Summary
يقدم هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية لإجراء فحص بصمة الالتصاق لتصوير أحداث التصاق أثناء التصاق سريع بالخلايا.
Abstract
التصاق المتداول ، الذي تسهله التفاعلات بوساطة selectin ، هو حركة ديناميكية وسلبية للغاية في تجنيد الكريات البيض إلى موقع الالتهاب. تحدث هذه الظاهرة في عدد الخلايا الجنوية بعد الشعيرات الدموية ، حيث يدفع تدفق الدم الكريات البيض في حركة متجددة على الخلايا البطانية. يتطلب المتداول المستقر توازنا دقيقا بين تكوين رابطة التصاق وانفصالها المدفوع ميكانيكيا ، مما يسمح للخلية بالبقاء ملتصقة بالسطح أثناء الدوران في اتجاه التدفق. وخلافا لعمليات الالتصاق الأخرى التي تحدث في بيئات ثابتة نسبيا، الالتصاق المتداول ديناميكية للغاية كما الخلايا المتداول السفر عبر الآلاف من ميكرون في عشرات ميكرون في الثانية الواحدة. وبالتالي، فإن أساليب علم الأحياء الميكانيكية التقليدية مثل المجهر قوة الجر غير مناسبة لقياس أحداث الالتصاق الفردية والقوى الجزيئية المرتبطة بها بسبب النطاق الزمني القصير والحساسية العالية المطلوبة. هنا، ونحن نصف لدينا أحدث تنفيذ قياس بصمة الالتصاق لتصوير P-selectin: PSGL-1 التفاعلات في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي. تستخدم هذه الطريقة الحبال مقياس التوتر المستندة إلى الحمض النووي لا رجعة فيه لإنتاج تاريخ دائم من أحداث الالتصاق الجزيئي في شكل مسارات مضان. يمكن تصوير هذه المسارات بطريقتين: (1) خياطة الآلاف من الصور المحدودة الحيود لإنتاج مجال رؤية كبير ، مما يتيح استخراج بصمة التصاق لكل خلية متجددة على آلاف الميكرونات في الطول ، (2) أداء DNA-PAINT لإعادة بناء صور فائقة الدقة للمسارات الفلورية داخل مجال صغير من الرؤية. في هذه الدراسة، تم استخدام فحص بصمة الالتصاق لدراسة خلايا HL-60 المتداول في ضغوط القص المختلفة. وبذلك، تمكنا من تصوير التوزيع المكاني ل P-selectin: تفاعل PSGL-1 واكتساب نظرة ثاقبة على قواهم الجزيئية من خلال كثافة الفلورسينس. وهكذا، توفر هذه الطريقة الأساس للتحقيق الكمي لمختلف التفاعلات بين الخلايا والسطح المشاركة في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي.
Introduction
تصف سلسلة التصاق المتداول كيف ترتبط الخلايا المتداولة بحائط الأوعية الدموية ولفه على طوله1. يتم التوسط في المقام الأول المتداول السلبي من قبل selectins ، وهي فئة رئيسية من جزيئات الالتصاق الخلوي (CAMs)1. تحت تدفق القص من الدم، الكريات البيض التعبير عن P-selectin جليكبروتين ليغند-1 (PSGL-1) تشكل روابط عابرة للغاية مع P-selectin، والتي يمكن التعبير عنها على سطح الخلايا البطانية الملتهبة. هذه العملية حاسمة بالنسبة للخلايا البيض للهجرة إلى موقع الالتهاب2. وبالإضافة إلى ذلك، سان جيرمان-1 هو أيضا مستقبلات حساسة ميكانيكية قادرة على تحريك مرحلة الالتصاق الشركة اللاحقة من سلسلة التصاق المتداول عند مشاركتها مع P-selectin3.
الطفرات الوراثية التي تؤثر على وظيفة CAM يمكن أن تؤثر بشدة على الجهاز المناعي، كما هو الحال في المرض النادر لنقص التصاق الكريات البيض (LAD)، حيث يؤدي خلل جزيئات الالتصاق التي تتوسط المتداول إلى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة الشديد4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الخلايا السرطانية المتداولة تهاجر بعد عملية المتداول مماثلة ، مما يؤدي إلى الانبثاث7،8. ومع ذلك ، لأن المتداول الخلية سريعة وديناميكية ، والأساليب التجريبية التقليدية الميكانيكية غير مناسبة لدراسة التفاعلات الجزيئية أثناء المتداول الخلية. في حين أن أساليب التلاعب أحادية الخلية وجزيء واحد مثل المجهر القوة الذرية وملاقط البصرية كانت قادرة على دراسة التفاعلات الجزيئية مثل التفاعل P-selectin تعتمد على القوة مع PSGL-1 على مستوى جزيء واحد9، فهي غير مناسبة للتحقيق في أحداث الالتصاق الحية أثناء المتداول الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن للتفاعل المميز في المختبر الإجابة مباشرة على السؤال حول الالتصاق الجزيئي في الجسم الحي. على سبيل المثال، ما هو نطاق التوتر الجزيئي ذي الصلة بيولوجيا عندما تعمل الخلايا في بيئتها الأصلية؟ وقد استولت الأساليب الحاسوبية مثل محاكاة ديناميات لاصقة10 أو بسيطة ثابتة الحالة11 بعض التفاصيل الجزيئية وكيف تؤثر على السلوك المتداول ولكن تعتمد اعتمادا كبيرا على دقة المعلمات والافتراضات النمذجة. ويمكن لتقنيات أخرى مثل الفحص المجهري لقوة الجر الكشف عن القوى أثناء هجرة الخلايا ولكنها لا توفر دقة مكانية كافية أو معلومات كمية عن التوتر الجزيئي. لا يمكن لأي من هذه التقنيات أن توفر ملاحظات تجريبية مباشرة للديناميكيات الزمنية والتوزيع المكاني وعدم التجانس في القوى الجزيئية ، والتي ترتبط مباشرة بوظيفة الخلية وسلوكها في بيئتها الأصلية.
لذلك ، فإن تنفيذ مستشعر القوة الجزيئية القادر على قياس التفاعلات بوساطة selectin بدقة أمر بالغ الأهمية لتحسين فهمنا للالتصاق المتداول. هنا، ونحن نصف بروتوكول لacesay12 بصمة الالتصاق حيث يتم تدحرجت الخرز المغلفة PSGL-1 على سطح تقديم ف selectin الحبال قياس التوتر الوظيفية (TGTs)13. هذه TGTs هي أجهزة استشعار قوة تعتمد على الحمض النووي لا رجعة فيها والتي تؤدي إلى تاريخ دائم من أحداث التمزق في شكل قراءات مضان. ويتحقق ذلك من خلال تمزق TGT (dsDNA) ومن ثم وضع العلامات اللاحقة لTGT الممزق (ssDNA) مع حبلا تكميلية وصفت الفلورسنت. إحدى المزايا الرئيسية لهذا النظام هي توافقه مع كل من التصوير محدود الحيود والتصوير فائق الدقة. يمكن ربط الخيط التكميلي المسمى بالفلورسنت إما بشكل دائم (>12 نقطة أساس) للتصوير المحدود الحيود أو ملزم بشكل عابر (7-9 bp) للتصوير فائق الدقة من خلال DNA PAINT. هذا هو نظام مثالي لدراسة التصاق المتداول كما تمزق TGTs أثناء المتداول النشط، ولكن يتم تحليل قراءات مضان بعد المتداول. كما توفر طريقتان للتصوير للمستخدم المزيد من الحرية للتحقيق في التصاق المتداول. عادة، التصوير محدود الحيود مفيد لاستخراج قوة التمزق الجزيئي من خلال كثافة الفلورسينس13، في حين أن التصوير فائق الدقة يسمح بالتحليل الكمي لكثافة المستقبلات. مع القدرة على التحقيق في هذه الخصائص من التصاق المتداول، وهذا النهج يوفر منصة واعدة لفهم آلية تنظيم القوة على الالتصاق الجزيئي للخلايا المتداول تحت تدفق القص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الوسم Oligonucleotide والتهجين
- تخفيض الروابط ثنائي كبريتيد البروتين G
- حل 10 ملغ من البروتين G (ProtG) في 1 مل من المياه فائقة البور.
ملاحظة: يتم تعديل البروتين G هنا مع بقايا السيستين واحد في C-terminus وعلامة بولي هيستيدين N-terminus. - تبادل المخزن المؤقت ≥20 ميكرولتر من ProtG (10 ملغم / مل) إلى 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) مع عمود P6.
- قياس تركيز البروتين بعد تبادل العازلة.
ملاحظة: تركيز نموذجي من 7-8 ملغم / مل. - إعداد 120 mM تريس (2-carboxyethyl)فوسفين (TCEP) عن طريق حل 3 ملغ من TCEP إلى 90 ميكرولتر من 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) تليها 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
ملاحظة: يجب أن تكون TCEP معدة حديثا. - أضف 4 ميكرولتر من 120 مللي متر من التسيب (480 نانومول) إلى 20 ميكرولتر من بروت جي (4-5 نانومول).
ملاحظة: تهدف إلى نسبة الضرس من ~ 100:1 TCEP إلى البروتين. - السماح لرد الفعل على المضي قدما لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إزالة TCEP الزائدة من ProtG مخفضة مع عمود P6 (المخزن المؤقت تبادلها في برنامج تلفزيوني 1x، pH 7.2).
- قياس تركيز ProtG انخفاض مع الأشعة فوق البنفسجية / فيس الطيف وحفظ الأطياف.
ملاحظة: تركيز نموذجي من 3.5-4.5 ملغم/ مل.
- حل 10 ملغ من البروتين G (ProtG) في 1 مل من المياه فائقة البور.
- رد فعل SSDNA المسمى أمين مع سولفو-SMCC
- حل الأمين المسمى ssDNA (أمين-ssDNA) في المياه الخالية من النيوكليز إلى تركيز 1 mM. تحقق من تركيز حبلا مع الأشعة فوق البنفسجية / فيس الطيف.
- إعداد 11.5 mM sulfo-SMCC (وصلة متقاطعة ثنائية الوظائف مع إستر sulfo-NHS وmalimide) حل جديد عن طريق حل 2 ملغ من sulfo-SMCC في 400 ميكرولتر من المياه فائقة الشراء ودوامة لخلط.
- إضافة 6 ميكرولتر من 1 mM أمين-ssDNA (6 نانومول) إلى 5.2 ميكرولتر من 11.5 mM sulfo-SMCC (60 نانومول) و 88.8 ميكرولتر من 1x PBS (pH 7.2). دوامة لمدة 5 ق تليها الطرد المركزي في 8600 × ز لمدة 3 دقائق.
- السماح لرد الفعل على المضي قدما لمدة 30 دقيقة في RT.
- إزالة sulfo-SMCC الزائدة من SMCC اقتران أمين-ssDNA (mal-ssDNA) مع عمود P6 (المخزن المؤقت المتبادل في 1x PBS, pH 7.2).
- قياس تركيز سوء ssDNA مع الأشعة فوق البنفسجية / فيس الطيف وحفظ الأطياف.
ملاحظة: تركيز نموذجي من 35-45 ميكرومتر.
- اقتران بروتيج-SsDNA
- إضافة 21 ميكرولتر من 4.5 ملغ / مل خفض ProtG (3 نانومول) إلى سوء ssDNA (~ 4-5 نانومول).
ملاحظة: الأحجام والتركيزات هنا هي قيم نموذجية. ضبط وفقا لقياس تجريبي الفردية. ضمان دائما كمية زائدة من سوء ssDNA على ProtG بنسبة ~ 1.5:1. - دوامة لمدة 5 ق والسماح لرد الفعل على المضي قدما لمدة 3 ساعة في RT.
- إضافة 21 ميكرولتر من 4.5 ملغ / مل خفض ProtG (3 نانومول) إلى سوء ssDNA (~ 4-5 نانومول).
- بروتج-ssDNA تنقية وتوصيف
- تنقية بروتج-ssDNA المقترنة من خلال عزلته العلامة مع حمض النيكل والنتريلوترياستيك المغناطيسي (ني-NTA) الخرز.
- إزالة imidazole الزائدة (ني NTA elution العازلة) من المنتج مع عمود P6 (المخزن المؤقت تبادلها في برنامج تلفزيوني 1x، PH 7.2).
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لقياس مقدار التلازم، حيث أن الإميدازول لديه امتصاص كبير عند 280 نانومتر. - استخدم مطياف الأشعة فوق البنفسجية/العدسات لتسجيل أطياف المنتج ProtG-ssDNA وكذلك المخزن المؤقت ل Elution Ni-NTA (1x).
ملاحظة: نموذجية بروتغ-ssDNA امتصاص في 260 نانومتر و 280 نانومتر هو 0.8 و 0.6، على التوالي. - لتحديد كفاءة ونسبة اقتران ProtG إلى ssDNA ، استخدم برنامج MATLAB المكتوب خصيصا (ملف الترميز التكميلي 1) لتحليل طيف المنتج النهائي استنادا إلى الأطياف الثلاثة التي تم جمعها سابقا (ProtG ، SMCC-strand ، ني-NTA حبة elution العازلة).
ملاحظة: Briefly، التعليمات البرمجية يعمل كما هو موضح في الخطوات 1.4.5-1.4.8. التركيز النموذجي هو 4 ميكرومتر من ProtG-ssDNA مع ProtG و ssDNA بنسبة 1:1 مولر ~(الشكل 2A). - إدخال ProtG، SMCC-حبلا، ني-NTA حبة elution العازلة، وبروتج-ssDNA الأشعة فوق البنفسجية / فيس الأطياف في السيناريو MATLAB
- إجراء تقليل غير خطي متعدد الأبعاد لإعادة بناء أطياف ProtG-ssDNA من أطياف المصدر (أطياف بروتج، SMCC-strand، وأطياف العازلة لخرزة ني-NTA)
ملاحظة: ناتج الدالة التصغير ثلاثة عوامل التحويل، واحد لكل أطياف المصدر. - إعادة بناء أطياف ProtG-ssDNA عن طريق ضرب الأطياف بعاملها المقابل والجمع بين أطياف المصدر المحولة.
- مضاعفة التركيز الأولي من بروتج وSMCC-حبلا من عوامل التحول المقابلة لتحديد تركيزات SMCC-حبلا وProG في المنتج ProtG-ssDNA.
- (اختياري) تشغيل الصفحة الأصلية وفقا الشكل 2B للمساعدة في ضمان كل مكون وخطوة يعمل كما هو متوقع.
- التهجين TGT
- تهجين ProtG-ssDNA (حبلا العلوي) مع حبلا القاع البيوتينيلات في نسبة الضرس من 1.2:1 مع تركيزات من 240 nM و 200 nM على التوالي في T50M5 العازلة (10 mM تريس, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) لتهجين بناء TGT الكامل. السماح للتهجين في RT ≥1 ساعة.
2. سطح PEGylation
- تنظيف السطح
- تنظيف قارورة Erlenmeyer واحدة وجرارتين تلطيخ لكل 8 coverlips. ملء كل حاوية مع 1 M كوه الحل و sonicate لمدة 1 ساعة في RT. غسل جيدا كل حاوية مع المياه فائقة البور والجافة مع N2 أو في الفرن.
ملاحظة: ملء كوه إلى الأعلى للمس الغطاء، بحيث يتم تنظيفها أيضا. - شطف جيدا كل coverslip مع المياه فائقةبور ووضعها في واحدة من الجرار تلطيخ تنظيفها.
ملاحظة: تأكد من أنها ليست عالقة لبعضها البعض أو إلى جدار الجرار تلطيخ. - في غطاء الدخان، قم بإعداد محلول البيرانا حديثا بإضافة 30 مل من بيروكسيد الهيدروجين (30٪) إلى 90 مل من حمض الكبريتيك المركز (95٪-98٪) في كوب 250 مل.
تنبيه: حمض الكبريتيك المركز شديد التآكل. إضافة بيروكسيد الهيدروجين ببطء شديد إلى حمض الكبريتيك ودوامة بعناية لخلط. - غمر كامل الأغطية في جرة تلطيخ مع محلول البيرانا. اترك الأغطية في البيرانا لمدة 30 دقيقة في غطاء الدخان.
تنبيه: تهدئة محلول البيرانا إلى ما لا يزيد عن 80 درجة مئوية قبل صب لمنع تكسير جرة تلطيخ. - تجاهل محلول البيرانا في كوب 1000 مل وتحييد مع كوه 1 M من تنظيف الزجاج.
- (اختياري) كرر تنظيف أسماك البيرانا (الخطوات 2.1.3-2.1.5) مع محلول البيرانا الطازج.
- شطف الأغطية مع كميات وفيرة من المياه فائقة البور لإزالة جميع محلول البيرانا المتبقية. هز بلطف جرة تلطيخ خلال كل ارتفاع لتسهيل إزالة (ينصح 10 شطف).
- شطف الأغطية بالميثانول 3 مرات لإزالة الماء من سطح الغطاء والحفاظ على الأغطية المغمورة بالميثانول.
- تنظيف قارورة Erlenmeyer واحدة وجرارتين تلطيخ لكل 8 coverlips. ملء كل حاوية مع 1 M كوه الحل و sonicate لمدة 1 ساعة في RT. غسل جيدا كل حاوية مع المياه فائقة البور والجافة مع N2 أو في الفرن.
- السيلانة السطحية
- إعداد محلول أمينوسيلين 1٪ عن طريق خلط تماما 94 مل من الميثانول، 1 مل من أمينوسيلين، و 5 مل من حمض الخليك الجليدي في قارورة إرلينماير تنظيفها والمجففة. صب في الثانية تنظيفها والمجففة تلطيخ jar14.
- نقل الأغطية المغمورة تحت محلول الميثانول إلى جرة تلطيخ تحتوي على محلول أمينوسيلين 1٪ والحفاظ على جرة مغطاة.
ملاحظة: لا تسمح للأغطية بالجفاف أثناء نقلها إلى أمينوسيلين للحد من التعرض السطحي الزجاجي للهواء. - احتضان جرة تلطيخ تحتوي على الأغطية في أمينوسيلين لمدة 1 ساعة في 70 درجة مئوية في الفرن15.
- تجاهل بعناية محلول أمينوسيلين في حاوية نفايات منفصلة وشطف الأغطية في جرة تلطيخ مع الميثانول 5 مرات لإزالة محلول أمينوسيلين.
- شطف الأغطية في جرة تلطيخ مع المياه فائقة الشراء 5 مرات وتجفيفها مع N2.
- خبز الأغطية المجففة في جرة تلطيخ في فرن في 110 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. السماح للأغطية لتبرد إلى RT، ثم وضعها على رف PEGylation.
ملاحظة: قم بتغطية جرة التلطيخ بغطاء أثناء الخبز لتقليل ترسب معين و كيميائي على السطح15.
- إعداد حل PEG
- إذابة PEG (بولي إيثيلين غليكول) و PEG-biotin إلى RT لمدة 30 دقيقة تقريبا.
ملاحظة: تقلل هذه الخطوة من تكثيف الرطوبة الذي يمكن أن يحط من إستر NHS على PEG. - جعل PEG العازلة بإضافة 84 ملغ من بيكربونات الصوديوم إلى 10 مل من المياه فائقة البور. يجب أن توفر هذه الصيغة المخزن مؤقت عند 8.4 pH.
- ل8 coverlips، مع كل جانب PEGylated واحد مع 20:1 PEG: PEG-البيوتين: قياس 100 ملغ من PEG و 5 ملغ من PEG-البيوتين لإضافة إلى 400 ميكرولتر من العازلة PEG. دوامة الحل لمدة 30 ق والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في السرعة القصوى (≥18000 س غ).
ملاحظة: هذه الخطوة حساسة للوقت، حيث يبدأ التحلل المائي SVA NHS-ester على الفور ولديه نصف عمر 34 دقيقة عند pH 8.0، مع نصف عمر أقصر عند pH 8.4.
- إذابة PEG (بولي إيثيلين غليكول) و PEG-biotin إلى RT لمدة 30 دقيقة تقريبا.
- حضانة PEG وتخزين غطاء الغطاء
- إعداد غرفة الرطوبة ووضع الأغطية داخل.
- إضافة 90 ميكرولتر من محلول PEG إلى غطاء في غرفة الرطوبة ووضع غطاء ثاني على رأس محلول PEG باستخدام ملاقط عقد coverslip لنشر حل PEG بالتساوي.
- تأكد من عدم وجود فقاعات في الحل انخفض على coverslip. انخفاض نهاية واحدة من coverlip الثاني على coverlip الأولى وإسقاط ببطء الطرف الآخر بحيث لا توجد فقاعات تقع بين coverlips.
ملاحظة: سوف تتسبب الفقاعات في ضعف PEGylated بعض المناطق. - كرر حتى يكون جميع الأغطية PEG (أي 8 coverslips = 4 السندويشات PEG). احتضان حلول PEG بين عشية وضحاها (~ 12 ساعة) في RT في غرفة الرطوبة في dark16.
- فصل أزواج غطاء ووضعها في جرة تلطيخ. لاحظ الجوانب PEGylated.
- شطف الأغطية جيدا مع المياه فائقة البور وجافة مع N2.
ملاحظة: أمسك الأغطية بالملاقط وانفخ N2 عبر السطح باتجاه الملاقط لمنع الملوثات من التجفيف على السطح. - وضع علامة على الجانب غير PEGylated مع نقطة في زاوية باستخدام علامة دائمة أو قلم الماس.
- ضع 2 غطاء PEGylated في أنابيب بريدية مع الجانبين PEGylated تواجه بعضها البعض للمساعدة في تحديد الجانب PEGylated قبل الاستخدام.
- فراغ أنبوب لمدة 5 دقائق والردم مع N2. ختم أنبوب مع البارافيلم.
- تخزين الأغطية PEGylated في -20 درجة مئوية في أنابيب البريد مختومة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
ملاحظة: قم بتدفئة أنابيب التخزين إلى RT قبل تجميع الشريحة. التكثيف على الأغطية أثناء الختم سوف يسبب تسرب.
3. تدفق غرفة إعداد
- تجميع رقاقة
- نشر رقيقة كمية صغيرة من الايبوكسي على كلا الجانبين من الشريط على الوجهين مع شفرة حلاقة.
ملاحظة: قد ينتشر الكثير من الايبوكسي في القناة أثناء التجميع. - الليزر قطع الشريط المغلفة الايبوكسي لإنشاء 4 قنوات. إنشاء رقاقة تدفق عن طريق شطيرة الشريط الايبوكسي بين شريحة من 4 حفرة وأغطية PEG (الشكل 1A).
- باستخدام طرف ماصة، وتطبيق ضغط لطيف على طول القنوات لخلق ختم جيدة. علاج الايبوكسي لمدة ≥1 ساعة.
ملاحظة: لا قص الزجاج لتجنب الانزلاق ضد الايبوكسي.
- نشر رقيقة كمية صغيرة من الايبوكسي على كلا الجانبين من الشريط على الوجهين مع شفرة حلاقة.
- جمعية الغرفة
- قم بمحاذاة الشريحة بحيث يتم وضع فتحة كل قناة في مراكز المحول (الشكل 1A). وضع اثنين من الفواصل الاكريليك شفافة على رأس رقاقة، وتطبيق ضغط ثابت في منتصف الكتلة، والمسمار في اثنين من مسامير 4-40 في نهايات كل فاصل.
ملاحظة: لا تفرض المسمار أو اضغط بقوة على الفواصل، أو قد الكراك رقاقة. - على الجانب الآخر من قوس، المسمار مداخل في الثقوب مترابطة. مراقبة حالة الختم من خلال كتلة الاكريليك شفافة.
- كما الأنابيب يجعل الاتصال مع فتح رقاقة، ختم الاتصال عن طريق التواء بلطف الأنابيب في اتجاه عقارب الساعة.
ملاحظة: قد تتسبب المداخل المحكمة في انسداد التدفق، بينما تتسبب الاتصالات الفضفاضة في حدوث تسرب.
- قم بمحاذاة الشريحة بحيث يتم وضع فتحة كل قناة في مراكز المحول (الشكل 1A). وضع اثنين من الفواصل الاكريليك شفافة على رأس رقاقة، وتطبيق ضغط ثابت في منتصف الكتلة، والمسمار في اثنين من مسامير 4-40 في نهايات كل فاصل.
4. إعداد السطح
ملاحظة: الرجوع إلى الشكل 1B لسير العمل الكلي.
- منع العوامل لمنع الربط غير المحدد
- استخدام ماصة لتدفق 200 ميكرولتر من العازلة غسل (10 mM تريس، 50 م م NaCl، 5 م MgCl2 و 2 MM CaCl2، 0.05٪ توين 20) في الغرفة للتحقق من وجود تسرب. إذا تشكلت الفقاعات في القناة، ادفع بقوة 200 ميكرولتر إضافية لإزالة الفقاعات.
ملاحظة: فقاعات الهواء الكبيرة التي لم تتم إزالتها في هذه الخطوة يمكن أن تزيح وتدمر التشغيل السطحي لاحقا. - أضف 40 ميكرولتر من BSA (1٪ ث /v) إلى غرفة التدفق لمنع الربط غير المحدد واحتضان لمدة 10 دقائق.
- تأكد من إضافة حجم كاف خلال كل فترة حضانة لملء غرف التدفق وتشكيل قطرات في المداخل والمنافذ. ضبط أحجام الحضانة وفقا لذلك وإجراء جميع الحضانات في غرفة الرطوبة.
- أضف 40 ميكرولتر من توين 20 (5٪ v/v) إلى غرفة التدفق. احتضان لمدة 10 دقيقة لزيادة الحد من الربط غير محددة.
- (اختياري) تحقق من السطح للحصول على كمية كافية من الخرز البوليسترين المتدفقة من خلال القناة. إضافة 40 ميكرولتر من حبات البوليسترين المغلفة ProtG (0.01٪ ث / v) والصورة باستخدام المجهر darkfield مع هدف 10x. إذا كانت الخرز لا تلتزم السطح، انتقل إلى الخطوة التالية.
- اغسل القناة مع 200 ميكرولتر من عازل الغسيل لإزالة جميع عوامل السلب.
- استخدام ماصة لتدفق 200 ميكرولتر من العازلة غسل (10 mM تريس، 50 م م NaCl، 5 م MgCl2 و 2 MM CaCl2، 0.05٪ توين 20) في الغرفة للتحقق من وجود تسرب. إذا تشكلت الفقاعات في القناة، ادفع بقوة 200 ميكرولتر إضافية لإزالة الفقاعات.
- عملية سطح الغرفة
- أضف 40 ميكرولتر من الستريبتافيدين (100 ميكروغرام/مل) إلى غرفة التدفق واحتضن لمدة 20 دقيقة. ثم، يغسل مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل.
- أضف 40 ميكرولتر من ProtG-TGT المهجن (100 nM) إلى غرفة التدفق واحتضن لمدة 20 دقيقة. ثم، يغسل مع 200 ميكرولتر غسل العازلة.
- إضافة 40 ميكرولتر من حبلا بروتغ-TGT الأعلى (100 nM) لمدة 20 دقيقة لإكمال أي حبلا TGT السفلي غير المثمر على السطح. غسل مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل.
- إضافة 40 ميكرولتر من P-selectin-Fc (10 ميكروغرام / مل) إلى غرفة التدفق واحتضان لمدة 60 دقيقة. ثم، يغسل مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل.
ملاحظة: مدة الحضانة أمر بالغ الأهمية.
5. التجربة والتصوير
- إعداد نظام التدفق
- ملء حقنة زجاجية 5 مل مع المخزن المؤقت المتداول (HBSS مع 2 MM CaCl2، 2 mM MgCl2، 10 MM HEPES، 0.1٪ BSA). تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة عن طريق النقر على جانبي الحقنة لطرد الفقاعات ودفعها إلى الخارج أثناء تعويمها نحو الطرف.
- أدخل إبرة معقمة (26 جم، 5/8 بوصة طول) في 200 مم من أنابيب البولي إيثيلين (I.D: 0.38 مم؛ O.D: 1.09 مم) وربط الإبرة إلى حقنة الزجاج.
ملاحظة: تأكد من عدم وجود هواء في أي مكان في موصل الإبرة. - إصلاح المحاقن على مضخة حقنة وإمالة مضخة حقنة بحيث يتم رفع الجانب المكبس لمنع فقاعات الهواء من دخول القناة. أدخل نهاية الأنبوب في مدخل غرفة التدفق.
ملاحظة: تأكد من الاتصال السائل إلى السائل عند إجراء الاتصال عن طريق إيداع قطرات على المداخل وجود قطرات في نهاية أنابيب الحقنة. تأكد من عدم دخول فقاعات الهواء إلى القناة عن طريق السماح بإفلات صغير للتشكل في نهاية أنابيب الحقنة قبل إدخالها في المدخل. - أدخل نهاية واحدة من 200 مم أخرى من أنابيب البولي إيثيلين في المنفذ ، والطرف الآخر غارقة في كوب من النفايات.
- الإعداد للخلية المتداول
- تنمو خلايا HL-60 في 25 سم2 قوارير الثقافة التهوية في وسائل الإعلام IMDM تكملها 20٪ مصل البقر الجنين و 1٪ المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. الحفاظ على كثافات الخلايا بين 1 × 105-2 × 106 خلايا / مل.
- (اختياري) تمييز خلايا HL-60 في وسيط IMDM كامل يحتوي على 1.25٪ DMSO في كثافة أولية من 2 × 105 خلايا / مل. احتضان الخلايا لتكون الأكثر نشاطا لمدة 5-6 أيام.
- خذ عينة (1-2 مل) من تعليق الخلية والطرد المركزي (200 × ز، 3 دقائق) لكريه الخلايا.
- إزالة المتوسطة وإعادة إنفاق الخلايا بلطف في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتداول. كرر خطوة الغسيل مرتين لإزالة الحطام الخلوي.
- قياس كثافة الخلية مع مقياس الدم. إعادة تركيب الكريات الخلية مع المتداول العازلة إلى كثافة 2 × 105 خلايا / مل.
- قطع بعناية الأنابيب من مداخل / منفذ وماصة 40 ميكرولتر من تعليق الخلية في غرفة التدفق. إعادة توصيل الأنابيب كما هو موضح سابقا، وضمان عدم إدخال فقاعات في قناة التدفق.
- بدء تجربة المتداول الخلية عن طريق بدء مضخة حقنة بمعدلات التدفق المطلوب.
ملاحظة: تعتمد كثافة المسارات الفلورية على إجهاد القص، كما أن إجهاد/سرعة القص بسرعات الخلية المنخفضة سينتج عموما مسارات باهتة (الشكل 4A). تجنب كثافة الخلايا العالية على السطح أو المدة الزائدة للدرفلة لضمان مسارات أحادية الخلية قابلة للفصل (الشكل 4B، C). - استخدام المجهر darkfield مع هدف 10x لضمان رصد المتداول الخلية.
- بمجرد الانتهاء من التجربة، قم بإزالة الخلايا من القناة عن طريق غرس المخزن المؤقت المتداول عند 100 مل/ساعة حتى يصبح السطح خاليا من الخلايا.
- تصوير المسارات المحلية من خلال "تراكم النقاط المستندة إلى الحمض النووي للتصوير في تضاريس النانو" (DNA-PAINT)
- إضافة 40 ميكرولتر من حبلا صور الحمض النووي-PAINT (500 pM) في مخزن الحمض النووي-PAINT (0.05٪ توين-20، 5 مللي متر تريس، 75 mM MgCl2، 1 mM EDTA) إلى القناة.
- إجراء المجهر الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) باستخدام عدسة هدف TIRF 100x الغمر النفط. احصل على إطارات 40000+ مع وقت تعرض 25 مللي ثانية لكل إطار عند كسب 300 (EM) من الإلكترونات المتكاثرة باستخدام كاميرا جهاز الشحن المقترن بالإلكترونات (EMCCD).
- استخدم حزمة برامج Picasso17 لترجمة الصور فائقة الدقة (الشكل 4D) وتقديمها باتباع الخطوات 5.3.4-5.3.5.
- تحميل الفيلم DNA-PAINT في برنامج توطين لتحديد توطين كل الفلوروفوري في كل إطار.
ملاحظة: تحسين طول مربع الجانب و Min. Net Gradient المعلمات حتى يتم تعقب الفلوروفوريس فقط بدقة. Min. صافي معامل التدرج يمكن أن تذهب في كثير من الأحيان فوق 100000 لتحقيق تتبع الأمثل. الإعداد صالح: MLE، طريقة غاوسية متكاملة تنتج أفضل نتيجة. وأخيرا، إذا كان الفيلم طويل جدا، تقسيمه إلى أكوام من 10000 إطار من أجل تتبع المعاينة في التعرييب للعمل بشكل صحيح قبل إعادة دمجها في ملف hdf5 النهائي. - ثم قم بتحميل الملف hdf5 الناتجة في برنامج تقديم لتنفيذ تصحيح الانجراف وتقديم.
ملاحظة: تنفيذ تصحيح الانجراف متعددة عبر Undrift بواسطة RCC لتحسين النتيجة النهائية.
- تصوير المسارات الطويلة عن طريق وضع العلامات الدائمة
- أضف خيط الصور الدائم واحتضنه لمدة 120 s في المخزن المؤقت T50M5. اغسل القناة عن طريق غرس 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت.
- تسجيل صورة مع ليزر الإثارة قبالة للحصول على ضجيج الكاميرا الخلفية. صورة مساحة كبيرة في نمط الشبكة بواسطة المجهر TIRF.
ملاحظة: يوصى بتراكب الإطارات الزائدة عن الإطار ≥10٪ للخياطة اللاحقة. - برمجة المجهر لمسح أكثر من مساحة 400 × 50 صورة (20000 صور في المجموع). باستخدام برنامج فيجي، تقسيم البيانات الخام إلى ملفات tiff الفردية، تحتوي كل منها على 10000 صورة كحد أقصى.
- قم بتسوية جميع الصور باستخدام ملف الإضاءة (الشكل 3A-C) باتباع الخطوات 5.4.5-5.4.7.
- طرح ضجيج الكاميرا الخلفية من كل إطار. الحصول على إسقاط مكدس المتوسط (ملف تعريف الإضاءة) من كل إطار طرح الخلفية.
- تطبيع ملف تعريف الإضاءة بقيمتها القصوى. تقسيم كل إطار الخلفية طرحها من قبل التشكيل الجانبي الإضاءة تطبيع.
- إعادة زيادة حجم الإطارات المصححة إلى النطاق المناسب لعمق البت المطابق.
- استخدام MIST18 لغرزة الصور (الشكل 3D، E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف البروتوكول أعلاه الإجراء التجريبي لمقايسة بصمة الالتصاق. يوضح سير عمل التجربة العامة في الشكل 1، بدءا من تجميع غرفة التدفق (الشكل 1A) إلى التشغيل السطحي (الشكل 1B) وخطوات التجربة والتصوير (الشكل 1C).
الشكل 2 هو نتيجة تمثيلية لتوصيف التكيف البيولوجي ProtG-ssDNA. تم جمع أطياف الأشعة فوق البنفسجية / الفيس المكونة من ثلاثة مكونات في المنتج النهائي ، وهي ProtG و mal-ssDNA و imidazole elution buffer ، قبل اقتران النهائي (الشكل 2A) ، كل منها يتوافق مع تركيز معروف. وتشكل هذه الأطياف الأساس المتعامد للملاءمة مع طيف منتجات التكيف البيولوجي، حيث تكون المعلمات الثلاثة غير المعروفة هي تركيزاتها. تم استخدام وظيفة مخصصة في MATLAB لتحديد التركيزات. تظهر النتائج نسبة 1:1 تقريبا من ProtG إلى ssDNA (الشكل 2A). هذا هو كما هو متوقع لأن SsDNA لديه تعديل أمين واحد فقط، وProG لديه السيستين واحد هندستها في C-terminus لها. هذا النهج هو أكثر فائدة لنهج ذكرت سابقا19 باستخدام الحمض النووي واحد ثيول تعديل لاستهداف العديد من الأمينات الأولية على ProtG، حيث لا يمكن الحفاظ على نسبة اقتران بسهولة.
بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام PAGE الأصلي لتأكيد التعديل البيولوجي (الشكل 2B). الحمض النووي ملطخ بجيلغرين والبروتينات بواسطة كوماسي الأزرق، على التوالي. كما البقع GelGreen dsDNA أكثر قوة من ssDNA، فمن المتوقع أن أي عصابات ssDNA لتكون باهتة من تركيز الضرس على قدم المساواة من العصابات dsDNA (الممرات 3، 4). لأن الأسهم ProtG يحتوي على بقايا السيستين C-المحطة الطرفية، جزء صغير من البروتينات تشكل dimers من خلال السندات كبريتيد، كما رأينا في حارة 5 (الشكل 2B). من ناحية أخرى ، يظهر ProtG المخفض شريطا واحدا (حارة 6). عند استخدام البروتج الأسهم في اقتران الحمض النووي مباشرة، وبروتج ديبريتيد خافت لا يتفاعل مع الحمض النووي ويظهر كفرقة دون أي تلطيخ GelGreen (الممرات 7، 8). يختفي شريط ProtG dimer في منتج التحام باستخدام ProtG المنخفض (الممرات 9، 10). لأن يتم استخدام فائض من سوء ssDNA إلى ProtG (1.5:1) أثناء اقتران، TGT فقط العصابات مرئية في المنتج اقتران النهائي (الممرات 8، 10). تشير نطاقات GelGreen الساطعة التي تتزامن مع نطاق ProtG أحادية الألوان إلى اقتران ناجح وغلة جيدة.
يوضح الشكل 3 صور المجهر الخام التمثيلية وسير العمل لتصحيحها من أجل خياطة الصور وتحليلها لاحقا. ملف الإضاءة TIRF المقدمة من الألياف وضع واحد هو عموما أكثر إشراقا في منتصف مجال الرؤية ويعتم حول حواف (الشكل 3A، B). للتعويض عن الإضاءة غير المستوية وتسوية الصور للتحليل الكمي ، تم تحديد ملف الإضاءة بمتوسط آلاف الإطارات الفردية (الشكل 3B). تم إنتاج الصور المسطحة عن طريق طرح ضوضاء الكاميرا من كل من ملفات تعريف الخام والإضاءة ومن ثم تطبيعها من قبل ملف الإضاءة (الشكل 3C). يتضح بوضوح تأثير تسطيح الصورة عندما يتم خياطة الصور لتشكيل صورة كبيرة. تظهر كثافة الصورة في مناطق الخلفية بدون أي مسارات للخلايا أنماطا دورية واضحة تتوافق مع الصور غير المصححة (الشكل 3D). نفس مجال الرؤية مخيط من الصور بالارض تنتج خلفية مسطحة (الشكل 3E). وجود خلفية مسطحة أمر بالغ الأهمية لتفسير تقلبات الكثافة على طول مسار الخلية. وكتجربة أولى، يستخدم ملف تعريف تدفق منحدر مماثل للتشكيل الموضح في الشكل 3F لتحديد نطاق إجهاد القص المناسب للتجربة لضمان كل من المتداول الخلوي المستقر ومسارات الخلايا الفلورية الواضحة. تظهر بصمة التصاق نموذجية أحادية الخلية تحت ملف التدفق هذا في الشكل 3G ، حيث تزداد الكثافة مع زيادة إجهاد القص حتى لا تتمكن الخلية من الاستمرار في الدوران عند إجهاد القص العالي والابتعاد عن السطح ، مما يمثل نهاية مسار واحد.
ويوضح الشكل 4 النتائج المحتملة من النتائج التجريبية دون المستوى الأمثل إلى النتائج التجريبية التمثيلية المثلى. يوضح الشكل 4A نتيجة دون المستوى الأمثل حيث يكون للمسارات الفلورية نسبة منخفضة من الإشارة إلى الضوضاء. ومن المرجح أن يكون سبب ذلك إما انخفاض كثافة سطح المسابير المترافقة بالكامل أو انخفاض معدل التدفق. ويوضح الشكل 4 باء نتيجة أخرى دون المستوى الأمثل حيث تكون مسارات الفلورسنت معبأة بكثافة كبيرة جدا بحيث لا يمكن حل وعزل المسارات الفردية لتحليلها لاحقا. الشكل 4C هو مثال على نتيجة جيدة حيث المسارات الفردية قابلة للحل على مسافة طويلة وواضحة على خلفية. الشكل 4D هو مثال على صورة TIRF محدودة الحيود (النصف الأيسر) بالمقارنة مع نفس المسار الذي صوره DNA-PAINT (النصف الأيمن). ينتج DNA-PAINT في هذا الإعداد دقة NeNA (أقرب تحليل قائم على الجيران) يبلغ 28.8 نانومتر.
الشكل 1: تجربة سير العمل من المقايسة بصمة الالتصاق. (أ) تجميع خلية التدفق وغرفة التدفق. (ب) التخميل السطحي والوظيفية. تتميز كل خطوة حضانة بالمدة ، تليها خطوة غسيل. (ج) تجربة التدحرج الخلوي والتصوير. سوف الخلايا المتداول على السطح فك الحمض النووي حيث تتشكل تفاعلات التصاق، وترك ssDNA على السطح الذي يمثل موقع كل حدث التصاق. تم تسمية السطح مع ssDNA الصور الدائمة للتصوير منطقة واسعة النطاق، مما يتطلب 2 دقيقة تلطيخ قبل الغسيل. لتصوير الحمض النووي-PAINT فائق الدقة، يتم الاحتفاظ بخيط الصور في المخزن المؤقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف التكيف البيولوجي. (أ) امتصاص الأشعة فوق البنفسجية-VIS لمنتج ضبط الأجهزة الحيوية النقي Ni-NTA (الأزرق) وملاءمة المنحنى (الأحمر) لتحديد نسبة التضمين. تم استخدام أطياف الامتصاص من ProtG (أرجواني) ، وmal-ssDNA (أخضر) ، وimidazole (رمادي) كمكونات لإنشاء أفضل ملاءمة (حمراء) الطيف المنتج (الأزرق). تظهر بقايا النوبة على أنها الخط الأسود المتقطع. وهذا يسمح لنا لتحديد تركيز ProtG وssDNA في المنتج ضبط الحيوي المنقى ونسبة الضرس الخاصة بهم. (ب) الصفحة الأصلية للمكونات في إجراء التعديل البيولوجي. يظهر الممر الأول سلم الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي (25 و50 و75 و100 و150 و200 و250 و300 و350 و500 و766 نقطة أساس). صورة هلام هو زائف اللون، مع الحمض النووي تلطيخ GelGreen في الأخضر وكوماسي وصمة عار البروتين الأزرق (معكوس) في أرجواني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: معالجة الصور والنتائج التمثيلية من التصوير الواسع النطاق للمنطقة. (أ) الآلاف من صور TIRF الخام تبليط منطقة واسعة. (ب) لمحة الإضاءة المستمدة من الصور الخام. (ج) تصحيح الصور عن طريق تسطيح ملف الإضاءة. (D) صورة مخيط من البلاط صورة الخام. يمكن النظر إلى ملف الإضاءة غير المتكافئ على أنه أنماط دورية في الصورة. يشير المربعان الأزرق والأحمر إلى مقاطع الصور حيث يتم إسقاط ملفات تعريف متوسط الكثافة (آثار زرقاء وحمراء). تمثل قيم الكثافة المتوسطة (الوحدة التعسفية) قيم الصور ذات 8 بتات (0-255). (ه) نفس المنطقة كما (دال) ولكن مخيط باستخدام صور بالارض. ولا تظهر الإسقاطات أي أنماط دورية واسعة النطاق. (و) ملف الإجهاد القص لاستخدامها في التجارب لتحديد مجموعة من الضغوط القص التي تؤدي إلى المتداول الخلية والغلة المسارات الفلورية. (G) مسار فلوري عينة من خلية واحدة تحت ملف تعريف التدفق الموضح في (F). تنتقل الخلية من اليسار إلى اليمين ، وتزداد كثافة الفلورسينس مع تصاعد إجهاد القص حتى لا تتمكن الخلية من الحفاظ على المتداول والفصل عن السطح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية دون المستوى الأمثل والنتائج المثلى. (أ) مثال على المسارات الفلورية مع تباين غير كاف. (ب) مثال على كثافة المسار الفلوري المفرط. (ج) مثال على كثافة المسار المثلى والتباين. تم الحصول على الصور الثلاثة تحت نفس الحالة ، بالارض ومخيط. تمثل المربعات الحمراء في كل صورة المنطقة التي تم فيها التقاط إسقاطات الكثافة (يمين). (د) مسار فلوري يظهر في التصوير المحدود بالانعراج (النصف الأيسر) والتصوير بالحمض النووي PAINT (النصف الأيمن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مشكلة | السبب المحتمل | حل | |
| شريط الايبوكسي لا قطع بشكل صحيح | طبقة الايبوكسي سميكة جدا | رقيقة طبقة الايبوكسي قدر الإمكان مع شفرة razer | |
| ليزر قوة الحفار والسرعة غير الأمثل | تحسين قوة وسرعة حفار الليزر | ||
| فقاعات عالقة على جانبي غرفة التدفق | مقدمة سائلة أولية غير سليمة | دفع حلول العازلة من خلال قناة بمعدل تدفق عالية لغسل الفقاعات | |
| فقاعات تمر عبر غرفة التدفق | مقدمة سائلة غير سليمة من خلال المدخل والمنفذ | تأكد من وجود قطرة سائلة على أنابيب المدخل لضمان الاتصال من السائل إلى السائل بين طرف ماصة والمدخل | |
| فقاعات من الحقنة دخلت خط التدفق | إمالة مضخة حقنة لضمان محاصرون فقاعات في نهاية المكبس | ||
| السائل لا يستطيع دخول القنوات | مداخل مشدود على ضيق جدا | ضبط لتحسين الختم. يجب أن الأنابيب مدخل مجرد لمس افتتاح القناة عندما مشدود في بشكل صحيح. | |
| تسرب القناة | الايبوكسي لم يشفى تماما | إعادة جعل القنوات، وضمان استخدام 5 دقائق علاج الايبوكسي بسرعة والسماح علاج لمدة 1 ساعة على الأقل | |
| المداخل لا ختم بشكل صحيح | ضبط لتحسين الختم | ||
| الخلايا عالقة | ضعف PEGylation مما يؤدي إلى ربط غير محددة | من الناحية المثالية، طبعة جديدة PEG. بالإضافة إلى ذلك، يمكن محاولة احتضان عوامل حظر إضافية (BSA و Tween-20) وإضافة عوامل حظر لغسل المخزن المؤقت. | |
| تهديف السطح الذي دمرته فقاعات الهواء الكبيرة التي تمر عبر القناة | ضمان عدم وجود فقاعات تذهب من خلال القناة | ||
| مشكلة مع الخلايا | استخدام HL-60 2 أسابيع بعد إعادة تشغيل ثقافة الخلية من المجمدة. تأكيد الخلية المتداول على سطح التحكم مع P-selectin فقط. | ||
| الخلايا لا أو لديها تفاعلات متفرقة مع السطح | P-selectin كثافة منخفضة جدا، نتيجة لضعف التشغيل السطحي و / أو ضعف التكيف البيولوجي | أولا، استخدم ProtG-biotin بدلا من ProtG-TGT كعنصر تحكم لتحديد ما إذا كانت المشكلة ناتجة عن التعديل البيولوجي أو كثافة البيوتين السطحي. بعد ضمان جودة التعديل البيولوجي وكثافة البيوتين السطحي، قم بزيادة تركيز TGT-ProtG وP-selectin-Fc ووقت الحضانة. | |
| الخلايا لفة ولكن لا تنتج المسارات الفلورية | تفاعلات التصاق أضعف من أن تمزق TGT | زيادة معدل التدفق أثناء تجربة المتداول لزيادة قوة التفاعل. نوصي بتكثيف أولي لملف تعريف التدفق (الشكل 3F) للعثور على معدل التدفق الأمثل الذي ينتج مسارات ثابتة للدرفلة والفلورسينس (الشكل 3G) | |
| سطح نوعية سيئة يؤدي إلى مضان الخلفية العالية وعدم كفاية التباين لرؤية المسارات | التحقق من التخدير السطحي | ||
الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يسرد الجدول الأسباب والحلول المحتملة للمشاكل التي تحدث عند إجراء هذا الفحص
ملف الترميز التكميلي 1: نص MATLAB المكتوب خصيصا لتحلل طيف المنتج النهائي استنادا إلى الأطياف الثلاثة التي تم جمعها سابقا (ProtG ، SMCC-strand ، ني-NTA bead elution buffer) لتحديد كفاءة التواز ونسبة ProtG إلى ssDNA. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتيح فحص بصمة الالتصاق تصور أحداث التصاق الجزيئي بين PSGL-1 و P-selectin أثناء التصاق التدحرج الخلوي. يتم بدء هذه العملية عن طريق التقاط P-selectin بوساطة تليها المتداول تحت إجهاد القص السائل. عادة ما تنطوي المشكلات المحتملة أثناء التجربة على مسارات فلورية ضعيفة أو مفقودة حتى عندما تتدحرج الخلايا بشكل جيد. غالبا ما تنتج هذه المشاكل من عناصر تحكم الجودة في الخطوات الهامة في البروتوكول كما هو مذكور في جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 1).
الجزيئات الحيوية والمخازن المؤقتة مطلوبة ليتم تصفيتها وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمنع التلوث لأن إعداد السطح ينطوي على خطوات متعددة. تعد عملية التخميل السطحي عالية الجودة شرطا لتحقيق كثافة وظيفية سطحية مناسبة وتقليل الربط غير المحدد للجزيئات الحيوية. يمكن أن يؤدي الربط غير المحدد للجزيئات الحيوية إلى السطح إلى خلق خلفية مضان عالية ، تتداخل مع التصوير الفلوري أحادي الجزيء وتحليل البيانات الإحصائية. يمكن أن تؤثر عوامل متعددة على التخدير السطحي. التحلل المائي من أمينوسيلاين و PEG-NHS تسفر عن كفاءة أقل بكثير من PEGylation. غسل KOH كافية وتنظيف البيرانا تعزيز hydrophilicity عن طريق توليد مجموعات هيدروكسيل الحرة على سطح الزجاج، وزيادة كثافة المجموعة التفاعلية كيميائيا. الخلايا ستكون عالقة على الأسطح سيئة اللامبالاة. يتم فحص جودة التخميل السطحي من خلال قياس كثافة مضان الخلفية قبل وبعد PEGylation باستخدام الجزيئات الحيوية الفلورية.
الكثافة السطحية للليجاند هو عامل حاسم للخلية المتداول، والتي تسيطر عليها PEG: PEG-biotin نسبة، TGT التهجين، وربط P-selectin. في هذا النظام، و PEG: PEG-biotin نسبة 20:1 كافية لسطح وظيفية مع P-selectin كافية للخلية المتداول. كما يعمل التهجين الفعال ل TGT على تحسين كثافة السطح ونسبة الإشارة إلى الضوضاء للمسارات الفلورية. يتضمن هذا البروتوكول خطوة تجديد من أعلى حبلا-TGT-ProtG لضمان أي حبلا TGT السفلي غير المخمور يكمل قبل التجارب. كما يؤثر اقتران الحمض النووي ببروتج على الكثافة السطحية. تمت إضافة وصلة Sulfo-SMCC إلى الحمض النووي في فائض الضرس 10 أضعاف بحيث تفاعلت جميع الحمض النووي مع الرابط. تم استخدام ProtG مع بقايا السيستين واحد (ProtG-Cys) في C-terminus لتحقيق الحمض النووي 1:1: ProtG نسبة اقتران. لأن ProtG-Cys يمكن أن تشكل ديمرات من خلال سندات ثاني كبريتيد، هناك حاجة إلى علاج TCEP للحد من السندات ثاني كبريتيد قبل ردود الفعل عبر التفاعل سلفهيدريل. يمكن التحقق من صحة الحمض النووي المقترن بالبروتين والتهجين TGT من خلال تحليل PAGE الأصلي ، حيث سيظهر الحمض النووي المزدوج والحمض النووي المزدوج التنقل المتخلف بسبب زيادة الوزن الجزيئي. ويمكن أيضا تقدير كفاءة التجميع بواسطة قياس كثافة الجل (الشكل 2B). تعتبر عمليات PEGylation والتكتل الحيوي الدقيقة حاسمة لإنتاج سطح ثابت. أحيانا، قد تؤثر حالة الخلية على تشكيل الخلية المتداول والمسار. على الرغم من أن التعبير سان جيرمان-1 على كثافة الخلية لم يتم الإبلاغ عنها، كثافة الخلية هو منظم قوي لدورة الخلية والتعبير البروتين خلال مرحلة النمو.
وبالنظر إلى أن سان جيرمان-1 يعمل أيضا كم مستقبلات نقل إشارة وينظم انتشار الخلايا20,21، يتم الحفاظ على ظروف الثقافة مثل كثافة الخلية لمستوى التعبير متسقة وقدرة ملزمة من PSGL-1. مرفق P-selectin-Fc بوساطة ProtG على السطح أمر بالغ الأهمية لتصاق والتدحرج من الخلايا. تعتمد الحركية الملزمة ل P-selectin إلى ProtG على التركيز. انخفاض تركيزات P-selectin يؤدي إلى زيادة الوقت للوصول إلى التوازن. مطلوب ما لا يقل عن 30 دقيقة لربط التشبع لتركيزات أقل من 100 nM22. 10 تم استخدام NM من P-selectin للحد من الربط غير محددة إلى السطح وزيادة وقت الحضانة للتفاعل الكافي مع ProtG. حضانة 1 ساعة هو ما يكفي من الوقت للحث على التصاق الخلية والمتداول في هذا النظام.
وTGT وما يقابلها من العمر تعتمد على القوة هو عامل مهم في نتائج هذا الفحص. أثناء التصاق المتداول، يتم نقل القوة على الحبل من خلال كل من TGT وP-selectin: تفاعل PSGL-1. كل من هذه المكونات الفردية لديها حياة فريدة تعتمد على القوة، واعتمادا على القوة التطبيقية، فإن احتمال تمزق تفضل واحدة على الأخرى. على سبيل المثال، فقد تبين أنه عند استخدام TGT الموضحة في هذه المقالة، في القوات أدناه 13.6 pN، P-selectin: PSGL-1 ينفر في المقام الأول، في حين أعلاه 13.6 pN، TGT ينفر أساسا13. هذا مهم لفهم عند تنفيذ هذا المقايسة لأنه إذا كان الإجهاد القص منخفضة جدا أو الخرز المتداول بطيئة جدا، وأحداث تمزق سيكون في المقام الأول P-selectin: PSGL-1 التفاعل، وسيكون هناك الحد الأدنى أو لا إشارة مضان قابلة للقياس من TGTs. كما ستؤثر عتبة التوتر في TGT على النتائج. إذا تمزق TGT في عالية جدا من قوة، فإن أحداث تمزق يكون في المقام الأول P-selectin: PSGL-1، وسيكون هناك الحد الأدنى من إشارة مضان.
الطريقة الموصوفة هنا تسمح بتحليل قوى التمزق الجزيئي ، وكذلك مواقع أحداث الالتصاق الجزيئي المشاركة في التصاق المتداول. بدلا من الكشف في الوقت الحقيقي عن التصاق، أهم ميزة لهذه الطريقة هو أنه يسمح للتصوير والتحليل بعد التجربة. بمجرد ترك بصمة التصاق على السطح في شكل ssDNA ، لا يزال من الممكن تصوير المسارات بعد 12 ساعة إذا تم الحفاظ على قنوات التدفق في ثلاجة 4 درجات مئوية في غرفة رطوبة داكنة مع حظر المداخل والمنافذ لمنع التجفيف. يعتمد تفسير قراءات الفلورسينس لهذا المقايسة على طريقة التصوير المختارة. من خلال التصوير فائق الدقة، يحقق هذا المقايسة دقة مكانية عالية (<50 نانومتر) تسمح بإجراء تحليل كمي لكثافة TGTs13 الممزقة. تحليل كثافة مستقبلات أو تمزق كثافة TGT سيكون مفيدا في التحقيق في سلوك التصاق المتداول في ظل ظروف مختلفة. وعلى العكس من ذلك، فإن التصوير المحدود الحيود لا يوفر دقة مكانية عالية؛ بل إنه لا يوفر دقة مكانية عالية؛ بل إنه يوفر دقة عالية في الوضوح. ومع ذلك ، فإنه يسمح لمساحة كبيرة من السطح أن تكون صورة لتحليل المسارات الفلورية من الخرز متعددة على مدى مئات من مجالات الرؤية. هذا مفيد حيث يمكن تحليل كثافة الفلورية للمسار للحصول على حبة واحدة على مسافة كبيرة توفر معلومات عن التغيرات في السلوك المتداول مع مرور الوقت. مثل هذا المثال هو تغيير إجهاد القص مع مرور الوقت ومراقبة التغيرات المقابلة في كثافة الفلورسينس. في الآونة الأخيرة ، وقد تبين أنه من خلال نموذج بسيط ، يمكن استخدام كثافة الفلورية من المسارات لتقدير توزيع القوة الجزيئية13. وهناك أيضا إمكانية تطبيق أساليب قياس النسب لتحقيق القياس الكمي للقوة باستخدام هذا المقايسة23.
لأن المتداول الخلية يحدث بسرعة (10s من μm / ثانية) وعلى مسافة طويلة (1000s من ميكرومتر) ، ودراسة التوتر الجزيئي كانت صعبة مع أجهزة استشعار التوتر الجزيئي التقليدية في الوقت الحقيقي. يكسر اختبار بصمة الالتصاق هذا القيد الصعب للسماح بالتصوير بعد الحدث. على الرغم من أن حدث تمزق TGT لا يبلغ بشكل مباشر عن حجم التوتر الذي حدث قبل التمزق ، فقد تم إجراء تطورات واعدة في تحليل مسارات الفلورسينس للسماح بإجراء تحقيق كمي للقوى الجزيئية المشاركة في التصاق المتداول13،23،24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الكندية للابتكار (CFI 35492)، ومجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا منحة ديسكفري (RGPIN-2017-04407)، وصندوق الحدود الجديدة في البحوث (NFRFE-2018-00969)، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (SCH-2020-0559)، وصندوق جامعة كولومبيا البريطانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
