Summary
Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour l’occlusion veineuse rétinienne à l’aide de rose bengale et un système de microscope d’imagerie rétinienne guidé par laser avec des recommandations pour maximiser sa reproductibilité dans les souches génétiquement modifiées.
Abstract
Les modèles murins d’occlusion veineuse rétinienne (OVR) sont souvent utilisés en ophtalmologie pour étudier les lésions hypoxiques-ischémiques dans la rétine neurale. Dans ce rapport, une méthode détaillée soulignant les étapes critiques est fournie avec des recommandations d’optimisation pour atteindre des taux d’occlusion constamment réussis sur différentes souches de souris génétiquement modifiées. Le modèle murin RVO consiste principalement en l’administration intraveineuse d’un colorant photosensibilisateur suivie d’une photocoagulation au laser à l’aide d’un microscope imageur rétinien fixé à un laser guidé ophtalmique. Trois variables ont été identifiées comme déterminants de la cohérence de l’occlusion. En ajustant le temps d’attente après l’administration de rose bengal et en équilibrant la sortie laser de base et expérimentale, la variabilité entre les expériences peut être limitée et un taux de réussite plus élevé des occlusions obtenu. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les maladies rétiniennes caractérisées par un œdème rétinien et une lésion hypoxique-ischémique. De plus, comme ce modèle induit des lésions vasculaires, il peut également être appliqué pour étudier la neurovascularisation, la mort neuronale et l’inflammation.
Introduction
L’occlusion veineuse rétinienne (OVR) est une maladie vasculaire rétinienne courante qui a touché environ 28 millions de personnes dans le monde en 20151. L’OCV entraîne un déclin et une perte de vision chez les adultes et les personnes âgées en âge de travailler, ce qui représente une maladie menaçant la vue qui devrait augmenter au cours de la décennie proche. Certaines des pathologies distinctes de la RVO comprennent les lésions hypoxiques-ischémiques, l’œdème rétinien, l’inflammation et la perte neuronale2. Actuellement, la première ligne de traitement pour ce trouble est par l’administration d’inhibiteurs du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF). Bien que le traitement anti-VEGF ait contribué à améliorer l’œdème rétinien, de nombreux patients sont encore confrontés à un déclin de la vision3. Pour mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie et tester de nouvelles lignes de traitement potentielles, il est nécessaire de constituer un protocole modèle de souris RVO fonctionnel et détaillé pour différentes souches de souris.
Des modèles de souris ont été développés en mettant en œuvre le même dispositif laser utilisé chez les patients humains, associé à un système d’imagerie adapté à la taille correcte pour une souris. Ce modèle murin de RVO a été signalé pour la première fois en 2007 4 et établi par Ebneter et al. 4,5. Finalement, le modèle a été optimisé par Fuma et al. pour reproduire les principales manifestations cliniques de la RVO telles que l’œdèmerétinien 6. Depuis que le modèle a été rapporté pour la première fois, de nombreuses études l’ont utilisé en utilisant l’administration d’un colorant photosensibilisant suivie d’une photocoagulation des principales veines rétiniennes avec un laser. Cependant, la quantité et le type de colorant administré, la puissance laser et le temps d’exposition varient considérablement d’une étude à l’autre qui ont utilisé cette méthode. Ces différences peuvent souvent entraîner une variabilité accrue du modèle, ce qui le rend difficile à reproduire. À ce jour, il n’existe aucune étude publiée avec des détails spécifiques sur les pistes potentielles d’optimisation.
Ce rapport présente une méthodologie détaillée du modèle murin RVO dans la souche C57BL/6J et une souche de caspase-9 endothéliale inductible par le tamoxifène (iEC Casp9KO) avec un fond C57BL/6J et pertinente pour la pathologie RVO comme souche de référence pour une souris génétiquement modifiée. Une étude antérieure avait montré que l’activation non apoptotique de la caspase-9 endothéliale provoque un œdème rétinien et favorise la mort neuronale8. L’expérience d’utilisation de cette souche a permis de déterminer et de donner un aperçu des modifications potentielles pour adapter le modèle murin RVO, qui peut être applicable à d’autres souches génétiquement modifiées.
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Protocol
Ce protocole suit la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Les expériences sur les rongeurs ont été approuvées et surveillées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Columbia.
NOTE: Toutes les expériences ont utilisé des souris mâles âgées de deux mois qui pesaient environ 20 g.
1. Préparation et administration de tamoxifène pour l’ablation génétique inductible de gènes floxed
REMARQUE: Le diamètre du vaisseau rétinien peut être affecté par le poids de l’animal. Assurez-vous que tous les animaux utilisés pour une expérience ont des poids similaires.
- Diluer le tamoxifène dans de l’huile de maïs à une concentration de 20 mg/mL.
REMARQUE: Le tamoxifène est toxique et sensible à la lumière. Protéger de la lumière, par exemple avec du papier d’aluminium. - Vortex la solution pendant quelques secondes.
- Laisser au four à 55 °C pendant 15 min.
REMARQUE: Assurez-vous que le tamoxifène s’est complètement dissous. Un vortex supplémentaire peut être nécessaire. - Conservez la solution à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
- Utilisez une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G pour injection de tamoxifène. Nettoyez la zone d’injection avec de l’éthanol à 70%. Administrer 2 mg de tamoxifène (100 μL de 20 mg/mL) par voie intrapéritonéale (IP) une fois par jour pendant le temps établi selon la lignée Cre inductible spécifique.
- Prévoyez deux jours de repos pour les animaux avant de commencer les expériences.
2. Préparation des réactifs pour la photocoagulation au laser
- Rose bengale
REMARQUE: Rose bengal est sensible à la lumière. Conserver dans l’obscurité jusqu’à utilisation et préparer frais pour de meilleurs résultats.- Préparez le rose bengal en le diluant à 5 mg/mL dans une solution saline stérile et filtrez-le à travers un filtre à seringue de 0,2 μm.
- Préparez une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G avec du rose Bengal.
- Kétamine/xylazine
- Diluer la kétamine et la xylazine dans une solution saline stérile en conséquence pour les concentrations suivantes: kétamine (80-100 mg/kg) et xylazine (5-10 mg/kg).
- Carprofène
- Diluer le carprofène à 1 mg/mL dans une solution saline stérile.
- Préparez une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 26 G contenant du carprofène.
- Solution saline stérile
- Préparez une seringue de 5 mL munie d’une aiguille de 26 G avec une solution saline stérile.
3. Configuration laser
- Manipulez délicatement le câble à fibre optique et connectez-le au boîtier de commande laser et à l’adaptateur laser du microscope imageur rétinien.
- Allumez le boîtier de lampe du microscope imageur rétinien.
- Allumez l’ordinateur et ouvrez le programme d’imagerie.
- Ajustez la balance des blancs en utilisant un morceau de papier blanc et en le plaçant devant l’oculaire de la souris et en cliquant sur Ajuster dans le programme d’imagerie.
- Allumez le boîtier de commande laser en tournant la clé et en suivant les instructions sur l’écran du boîtier de commande laser.
REMARQUE: Le laser utilisé dans cette expérience est de classe 3B et peut causer des lésions oculaires. Portez des lunettes de protection lorsque vous utilisez le laser. - Vérifiez la puissance laser de base.
- Utilisez un capteur de puissance laser.
- Ajustez l’écran du boîtier de commande laser aux paramètres suivants : 50 mW et 2 000 ms.
- Allumez le laser et placez le capteur de puissance devant l’oculaire.
REMARQUE: Assurez-vous que la lumière du microscope est éteinte lors du test de la puissance laser de base. - Appuyez sur la pédale de pédale pour activer le laser.
- Visez une puissance de 13 à 15 mW.
REMARQUE: La lecture de puissance laser déterminera le taux de réussite des occlusions veineuses rétiniennes. Si la lecture de puissance laser est trop faible, des ajustements peuvent être apportés à la puissance et à la durée d’exposition au laser. Voir le tableau 1 pour les recommandations.
- Ajustez la puissance du laser expérimental en configurant l’écran du boîtier de commande laser pour les paramètres suivants : 100 mW, 1 000 ms.
- Éteignez le laser.
REMARQUE: Pour des raisons de sécurité et pour éviter la surchauffe, il est préférable de garder le laser éteint entre les souris.
4. Injection de rose bengal dans la veine de la queue de souris
- Versez 300 mL d’eau dans un bécher de 500 mL.
- Réchauffer le bécher dans un four à micro-ondes pendant 1 min.
- Mettez de la gaze dans l’eau chaude du bécher.
- Mettez la souris dans un dispositif de retenue.
- Appuyez doucement sur la gaze dans la queue de la souris et recherchez les veines dilatées. Désinfectez le site d’injection à l’aide d’une lingette imbibée d’alcool après la dilatation de l’eau tiède.
- Insérez l’aiguille dans le site d’injection et tirez sur la seringue pour vous assurer que vous êtes dans la veine. Ensuite, injectez la veine de la queue de la souris, en administrant la quantité correcte en fonction du poids de l’animal (37,5 mg / kg). Appliquez une pression sur le site d’injection pour éviter les hématomes ou les saignements. Effacez le site.
- Libérez la souris de la retenue et remettez-la dans la cage.
- Laisser circuler 8 min pour que le rose bengal circule avant l’injection d’anesthésiques.
REMARQUE: Cela fournira un total de 10 minutes entre l’injection de rose bengale et l’irradiation laser.
5. Occlusion des veines principales
- Allumez la plate-forme de la souris chauffée.
- Ajouter une goutte de phényléphrine et de tropicamide dans chaque œil.
- Injecter 150 μL d’anesthésiques, de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg) IP.
REMARQUE: Au cours de cette procédure, la souris a reçu deux injections IP. Par conséquent, les côtés ont été alternés. L’injection IP pour l’anesthésie a été administrée dans le quadrant abdominal inférieur droit, et la solution saline a été injectée dans le quadrant abdominal inférieur gauche. Il est recommandé de tirer sur la seringue avant l’injection pour s’assurer que l’aiguille est dans l’abdomen et non dans les organes. - Pincez l’animal pour déterminer la profondeur de l’anesthésie et attendez qu’il ne réponde plus.
- Ajouter une goutte de chlorhydrate de proparacaïne par œil (analgésique).
- Ajouter la pommade gel aux deux yeux.
- Injecter 150 μL de carprofène par voie sous-cutanée entre les oreilles.
- Accueillez la souris sur la plate-forme.
- Ajustez la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond d’œil rétinien soit claire et nette.
- Comptez les veines rétiniennes et prenez une image du fond d’œil.
REMARQUE: Les veines rétiniennes sont plus foncées et plus larges que les artères. Les veines et les artères alternent; Cependant, il peut parfois y avoir une artère ramifiée près du nerf optique et, par conséquent, deux artères adjacentes. - Allumez le laser et visez une veine rétinienne à environ 375 μm du disque optique.
- Irradiez le récipient en appuyant sur la pédale et en déplaçant légèrement le faisceau laser jusqu’à 100 μm. Répétez cette étape trois fois et déplacez le faisceau laser après chaque impulsion afin que l’irradiation ne soit pas focalisée en un seul endroit.
- Répéter l’irradiation sur d’autres vaisseaux principaux pour obtenir 2-3 occlusions.
6. Établir le nombre de veines obstruées au jour 0
- Éteignez la lampe après avoir irradié les récipients et attendez 10 min.
REMARQUE: L’exposition à la lumière peut causer des dommages rétiniens et une inflammation; Éteignez la lampe pendant le temps d’attente pour minimiser l’exposition7. - Rallumez la lampe et comptez le nombre de veines obstruées.
- Prenez une image du fond d’œil.
7. Suivi
- Injecter 1 mL de solution saline IP stérile.
REMARQUE: Voir les détails de l’injection IP dans la section 5, étape 3. - Ajouter des gouttes ophtalmiques lubrifiantes aux deux yeux.
- Ajouter la pommade gel aux deux yeux.
- Observez la souris pendant qu’elle se remet de l’anesthésie et ne la remettez pas dans la cage avec les autres animaux avant d’être complètement rétablie. Le carprofène (5 mg / kg) peut être administré quotidiennement jusqu’à 2 jours après l’intervention. Si elle est appliquée aux humains, la douleur n’est pas un symptôme de l’OVR.
REMARQUE : Ne laissez pas les animaux sans surveillance jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement de l’anesthésie.
8. Évaluation de l’œdème rétinien par tomographie par cohérence optique (TCO)
REMARQUE : Cette étape peut être effectuée au moment d’intérêt de l’investigateur. Le pic d’œdème rétinien pour une souris C57BL / 6J est de 1 jour après la procédure RVO. Ce point temporel peut varier en fonction de l’arrière-plan de la souris.
- Allumez le boîtier lumineux du microscope imageur rétinien, l’appareil OCT et la plate-forme de souris chauffée.
- Le lendemain de l’occlusion, suivez les étapes 5.2 à 5.7 pour préparer l’animal.
- Ouvrez les logiciels d’imagerie et d’OPO.
- Dans le programme de l’OPO, réglez le nudge à 5.
- Prendre OCT à 75 μm distal de la brûlure ou 4 clics.
- Prenez des images OCT à quatre quadrants de la rétine.
- Analysez les images de l’OPO à l’aide d’un logiciel de traçage.
- Comparez l’épaisseur rétinienne des mesures pré-irradiées à 1 jour après la RVO ou au moment d’intérêt.
REMARQUE: Lors de l’analyse des données, prenez en considération le nombre de veines irradiées, car cela peut influencer le développement de l’œdème rétinien. Les animaux sont ensuite euthanasiés par l’administration d’anesthésique suivie d’une chirurgie de non-survie par perfusion.
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Representative Results
Le modèle murin RVO vise à obtenir avec succès des occlusions dans les veines rétiniennes, entraînant une lésion hypoxique-ischémique, une rupture de la barrière rétinienne sanguine, une mort neuronale et un œdèmerétinien 8. La figure 1 montre une chronologie des étapes pour assurer la reproductibilité, un schéma de la conception expérimentale et décrit les étapes qui peuvent être optimisées davantage en fonction des questions expérimentales. Les trois principales étapes qui peuvent être modifiées sont le temps d’attente après l’administration du rose bengale, la puissance laser de base et la sortie laser expérimentale. Dans ce rapport, des souris C57BL/6J, ainsi que des compagnons de portée WT et KO d’une lignée de souris knockout à cellules endothéliales inductibles caspase-9 (iEC Casp9), ont été utilisés pour déterminer les paramètres optimaux entre différentes souches.
Le temps d’attente entre l’injection de rose bengal et l’irradiation au laser peut altérer le succès de la photocoagulation dans les veines. Un temps d’attente trop court peut entraîner une faible concentration de bengale rose dans les veines, tandis qu’un temps d’attente trop long peut entraîner l’élimination du bengale rose de la circulation rétinienne. Les deux situations peuvent entraîner une mauvaise photocoagulation et des occlusions infructueuses. Lors de l’essai du nombre d’occlusions obtenues immédiatement après l’irradiation laser, la comparaison des animaux qui ont été traités au laser 10 et 20 minutes après l’administration de rose bengal a révélé qu’il n’y avait aucune différence dans le nombre d’occlusions obtenues (Figure 2B). Cependant, le nombre d’occlusions subies jusqu’à 1 jour après la RVO a diminué de manière significative chez les animaux qui ont été traités au laser 20 minutes après l’administration de rose bengale, indépendamment du génotype. Ce résultat suggère que lors de l’étude des lésions aiguës induites par l’OVR, le temps d’attente après l’administration de rose bengal peut avoir un impact sur la stabilité de l’occlusion. La reperfusion précoce des veines (avant 24 heures après la blessure) pourrait avoir un impact sur le développement de l’œdème rétinien et, par conséquent, devrait être contrôlée en déterminant le temps d’attente correct entre l’administration de rose bengale et l’irradiation au laser.
En principe, une photocoagulation réussie conduisant à l’occlusion est entraînée par la puissance du laser. Bien qu’il s’agisse d’une partie importante du processus, c’est aussi l’une des plus grandes sources de variabilité dans le modèle et devrait être optimisée pour la cohérence. Pour ce faire, il est recommandé de mesurer la sortie laser lors de la configuration avant que les souris ne reçoivent une injection de rose Bengal. La sortie recommandée pour la puissance laser de base est comprise entre 13,0 et 15,0 mW. Une faible puissance laser de base, telle que 11,5 mW, sans modification de la puissance expérimentale (100 mW), n’a entraîné aucune occlusion, comme le montre la figure 3. En revanche, une sortie laser de base de 13,5 mW avec une puissance expérimentale de 100 mW a abouti à des occlusions réussies. Dans les cas où la sortie laser était inférieure à 13,0 mW, la puissance expérimentale a été augmentée à 110 mW pour obtenir les mêmes occlusions réussies qu’avec une sortie laser de base plus élevée. En règle générale, 100 mW est la puissance expérimentale standard; cependant, si la sortie laser est inférieure à 13,0 mW, elle peut être compensée en modifiant la puissance expérimentale avec les plages recommandées dans le tableau 1.
Quatre principaux types d’occlusions ont été notés après la photocoagulation au laser des veines. Ces types d’occlusions sont résumés à la figure 4A et ont été classés en fonction de la quantité de flux sanguin; vaisseaux entièrement obstrués (pas de flux sanguin), vaisseaux partiellement obstrués (la plupart du temps bloqués par un écoulement occasionnel), partiellement réperfusés (flux sanguin constant ininterrompu avec entrave) et vaisseaux entièrement perfusés (aucune obstruction évidente). Pour déterminer si les types d’occlusions changent en fonction du génotype et déterminer le temps passé par état d’occlusion, des vidéos de 10 minutes après l’irradiation laser ont été évaluées. Cette évaluation a permis de déterminer que le système vasculaire irradié des souris iEC Casp9 passe plus de temps dans des états partiellement reperfusés et partiellement occlus que C57BL6/J, qui passent plus de temps dans des états complètement occlus (Figure 4B).
La figure 5 montre comment l’état d’occlusion des vaisseaux change rapidement dans les 10 premières minutes après la photocoagulation au laser. Une fois ces 10 minutes initiales écoulées, les occlusions se stabilisent et sont maintenues jusqu’à un point temporel de 24 heures. Ainsi, pour évaluer le nombre initial précis d’occlusions par œil, il est recommandé d’attendre 10 minutes après l’irradiation. Une évaluation antérieure de ce modèle a déterminé que la plupart des occlusions reperfusent 8 jours après l’irradiation8; Cependant, le taux d’occlusions qui reperfuse par jour peut varier selon la souche et doit être déterminé dans chaque modèle expérimental. Le modèle présenté ici est de lésion aiguë et destiné à être utilisé pour comprendre les voies qui mènent à l’œdème, qui se développe dans les 24 heures après les occlusions. Une autre caractéristique de la RVO est les hémorragies en forme de flamme, qui peuvent être observées 24 heures après la blessure, comme le montre la figure 5.
Un suivi 24 h après la RVO peut révéler d’autres pathologies ophtalmiques pouvant survenir à la suite de la méthode RTO. Certains incluent, mais ne sont pas limités à l’hémorragie sous-rétinienne (caractérisée par une plaque sanguine continue), le décollement de la rétine, la rétine entièrement ischémique (pas de flux sanguin dans les veines et les artères) et les cataractes. La figure 6 montre des images du fond d’œil avec la TCO correspondante à titre d’exemple, sauf dans les yeux où se forme la cataracte (figure 6F), car la TCO ne peut pas être réalisée en présence d’une cataracte. La figure 6A montre des exemples de ce à quoi ressemblent une image du fond d’œil et une OCT d’un œil non blessé pour référence.
La principale pathologie morphologique de la RVO dans ce modèle est l’œdème rétinien. Pour évaluer le niveau d’œdème rétinien, il est recommandé de prendre des images OCT avant le jour de la procédure RVO pour une lecture de base et au moment d’intérêt. La figure 7 montre la quantification OCT de l’œdème rétinien dans les yeux blessés. Une autre mesure utilisée pour déterminer l’état des couches neuronales consiste à évaluer la désorganisation des couches internes de la rétine (DRIL). Il s’agit d’une mesure utilisée en milieu clinique qui représente la non-perfusion capillaire, une autre caractéristique de RVO 5,9,10. Un exemple de cette évaluation se trouve à la figure 7B. La figure 7C montre un exemple d’image OCT avec les étiquettes correspondantes pour chaque couche rétinienne.
Figure 1 : Chronologie et schéma du modèle murin RVO. (A) Chronologie des événements depuis l’administration du rose bengale jusqu’à l’imagerie des veines obstruées. (B) Représentation résumée de la méthode pour obtenir une photocoagulation veineuse rétinienne réussie. Les cases rouges représentent des étapes importantes du processus qui sont très variables et qui peuvent être optimisées par modèle de souris et question d’intérêt. (C) Les veines principales de la rétine (V) sont plus larges et plus foncées que les artères (A). Chaque veine majeure sera irradiée avec un laser guidé de 532 nm, la taille du spot 50 μm, la puissance 100 mW, la durée 1 s, l’énergie totale 0,3 J et l’exposition radiante 15278,87 J/cm2, à une distance moyenne de 375 μm du nerf optique. (D) L’application au laser provoque une bulle de vaporisation visible sur l’imagerie du fond d’œil d’environ 150 μm et couvre <4% de la surface totale de la rétine. Les nombres représentent l’emplacement et la direction de mouvement suggérés (flèches) du faisceau laser lors de l’irradiation des vaisseaux. Abréviations : A = artère; V = veine; ON = nerf optique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le moment de la photo-occlusion par rapport à l’administration de rose bengal est critique pour une photocoagulation réussie. (A) Images rétiniennes du fond d’œil de iEC Casp9 WT et iEC Casp9 KO photo-occluses 10 et 20 minutes après l’administration de rose bengale. Les cercles blancs représentent les veines qui ont eu des occlusions réussies. (B) Nombre d’occlusions immédiatement après l’irradiation (0 h) et 1 jour après l’irradiation pendant 10 min et 20 min après l’injection de génotypes combinés par le bengalile rose. Test t de Welch, les barres d’erreur indiquent SEM. (C) Nombre d’occlusions séparées par génotype. ANOVA bidirectionnelle et test LSD de Fisher; les barres d’erreur indiquent SEM. Abréviations : WT = type sauvage; KO = KO; SEM = erreur type de la moyenne; ANOVA = analyse de la variance; LSD = différence la moins significative; ns = non significatif; P-RVO = occlusion veineuse post-rétinienne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La mesure de la sortie laser expérimentale et de base est une étape critique pour une photocoagulation réussie. Images rétiniennes du fond d’œil de iEC Casp9 WT et iEC Casp9 KO 10 min après photocoagulation; photo-occlus avec différents niveaux de sortie laser de base et expérimentaux. La faible sortie laser de base peut être compensée par une sortie laser expérimentale (12,8 mW, 110 mW). Les cercles blancs représentent les veines qui ont eu des occlusions réussies. Abréviations : WT = type sauvage; KO = KO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : La méthode RVO donne différents types d’occlusions. (A) Images rétiniennes du fond d’œil de C57BL/6J, iEC Casp9 WT et iEC Casp9 KO 10 min après la photocoagulation avec différents types d’occlusions : complètement occlus, partiellement occlus, partiellement reperfusé et complètement réperfusé. Les encarts montrent une vue focalisée d’une veine qui a entraîné un type spécifique d’occlusion après la photocoagulation. (B) Quantification du pourcentage de veines obstruées dans les différents états d’occlusion pour chaque génotype au cours des 10 premières minutes suivant l’irradiation. Des vidéos de dix minutes ont été évaluées par deux chercheurs, aveugles aux génotypes, qui ont attribué des numéros aux différents états d’occlusion (complètement occlus (-2), partiellement occlus (-1), complètement reperfusés (2) et partiellement reperfusés (1)) par durée. Abréviations : RVO = occlusion veineuse rétinienne; WT = type sauvage; KO = KO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Chronologie des occlusions après l’OVR. Images rétiniennes du fond d’œil de C57BL/6J, iEC Casp9 WT et iEC Casp9 KO 0, 5 min, 10 min et 24 h après irradiation laser. Les 10 premières minutes sont critiques pour l’état des occlusions et peuvent changer rapidement. Après les 10 minutes initiales, les occlusions sont stables jusqu’à au moins 24 h. Les cercles blancs représentent les veines qui ont eu des occlusions réussies, et les pointes de flèches jaunes représentent les hémorragies en forme de flamme. Abréviations : RVO = occlusion veineuse rétinienne; WT = type sauvage; KO = KO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Différentes pathologies ophtalmiques peuvent survenir après une OVR. (A-E) montrent des images rétiniennes du fond d’œil et l’OCT correspondante. (A) Un exemple d’œil non blessé qui n’a pas subi le processus RVO. (B) Hémorragie sous-rétinienne montrant une fuite de sang hors des vaisseaux dans l’image du fond d’œil. (C) Décollement de la rétine vu par le pli flou dans le fond d’œil et le soulèvement de la rétine dans l’OCT. (D) Œdème excessif montré par une grande quantité de gonflement dans l’OCT. (E) Un œil entièrement ischémique avec un flux sanguin complètement altéré entraînant une rétine blanche. (F) Deux exemples différents d’œil cataracte où une image claire du fond d’œil et un TCO n’ont pas pu être obtenus. Barres d’échelle OCT: 100 μm. Abréviations : RVO = occlusion veineuse rétinienne; OCT = tomographie par cohérence optique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Quantification des images OCT. (A) Examen de l’épaisseur de la couche et de la DRIL dans les yeux témoins non lasers et les yeux qui ont subi la procédure RVO. Mesures GCL, IPL, INL, OPL, ONL, segment externe et rétine entière. Statistiques, test de Mann-Whitney valeurs p : GCL : 0,0070, IPL : 0,0205, INL : <0,0001, OPL : 0,0014, ONL : 0,5582, segment externe : 0,44852, rétine entière : 0,0019. Les barres d’erreur montrent la quantification SEM. (B) DRIL mesurée à partir des images OCT de témoins non lasers et de souris RVO WT et KO iEC Casp9 ainsi que de souris c57/BL6J qui avaient RVO. Les barres d’erreur indiquent SEM. (C) Exemple d’OCT avec les étiquettes de chaque couche rétinienne. Abréviations : DRIL = désorganisation des couches internes de la rétine; RVO = occlusion veineuse rétinienne; WT = type sauvage; KO = KO; GCL = couche de cellules ganglionnaires; IPL = couche plexiforme interne; INL = couche nucléaire interne; BPO = couche plexiforme externe; ONL = couche nucléaire externe; SEM = erreur type de la moyenne; OCT = tomographie par cohérence optique; ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Sortie laser de base (mW) | Sortie laser expérimentale recommandée (mW) | Temps d’exposition recommandé (ms) |
| <11,0 ou >15,0 | Éteignez le laser et ajustez la fibre à l’extrémité connectée au boîtier de commande laser. Dévissez-le et déplacez-le légèrement vers la droite ou la gauche. Mesurez à nouveau le résultat, jusqu’à ce qu’il atteigne une valeur supérieure ou inférieure. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Tableau 1 : La faible sortie laser de base peut être compensée par une sortie laser expérimentale plus élevée. Variations de la sortie laser de base et de la sortie laser expérimentale recommandée et du temps d’exposition.
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Discussion
Le modèle de RVO chez la souris offre un moyen de mieux comprendre la pathologie de la RVO et de tester des traitements potentiels. Bien que le modèle RVO de souris soit largement utilisé sur le terrain, il est nécessaire de disposer d’un protocole détaillé actuel du modèle qui traite de sa variabilité et décrit l’optimisation du modèle. Ici, nous fournissons un guide avec des exemples d’expérience sur ce qui peut être modifié pour obtenir les résultats les plus cohérents dans une cohorte d’animaux de laboratoire et fournir des données fiables.
Les deux éléments les plus essentiels du modèle murin RVO sont la sortie laser et l’injection intraveineuse réussie du colorant photosensibilisant. Pour produire la puissance nécessaire pour induire la coagulation lorsque le laser est dirigé vers une veine particulière, la sortie laser doit être correctement ajustée. Bien que cela puisse être réalisé en utilisant les techniques suggérées dans la méthode, il est important de tenir compte des différences dans la configuration du système de chaque laboratoire. Les variations du câble à fibre optique et la façon dont il est accommodé par rapport à l’équipement et à la température ambiante sont quelques-unes des variables qui peuvent expliquer la faible sortie laser. Des réglages indépendants de la configuration du système sont recommandés pour augmenter la sortie laser.
Cependant, cet effort est inopérable sans une technique appropriée de la veine de la queue pour administrer le colorant photosensibilisant. Les injections de veines de la queue peuvent être difficiles à réaliser, et c’est une compétence qui prend du temps à développer. De mauvaises injections peuvent entraîner aucune occlusion; dans ce cas, Rose Bengal peut être administré via IP. L’administration de rose bengal par IP a été utilisée pour modéliser la RVO, mais avec un temps d’irradiation laser plus long (3 s) et une concentration plus élevée de rose bengal (40 mg/mL)11. Pour limiter l’irradiation laser prolongée et cibler spécifiquement le système vasculaire, les nervures de la queue sont le mode d’administration privilégié.
Ce modèle pourrait également être réalisé en utilisant d’autres colorants photoactivables tels que l’éosine Y et la fluorescéine de sodium12,13,14, bien que le rose bengal soit le colorant photoactivable 4,5,6,8 le plus utilisé. Il a été démontré que tous les colorants produisent des caractéristiques précoces de la maladie clinique telles que l’hémorragie rétinienne et l’œdème rétinien15. Il a été démontré que les colorants photoactivables n’ont pas d’effets nocifs sur les animaux, ce qui montre une toxicité négligeable pour le système15,16. Il convient également de noter que le colorant choisi doit avoir un maximum d’absorption compatible avec la longueur d’onde du laser utilisé. Rose Bengal a une excitation à 525 nm17, la fluorescéine de sodium à 475-490 nm 18 et l’éosine Y à 490 nm19.
Les principales sources de variabilité dans ce modèle sont le moment de la photo-occlusion par rapport à l’administration de rose bengale et la sortie laser de base et expérimentale. Alors que la figure 2 montre des points temporels de 10 et 20 minutes pour la photo-occlusion, un petit nombre d’expériences de 5 et 15 minutes ont également été réalisées (données non présentées), ce qui a donné des occlusions qui n’étaient pas aussi cohérentes que le point de temps de 10 minutes. Par conséquent, 10 min ont été choisis comme temps d’attente optimal entre l’administration de rose bengale et la photo-occlusion pour cette méthode. Cependant, des études ont rapporté que la RVO peut également être induite dès 3 minutes après l’administration de rose bengal5. Une autre façon de déterminer le temps d’attente optimal spécifique à la souche de souris du bengle rose à la photo-occlusion consiste à surveiller la concentration relative du bengalile rose en utilisant le mode d’imagerie par fluorescence avec un filtre à tétraméthylrhodamine (TRITC). Cependant, le protocole décrit ici peut être effectué à l’aide de microscopes imageurs rétiniens qui n’ont pas de filtre TRITC.
L’autre source de grande variabilité dans ce modèle est la sortie laser de base. Comme les niveaux quotidiens de sortie laser de base peuvent être très différents, il est important d’évaluer les niveaux avant chaque expérience. La normalisation de la sortie laser de base dans toutes les études peut aider à potentialiser et à étendre l’utilisation du modèle murin RVO. Le réajustement du câble à fibre optique peut suffire à modifier les niveaux de base ; toutefois, si une mesure de 13,0 mW ne peut être atteinte, le tableau 1 fournit un guide pour la compensation à l’aide de la puissance expérimentale. Il est important de noter que la rétine étant un système fermé, il est essentiel de déterminer la fraction de veines obstruées (le nombre de veines occluses divisé par le nombre de veines irradiées) pour comprendre, contrôler et prédire la gravité des dommages dans le modèle RVO. L’analyse antérieure des lectures endommagées (DRIL et épaisseur rétinienne) était corrélée à la fraction de veines obstruées et prédisait l’atrophie rétinienne 8 jours après RVO8. Ainsi, la fraction de veines obstruées doit être considérée et évaluée. On ne sait toujours pas comment d’autres états d’occlusion intermédiaires, tels que partiellement reperfusé, partiellement occlus ou veines autrefois obstruées et reperfusées au bout de 10 minutes, contribuent au développement d’un œdème et d’une atrophie rétiniens.
D’autres études des yeux avec ces types d’occlusions peuvent aider à déterminer si une occlusion soutenue est nécessaire pour des dommages importants ou si même des occlusions transitoires sont importantes dans ce modèle. Selon la question expérimentale posée, différents taux d’occlusion seront optimaux. Un taux d’occlusion de 40 à 50% est idéal dans la plupart des cas, ce qui signifie deux ou trois occlusions dans un œil à six veines. Cela garantit des lésions importantes, mais la rétine est intacte et peut être disséquée pour des analyses immunohistochimiques et biochimiques.
Pour déterminer cela, il est pertinent de distinguer la vue pathologique d’une occlusion réussie et représentative de la signature RVO. L’occlusion naturelle présentée par RVO comprend des hémorragies en forme de flamme 20 (à ne pas confondre avec l’hémorragie sous-rétinienne), qui peuvent être observées dans ce modèle24 h après une blessure. Le modèle RVO peut également entraîner des lésions rétiniennes indésirables (non distinctives de la pathologie RTO) telles que celles illustrées à la figure 6B-F, si ses paramètres ne sont pas contrôlés avec prudence. Une approche qui peut être adoptée pour éviter ceux-ci, en plus de réguler la concentration de rose bengal et la puissance laser expérimentale, est d’arrêter d’irradier les vaisseaux qui ont une formation claire d’un thrombus après la première ou la deuxième irradiation.
D’autres facteurs à prendre en compte lors de l’utilisation de ce modèle et du choix des veines à occlure sont la souche de la souris et le diamètre du vaisseau. Certaines souches de souris, telles que BALB/c, plus communément appelées albinos, sont sensibles aux dommages causés par la lumière21. De plus, ils ont des déficits de développement rétinien qui conduisent à des défauts dans la décussation au niveau du chiasme optique et de l’acuité visuelle22,23. Il est recommandé d’évaluer pleinement l’intégrité rétinienne basale et vasculaire des témoins non blessés pour la souche de souris choisie pour les études RCO. Des études ont montré que la largeur des veines peut interférer avec le développement de l’œdème rétinien et de la pathologie de la maladie24. Ainsi, des animaux de poids similaire doivent être utilisés pour éviter toute variabilité supplémentaire. Les facteurs d’exclusion des yeux à utiliser dans une étude dépendront également de la question expérimentale. Il peut être sage d’inclure tout œil qui a déjà été occlus, même s’il est reperfusé au moment de suivi pour la signalisation. Cependant, si des occlusions stables sont souhaitées, ces yeux seraient exclus. La figure 6 montre des exemples de critères d’exclusion possibles ou d’yeux qui pourraient être utilisés pour l’analyse pathologique.
Pour montrer que ces réglages laser ne causaient pas de dommages et que les effets observés étaient vraiment motivés par les occlusions elles-mêmes, des contrôles fictifs ont été effectués dans des études antérieures8. Les souris simulées ont quand même reçu une injection de bengale rose dans la veine de la queue, mais ont été irradiées dans l’espace parenchymateux entre les principaux vaisseaux au lieu d’être irradiées sur la veine. Il s’agissait d’une étape importante pour s’assurer que le modèle reproduisait les blessures RVO observées chez les patients au lieu de simplement blesser les tissus avec un laser. Ces simulacres ne montrent aucune activation de la caspase-9 ou -7 ou de l’un des œdèmes observés chez les souris qui ont reçu une irradiation laser normale dans les vaisseaux, indiquant que le laser n’a pas eu d’effets indésirables. Il est essentiel d’avoir ces contrôles, surtout si des réglages laser plus élevés seront utilisés pour s’assurer que la blessure modélisée est une représentation précise des dommages souhaités8.
Le modèle murin RVO peut être appliqué pour étudier d’autres maladies résultant de lésions hypoxiques-ischémiques de la rétine et du cerveau, telles que la rétinopathie diabétique, la rétinopathie du prématuré et les accidents vasculaires cérébraux. En outre, il peut servir de modèle pour étudier les voies de signalisation pertinentes pour le développement de lésions vasculaires et tester des traitements potentiels qui améliorent la neurodégénérescence dans le système nerveux central. L’optimisation personnalisée dans ce rapport peut limiter la variabilité du modèle RVO murin et faire la lumière sur la physiopathologie de l’OVR.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
- Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
- Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
- Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338 (2018).
- Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
- Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
- Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W.
- Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560 (2019).
- Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
- Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
- Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
- MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
- Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
- Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J.
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
