Summary
Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para oclusão da veia retiniana usando rosa bengala e um sistema de microscópio de imagem retiniana guiado a laser com recomendações para maximizar sua reprodutibilidade em cepas geneticamente modificadas.
Abstract
Modelos de camundongos de oclusão da veia retiniana (RVO) são frequentemente usados em oftalmologia para estudar a lesão hipóxico-isquêmica na retina neural. Neste relatório, um método detalhado que aponta etapas críticas é fornecido com recomendações para otimização para alcançar taxas de oclusão consistentemente bem-sucedidas em diferentes cepas de camundongos geneticamente modificados. O modelo de camundongo RVO consiste principalmente na administração intravenosa de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação a laser usando um microscópio de imagem da retina ligado a um laser guiado oftálmico. Três variáveis foram identificadas como determinantes da consistência da oclusão. Ajustando o tempo de espera após a administração de rosa bengala e equilibrando a linha de base e a saída experimental do laser, a variabilidade entre os experimentos pode ser limitada e uma maior taxa de sucesso das oclusões alcançada. Este método pode ser usado para estudar doenças da retina que são caracterizadas por edema de retina e lesão hipóxico-isquêmica. Além disso, como esse modelo induz lesão vascular, ele também pode ser aplicado para estudar a neurovasculatura, a morte neuronal e a inflamação.
Introduction
A oclusão da veia retiniana (RVO) é uma doença vascular comum da retina que afetou aproximadamente 28 milhões de pessoas em todo o mundo em 20151. RVO leva ao declínio da visão e perda em adultos em idade ativa e idosos, representando uma doença que ameaça a visão em curso estima-se que aumente ao longo da década próxima. Algumas das patologias distintas do RVO incluem lesão hipóxico-isquêmica, edema de retina, inflamação e perda neuronal2. Atualmente, a primeira linha de tratamento para este distúrbio é através da administração de inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Embora o tratamento anti-VEGF tenha ajudado a melhorar o edema da retina, muitos pacientes ainda enfrentam declínio da visão3. Para entender melhor a fisiopatologia desta doença e testar possíveis novas linhas de tratamento, há a necessidade de constituir um protocolo de modelo de camundongo RVO funcional e detalhado para diferentes cepas de camundongos.
Modelos de camundongos foram desenvolvidos implementando o mesmo dispositivo a laser usado em pacientes humanos, emparelhado com um sistema de imagem dimensionado para o tamanho correto para um mouse. Este modelo de RVO em camundongo foi relatado pela primeira vez em 2007 4 e posteriormente estabelecido por Ebneter e outros 4,5. Eventualmente, o modelo foi otimizado por Fuma et al. para replicar as principais manifestações clínicas do RVO, como o edema de retina6. Desde que o modelo foi relatado pela primeira vez, muitos estudos o empregaram usando a administração de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação das principais veias da retina com um laser. No entanto, a quantidade e o tipo de corante que é administrado, a potência do laser e o tempo de exposição variam significativamente entre os estudos que usaram esse método. Essas diferenças muitas vezes podem levar ao aumento da variabilidade no modelo, dificultando a replicação. Até o momento, não há estudos publicados com detalhes específicos sobre possíveis caminhos para sua otimização.
Este relato apresenta uma metodologia detalhada do modelo de camundongo RVO na cepa C57BL/6J e uma cepa caspase-9 endotelial induzível por tamoxifeno (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J e de relevância para a patologia RVO como cepa de referência para um camundongo geneticamente modificado. Estudo prévio havia demonstrado que a ativação não apoptótica da caspase-9 endotelial instiga edema retiniano e promove morte neuronal8. A experiência usando essa cepa ajudou a determinar e fornecer informações sobre possíveis modificações para adaptar o modelo de camundongo RVO, que pode ser aplicável a outras cepas geneticamente modificadas.
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Protocol
Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.
NOTA: Todos os experimentos usaram camundongos machos de dois meses de idade que pesavam aproximadamente 20 g.
1. Preparação e administração de tamoxifeno para ablação genética induzível de genes floxados
NOTA: O diâmetro dos vasos da retina pode ser afetado pelo peso do animal. Certifique-se de que todos os animais utilizados para uma experiência têm pesos semelhantes.
- Diluir o tamoxifeno em óleo de milho a uma concentração de 20 mg/mL.
NOTA: O tamoxifeno é um tóxico e é sensível à luz. Proteja da luz, por exemplo, com papel alumínio. - Vórtice a solução por alguns segundos.
- Deixar no forno a 55 °C durante 15 min.
NOTA: Certifique-se de que o tamoxifeno se dissolveu completamente. Vórtices adicionais podem ser necessários. - Conservar a solução a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.
- Use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 26 G para injeção de tamoxifeno. Limpe a área de injeção com etanol a 70%. Administrar 2 mg de tamoxifeno (100 μL de 20 mg/mL) por via intraperitoneal (IP) uma vez ao dia pelo tempo estabelecido de acordo com a linha de Cre induzível específica.
- Permita dois dias de descanso para os animais antes de iniciar os experimentos.
2. Preparação de reagentes para fotocoagulação a laser
- Rosa bengala
NOTA: A rosa bengala é sensível à luz. Armazenar no escuro até o uso e preparar fresco para melhores resultados.- Preparar a rosa bengala diluindo-a em 5 mg/ml em solução salina estéril e filtrá-la através de um filtro de seringa de 0,2 μm.
- Prepare uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 26 G com rosa bengala.
- Cetamina/xilazina
- Diluir cetamina e xilazina em solução salina estéril de acordo com as seguintes concentrações: cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).
- Carprofeno
- Diluir o carprofeno a 1 mg/ml em solução salina estéril.
- Prepare uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 26 G com carprofeno.
- Solução salina estéril
- Prepare uma seringa de 5 ml equipada com uma agulha de 26 G com solução salina estéril.
3. Configuração do laser
- Manuseie suavemente o cabo de fibra óptica e conecte-o à caixa de controle a laser e ao adaptador a laser do microscópio de imagem da retina.
- Ligue a caixa da lâmpada do microscópio de imagem da retina.
- Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens.
- Ajuste o balanço de branco usando um pedaço de papel branco e colocando-o na frente do olho do mouse e clicando em Ajustar no programa de imagem.
- Ligue a caixa de controle a laser girando a tecla e seguindo as instruções na tela da caixa de controle a laser.
NOTA: O laser utilizado nesta experiência é de Classe 3B e pode causar danos oculares. Use óculos de proteção ao operar o laser. - Verifique a potência do laser de linha de base.
- Use um medidor de energia a laser.
- Ajuste a tela da caixa de controle a laser para os seguintes parâmetros: 50 mW e 2.000 ms.
- Ligue o laser e coloque o medidor de energia na frente da ocular.
NOTA: Certifique-se de que a luz do microscópio está apagada durante o teste da potência do laser de linha de base. - Pressione o pedal do pedal do pedal para ativar o laser.
- Apontar para a leitura de potência do laser para ser 13-15 mW.
NOTA: A leitura de energia do laser determinará a taxa de sucesso para oclusões da veia da retina. Se a leitura da potência do laser for muito baixa, ajustes podem ser feitos na potência e no tempo de exposição ao laser. Consulte a Tabela 1 para obter recomendações.
- Ajuste a potência experimental do laser configurando a tela da caixa de controle do laser para os seguintes parâmetros: 100 mW, 1.000 ms.
- Desligue o laser.
NOTA: Por segurança e para evitar o superaquecimento, é melhor manter o laser desligado entre os ratos.
4. Injeção de veia da cauda do rato de rosa bengala
- Despeje 300 mL de água em um copo de 500 mL.
- Aqueça o copo em um forno de micro-ondas por 1 min.
- Coloque gaze na água morna no copo.
- Coloque o mouse em uma contenção.
- Pressione a gaze na cauda do rato suavemente e procure as veias dilatadas. Desinfete o local de injeção usando um toalhete de álcool após a dilatação da água morna.
- Insira a agulha no local de injeção e puxe a seringa para garantir que está na veia. Em seguida, injete a veia da cauda do rato, administrando a quantidade correta de acordo com o peso do animal (37,5 mg/kg). Aplique pressão no local da injeção para evitar hematoma ou sangramento. Limpe o site.
- Solte o mouse da contenção e devolva-o à gaiola.
- Aguarde 8 minutos para que a rosa bengala circule antes da injeção de anestésicos.
NOTA: Isso proporcionará um total de 10 minutos entre a injeção de rosa bengala e a irradiação a laser.
5. Oclusão das veias maiores
- Ligue a plataforma do mouse aquecida.
- Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida em cada olho.
- Injete 150 μL dos anestésicos, cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) IP.
NOTA: Durante este procedimento, o rato recebeu duas injeções IP. Assim, os lados foram alternados. A injeção de IP para a anestesia foi administrada no quadrante abdominal inferior direito, e a solução salina foi injetada no quadrante abdominal inferior esquerdo. Recomenda-se puxar a seringa antes da injeção para garantir que a agulha esteja no abdômen e não em nenhum órgão. - Aperte o animal para determinar a profundidade da anestesia e espere até que ele não responda.
- Adicione uma gota de cloridrato de proparacaína por olho (analgésico).
- Adicione pomada de gel a ambos os olhos.
- Injete 150 μL de carprofeno por via subcutânea entre as orelhas.
- Acomodem o mouse na plataforma.
- Ajuste a plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada.
- Conte as veias da retina e tire uma imagem do fundo.
NOTA: As veias da retina são mais escuras e mais largas do que as artérias. Veias e artérias se alternam; no entanto, às vezes pode haver uma artéria ramificada perto do nervo óptico e, portanto, duas artérias adjacentes. - Ligue o laser e aponte para uma veia da retina a aproximadamente 375 μm do disco óptico.
- Irradiar o recipiente pressionando o pedal e movendo ligeiramente o feixe de laser até 100 μm. Repita este passo três vezes e mova o feixe de laser após cada pulso para que a irradiação não seja focada em um ponto.
- Repita a irradiação em outros vasos principais para alcançar 2-3 oclusões.
6. Estabelecimento do número de veias ocluídas no dia 0
- Desligue a lâmpada depois de irradiar os recipientes e aguarde 10 min.
NOTA: A exposição à luz pode causar danos na retina e inflamação; desligue a lâmpada durante o tempo de espera para minimizar a exposição7. - Ligue a lâmpada novamente e conte o número de veias ocluídas.
- Tire uma imagem do fundo.
7. Cuidados posteriores
- Injete 1 mL de solução salina estéril IP.
NOTA: Consulte os detalhes da injeção de IP na seção 5, etapa 3. - Adicione colírios lubrificantes a ambos os olhos.
- Adicione pomada de gel a ambos os olhos.
- Observe o rato enquanto ele se recupera da anestesia e não o devolva à gaiola com os outros animais até que esteja totalmente recuperado. O carprofeno (5 mg/kg) pode ser administrado diariamente até 2 dias após o procedimento. Se aplicado a seres humanos, a dor não é um sintoma de RVO.
NOTA: Não deixe os animais sozinhos até que eles se recuperem totalmente da anestesia.
8. Avaliação do edema de retina por tomografia de coerência óptica (OCT)
NOTA: Esta etapa pode ser feita no ponto de interesse do investigador. O pico de edema da retina para um rato C57BL/6J é de 1 dia após o procedimento de RVO. Esse ponto de tempo pode variar dependendo do plano de fundo do mouse.
- Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina OCT e a plataforma aquecida do mouse.
- No dia seguinte à oclusão, siga os passos 5.2 a 5.7 para preparar o animal.
- Abra os programas de software de imagem e OCT.
- No programa OCT, ajuste o empurrão para 5.
- Tome OCT a 75 μm distal da queimadura ou 4 cliques.
- Tire imagens OCT em quatro quadrantes da retina.
- Analise as imagens da OCT usando o software de rastreamento.
- Compare a espessura da retina das medidas pré-irradiadas com 1 dia após o RVO ou no ponto de interesse do momento.
NOTA: Ao analisar os dados, leve em consideração o número de veias irradiadas, pois isso pode influenciar o desenvolvimento de edema de retina. Os animais são então eutanasiados pela administração de anestésico seguido de cirurgia de perfusão sem sobrevida.
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Representative Results
O modelo de camundongo RVO visa alcançar com sucesso oclusões nas veias da retina, levando a lesão hipóxico-isquêmica, quebra da barreira hemato-retiniana, morte neuronal e edema de retina8. A Figura 1 mostra uma linha do tempo de etapas para garantir a reprodutibilidade, um esquema do desenho experimental e descreve as etapas que podem ser otimizadas dependendo das questões experimentais. As três etapas principais que podem ser modificadas são o tempo de espera após a administração de rosa bengala, a potência do laser de linha de base e a saída experimental do laser. Neste relatório, camundongos C57BL/6J, bem como companheiros de ninhada WT e KO de uma linhagem de camundongo knockout de células endoteliais induzíveis caspase-9 (iEC Casp9), foram usados para determinar as configurações ideais em diferentes cepas.
O tempo de espera da injeção de rosa bengala para irradiação a laser pode alterar o sucesso da fotocoagulação nas veias. Um tempo de espera muito curto pode resultar em baixa concentração de rosa bengala dentro das veias, enquanto um tempo de espera muito longo pode levar a rosa bengala sendo eliminada da circulação da retina. Ambas as situações podem levar a uma fotocoagulação deficiente e oclusões malsucedidas. Ao testar o número de oclusões obtidas imediatamente após a irradiação a laser, a comparação de animais que foram laserizados 10 e 20 min após a administração de rosa bengala revelou que não houve diferenças no número de oclusões alcançadas (Figura 2B). No entanto, o número de oclusões sustentadas até 1 dia após o RVO diminuiu significativamente em animais que foram laserizados 20 min após a administração de rosa bengala, independentemente do genótipo. Este resultado sugere que, ao estudar a lesão aguda induzida por RVO, o tempo de espera após a administração de rosa bengala pode afetar a estabilidade da oclusão. A reperfusão precoce de veias (antes de 24 h após a lesão) pode afetar o desenvolvimento de edema de retina e, portanto, deve ser controlada determinando o tempo de espera correto desde a administração de rosa bengala até a irradiação a laser.
Em princípio, a fotocoagulação bem-sucedida que leva à oclusão é impulsionada pela potência do laser. Embora esta seja uma parte tão importante do processo, é também uma das maiores fontes de variabilidade no modelo e deve ser otimizada para consistência. Para conseguir isso, recomenda-se medir a saída do laser durante a configuração antes que os ratos sejam injetados com rosa bengala. A saída recomendada para a potência basal do laser está entre 13,0 e 15,0 mW. A baixa potência basal do laser, como 11,5 mW, sem modificar a potência experimental (100 mW), resultou em não haver oclusões, como mostra a Figura 3. Em contraste, uma saída de laser basal de 13,5 mW com uma potência experimental de 100 mW resultou em oclusões bem-sucedidas. Nos casos em que a saída do laser foi inferior a 13,0 mW, a potência experimental foi aumentada para 110 mW para alcançar as mesmas oclusões bem-sucedidas que com maior saída de laser basal. Normalmente, 100 mW é a potência experimental padrão; no entanto, se a saída do laser for inferior a 13,0 mW, ela pode ser compensada modificando a potência experimental com as faixas recomendadas na Tabela 1.
Quatro tipos principais de oclusões foram observados para ocorrer após a fotocoagulação a laser das veias. Esses tipos de oclusões estão resumidos na Figura 4A e foram classificados de acordo com a quantidade de fluxo sanguíneo; vasos totalmente ocluídos (sem fluxo sanguíneo), vasos parcialmente ocluídos (principalmente bloqueados com fluxo ocasional), parcialmente reperfundidos (fluxo sanguíneo constante ininterrupto com obstáculo) e vasos totalmente reperfundidos (sem obstrução óbvia). Para investigar se os tipos de oclusões mudam de acordo com o genótipo e determinar o tempo gasto por estado de oclusão, foram avaliados vídeos de 10 minutos após a irradiação a laser. Essa avaliação ajudou a determinar que a vasculatura irradiada de camundongos iEC Casp9 passa mais tempo em estados parcialmente reperfundidos e parcialmente ocluídos do que C57BL6/J, que passam mais tempo em estados totalmente ocluídos (Figura 4B).
A Figura 5 demonstra como o estado de oclusão dos vasos muda rapidamente nos primeiros 10 minutos após a fotocoagulação a laser. Uma vez que esses 10 minutos iniciais tenham passado, as oclusões se estabilizam e são mantidas até um período de tempo de 24 horas. Assim, para avaliar o número inicial exato de oclusões por olho, recomenda-se aguardar 10 min após a irradiação. Uma avaliação prévia desse modelo determinou que a maioria das oclusões se reperfunde 8 dias após airradiação 8; no entanto, a taxa de oclusões que reperfundem por dia pode variar de acordo com a deformação e deve ser determinada em cada modelo experimental. O modelo aqui apresentado é de lesão aguda e destina-se a ser utilizado para compreender as vias que levam ao edema, que se desenvolve dentro de 24 h após as oclusões. Outra característica do RVO são as hemorragias em forma de chama, que podem ser observadas às 24 h pós-lesão, conforme ilustrado na Figura 5.
O seguimento às 24 h pós-RVO pode revelar outras patologias oftálmicas que podem ocorrer como resultado do método RVO. Alguns incluem, mas não estão limitados a hemorragia sub-retiniana (caracterizada por mancha sanguínea contínua), descolamento de retina, retina totalmente isquêmica (sem fluxo sanguíneo em veias e artérias) e catarata. A Figura 6 mostra imagens de fundo de olho com OCT correspondente como exemplos, exceto em olhos onde a catarata se forma (Figura 6F), pois a OCT não pode ser realizada na presença de catarata. A Figura 6A mostra exemplos de como uma imagem de fundo de olho e OCT de um olho não ferido se parecem para referência.
A principal patologia morfológica do RVO neste modelo é o edema de retina. Para avaliar o nível de edema da retina, recomenda-se a realização de imagens OCT antes do dia do procedimento RVO para uma leitura basal e no momento de interesse. A Figura 7 mostra a quantificação da OCT do edema de retina em olhos lesados. Outra medida usada para determinar o estado das camadas neuronais é avaliar a desorganização das camadas internas da retina (DRIL). Trata-se de uma medida utilizada no cenário clínico que representa a não perfusão capilar, outra característica do RVO 5,9,10. Um exemplo dessa avaliação pode ser encontrado na Figura 7B. A Figura 7C mostra um exemplo de uma imagem OCT com os rótulos correspondentes para cada camada da retina.
Figura 1: Linha do tempo e esquema do modelo de camundongo RVO. (A) Linha do tempo de eventos desde a administração de rosa bengala até a imagem de veias ocluídas. (B) Representação resumida do método para alcançar o sucesso da fotocoagulação da veia retiniana. As caixas vermelhas representam etapas importantes no processo que são altamente variáveis e que podem ser otimizadas por modelo de mouse e questão de interesse. (C) As veias maiores da retina (V) são mais largas e escuras em comparação com as artérias (A). Cada veia principal será irradiada com um laser guiado de 532 nm, tamanho spot de 50 μm, potência de 100 mW, duração 1 s, energia total de 0,3 J e exposição radiante de 15278,87 J/cm2, a uma distância média de 375 μm do nervo óptico. (D) A aplicação do laser causa uma bolha de vaporização visível na imagem do fundo de olho de aproximadamente 150 μm e cobre <4% da área total da retina. Os números representam a localização sugerida e a direção do movimento (setas) do feixe de laser ao irradiar vasos. Abreviaturas: A = artéria; V = veia; ON = nervo óptico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O tempo de fotooclusão em relação à administração de rosa bengala é crítico para o sucesso da fotocoagulação . (A) Imagens de retina de fundo de olho de iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO foto-ocluídas 10 e 20 minutos após a administração de rosa bengala. Os círculos brancos representam veias que tiveram oclusões bem-sucedidas. (B) Número de oclusões imediatamente após a irradiação (0 h) e 1 dia após a irradiação por 10 min e 20 min após a injeção de genótipos combinados de rosa bengala. Teste t de Welch, barras de erro indicam MEV. (C) Número de oclusões separadas por genótipo. ANOVA bidirecional e teste de LSD de Fisher; As barras de erro indicam SEM. Abreviaturas: WT = wild-type; KO = nocaute; MEV = erro padrão da média; ANOVA = análise de variância; LSD = diferença menos significativa; ns = não significativo; P-RVO = oclusão da veia pós-retiniana. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A medição da linha de base e da saída experimental do laser são etapas críticas para o sucesso da fotocoagulação. Imagens de retina de fundo de olho de iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO 10 min após a fotocoagulação; foto-ocluído com diferentes níveis de saída de laser basal e experimental. A baixa saída de laser de linha de base pode ser compensada com a saída experimental do laser (12,8 mW, 110 mW). Os círculos brancos representam veias que tiveram oclusões bem-sucedidas. Abreviaturas: WT = tipo selvagem; KO = nocaute. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O método RVO resulta em diferentes tipos de oclusões. (A) Imagens de fundo de olho da retina de C57BL/6J, iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO 10 min após a fotocoagulação com diferentes tipos de oclusões: totalmente ocluídas, parcialmente ocluídas, parcialmente reperfundidas e totalmente reperfundidas. As inserções mostram uma visão focada de uma veia que resultou em um tipo específico de oclusão após a fotocoagulação. (B) Quantificação da porcentagem de veias ocluídas nos diferentes estados de oclusão para cada genótipo durante os primeiros 10 min pós-irradiação. Os vídeos de dez minutos foram avaliados por dois pesquisadores, cegos para genótipos, que atribuíram números aos diferentes estados de oclusão (totalmente ocluídos (-2), parcialmente ocluídos (-1), totalmente reperfundidos (2) e parcialmente reperfundidos (1)) por duração. Abreviaturas: RVO = oclusão da veia retiniana; WT = tipo selvagem; KO = nocaute. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Linha do tempo das oclusões após o RVO. Imagens de retina de fundo de olho de C57BL/6J, iEC Casp9 WT e iEC Casp9 KO 0, 5 min, 10 min e 24 h após irradiação a laser. Os primeiros 10 minutos são críticos para o estado das oclusões e podem mudar rapidamente. Após os 10 minutos iniciais, as oclusões são estáveis até pelo menos 24 h. Círculos brancos representam veias que tiveram oclusões bem-sucedidas, e pontas de seta amarelas retratam hemorragias em forma de chama. Abreviaturas: RVO = oclusão da veia retiniana; WT = tipo selvagem; KO = nocaute. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Diferentes patologias oftálmicas podem ocorrer após RVO. (A-E) mostram imagens da retina do fundo de olho e OCT correspondente. (A) Um exemplo de um olho não lesionado que não foi submetido ao processo RVO. (B) Hemorragia sub-retiniana mostrando sangue vazando para fora dos vasos na imagem do fundo de olho. (C) Descolamento de retina visto pela dobra borrada no fundo e o levantamento da retina na OCT. (D) Edema excessivo mostrado por uma grande quantidade de inchaço na OCT. (E) Um olho totalmente isquêmico com fluxo sanguíneo completamente prejudicado, resultando em uma retina branca. (F) Dois exemplos diferentes de um olho cataratado em que não foi possível obter uma imagem clara do fundo de olho e a OCT. Barras de escala OCT: 100 μm. Abreviaturas: RVO = oclusão da veia retiniana; OCT = tomografia de coerência óptica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Quantificação das imagens OCT. (A) Examinar a espessura da camada e o DRIL em olhos de controle sem laser e olhos que passaram pelo procedimento RVO. Medidas de GCL, IPL, INL, OPL, ONL, Segmento externo e Retina inteira. Estatísticas, Mann-Whitney teste p-valores: GCL: 0,0070, IPL: 0,0205, INL: <0,0001, OPL: 0,0014, ONL: 0,5582, Segmento Externo: 0,44852, Retina inteira:0,0019. As barras de erro mostram a quantificação do SEM. (B) DRIL medida a partir das imagens OCT de controles não laserizados e camundongos RVO WT e KO iEC Casp9, bem como camundongos c57/BL6J que tinham RVO. As barras de erro mostram SEM. (C) OCT de exemplo com os rótulos de cada camada da retina. Abreviaturas: DRIL = Desorganização das camadas internas da retina; RVO = oclusão da veia retiniana; WT = tipo selvagem; KO = nocaute; GCL = Camada de Células Gânglias; IPL = Camada Plexiforme Interna; INL = Camada Nuclear Interna; OPL = Camada Plexiforme Externa; ONL = Camada Nuclear Externa; MEV = erro padrão da média; OCT = tomografia de coerência óptica; ns = não significativo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Saída a laser de linha de base (mW) | Saída Experimental Recomendada de Laser (mW) | Tempo de Exposição Recomendado (ms) |
| <11.0 ou >15.0 | Desligue o laser e ajuste a fibra na extremidade que está conectada à caixa de controle do laser. Desparafuse-o e mova-o ligeiramente para a direita ou para a esquerda. Meça o resultado novamente, até que ele atinja um valor maior ou menor. | |
| 11.0-12.0 | 120 | 1,000 |
| 12.0-13.0 | 110 | 1,000 |
| 13.0-14.0 | 100 | 1,000 |
| 14.0-15.0 | 100 | 1,000 |
Tabela 1: A baixa saída basal do laser pode ser compensada com maior saída experimental do laser. Variações na saída de laser basal e na saída experimental recomendada de laser e tempo de exposição.
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Discussion
O modelo RVO de camundongo fornece um caminho para entender melhor a patologia do RVO e testar possíveis terapêuticas. Embora o modelo RVO do mouse seja amplamente utilizado no campo, há a necessidade de um protocolo detalhado atual do modelo que aborde sua variabilidade e descreva a otimização do modelo. Aqui, fornecemos um guia com exemplos da experiência sobre o que pode ser alterado para obter os resultados mais consistentes em uma coorte de animais experimentais e fornecer dados confiáveis.
Os dois elementos mais essenciais do modelo de rato RVO são a saída a laser e a injeção intravenosa bem-sucedida do corante fotossensibilizador. Para produzir a potência necessária para induzir a coagulação quando o laser é direcionado para uma veia específica, a saída do laser deve ser ajustada adequadamente. Embora isso possa ser alcançado usando as técnicas sugeridas no método, é importante considerar as diferenças na configuração do sistema de cada laboratório. Variações do cabo de fibra óptica e como ele é acomodado em relação ao equipamento e à temperatura ambiente são algumas das variáveis que podem explicar a baixa saída do laser. Ajustes independentes na configuração do sistema são recomendados para aumentar a saída do laser.
No entanto, esse esforço é inoperável sem uma técnica de veia de cauda apta para fornecer o corante fotossensibilizador. As injeções na veia da cauda podem ser difíceis de alcançar, e é uma habilidade que leva tempo para se desenvolver. Injeções ruins podem resultar em nenhuma oclusão; neste caso, rosa bengala pode ser administrada via IP. A administração de rosa bengala via IP tem sido usada para modelar RVO, mas com maior tempo de irradiação a laser (3 s) e maior concentração de rosa bengala (40 mg/mL)11. Para limitar a irradiação prolongada do laser e atingir especificamente a vasculatura, o vimento da cauda é o modo preferido de administração.
Este modelo também poderia ser realizado utilizando outros corantes fotoativáveis, como Y eosina e fluoresceína de sódio12,13,14, embora a rosa bengala seja o corante fotoativável mais utilizado 4,5,6,8. Todos os corantes demonstraram produzir características precoces da doença clínica, como hemorragia retiniana e edema de retina15. Demonstrou-se que os corantes fotoativáveis não têm efeitos adversos sobre os animais, mostrando toxicidade insignificante para o sistema15,16. Deve-se notar também que o corante escolhido deve ter um máximo de absorção compatível com o comprimento de onda do laser que está sendo usado. Rose Bengal tem uma excitação em 525 nm17, fluoresceína de sódio em 475-490 nm 18 e eosina Y em 490 nm19.
As principais fontes de variabilidade neste modelo são o tempo de fotooclusão em relação à administração de rosa bengala e a saída basal e experimental do laser. Enquanto a Figura 2 mostra pontos de tempo de 10 e 20 minutos para foto-oclusão, um pequeno número de experimentos de 5 e 15 minutos também foram realizados (dados não mostrados), produzindo oclusões que não foram tão consistentes quanto o ponto de tempo de 10 minutos. Portanto, 10 min foi escolhido para ser o tempo de espera ideal entre a administração de rosa bengala e a fotooclusão para este método. No entanto, estudos relataram que o RVO também pode ser induzido tão cedo quanto 3 min após a administração de rosa bengala5. Outra maneira de determinar o tempo de espera ideal específico da cepa do camundongo da rosa bengala à fotooclusão é monitorar a concentração relativa de rosa bengala usando o modo de imagem de fluorescência com um filtro de tetrametilrodamina (TRITC). No entanto, o protocolo aqui descrito pode ser realizado utilizando microscópios de imagem de retina que não possuem filtro TRITC.
A outra fonte de alta variabilidade neste modelo é a saída de laser de linha de base. Como os níveis diários de saída de laser basal podem ser muito diferentes, é importante avaliar os níveis antes de cada experimento. A padronização da saída de laser de linha de base em todos os estudos pode ajudar a potencializar e expandir o uso do modelo de mouse RVO. Reajustar o cabo de fibra pode ser suficiente para modificar os níveis de linha de base; no entanto, se uma medição de 13,0 mW não puder ser alcançada, a Tabela 1 fornece um guia para a compensação usando a potência experimental. É importante ressaltar que, como a retina é um sistema fechado, a determinação da fração de veias ocluídas (o número de veias ocluídas dividido pelo número de veias irradiadas) é essencial para a compreensão, controle e previsão da gravidade do dano no modelo RVO. A análise prévia das leituras danificadas (DRIL e espessura da retina) correlacionou-se com a fração de veias ocluídas e previu atrofia retiniana aos 8 dias após o RVO8. Assim, a fração de veias ocluídas deve ser considerada e avaliada. Ainda não está claro como outros estados intermediários de oclusão, como parcialmente reperfundidos, parcialmente ocluídos ou veias que já foram ocluídas e reperfundidas por 10 min, contribuem para o desenvolvimento de edema e atrofia da retina.
Estudos adicionais dos olhos com esses tipos de oclusões podem ajudar a investigar se uma oclusão sustentada é necessária para danos substanciais ou se mesmo oclusões transitórias são importantes neste modelo. Dependendo da pergunta experimental que está sendo feita, diferentes taxas de oclusão serão ideais. Uma taxa de oclusão de 40-50% é ideal na maioria dos casos, o que significa duas ou três oclusões em um olho com seis veias. Isso garante lesões substanciais, mas a retina está intacta e pode ser dissecada para análises imuno-histoquímicas e bioquímicas.
Para determinar isso, distinguir a visão patológica de uma oclusão bem-sucedida e representativa da assinatura RVO é relevante. A oclusão natural apresentada pelo RVO inclui hemorragias em forma de chama 20 (não confundir com hemorragia sub-retiniana), que podem ser observadas neste modelo24 h após a lesão. O modelo RVO também pode levar a lesões retinianas indesejadas (não distintivas da patologia RVO), como as mostradas na Figura 6B-F, se seus parâmetros não forem cautelosamente controlados. Uma abordagem que pode ser adotada para evitá-los, além de regular a concentração de rosa bengala e a potência experimental do laser, é parar de irradiar os vasos que têm uma formação clara de um trombo após a primeira ou segunda irradiação.
Outros fatores a serem considerados ao empregar esse modelo e decidir quais veias ocluir são a deformação do camundongo e o diâmetro do vaso. Algumas cepas de camundongos, como a BALB/c, mais comumente conhecida como albino, são suscetíveis a danos leves21. Além disso, apresentam déficits de desenvolvimento da retina que levam a defeitos na decussação no quiasma óptico e na acuidade visual22,23. Recomenda-se avaliar completamente a integridade retiniana e vascular basal de controles não lesados para a cepa de camundongo escolhida para estudos de RVO. Estudos têm demonstrado que a largura da veia pode interferir no desenvolvimento de edema de retina e patologia da doença24. Assim, animais de peso semelhante devem ser usados para evitar maior variabilidade. Os fatores de exclusão de quais olhos usar em um estudo também dependerão da questão experimental. Pode ser sensato incluir qualquer olho que já foi ocluído, mesmo que seja reperfundido no ponto de tempo de acompanhamento para sinalização. No entanto, se oclusões estáveis forem desejadas, esses olhos seriam excluídos. A Figura 6 mostra exemplos de possíveis critérios de exclusão ou olhos que poderiam ser utilizados para análise patológica.
Para mostrar que essas configurações de laser não estavam causando danos e os efeitos observados foram realmente impulsionados pelas próprias oclusões, controles simulados foram feitos em estudos anteriores8. Os camundongos simulados ainda receberam uma injeção na veia da cauda de rosa bengala, mas foram irradiados no espaço parenquimatoso entre os principais vasos, em vez de serem irradiados na veia. Este foi um passo importante para garantir que o modelo replicasse lesões de RVO observadas em pacientes, em vez de simplesmente ferir o tecido com um laser. Essas simulações não mostram ativação da caspase-9 ou -7 ou qualquer edema observado nos camundongos que receberam irradiação a laser normal para os vasos, indicando que o laser não teve efeitos adversos. Ter esses controles é essencial, especialmente se configurações mais altas do laser forem usadas para garantir que a lesão que está sendo modelada seja uma representação precisa do dano desejado8.
O modelo de camundongo RVO pode ser aplicado para estudar outras doenças que resultam de lesões hipóxico-isquêmicas na retina e no cérebro, como retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade e acidente vascular cerebral. Além disso, pode servir como um modelo para estudar as vias de sinalização relevantes para o desenvolvimento de lesões vasculares e testar potenciais tratamentos que melhoram a neurodegeneração no sistema nervoso central. A otimização adaptada neste relatório pode limitar a variabilidade no modelo RVO de camundongo e lançar luz sobre a fisiopatologia do RVO.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| Corn Oil | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| Fiber Patch Cable | Thor Labs | M14L02 | |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Lasercheck | Coherent | 1098293 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoneix Micron IV with Meridian, StreamPix, and OCT modules | Phoenix Technology Group | ||
| Proparacaine Hydrochloride | Akorn | NDC: 17478-263-12 | keep at 4 °C |
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-5G | light-sensitive |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Ehlers, J. P., Fekrat, S. Retinal vein occlusion: beyond the acute event. Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).
- Iftikhar, M., et al. Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema. American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Zhang, C., et al. Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration. Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Moein, H. R., et al. Optical coherence tomography angiography to detect macular capillary ischemia in patients with inner retinal changes after resolved diabetic macular edema. Retina. 38 (12), 2277-2284 (2018).
- Hirabayashi, K., et al. Development of a novel model of central retinal vascular occlusion and the therapeutic potential of the adrenomedullin-receptor activity-modifying protein 2 system. American Journal of Pathology. 189 (2), 449-466 (2019).
- Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response. PLoS One. 13 (3), 0191338 (2018).
- Drechsler, F., et al. Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion. Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).
- Genevois, O., et al. Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).
- Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W. Animal models of retinal vein occlusion. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (14), 6175-6192 (2017).
- Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits. Scientific Reports. 9 (1), 10560 (2019).
- Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application. Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).
- Emmart, E. W. Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates. Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).
- Yu, L., Liu, Z., Liu, S., Hu, X., Liu, L. Fading spectrophotometric method for the determination of polyvinylpyrrolidone with eosin Y. Chinese Journal of Chemistry. 27 (8), 1505-1509 (2009).
- MacDonald, D. The ABCs of RVO: a review of retinal venous occlusion. Clinical & Experimental Optometry. 97 (4), 311-323 (2014).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice. Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).
- Jeffery, G. The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development. Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).
- Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J. Albinism. Survey of Ophthalmology. 30 (2), 75-101 (1985).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
