, welche Augen in einer Studie verwendet werden sollen, hängen auch von der experimentellen Fragestellung ab. Es kann ratsam sein, jedes Auge, das einmal verschlossen war, einzubeziehen, auch wenn es zum Zeitpunkt der Nachuntersuchung für die Signalisierung reperfundiert wird. Werden jedoch stabile Verschlüsse gewünscht, wären diese Augen ausgeschlossen. Abbildung 6 zeigt Beispiele für mögliche Ausschlusskriterien oder Augen, die für die pathologische Analyse verwendet werden könnten.
Um zu zeigen, dass diese Lasereinstellungen keinen Schaden verursachten und die beobachteten Effekte wirklich durch die Okklusionen selbst verursacht wurden, wurden in früheren Studien Scheinkontrollen durchgeführt8. Die Scheinmäuse erhielten immer noch eine Schwanzveneninjektion von Rosenbengalen, wurden aber im Parenchymraum zwischen den Hauptgefäßen bestrahlt, anstatt auf der Vene bestrahlt zu werden. Dies war ein wichtiger Schritt, um sicherzustellen, dass das Modell RVO-Verletzungen bei Patienten repliziert, anstatt einfach Gewebe mit einem Laser zu verletzen. Diese Scheine zeigen keine Aktivierung von Caspase-9 oder -7 oder eines der Ödeme, die bei den Mäusen beobachtet wurden, die eine normale Laserbestrahlung der Gefäße erhielten, was darauf hindeutet, dass der Laser keine nachteiligen Auswirkungen hatte. Diese Kontrollen sind unerlässlich, insbesondere wenn höhere Lasereinstellungen verwendet werden, um sicherzustellen, dass die zu modellierende Verletzung eine genaue Darstellung des gewünschten Schadens darstellt8.
Das RVO-Mausmodell kann angewendet werden, um andere Krankheiten zu untersuchen, die aus hypoxisch-ischämischen Verletzungen der Netzhaut und des Gehirns resultieren, wie diabetische Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie und Schlaganfall. Darüber hinaus kann es als Modell dienen, um Signalwege zu untersuchen, die für die Entwicklung von Gefäßverletzungen relevant sind, und mögliche Behandlungen zu testen, die die Neurodegeneration im zentralen Nervensystem verbessern. Die Optimierung, die in diesem Bericht zugeschnitten ist, kann die Variabilität im Maus-RVO-Modell begrenzen und die Pathophysiologie der RVO beleuchten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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