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Biology

Automatizando quantificação agregada em caenorhabditis elegans

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/62997
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, 2Department of Computer and Information Science and Engineering, University of Florida

Summary

O protocolo a seguir descreve o desenvolvimento e otimização de um fluxo de trabalho de alto rendimento para cultivo de vermes, imagens de fluorescência e processamento automatizado de imagens para quantificar agregados de poliglutamina como uma avaliação de mudanças na proteostase.

Abstract

O aumento da prevalência de doenças neurodegenerativas por proteínas conformais (PCDs) tem fomentado um grande interesse nesse assunto ao longo dos anos. Essa atenção tem chamado para a diversificação e melhoria de modelos animais capazes de reproduzir fenótipos de doenças observados em humanos com PCDs. Embora os modelos murinos tenham se mostrado inestimáveis, eles são caros e estão associados a métodos laboriosos e de baixa produtividade. O uso do modelo de nematoides Caenorhabditis para estudar PCDs tem sido justificado por sua relativa facilidade de manutenção, baixo custo e tempo de geração rápida, que permitem aplicações de alto rendimento. Além disso, a alta conservação entre os C. elegans e os genomas humanos faz deste modelo uma ferramenta de descoberta inestimável. Nematoides que expressam os tratos de poliglutamina (polyQ) específicos do tecido marcados por tecidos fluorescentes apresentam agregação dependente de comprimento de comprimento de idade e políq caracterizada por focos fluorescentes. Tais repórteres são frequentemente empregados como proxies para monitorar mudanças na proteostase entre tecidos. A quantificação de agregado manual é demorada, limitando o throughput experimental. Além disso, a quantificação de focos manuais pode introduzir viés, pois a identificação agregada pode ser altamente subjetiva. Aqui, um protocolo que consiste em cultivo de vermes, aquisição de imagens e processamento de dados foi padronizado para suportar quantificação agregada de alto rendimento usando C. elegans que expressam polq específico do intestino. Ao implementar um pipeline de processamento de imagem baseado em C. elegans usando o CellProfiler, um software de análise de imagem, este método foi otimizado para separar e identificar worms individuais e enumerar seus respectivos agregados. Embora o conceito de automação não seja totalmente único, a necessidade de padronizar tais procedimentos para a reprodutibilidade, eliminação do viés da contagem manual e aumento do throughput é alta. Espera-se que esses métodos possam simplificar drasticamente o processo de triagem de grandes bibliotecas bacterianas, genômicas ou medicamentosas usando o modelo C. elegans .

Introduction

Doenças conformacionais neurodegenerativas dependentes da idade (PCDs) como Alzheimer, Parkinson e doenças de Huntington, ou esclerose lateral amiotrófica, são caracterizadas por misfolding de proteínas que leva à agregação, morte celular e degeneração tecidual1. Embora o erro de proteína seja reconhecido como o culpado, a etiologia dessas doenças não é clara. Dessa forma, o desenvolvimento de terapias efetivas tem sido dificultado pela falta de conhecimento sobre os fatores e condições que contribuem para o aparecimento e progressão da doença. Estudos recentes sugerem que as mudanças no microbioma influenciam o início, a progressão e a gravidade dos PCDs 2,3,4. No entanto, a complexidade do microbioma humano, ou mesmo murine, dificulta a realização de estudos que revelem a influência exata dos micróbios em seu hospedeiro. Portanto, organismos mais simples, como caenorhabditis elegans, são frequentemente usados como ferramenta de descoberta 5,6,7,8. Estudos recentes têm empregado C. elegans para investigar o efeito de bactérias na proteostase hospedeira e patogênese da doença 9,10. Colonização bacteriana, hormesis e alterações genômicas estão entre as condições exemplares que afetam a agregação de tratos de poliglutamina (polQ) 9,11,12. Além disso, esses aglomerados de proteínas desdobrados apresentam acúmulo de comprimento e idade de poliQ dentro do hospedeiro e estão associados à motilidadeprejudicada 9,13. A abordagem relativamente simples de quantificar puncta fluorescentemente rotulada pode gerar dados importantes sobre condições, fatores ou drogas que afetam a dobra e agregação de proteínas.

Embora a quantificação de puncta fluorescente tenha se mostrado um procedimento confiável e relativamente simples, o desafio continua sendo desenvolver um protocolo que facilitaria a triagem em larga escala de compostos, bactérias ou condições que afetam a agregação de proteínas. O conceito de processamento automatizado de imagens C. elegans e quantificação de puncta não é inteiramente novo, pois uma série de ferramentas práticas de suporte foram desenvolvidas14,15. No entanto, a integração de cultivo, aquisição de imagem e um pipeline de processamento são essenciais para eliminar a variabilidade nos resultados e permitir telas de maior rendimento.

Como tal, a intenção deste manuscrito é padronizar o procedimento utilizado para quantificar a agregação de polq em C. elegans como um proxy para detectar alterações na proteostase. Essa tarefa foi realizada empregando o CellProfiler, um software de análise de imagem de código aberto16 capaz de identificação automatizada de worms e agregados, e é integrado em um protocolo maior para cultivo de worms, aquisição de imagens e processamento de dados.

Protocol

Todos os procedimentos seguiram as diretrizes de segurança que foram revisadas e aprovadas pelo Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade da Flórida. Medidas de biossegurança apropriadas foram tomadas para mitigar o risco de exposição a bactérias nível 2 de segurança biológica.

NOTA: Para todos os experimentos, os C. elegans devem ser propagados e mantidos em placas de nematóde (NGM) semeadas com Escherichia coli OP50.

1. Preparação de placas de 10 cm NGM

  1. Combine 3 g de NaCl, 2,5 g de trippticase-pepton, e 17 g de ágar em um frasco de 2 L, e encha a 1 L com água dupla destilada (ddH2O). Adicione a barra de meximento magnética antes da autoclavagem.
  2. Autoclave a mistura por 45 min a 121 °C e uma pressão de 21 psi. Deixe a mistura esfriar a 50 °C em banho-maria.
  3. Utilizando técnicas assépticas, adicione as seguintes soluções estéreis: 1 mL de 1 M CaCl2· 2H2O, 1 mL de 1 M MgSO4· 7H2O, 1 mL de colesterol de 5 mg/mL dissolvido em 100% etanol (aquecido à temperatura ambiente), e 25 mL de 1 M KH2PO4 (pH = 6,0). Misture usando uma placa de agitação magnética. A mistura pode ser realizada por 1 min a 700 RPM.
  4. Despeje até que a mistura encha toda a placa de 10 cm. Alternativamente, use uma pipeta sorológica graduada para adicionar aproximadamente 20 mL de mistura por placa.
  5. Deixe as placas secarem por 24 h à temperatura ambiente antes de semear com bactérias ou armazene as placas simples a 4 °C após a secagem.
    NOTA: Todos os componentes de mídia são manuseados usando técnicas assépticas. As etapas 1.3-1.4 devem ser realizadas em um capô de fluxo laminar.

2. Preparação de ágar NGM com FUDR em placas de 24 poços

  1. Siga os passos 1.1-1.3.
  2. Suplementar NGM com 5-Fluoro-2′-desoxyuridina (FUDR) e misturar para alcançar uma concentração final de 100 μg/mL.
    NOTA: O FUDR inibe a replicação do DNA e, como resultado, bloqueia a reprodução de C. elegans mirando germe e embriogênese, afetando, em última análise, a vida útil. Portanto, é importante permitir que os vermes se desenvolvam totalmente em adultos jovens antes de transferir para placas contendo FUDR.
    ATENÇÃO: O FUDR é tóxico e deve ser manuseado de acordo com a Ficha técnica de segurança do fabricante.
  3. Usando uma pistola pipeta, dispense 1 mL de NGM-FUDR em cada poço.
    NOTA: Este processo pode ser facilitado pelo uso de um sistema automatizado de derramamento de placas.
  4. Deixe a placa secar por 24 h à temperatura ambiente antes de semear com bactérias ou armazenar placas simples a 4 °C.

3. Semeadura de placas: OP50 e bactérias de teste adicionais

  1. Para preparar uma cultura E. coli OP50 durante a noite, adicione 200 μL de uma alíquota bacteriana de um estoque congelado em um frasco de 500 mL Erlenmeyer contendo 250 mL de caldo Luria fresco e estéril (LB).
    NOTA: O volume da mídia depende do número de placas que precisam ser semeadas. Para preparar outras culturas bacterianas, inocular um tubo de cultura de 16 mL contendo 5 mL de meio de crescimento com bactérias de estoque congelado usando uma ponta de micropipette estéril.
  2. Incubar durante a noite em uma incubadora de 37 °C, tremendo a 220 RPM (rotações por minuto).
    NOTA: Use frascos esterilizados com pelo menos o dobro do volume de trabalho da mídia e vedação com papel alumínio autoclavado. Realizar a etapa de inoculação e dispensação bacteriana utilizando técnicas assépticas.
  3. Dispense 1-2 mL da cultura E. coli OP50 durante a noite no centro de cada placa NGM de 10 cm. Esta cultura não precisa ser espalhada em torno da placa NGM.
  4. Deixe as placas secarem à temperatura ambiente antes do uso/armazenamento.
    NOTA: Placas semeadas com tampas podem ser colocadas em um capô com fluxo de ar para facilitar a secagem.

4. Cultura e semeadura de placas: placas de 24 poços

  1. Prepare uma cultura noturna de cepas bacterianas desejadas, aderindo às instruções de cultivo encontradas nas etapas 3.1-3.2.
  2. Transfira 200 μL de cada cultura bacteriana para cada poço de uma placa de 24 poços contendo ágar NGM. Um volume de 200 μL de bactérias cobrirá toda a área do ágar, maximizando a quantidade de alimentos para garantir que os vermes não evitem o gramado bacteriano.
  3. Deixe as placas rachadas em um armário de segurança biológica (BSC) para facilitar a secagem. Verifique as placas periodicamente para evitar desidratação excessiva e altere a orientação da placa para promover até mesmo o fluxo de ar e a secagem. As placas devem secar dentro de 5h.
    NOTA: Qualquer trabalho com bactérias de Nível 2 de Segurança Biológica deve ser realizado em BSCs certificados e aprovado pelo Comitê de Biossegurança Institucional.

5. Sincronização etária

NOTA: Todas as etapas devem ser executadas utilizando técnicas assépticas adequadas (ou seja, trabalhando perto de uma chama ou dentro de um BSC).

  1. Lave hermafroditas gravid fora placas OP50 de 10 cm usando solução M9 esterilizada por filtro (5,8 g de Na2HPO4· 7H2O, 3,0 g de KH2PO4, 5 g de NaCl, 0,25 g de MgSO4·7H2O, em 1 L de ddH2O).
    1. Solução Pipette M9 na placa várias vezes usando um vidro estéril ou tubo sorológico plástico para levantar vermes do gramado bacteriano.
    2. Colete a suspensão do worm e transfira a solução para um tubo cônico de poliestireno de 15 mL.
  2. Centrifugar a 270 x g, temperatura ambiente (RT, ~23 °C), por 2 min.
  3. Aspire usando um frasco de armadilha de vácuo e descarte o supernatante, deixando a pelota de verme intacta.
    1. Resuspenja a pelota em 5-10 mL de M9 para lavar os vermes e repetir as etapas 5.2-5.3 duas vezes.
  4. Adicione 5 mL de solução de branqueamento de 20% (8,25 mL de ddH2O, 3,75 mL de 1M NaOH, 3,0 mL de alvejante não germicida) ao tubo e inverta continuamente para dissolver os vermes. Os vermes estão prontos para centrifugar uma vez que eles tenham quase completamente dissolvido.
    NOTA: Os tempos de branqueamento e o volume da solução de branqueamento dependerão do tamanho da amostra. Excesso e sub branqueamento são erros comuns. Como tal, esse processo geralmente requer otimização para determinar quando a amostra está pronta para centrifugação.
  5. Centrifugar por 2 min a 423 x g e descartar o supernaspe.
  6. Adicione 10 mL de M9 estéril para resuspensar a pelota de ovo.
    1. Centrifugar o tubo por 2 min a 423 x g para pastar os ovos. Remova o supernatante com um frasco aspirador.
    2. Repetir as etapas 5.6-5.6.1.
  7. Resuspenque a pelota de ovo em 5 mL de M9 estéril e coloque-a em um nutador durante a noite na temperatura desejada.
    NOTA: As larvas L1 sincronizadas por idade estarão prontas para serem transferidas para placas no dia seguinte.

6. Preparação de worms pós-sincronização etária

  1. Centrifugar os vermes sincronizados com idade a 270 x g por 3 min no RT (~23 °C).
  2. Aspire o supernatante em um ambiente limpo, como um capô de fluxo ou ao lado de um queimador Bunsen. Deixe aproximadamente 200 μL do supernaspeuta e resuspense os vermes.
  3. Usando uma micropipette, transfira a suspensão concentrada do verme para placas de GNM de 10 cm que foram previamente semeadas com OP50.
    NOTA: Cada prato pode suportar 1.500 vermes sem ficar sem comida; no entanto, essa concentração pode exigir ajuste dependendo da densidade do gramado bacteriano e da temperatura de crescimento. Recomenda-se usar várias placas para evitar que vermes morram de fome. É importante notar que estas placas não devem conter FUDR.
  4. Deixe as placas secarem; em seguida, inverta e armazene a 25 °C por 48 h.
    NOTA: Dependendo da condição da tela, os vermes da etapa 6.1 podem ser colocados diretamente nas placas de teste (contendo bactérias, drogas ou compostos de teste). Se a condição de teste desejada afetar o desenvolvimento, os vermes devem ser cultivados no NGM contendo OP50 até adultos jovens (~48 h) antes de expô-los a condições de teste.
  5. Após a incubação de 48 h, lave os vermes das placas com solução M9 estéril e coloque-os em tubos cônicos.
    NOTA: Vermes adultos afundarão no fundo do tubo. O tempo exato vai variar de acordo com o número de vermes recuperados de placas de 10 cm. Nessas condições, os vermes se estabelecem dentro de 10 minutos.
  6. Realize a inspeção visual para determinar a duração do tempo de assentamento, de forma que quaisquer ovos residuais ou larvas eclodidas sejam removidos.
  7. Adicione mais 10 mL de M9 para enxaguar as bactérias residuais de corpos de vermes.
    1. Centrifugar os vermes por 2-3 min a 270 x g a 23 °C.
    2. Realize a etapa de lavagem mais 3 vezes. Para obter melhores resultados, deixe cerca de 1-1,5 mL de solução M9 no tubo após a lavagem final.
    3. Transfira 10 μL da suspensão do worm para um slide de vidro e conte o número de vermes.
    4. Ajuste a densidade do verme para aproximadamente 150 worms por 10 μL de M9. A concentração de vermes na suspensão pode ser ajustada removendo ou adicionando solução M9 após centrifugação.
    5. Confirme que a concentração desejada foi estabelecida pela contagem média de várias gotas diferentes. Recomenda-se uma contagem média de pelo menos três gotas.
  8. Usando técnicas assépticas, transfira 10 μL da suspensão do worm contendo aproximadamente 150 vermes em cada poço da placa de teste.
  9. Inspecione os poços sob um microscópio para garantir que cada um tenha um número suficiente de vermes. Vermes adicionais podem ser adicionados antes da incubação.
  10. Deixe as placas secarem por aproximadamente 10 minutos; e, em seguida, inverter e transferir para uma incubadora de 25 °C por 72 h.
    NOTA: O período final de incubação pode ser ajustado para atender às necessidades do experimento. O tempo de incubação de 72 h é suficiente para suportar o crescimento de 150 animais que se alimentam de 200 bactérias μL em uma placa de 24 poços a 25 °C.

7. Preparando vermes para imagens

  1. Para facilitar a acomodação mais eficaz e minimizar a perda de amostras, imobilize os vermes antes da lavagem para evitar a natação.
    NOTA: Se trabalhar com poucas amostras, isso pode ser alcançado através da exposição ao levamisole (100 μM). No entanto, se trabalhar com um grande número de amostras, os vermes podem ser imobilizados por congelamento. Além disso, o congelamento prolongado (18-24 h) impedirá o desenvolvimento adicional de agregados de polq durante a preparação.
    1. Coloque placas multi-poços a -20 °C por 15-20 min ou até que os vermes não se movam mais.
    2. Retire as amostras do congelador e deixe-as sentadas por 5 minutos.
  2. Usando uma micropipette, adicione 1 mL de M9, resfriado a 4 °C, a um poço de interesse, pressione repetidamente e pressione o êmbolo 4-6 vezes para lavar os vermes em cada poço.
    NOTA: Às vezes, os vermes podem grudar nas pontas da micropipette. Como tal, diferentes dicas devem ser usadas entre cada poço para evitar a mistura de vermes.
  3. Transfira a suspensão do worm para um tubo de microcentrifuuagem e permita que os vermes afundem até o fundo.
  4. Aspire e descarte o supernaspe. Lave a amostra um total de três vezes.
  5. Depois que os vermes se estabeleceram até o fundo durante a lavagem final, aspire 500 μL de supernante, deixando 500 μL para resuspend worms.
  6. Transfira a suspensão restante do worm para uma nova placa de 24 poços e coloque-a em um congelador de -20 °C por 48 h.
    NOTA: Congelar vermes reduz a fluorescência de fundo e permite uma melhor visualização dos agregados.

8. Imagem

  1. Retire as placas do congelador e deixe descongelar, limpar o excesso de condensação e remover a tampa antes da imagem.
    NOTA: Os detalhes da captura de imagem variam de acordo com o equipamento e o software utilizados. Os protocolos para esta seção devem servir apenas como um guia, e modificações são esperadas. Também é necessário capturar imagens no formato de arquivo tiff.
  2. Durante a captura de imagens, use as seguintes configurações do microscópio: Tempo de exposição, 500 ms; Ampliação de 40x com adaptador de câmera 0,63x (25,2x), intensidade de GFP definida para 100%.
    NOTA: Várias configurações e sistemas de microscópio poderiam adquirir imagens diferentes das fornecidas na seção de resultados. Para obter uma descrição mais universal das imagens necessárias, são fornecidos detalhes mais objetivos em relação às imagens. Os agregados devem ter entre 1,0-10,0 pixels de diâmetro com uma intensidade fluorescente de 0,10-1.0 (unidades arbitrárias, escala 0-1) para ser devidamente identificado pelo CellProfiler. O fundo fluorescente para essas imagens agregadas é geralmente abaixo do limiar de 0,10. Para imagens de campo brilhante, a intensidade do verme varia de 0,7-1.0 com uma intensidade de fundo de 0.1-0.2. O comprimento médio de worms em imagens de brightfield varia de 250 pixels a 350 pixels de comprimento da cabeça à cauda.
  3. Ajuste os controles de luz transmitidos até que os vermes pareçam brilhantemente iluminados em comparação com o fundo escuro. Evite a superexposição; aumentará o tamanho do verme.
  4. Pode ser necessário alterar as posições dos vermes dentro do poço para evitar o agrupamento excessivo. Disperse vermes desajeitados usando uma ponta de pipeta.
  5. Defina o canal para GFP para estabelecer um plano focal para ambas as imagens.
    NOTA: É essencial que o plano focal seja determinado no canal GFP. Qualquer mudança no foco feita durante a captura de imagens de brightfield resultará no desalinhamento de agregados e worms durante a análise de imagem.
  6. Capture uma imagem de campo brilhante e pegue imediatamente sua imagem fluorescente correspondente sem perturbar a placa.
  7. Execute imagens de teste através do pipeline para determinar valores de intensidade e tamanho para objetos na imagem de acordo com a "NOTA" após a etapa 8.2.
    NOTA: O CellProfiler pode fornecer todas as informações necessárias sobre a intensidade e o comprimento dos objetos antes da análise.
  8. Para avaliar as imagens, primeiro, baixe CellProfiler17. Abra o software e arraste e solte imagens de interesse na caixa Imagens.
  9. Clique nas imagens na lista de arquivos para abri-las.
  10. No canto superior esquerdo da tela há vários ícones; usá-los para medir o tamanho dos objetos ou ampliar uma região específica. Selecione o vidro da lupa para destacar uma região de interesse.
  11. Selecione o ícone de seta para medir o comprimento de ambos os worms e agregados.
  12. Passe o mouse sobre o objeto desejado para determinar seu valor de intensidade que pode ser visto na parte inferior da tela.
    NOTA: Como todas as imagens são tiradas em escala de cinza, todos os valores de pixels vermelhos, azuis e verdes serão idênticos.

9. Análise de imagem

  1. Para utilizar o pipeline de análise de imagem CellProfiler, nomeie os pares de imagens corretamente. Use o seguinte formato: P1_A01_S1_C1, onde P1 se refere à placa específica e à sua respectiva designação numérica; "A", refere-se à linha e "01" à coluna; "S" refere-se a um par de imagens específico para um único poço; "C" refere-se ao canal, onde "1" é usado para denotar imagens de campo brilhante e "2" para imagens fluorescentes.
  2. Baixe CellProfiler (versão 4.1.3 ou superior) do site oficial17.
  3. Baixe o pipeline (Arquivo Suplementar 1). Carregue o pipeline (Pipeline) no CellProfiler selecionando Arquivo > importar > Pipeline do Arquivo.
    NOTA: Os módulos 2 e 3 foram desativados, pois foram considerados desnecessários. Sua função pode ser restaurada se a análise de imagem não produzir separação satisfatória e identificação de vermes; no entanto, a modificação do gasoduto é necessária.
  4. Para incorporar esses módulos, selecione as caixas localizadas à esquerda de cada módulo. Renomeie a imagem binária de entrada para o módulo "UntangleWorms" para a imagem de saída do módulo "convertobjectstoimage".
  5. Uma mensagem de erro pode aparecer durante o uso inicial relacionado ao Módulo 2. Se isso ocorrer, prossiga com a análise.
  6. Faça upload de um conjunto de treinamento usado para identificar worms no módulo "UntangleWorms". Este conjunto de treinamento pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 2.
    1. Selecione o módulo UntangleWorms para abrir suas configurações.
    2. Identificar o nome do arquivo do conjunto de treinamento e selecionar o ícone do arquivo de upload.
    3. Upload de Arquivo Suplementar 2 (conjunto de treinamento).
  7. Faça upload de imagens selecionando o módulo Imagens no canto superior esquerdo. Arraste e solte imagens devidamente nomeadas como descrito na etapa 9.1.
  8. Antes de analisar imagens, selecione a pasta de saída desejada que será usada para armazenar os resultados.
    1. Clique no botão Configurações de saída localizado perto do canto inferior esquerdo do programa.
    2. Selecione o ícone da pasta à direita da Saída Padrão para escolher o local de saída desejado.
  9. Selecione o ícone Analisar imagens para iniciar a análise de imagens.
  10. Se a análise demorar muito para ser concluída e estiver presa ao processamento de uma única imagem, é provável que ela se deva a problemas de aquisição de imagens. Se isso ocorrer, aborte a execução e prossiga para identificar as imagens não processadas, classificando-se através da pasta de saída e observando quais nomes de imagem não são encontrados.
    NOTA: As imagens podem exigir processamento adicional para remover artefatos grandes ou intensamente iluminados que não podem ser processados pelo gasoduto. Em alguns casos, essas imagens podem precisar ser excluídas da análise.
  11. Após análise completa, o software organizará os resultados em uma planilha de excel contendo worms individuais (coluna N) e seu respectivo número de agregados (coluna K).
    NOTA: Uma corrida bem sucedida produzirá uma planilha excel contendo o número de agregados por worm identificado para cada poço. Esses dados podem ser manipulados de forma determinada pelo experimentador.
  12. Baixe metadados organizer (Graphical User Interface) do Arquivo Suplementar 3 (Windows) ou Arquivo Suplementar 4 (Mac) para organizar convenientemente dados do arquivo CSV de saída do CellProfiler.
    NOTA: Este software não possui uma licença oficial e não será aberto automaticamente após o download.
  13. Siga os passos 9.14-9.17 se usar o Windows OS de 64 bits. O software não funcionará no Windows 32 bits. Siga as etapas 9.18-9.20 se usar o Mac OS. As etapas 9.21-9.22 são as mesmas para ambos os sistemas operacionais.
  14. Para o Sistema operacional Windows, localize o arquivo baixado e extraia-o para o local desejado.
  15. Localize e abra a pasta extraída nomeada gui_windowsOS_64x e inicie o aplicativo clicando no ícone do aplicativo "gui".
  16. Um prompt pode abrir solicitando permissão para executar. Selecione Mais Informações e clique em Confiança de qualquer maneira.
  17. O organizador de metadados está pronto para arrastar e soltar arquivos CSV de saída do CellProfiler. Continue até o passo 9.21.
  18. Para Mac OS, localize o arquivo baixado e abra gui_macOS_64x.zip. Esta etapa deve extrair automaticamente todos os arquivos.
  19. Abra a pasta extraída encontrada em "Downloads".
  20. Clique com o botão direito do mouse no aplicativo "gui" e selecione Abrir. Um aviso aparecerá pedindo permissão para abrir devido à falta de uma licença oficial. Selecione Abrir e continue com a etapa 9.21.
  21. Clique em Carregar seus arquivos aqui ou arraste e solte os arquivos CSV desejados do CellProfiler.
  22. Clique no botão Organizar , que trará o usuário para uma nova tela com um botão Download Files . Clique no botão e selecione o local desejado para salvar o arquivo de saída. O arquivo de saída aparecerá como o nome de arquivo original com extensão "_organized" adicionada ao nome do arquivo.

Representative Results

Descrito aqui é um fluxo de trabalho C. elegans que inclui protocolos de cultivo, aquisição de imagens e processamento que permitem a avaliação da agregação de polq na presença de várias bactérias usando um formato de placa de 24 poços como a plataforma de cultivo e imagem (Figura 1). Este protocolo pode ser ajustado para estudar o efeito de bactérias, condições específicas, pequenas moléculas, drogas ou manipulações genômicas na proteostase hospedeira. O método descrito foi otimizado utilizando vermes que expressam constitutivamente o poliQ intestinal fundido a uma proteína fluorescente amarela (vha6p::p olyQ44::YFP); no entanto, outros modelos que relatam proteostase em músculos ou neurônios também podem ser usados com maior otimização. Por exemplo, experimentos preliminares demonstram a aplicação desses métodos na quantificação de agregados proteicos em outros tecidos, como o poliQ muscular (Figura Suplementar 1). No entanto, a modificação no pipeline será necessária para ajustar adequadamente para o tamanho agregado e o brilho, conforme mencionado na seção 8 NOTA.

Figure 1
Figura 1: Representação visual do fluxo de trabalho. As principais etapas do protocolo incluem cinco estágios distintos: preparação de vermes e sincronização etária (etapas 1-5), colonização intestinal/tratamento de vermes (etapa 6), preparação amostral para imagem (etapa 7), aquisição de imagem (etapa 8) e processamento de imagem (etapa 9). As "Seções" do protocolo são referenciadas como "Passos" na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os experimentos iniciais de otimização revelaram várias dificuldades associadas à superlotação devido a um grande número de progens, resultando em esgotamento alimentar mais rápido. A suplementação de FUDR em placas de GNM descritas na seção 2 resolveu este problema (Figura 2). Além disso, na presença de FUDR, os vermes que foram alimentados com várias bactérias tinham um tamanho corporal mais consistente, o que permitiu uma detecção mais uniforme e precisa de vermes.

Figure 2
Figura 2: O uso do FUDR melhora a qualidade da imagem reduzindo a prole. As placas suplementadas por FUDR eliminam a prole C. elegans em comparação com vermes cultivados em placas de GNM de controle não FUDR semeadas com E. coli OP50. As imagens foram adquiridas com ampliação de 25,2x (ampliação de 40x com um adaptador de câmera 0,63x). Barras de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A fluorescência de fundo contribuiu para a detecção falsa positiva de agregados de POLQ. Para reduzir esse sinal de fluorescência no trato intestinal e melhorar a detecção automatizada de agregados, foi necessário congelar vermes antes da imagem. Vermes congelantes a -20 °C para 18-48 h melhorou significativamente a detecção de agregados de poliq, eliminando a fluorescência de fundo (Figura 3A). O olho humano é capaz de diferenciar entre agregados e fluorescência de fundo; portanto, a contagem manual antes e depois do congelamento é a mesma (Figura 3B). No entanto, a contagem automatizada não é tão precisa, mas o congelamento de contagens automatizadas significativamente melhoradas com precisão comparável à contagem manual (Figura 3B).

Figure 3
Figura 3: O congelamento melhora a detecção agregada. (A) Imagens fluorescentes de C. elegans expressando poliQ44 intestinal::YFP antes e depois do congelamento. As inserções representam imagens de close-up da área selecionada. Barras de escala = 500 μm. (B) Número médio de agregados por intestino em vermes colonizados com P. aeruginosa MPAO1 antes e depois de congelar usando quantificação agregada manual ou automatizada (pipeline). Os dados representam duas réplicas biológicas (n = 60-109). A significância estatística foi calculada utilizando-se o teste t do Student (**** p < 0,0001). As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A iluminação de campo brilhante invertido foi usada para detectar todo o canal C. elegans (Figura 4A) e GFP para imagem de agregados polyQ44::YFP (Figura 4B). A detecção, detecção e quantificação agregada de worms para cada worm foram feitas aplicando um pipeline otimizado de processamento de imagem CellProfiler (Arquivo Suplementar 1), que permite obter o número de agregados por worm individual (Figura 4C-D). Para testar a viabilidade dessa abordagem e a precisão da detecção e quantificação agregada automatizada, os vermes que expressavam o poliQ44 específico do intestino foram cultivados e preparados para imagens de acordo com os protocolos estabelecidos (seções 1-7). O número de agregados por worm foi avaliado utilizando-se o pipeline automatizado (seções 8-9) ou a contagem manual. Cada experimento foi realizado em três ensaios independentes usando 90-571 worms por condição. Embora o número médio de agregados por intestino obtidos com dois ensaios não tenha diferença significativa, os vermes no terceiro ensaio tiveram significativamente menos agregados quando quantificados usando a abordagem automatizada (Figura 5A). O número médio de agregados dos três ensaios resultou em ligeiramente, mas significativamente menos agregados quando a quantificação foi feita usando o pipeline CellProfiler (seções 8-9) (Figura 5B). No entanto, a diferença entre as duas abordagens foi mínima, indicando que o método automatizado pode ser aplicado a telas de grande escala.

Figure 4
Figura 4: Detecção agregada usando cellProfiler. (A) Imagem Brightfield usada para identificar corpos de vermes. (B) Imagem fluorescente original adquirida usando o canal GFP e usada para identificar e quantificar um número total de agregados de poliQ44::YFP intestinais. (C) Agregados identificados por meio do CellProfiler. (D) Um número total de agregados identificados sobrepostos sobre a imagem fluorescente original com vermes e contornos agregados. A captura e processamento de imagens foram realizadas utilizando as configurações descritas nas seções 8-9. Painéis E-H representam imagens de close-up das regiões delineadas correspondentes em imagens A-D. As imagens foram adquiridas com ampliação de 25,2x (ampliação de 40x com um adaptador de câmera 0,63x). Barras de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Eficácia da quantificação agregada automatizada. (A) Número agregado médio por intestino em worms colonizados com controle E. coli OP50 usando contagem manual (Manual) e quantificação automatizada baseada em CellProfiler (Pipeline). Os resultados representam dados analisados em três ensaios separados (T1-T3) (n = 90-571). (B) O número médio de agregados por intestino foi obtido utilizando quantificação agregada manual ou automatizada (Pipeline). A significância estatística foi calculada utilizando-se o teste t do Estudante (* p < 0,05, ** p < 0,01). As barras de erro representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para avaliar a reprodutibilidade dos resultados entre diferentes experimentadores, foram adquiridas imagens de uma placa contendo seis poços de vermes que foram alimentados por Pseudomonas aeruginosa MPAO1 ou Escherichia coli OP50, sendo adquiridas por três indivíduos, dois dos quais não tinham experiência prévia com vermes de imagem usando esses protocolos. Imagens coletadas de cada poço continham entre 30-115 vermes detectados. Uma diferença não significativa na agregação foi detectada em vermes dos mesmos poços que foram imagens pelos três experimentadores. Embora o número médio de agregados por intestino tenha permanecido muito consistente entre os três experimentadores de vermes alimentados com MPAO1 e OP50, houve algumas diferenças estatisticamente significativas no número médio de agregados, mas apenas em vermes colonizados por MPAO1 (Figura Suplementar 2). Esses resultados destacam a reprodutibilidade dos resultados mesmo entre experimentadores inexperientes.

Para garantir que a reprodutibilidade da quantificação agregada não seja significativamente influenciada pela posição do worm, um conjunto de 15 worms foi selecionado e visualizado 15 vezes separadas após a agitação entre cada captura de imagem usando uma ponta de pipeta. Foram coletadas e analisadas imagens de agregados em vermes alimentados com E. coli OP50 e P. aeruginosa MPAO1. O número médio de agregados de cada um desses diferentes conjuntos de imagens foi ligeiramente, mas não significativamente diferente, apoiando ainda mais a reprodutibilidade dessa abordagem (Figura Suplementar 3).

A colonização do intestino C. elegans com patógenos entericos gram-negativos tem sido demonstrada para interromper a proteostase entre os tecidos, com P. aeruginosa sendo um dos indutores mais potentes da agregação de polq9. Para determinar se esses protocolos otimizados detectarão e quantificarão com sucesso o aprimoramento mediado por P. aeruginosa de agregação, foram realizados vermes que expressam o polq intestinal com E. coli OP50 (bactérias de controle) e P. aeruginosa MPAO1, seções 1-8. As imagens adquiridas foram analisadas utilizando-se CellProfiler (seção 9, Arquivo Suplementar 1). Os resultados da quantificação automatizada mostram um aumento significativo no número de agregados induzidos por P. aeruginosa MPAO1, resultando consistentemente em um aprimoramento de duas vezes em comparação com vermes alimentados com controle E. coli OP50 (Figura 6).

Figure 6
Figura 6: O número médio de agregados por intestino em vermes colonizados com controle E. coli OP50 e P. aeruginosa MPAO1. O número de agregados por intestino foi avaliado utilizando-se cellprofiler (seções 8-9). Os dados são representados como o número médio de agregados por intestino em vermes colonizados com OP50 (n = 1068) e MPAO1 (n = 1557). A significância estatística foi calculada utilizando-se o teste t do Student (**** p < 0,0001). As barras de erro representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O gasoduto otimizado foi projetado para suportar telas de grande escala para condições que afetam a proteostase. Para testar a viabilidade dessa abordagem na triagem de grandes bibliotecas de bactérias para seu efeito na proteostase hospedeira, o gasoduto aqui descrito foi empregado (seções 1-9) para testar o efeito de 90 P. aeruginosa cepas mutantes não essenciais na agregação de poliq18. Esta tela piloto faz parte de um projeto maior projetado para tela de todas as cepas mutantes não essenciais de P. aeruginosa para sua capacidade de influenciar a proteostase hospedeira. Das 90 cepas bacterianas testadas, a colonização do intestino C. elegans com um candidato mostrou uma diminuição significativa no número de agregados (Figura 7). Os experimentos de acompanhamento para avaliar a sensibilidade deste ensaio foram realizados por meio de contagens de agregados manuais a partir de uma seleção aleatória de seis mutantes de P. aeruginosa que diferem não significativamente do controle MPAO1. Esses experimentos foram realizados utilizando as placas NGM mais tradicionais de 6 cm, transferindo worms para cepas de teste como L1 para recapitular métodos previamente estabelecidos9. Os experimentos de confirmação por contagem manual revelaram que nenhum dos mutantes, incluindo o que diminuiu significativamente o número de agregados (Figura 7), afetou a agregação de poliq (Figura Suplementar 4). Além disso, as sutis mudanças na agregação observadas na tela das 90 cepas mutantes não foram detectadas entre as contagens manuais dos candidatos selecionados, indicando que tais mudanças poderiam surgir devido à variabilidade biológica e experimental, como o baixo valor n. Coletivamente, os resultados indicam que, embora nosso método possa detectar mudanças significativas de forma confiável, as sutis provavelmente serão perdidas, e todos os candidatos em potencial terão que ser confirmados individualmente.

Figure 7
Figura 7: O número de agregados por intestino em um conjunto de amostras representativas de vermes colonizados por 92 cepas bacterianas. Os dados são representados como o número médio de agregados por intestino normalizado ao de vermes colonizados com MPAO1. As linhas pontilhadas representam o número médio de agregados em vermes colonizados com controle MPAO1 (superior, open circle) e OP50 (inferior, quadrado aberto). Símbolos sólidos representam 90 cepas mutantes distintas de P. aeruginosa MPAO1. O número médio de agregados por verme entre vermes colonizados com MPAO1 e um único mutante foi estatisticamente significativo. Os círculos cinzentos representam amostras que foram confirmadas manualmente (Figura Suplementar 4). A significância estatística foi calculada utilizando-se a análise unidirecional de variância (ANOVA), seguida de múltiplos comparativos do teste pós-hoc de Dunnett (** p < 0,01, **** p < 0,0001). As barras de erro representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para gerenciar a grande quantidade de dados gerados pelo CellProfiler, uma Interface Gráfica de Usuário (GUI) foi desenvolvida para automatizar o processamento e organização de dados (Figura 8). O GUI foi desenvolvido usando tkinter, um kit de ferramentas de widget multiplataforma Python de código aberto. A partir dos metadados dados, a aplicação extrai o número de agregados (coluna K) de cada poço (Coluna J) presente em uma placa. Uma biblioteca de manipulação de dados Python chamada "Pandas" foi usada para realizar o processo acima mencionado. O aplicativo GUI fornece suporte de arrastar e soltar para os usuários carregarem arquivos de dados. Os dados em cada arquivo são armazenados na forma de uma estrutura tabular bidimensional chamada quadro de dados. Um par de dicionários vazios é inicializado para cada poço único encontrado dentro do quadro de dados. Em seguida, os agregados distintos encontrados em cada poço são contados e anexados aos seus respectivos pares de dicionários. A coluna com dados menores é acolchoda com cordas de valor vazio para garantir que cada coluna esteja em tamanho. Finalmente, a estrutura é convertida em um quadro de dados que é exportado na forma de uma planilha para o diretório especificado pelo usuário.

Figure 8
Figura 8: Interface gráfica do usuário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Detecção de agregados de polq específicos do músculo. Os vermes que expressam poliQ35 específicos para músculos::YFP foram banhados como L1s e cultivados em OP50 por 48 h. Uma vez que os vermes se desenvolveram em adultos jovens, eles foram transferidos para placas de GNM de 24 poços, complementados com 100 μg/mL FUDR e semeados com MPAO1 por mais 72 h antes da imagem. (A) Imagem brightfield usada para identificar corpos de vermes. (B) Imagem fluorescente original adquirida usando o canal GFP. (C) Agregados identificados por meio do CellProfiler. (D) Um número total de agregados identificados sobrepostos sobre a imagem fluorescente original com vermes e contornos agregados. A captura e processamento de imagens foram realizadas utilizando as configurações descritas nas seções 8-9. Painéis E-H representam imagens de close-up das regiões delineadas correspondentes em imagens A-D. Barras de escala = 500 μm. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar 2: Reprodutibilidade da quantificação agregada entre diferentes experimentadores. Número médio de agregados quantificados usando CellProfiler para seis poços de worms colonizados com P. aeruginosa MPAO1 (barras pretas) e seis poços de vermes colonizados com controle E. coli OP50 (barras cinza). Cada poço foi imageado por três experimentadores (AVS, DMC, RDH). Os dados são representados como o número médio de agregados por intestino (n = 30-115). A significância estatística foi calculada utilizando-se o teste de comparações múltiplas de Tukey (* p < 0,05, ** p < 0,01). As barras de erro representam SEM. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar 3: O efeito da posição do verme na reprodutibilidade da quantificação agregada. Número agregado médio por intestino em vermes colonizados com controle E. coli OP50 (barras cinza) e P. aeruginosa MPAO1 (barras pretas ). Os resultados representam o número médio de agregados por intestino (15≥n≥12) quantificado por cellprofiler. A posição dos vermes dentro dos poços foi alterada pela agitação entre cada aquisição. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em nenhum dos grupos. A significância estatística foi calculada utilizando-se o ANOVA unidirecional seguido pelo teste de múltiplas comparações de Tukey. As barras de erro representam SEM. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 4: Confirmação da tela piloto com contagem manual. O número médio de agregados por intestino foi quantificado manualmente. Os dados representam perfis de agregação de vermes colonizados com seis mutantes knock-out MPAO1 (círculos cinzentos Figura 7) em comparação com os controles MPAO1 e OP50 do tipo selvagem (n = 30). A significância estatística foi calculada utilizando-se de ANOVA unidirecional seguido de múltiplos comparações do teste pós-hoc de Dunnett (**** p < 0,0001). As barras de erro representam SEM. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 5: O efeito do FUDR na agregação de poliqt intestinal. Os dados são representados como o número médio de agregados poliQ44::YFP por intestino (n = 20). Os vermes foram transferidos para o controle (sem FUDR) ou placas contendo FUDR (100 μg/mL) após 48h de crescimento a 25 °C em E. coli OP50. As contagens manuais foram coletadas após um adicional de 48 h. A significância estatística foi calculada utilizando-se o teste t do aluno (ns = não significativo). As barras de erro representam SEM. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Gasoduto proteostase. Pipeline de análise de imagens para download para uso no CellProfiler. Instruções para aplicação podem ser encontradas na seção 9. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Conjunto de treinamento desenrolando verme. Arquivo a ser carregado no módulo "UntangleWorms". Este conjunto de treinamento em particular é específico para os worms usados na abordagem inicial. Alterações no tamanho e forma do verme mudarão a precisão e a qualidade da identificação. Pode ser necessário criar um arquivo de treinamento mais personalizado. Instruções para a criação de um novo conjunto de treinamento podem ser encontradas no site oficial do CellProfiler17. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Interface gráfica do usuário para sistema operacional Windows. gui_windowsOS_64x.zip. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Interface gráfica do usuário para mac sistema operacional. gui_MacOS_64x.zip. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

O protocolo descrito descreve procedimentos para a cultura de C. elegans , imagem e processamento de imagens que incorporam o CellProfiler, um software de análise de imagem de código aberto. Os resultados representativos demonstram reprodutibilidade, redução de viés e escalabilidade. Este procedimento padronizado melhorará as estratégias de triagem empregadas com grandes bibliotecas bacterianas, genômicas ou medicamentosas. Enquanto existem outros métodos automatizados de detecção de objetos, a técnica descrita oferece um pipeline padronizado e de maior rendimento que integra cultivo, aquisição de imagens e análise.

Várias variações do cultivo de vermes tiveram que ser testadas para otimizar o protocolo aqui descrito. Inicialmente, os vermes foram transferidos para a amostra de bactérias imediatamente após a sincronização da idade (estágio L1). No entanto, tal abordagem resultou em uma população de vermes com tamanhos variáveis, mesmo entre vermes dentro do mesmo poço. C. elegans são conhecidos por evitar patógenos19, o que poderia ter contribuído para a variabilidade observada em tamanho e, finalmente, afetar a detecção de imagens a jusante- vermes, em particular. Para eliminar tal variabilidade, toda a área de NGM em cada poço foi coberta com bactérias de teste. Além disso, os vermes foram alimentados com E. coli OP50 e permitiram desenvolver-se totalmente em adultos jovens por 48 h a 25 °C. Permitir que os vermes atinjam a idade adulta em E. coli OP50 antes de transferi-los para bactérias de teste resultou em tamanho corporal mais consistente. Além disso, a superlotação e o rápido esgotamento dos alimentos por prole foram eliminados pela suplementação de ágar NGM com FUDR. A implementação do FUDR removeu a prole e a melhoria da identificação automatizada de vermes, que foi obscurecida pela mistura progênua com a população parental. No entanto, é importante ser cauteloso e usar controles adequados ao utilizar o FUDR, pois o composto é conhecido por afetar c. elegans proteostase e vida útil20,21. Nas condições descritas neste protocolo, a FUDR não afetou a agregação de polq intestinal (Figura Suplementar 5); portanto, sua utilização foi adequada e benéfica para o método descrito.

O congelamento de amostras antes da imagem acabou sendo um passo crítico no sucesso do emprego do gasoduto. As contagens agregadas anteriores ao congelamento foram significativamente maiores do que as contagens manuais (Figura 3B). Mantendo os worms a -20 °C por 18-48 h antes da imagem reduziu a fluorescência de fundo e, finalmente, melhorou a detecção agregada (Figura 3A). Os efeitos do congelamento na detecção agregada só foram investigados para o polq e não devem ser generalizados para outros modelos sem uma investigação mais aprofundada de tais efeitos.

Apesar de todas as condições serem mantidas as mesmas, observou-se que o número médio de agregados por verme poderia variar entre diferentes corridas, enquanto a razão entre o número de agregados em animais colonizados com OP50 versus MPAO1 permaneceu consistente (Figura 6, Figura Suplementar 2, Figura Suplementar 5). Portanto, é essencial incluir sempre o controle E. coli OP50, ou quaisquer controles de referência adequados adicionais, em todas as corridas. Tal variabilidade na contagem agregada entre experimentos poderia ser influenciada por condições ambientais (temperatura, umidade)22,23 ou fundo genético 8. Na verdade, observou-se que após a cultura prolongada, a fluorescência intestinal diminuiu drasticamente ou foi completamente perdida, o que exigiu descongelar uma nova cepa do estoque congelado. A diminuição observada da fluorescência pode ser resultado de alterações genéticas que suprimem transgenes tóxicos, como aqueles que expressam o polq. No entanto, a reprodutibilidade excepcional dos resultados observados entre diferentes experimentadores (Figura Suplementar 2), entre as réplicas biológicas (Figura 5) e dentro da mesma amostra (Figura Suplementar 3) enfatizam a força dessa abordagem.

Inúmeros relatos utilizaram o poliq intestinal para estudar proteostase 9,11,12,13,24,25. No entanto, uma comparação direta entre os resultados não pode ser feita devido à variabilidade entre abordagens experimentais e métodos de leitura. No entanto, alguns resultados de dados publicados anteriormente são recapitulados pela quantificação automatizada aqui descrita, incluindo indução bacteriana de agregação 9,13 e um número comparável de agregados11. Coletivamente, o gasoduto descrito oferece uma ferramenta valiosa para estudar proteostase.

O método aqui descrito tem alguns desafios inerentes. Por exemplo, requer tempo suficiente para dominar todos os componentes deste protocolo, o que é especialmente verdadeiro para a seção 8 do protocolo, o que requer familiaridade com o ensaio para determinar se as imagens adquiridas são apropriadas para a análise do pipeline. Desvios das configurações de aquisição de imagens utilizadas neste protocolo são possíveis; no entanto, a modificação das configurações e do conjunto de treinamento de worms provavelmente será necessária. Este pipeline pode distinguir agregados de vários tamanhos e aqueles que estão tocando, o que limita a "mistura" de agregados e, em última análise, aumenta a sensibilidade de detecção. No entanto, problemas podem surgir ao tentar identificar grandes agregados que excedam a faixa de tamanho aceita, pois a expansão do limiar de tamanho superior pode levar a erros causados pela má identificação, como a incapacidade de diferenciar agregados que estão tocando. Um equilíbrio entre precisão, tamanho e intensidade deve ser encontrado antes da análise da imagem. A eficiência da identificação agregada poderia ser melhorada incorporando aprendizado de máquina para criar uma rede neural capaz de melhorar a detecção agregada. Tais melhorias estão sendo exploradas e ajudarão muito a abordar questões atuais, como a detecção de agregados que estão em diferentes planos focais ou que têm formas anormais.

Uma fraqueza notável do método descrito é a variabilidade em contagens agregadas automatizadas, pois nem sempre são recapituladas por contagens manuais em vermes alimentados com diferentes cepas bacterianas. Por exemplo, com base em contagens automatizadas, os vermes alimentados pelo mutante P. aeruginosa 53 (M53) tiveram significativamente menos agregados em comparação com a cepa do tipo selvagem (MPAO1) (Figura 7); no entanto, a confirmação do hit não mostrou diferença significativa (Figura Suplementar 4). Em geral, telas de drogas de alto rendimento têm uma alta taxa de detecção de hits falso-positivos, e o método descrito não é exceção26. Assim, é uma parte crítica do protocolo confirmar todos os possíveis acertos.

Embora este protocolo tenha sido otimizado para se adequar a uma estratégia de triagem para identificar bactérias que afetam a proteostase hospedeira, cada passo pode ser modificado para testar o efeito de bibliotecas genômicas rnai, pequenas moléculas ou outras condições. Modificações adicionais podem ser feitas em cada etapa para atender aos requisitos de uma estratégia específica de triagem. Além disso, essa técnica proporciona um nível de flexibilidade que permite a otimização de cada etapa para se adequar a um modelo específico. Por exemplo, essa abordagem pode ser estendida à agregação de polq em outros tecidos ou extraindo outras características detectadas em imagens como monitorar a expressão genética usando repórteres fluorescentes indutíveis (por exemplo, genes de choque térmico), avaliação da localização subcelular de proteínas (por exemplo, localização nuclear do DAF-16), estudo da agregação em outros modelos de doenças (Aβ1-42, α-sinucleína, TDP-43, etc.) ou avaliação de fenótipos fisiológicos, como o tamanho do verme.

Disclosures

Os autores declararam que não existem conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (1RO3AG069056-01) e pela Sociedade de Doenças Infecciosas da América financiando o DMC. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito. Agradecemos aos membros do Laboratório Czyz por revisarem o manuscrito. Os números dos desenhos animados foram gerados usando a licença remunerada do BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL Microtubes Olympus Plastics Cat#24-282 Microcentrifuge tubes
10 mL Serological Pipettes GenClone Cat#12-104 Plastic pipettes
15 mL Centrifuge Tubes, Racked Olympus Plastics Cat#28-101 Conical tubes
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Fisher Scientific D2235100MG FUDR
Accu-jet Pro Pipette Controller Genesee Scientific 91-600RB Pipette gun
Agar Fisher Scientific Cat#BP1423-2 Granulated agar
BioRender BioRender Graphical figure generator
Bleach (Regular) Clorox Bar# 044600324111, Splash-less Bleach 4.5% sodium hypochlorite
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] Morimoto Lab (Northwestern University) AM140, Q35::YFP Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] Morimoto Lab (Northwestern University) AM738, Q44::YFP Intestinal polyQ
CaCl2·2H2O Fisher Scientific Cat#C79-500 Calcium chloride dihydrate
CellProfiler Broad Institute Image analysis software
Cholesterol Fisher Scientific Cat#ICN10138201 Cholesterol
Circulating Water Bath Head Lauda 26LE Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO CoolLED 8114931 Fluorescent light control and emitter
16 mL Culture Tubes Olympus Plastics 21-129 Culture tubes, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 E. coli control strain
Ethanol, 200 Proof Decon Labs, Inc. 2701
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen Leica Microsystems 10450910 Eyepiece set
Filter Set ET GFP - MZ10F Leica Microsystems 10450588 Filter cube
GraphPad Prism v9.2.0 GraphPad Software, Inc. Statistical analysis tool
Heratherm Incubator IMP180 Thermo 51031562 Refrigerated incubator
Innova 4000 New Brunswick Scientific M1192-0000 Shaking incubator
K5 Camera Leica Microsystems 11547112 Stereomicroscope camera
KH2P04 Fisher Scientific Cat#P285-3 Potassium phosphate monobasic
LAS X Imaging Software Leica Microsystems Microscope imaging software
Leica MZ10 F Optics Carrier Leica Microsystems 10450103 Stereomicroscope
Levamisole Fisher Scientific Cat#0215522805 Levamisole hydrochloride
Luria Broth (Lennox) Apex Bioresearch Products Cat#11-125 LB
Magnetic Stir Plate Fisher Scientific 11-100-49S Stir plate
MgSO4·7H2O Alfa Aesar A14491 Magnesium sulfate heptahydrate
Microscope Slides Premiere 8205 Single frosted microscope slides
Na2HPO4·7H2O Fisher Scientific Cat#S373-500 Sodium phosphate dibasic heptahydrate
NaCl Fisher Scientific Cat#S671-500 Sodium chloride
NaOH Fisher Scientific Cat#S318-3 Sodium hydroxide pellets
Objective Achromat, f = 100 mm Leica Microsystems 10411597 Objective microscope lens
Petri Dishes Genesee Scientific Cat#32-107G 100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library Manoil Lab (University of Washington) P. aeruginosa mutant library
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-102 Used for worm growth and imaging
Trinocular Tube 100% M-series Leica Microsystems 10450043
Trypticase Peptone ThermoFisher, Difco Cat#211921
TX-400 Rotor Thermo Scientific Cat#75003181 Swing bucket rotor
Vacuum Driven Filter System GenClone Cat#25-227 500 mL, PES Membrane, .22 µm
Video Objective with C-Mount Leica Microsystems 10447367 0.63x camera adapter tube

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Biologia Edição 176 C. elegans proteostase poliglutamina agregação
Automatizando quantificação agregada em <em>caenorhabditis elegans</em>
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Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., … More

Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., Walker, A. C., Pagolu, C. N., Enslow, S. M., Czyż, D. M. Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (176), e62997, doi:10.3791/62997 (2021).

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