Summary
Denne protokol præsenterer de eksperimentelle procedurer til at udføre vedhæftning fodaftryk assay til billede vedhæftning begivenheder under hurtig celle rullende vedhæftning.
Abstract
Rullende vedhæftning, lettet af selectin-medieret interaktioner, er en meget dynamisk, passiv motilitet i at rekruttere leukocytter til stedet for betændelse. Dette fænomen forekommer i postcapillary venules, hvor blodgennemstrømningen skubber leukocytter i en rullende bevægelse på endotelcellerne. Stabil rulning kræver en delikat balance mellem vedhæftningsbindingsdannelse og deres mekanisk drevne dissociation, så cellen kan forblive fastgjort til overfladen, mens den ruller i strømmens retning. I modsætning til andre vedhæftningsprocesser, der forekommer i relativt statiske miljøer, er rullende vedhæftning meget dynamisk, da de rullende celler bevæger sig over tusindvis af mikron med snesevis af mikron i sekundet. Derfor er konventionelle mekanobiologiske metoder såsom trækkraftmikroskopi uegnede til måling af de enkelte vedhæftning og de tilhørende molekylære kræfter på grund af den korte tidshorisont og høj følsomhed, der kræves. Her beskriver vi vores seneste implementering af vedhæftning fodaftryk assay til billede P-selectin: PSGL-1 interaktioner i rullende vedhæftning på molekylært niveau. Denne metode udnytter irreversible DNA-baserede spændingsmåler tøjre til at producere en permanent historie af molekylære vedhæftning begivenheder i form af fluorescens spor. Disse spor kan afbildes på to måder: (1) syning sammen tusindvis af diffraction-begrænsede billeder til at producere et stort synsfelt, der muliggør udvinding af vedhæftning fodaftryk af hver rullende celle over tusindvis af mikron i længden, (2) udfører DNA-PAINT at rekonstruere super-opløsning billeder af fluorescens spor inden for et lille synsfelt. I denne undersøgelse, vedhæftning fodaftryk assay blev brugt til at studere HL-60 celler rullende på forskellige forskydning understreger. Ved at gøre det var vi i stand til at forestille os den rumlige fordeling af P-selectin: PSGL-1 interaktion og få indsigt i deres molekylære kræfter gennem fluorescensintensitet. Denne metode danner således grundlag for den kvantitative undersøgelse af de forskellige celleoverfladeinteraktioner, der er involveret i rullende vedhæftning på molekylært niveau.
Introduction
Den rullende vedhæftning kaskade beskriver, hvordan cirkulerende celler binde til og rulle langs blodkarvæggen1. Passiv rullende er primært medieret af selectins, en stor klasse af cellulære vedhæftning molekyler (CAMs)1. Under forskydningen af blod danner leukocytter, der udtrykker P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), meget forbigående bindinger med P-selectin, som kan udtrykkes på overfladen af betændte endotelceller. Denne proces er afgørende for leukocytter at migrere til et sted for inflammation2. Derudover er PSGL-1 også en mechanosensitiv receptor, der er i stand til at udløse den efterfølgende faste vedhæftningsfase af den rullende vedhæftningskaskade ved dets engagement med P-selectin3.
Genetiske mutationer, der påvirker CAM-funktionen, kan alvorligt påvirke immunsystemet, såsom i den sjældne sygdom af leukocyt vedhæsionsmangel (LAD), hvor funktionsfejl i vedhæftningsmolekyler, der formidler rullende, fører til alvorligt immunkompromitterede individer4,5,6. Derudover har cirkulerende tumorceller vist sig at migrere efter en lignende rullende proces, hvilket fører til metastaser7,8. Men fordi cellerullende er hurtig og dynamisk, konventionelle eksperimentelle mekanobiologi metoder er uegnede til at studere molekylære interaktioner under celle rullende. Mens enkeltcellede og enkeltmolekyle manipulationsmetoder som atomprøvesprængningsmikroskopi og optisk pincet var i stand til at studere molekylære interaktioner som P-selectins kraftafhængige interaktion med PSGL-1 på enkeltmolekyleniveau9, er de uegnede til at undersøge levende vedhæftning hændelser under cellerullende. Derudover kan interaktionen karakteriseret in vitro ikke direkte besvare spørgsmålet om molekylær vedhæhæftning in vivo. Hvilket molekylært spændingsområde er f.eks. biologisk relevant, når celler fungerer i deres oprindelige miljø? Beregningsmetoder såsom selvklæbende dynamik simulering10 eller simpel steady-state model11 har fanget visse molekylære detaljer, og hvordan de påvirker den rullende adfærd, men er meget afhængige af nøjagtigheden af modellering parametre og antagelser. Andre teknikker såsom trækkraftmikroskopi kan detektere kræfter under cellemigration, men giver ikke tilstrækkelig rumlig opløsning eller kvantitative oplysninger om molekylær spænding. Ingen af disse teknikker kan give direkte eksperimentelle observationer af den tidsmæssige dynamik, rumlige fordeling og størrelse heterogenitet af molekylære kræfter, som direkte vedrører cellefunktion og adfærd i deres oprindelige miljø.
Derfor er implementering af en molekylær kraftsensor, der er i stand til nøjagtigt at måle udvalgteinmedierede interaktioner, afgørende for at forbedre vores forståelse af rullende vedhæftning. Her beskriver vi protokollen for vedhæftning fodaftryk assay12 hvor PSGL-1 belagt perler er rullet på en overflade præsentere p-selectin funktionaliseret spænding gauge tethers (TGTs)13. Disse TGT'er er irreversible DNA-baserede kraftsensorer, der resulterer i en permanent historie med brudhændelser i form af fluorescensudlæsning. Dette opnås gennem brud på TGT (dsDNA) og derefter efterfølgende mærkning af den bristede TGT (ssDNA) med en fluorescerende mærket komplementær streng. En stor fordel ved dette system er dets kompatibilitet med både diffraktionsbeskret og superopløsningsbilleddannelse. Den fluorescerende mærkede komplementære streng kan enten være permanent bundet (>12 bp) for diffraktionsbegrænset billeddannelse eller forbigående bundet (7-9 bp) til billeddannelse i superopløsning gennem DNA PAINT. Dette er et ideelt system til at studere rullende vedhæftning som TGTs er bristet under aktiv rullende, men fluorescens udlæsning er analyseret post-rullende. De to billeddannelsesmetoder giver også brugeren mere frihed til at undersøge rullende vedhæftning. Typisk, diffraktion-begrænset billeddannelse er nyttig til udvinding molekylær brudkraft gennem fluorescens intensitet13, mens super-opløsning billeddannelse giver mulighed for kvantitativ analyse af receptortæthed. Med evnen til at undersøge disse egenskaber ved rullende vedhæftning giver denne tilgang en lovende platform for forståelse af kraftreguleringsmekanismen på den molekylære vedhæftning af rullende celler under forskydningsstrømning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oligonucleotid mærkning og hybridisering
- Reduktion af protein G disulfidbindinger
- 10 mg protein G (ProtG) opløses i 1 mL ultrapurt vand.
BEMÆRK: Protein G her er modificeret med en enkelt cystein rest på C-endestation og en N-terminus poly-histidin tag. - Bufferudveksling ≥20 μL protG (10 mg/mL) i 1x PBS (pH 7.2) med en P6-kolonne.
- Mål proteinkoncentrationen efter bufferudveksling.
BEMÆRK: Typisk koncentration på 7-8 mg/mL. - Der fremstilles 120 mM Tris(2-carboxyethyl)fosphin (TCEP) ved at opløse 3 mg TCEP i 90 μL på 1x PBS (pH 7.2) efterfulgt af 10 μL på 0,5 M EDTA.
BEMÆRK: TCEP skal være frisklavet. - Der tilsættes 4 μL på 120 mM TCEP (480 nmol) til 20 μL protG (4-5 nmol).
BEMÆRK: Sigt efter et molarforhold på ~ 100: 1 TCEP til protein. - Lad reaktionen fortsætte i 30 min ved stuetemperatur (RT).
- Fjern overskydende TCEP fra den reducerede ProtG med en P6-kolonne (buffer ombyttet i 1x PBS, pH 7.2).
- Mål koncentrationen af den reducerede ProtG med et UV/Vis spektrofotometer og gem spektret.
BEMÆRK: Typisk koncentration på 3,5-4,5 mg/mL.
- 10 mg protein G (ProtG) opløses i 1 mL ultrapurt vand.
- Amine-mærket ssDNA reaktion med Sulfo-SMCC
- Opløs aminmærket ssDNA (amine-ssDNA) i nucleasefrit vand i en koncentration på 1 mM. Kontroller strengkoncentrationen med et UV/Vis-spektrofotometer.
- Forbered 11,5 mM sulfo-SMCC (en hetero-bifunktionel crosslinker med sulfo-NHS ester og maleimid) opløsning frisk ved at opløse 2 mg sulfo-SMCC i 400 μL ultrapure vand og vortex til at blande.
- Der tilsættes 6 μL af 1 mM amine-ssDNA (6 nmol) til 5,2 μL på 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) og 88,8 μL på 1x PBS (pH 7,2). Vortex i 5 s efterfulgt af centrifugering ved 8600 x g i 3 min.
- Lad reaktionen fortsætte i 30 min på RT.
- Overskydende sulfo-SMCC fra SMCC konjugeret amin-ssDNA (mal-ssDNA) med en P6 kolonne (buffer udvekslet i 1x PBS, pH 7,2).
- Mål koncentrationen af mal-ssDNA med et UV/Vis spektrofotometer og gem spektret.
BEMÆRK: Typisk koncentration på 35-45 μM.
- ProtG-ssDNA bøjning
- Der tilsættes 21 μL på 4,5 mg/mL reduceret ProtG (3 nmol) til mal-ssDNA (~4-5 nmol).
BEMÆRK: Volumener og koncentrationer her er typiske værdier. Juster i henhold til individuel eksperimentel måling. Sørg altid for en overskydende mængde mal-ssDNA over ProtG i et forhold på ~ 1,5: 1. - Vortex i 5 s og lad reaktionen fortsætte i 3 timer på RT.
- Der tilsættes 21 μL på 4,5 mg/mL reduceret ProtG (3 nmol) til mal-ssDNA (~4-5 nmol).
- ProtG-ssDNA rensning og karakterisering
- Rense den konjugerede ProtG-ssDNA gennem hans-tag isolation med magnetisk nikkel-nitrilotriacetic syre (Ni-NTA) perler.
- Overskydende imidazole (Ni-NTA elution buffer) fra produktet med en P6 kolonne (buffer udvekslet i 1x PBS, pH 7.2).
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for kvantificering af bøjningen, da imidazole har en betydelig absorption ved 280 nm. - Brug et UV/Vis-spektrofotometer til at registrere spektret af produktet ProtG-ssDNA samt Ni-NTA elutionsbufferen (1x).
BEMÆRK: Typisk ProtG-ssDNA-absorbans ved henholdsvis 260 nm og 280 nm er henholdsvis 0,8 og 0,6. - For at bestemme bøjningseffektiviteten og forholdet mellem ProtG og ssDNA skal du bruge det specialskrevne MATLAB-script (Supplerende Coding File 1) til at nedbryde det endelige produktspektrum baseret på de tre spektre, der tidligere er indsamlet (ProtG, SMCC-streng, Ni-NTA-bead elutionsbuffer).
BEMÆRK: Kort sagt fungerer koden som beskrevet i trin 1.4.5-1.4.8. Den typiske koncentration er 4 μM ProtG-ssDNA med ProtG og ssDNA ved et ~1:1 molarforhold (figur 2A). - Input ProtG, SMCC-streng, Ni-NTA perle elution buffer, og ProtG-ssDNA UV / Vis spektre i MATLAB script
- Udfør en flerdimensional ubegrænset minimering for at rekonstruere ProtG-ssDNA-spektret fra kildespektret (ProtG, SMCC-streng og Ni-NTA perle elutionsbufferspektre)
BEMÆRK: Minimeringsfunktionen udsender tre transformationsfaktorer, en for hvert kildespektre. - Rekonstruer ProtG-ssDNA-spektret ved at multiplicere spektret med deres tilsvarende faktor og kombinere det transformerede kildespektre.
- Multiplicer den oprindelige koncentration af ProtG- og SMCC-strengen med de tilsvarende transformationsfaktorer for at bestemme koncentrationerne af SMCC-streng og ProtG i ProtG-ssDNA-produktet.
- (VALGFRIT) Kør oprindelig SIDE i henhold til figur 2B for at sikre, at hver komponent og trin fungerer som forventet.
- TGT hybridisering
- Hybridisere ProtG-ssDNA (øverste streng) med biotinyleret bundstreng ved et molarforhold på 1,2:1 med koncentrationer på henholdsvis 240 nM og 200 nM i T50M5 buffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) for at hybridisere den fulde TGT-konstruktion. Lad hybridisere på RT ≥1 time.
2. Overflade PEGylation
- Overfladerensning
- Rengør en Erlenmeyer kolbe og to farvning krukker for hver 8 coverslips. Fyld hver beholder med 1 M KOH opløsning og soniker i 1 time på RT. Vask hver beholder grundigt med ultrapurt vand og tør med N2 eller i en ovn.
BEMÆRK: Fyld KOH til toppen for at røre låget, så de også rengøres. - Skyl hver dæksel med ultrapure vand grundigt og læg dem i en af de rensede farvningsglas.
BEMÆRK: Sørg for, at de ikke sidder fast på hinanden eller til væggen i farvningsglassene. - I en røghætte, frisklave en piranha opløsning ved at tilføje 30 mL hydrogenperoxid (30%) til 90 mL koncentreret (95%-98%) svovlsyre i en 250 mL bægerglas.
FORSIGTIG: Koncentreret svovlsyre er stærkt ætsende. Tilsæt brintoverilte meget langsomt til svovlsyren og hvirvle forsigtigt for at blande. - Dyk dækslerne helt ned i farvningskrukken med piranhaopløsningen. Lad coverlips i piranha i 30 minutter i røghætten.
FORSIGTIG: Køl piranhaopløsningen ned til højst 80 °C, før den hældes, for at undgå revner i farvningskrukken. - Kassér piranhaopløsningen i et 1000 mL bægerglas, og neutraliseres med 1 M KOH fra glasrengøring.
- (VALGFRIT) Piranha-rengøring (trin 2.1.3-2.1.5) gentages med en frisk piranhaopløsning.
- Skyl dækslerne med rigelige mængder ultrapurt vand for at fjerne al resterende piranhaopløsning. Ryst forsigtigt farvningskrukken under hver stigning for at lette fjernelsen (10 skylninger anbefales).
- Skyl dækslerne med methanol 3 gange for at fjerne vand fra dækslernes overflade og hold dækslerne nedsænket i methanol.
- Rengør en Erlenmeyer kolbe og to farvning krukker for hver 8 coverslips. Fyld hver beholder med 1 M KOH opløsning og soniker i 1 time på RT. Vask hver beholder grundigt med ultrapurt vand og tør med N2 eller i en ovn.
- Overfladesilanisering
- Forbered en 1% aminosilaneopløsning ved grundigt at blande 94 ml methanol, 1 ml aminosyre og 5 ml istidseddikesyre i den rensede og tørrede Erlenmeyer kolbe. Hæld i den anden rensede og tørrede farvning krukke14.
- Overfør dækslerne nedsænket under methanolopløsningen til farvningskrukken, der indeholder 1% aminosilaneopløsning, og hold krukken dækket.
BEMÆRK: Lad ikke dækslerne tørre, mens de overføres til aminosyren for at begrænse eksponeringen for glasoverfladen for luft. - Inkuberes farvningskrukken, der indeholder coverlips i aminosilane, i 1 time ved 70 °C i en ovn15.
- Kassér forsigtigt aminosilaneopløsningen i en separat affaldsbeholder og skyl dækslerne i farvningskrukken med methanol 5 gange for at fjerne aminosilaneopløsningen.
- Skyl coverlips i farvningskrukken med ultrapurt vand 5 gange og tør dem med N2.
- Bag de tørrede dæksler i farvningsglasset i en ovn ved 110 °C i 20 min. Lad coverlips afkøles til RT, og placer dem derefter på PEGylation rack.
BEMÆRK: Dæk farvningskrukken med låg under bagningen for at minimere bestemte og kemiske aflejring på overfladen15.
- FORBEREDELSE AF PEG-løsning
- Optø PEG (Polyethylenglycol) og PEG-biotin til RT i ca. 30 min.
BEMÆRK: Dette trin minimerer fugtkondensering, der kan forringe NHS-esteren på PEG. - Lav PEG buffer ved at tilføje 84 mg natriumbicarbonat til 10 mL ultrapurt vand. Denne formulering skal give en buffer ved pH 8.4.
- For 8 coverslips, hver med en PEGylated side med 20:1 PEG:PEG-biotin: mål 100 mg PEG og 5 mg PEG-biotin til at tilføje til 400 μL PEG buffer. Vortex opløsningen til 30 s og centrifuge i 1 min ved max hastighed (≥18000 x g).
BEMÆRK: Dette trin er tidsfølsomt, da SVA NHS-ester hydrolyse starter med det samme og har en halveringstid på 34 min ved pH 8.0, med en kortere halveringstid ved pH 8.4.
- Optø PEG (Polyethylenglycol) og PEG-biotin til RT i ca. 30 min.
- PEG inkubation og coverlip opbevaring
- Sæt fugtighedskammeret op, og placer dækslerne indeni.
- Der tilsættes 90 μL PEG-opløsning til en coverlip i fugtighedskammeret, og placer endnu et coverlip oven på PEG-opløsningen ved hjælp af coverslip-holdet pincet for jævnt at sprede PEG-opløsningen.
- Sørg for, at der ikke er bobler i opløsningen faldt på dæksleren. Lavere den ene ende af den anden coverslip på den første coverslip og langsomt slippe den anden ende, så der ikke er bobler klemt inde mellem coverlips.
BEMÆRK: Bobler vil medføre, at visse områder er dårligt PEGylated. - Gentag indtil alle coverslips har PEG (dvs. 8 coverslips = 4 PEG sandwich). Inkuber PEG-opløsningerne natten over (~ 12 timer) på RT i et fugtighedskammer i mørke16.
- Adskil coverlip par og læg dem i en farvning krukke. Bemærk de PEGylated sider.
- Skyl dækslerne grundigt med ultrapurt vand og tør med N2.
BEMÆRK: Hold dækslerne med pincet og blæs N2 over overfladen mod pincet for at forhindre forurenende stoffer i at tørre på overfladen. - Markér den ikke-PEGylated side med en prik i et hjørne ved hjælp af en permanent markør eller en diamantpen.
- Placer 2 PEGylated coverslips i mailer rør med PEGylated sider vender hinanden for at hjælpe med at identificere PEGylated side før brug.
- Støvsug røret i 5 min og opfyldning med N2. Forsegl røret med parafilm.
- De PEGylated coverslips ved -20 °C opbevares i de forseglede postrør i op til 6 måneder.
BEMÆRK: Varm opbevaringsrørene til RT før spånmontering. Kondens på dækslerne under forseglingen vil forårsage lækage.
3. Forberedelse af flowkammer
- Chip samling
- Spred en lille mængde epoxy på begge sider af dobbeltsidet tape med et barberblad.
BEMÆRK: For meget epoxy kan sprede sig til kanalen under monteringen. - Laser-cut epoxy belagt tape til at skabe 4 kanaler. Opret flowchippen ved at sandwiche epoxybåndet mellem en 4-hullers slide og PEG coverslip (Figur 1A).
- Brug en pipettespids påfør forsigtigt tryk langs kanalernes længde for at skabe en god forsegling. Hærde epoxyen i ≥1 time.
BEMÆRK: Forskyde ikke glasset for at undgå at glide mod epoxy.
- Spred en lille mængde epoxy på begge sider af dobbeltsidet tape med et barberblad.
- Afdelingssamling
- Juster chippen, så åbningen af hver kanal er placeret i midten af adapteren (Figur 1A). Placer to gennemsigtige akryl afstandslænder på toppen af chippen, anvende fast tryk i midten af blokken, og skrue i to 4-40 skruer i enderne af hver afstandslæng.
BEMÆRK: Skru ikke skruen eller tryk for hårdt på afstandsmændene, da chippen kan revne. - På den anden side af beslaget skrues indløbene ind i gevindhullerne. Overvåg tætningsbetingelsen gennem den gennemsigtige akrylblok.
- Når slangen kommer i kontakt med chippens åbning, forsegles forbindelsen ved forsigtigt at vride slangen med uret.
BEMÆRK: Overspændte indløb kan forårsage flowblokering, mens løse kontakter vil forårsage lækage.
- Juster chippen, så åbningen af hver kanal er placeret i midten af adapteren (Figur 1A). Placer to gennemsigtige akryl afstandslænder på toppen af chippen, anvende fast tryk i midten af blokken, og skrue i to 4-40 skruer i enderne af hver afstandslæng.
4. Overfladeforberedelse
BEMÆRK: Se figur 1B for den samlede arbejdsgang.
- Blokering af agenter for at forhindre uspecifik binding
- Brug en pipette til at strømme 200 μL vaskebuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 og 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) ind i kammeret for at kontrollere for lækage. Hvis der dannes bobler i kanalen, skal du aggressivt skubbe yderligere 200 μL for at fjerne boblerne.
BEMÆRK: Store luftbobler, der ikke fjernes ved dette trin, kan løsne sig og ødelægge overfladefunktionalisering senere. - Der tilsættes 40 μL BSA (1% w/v) til flowkammeret for at forhindre uspecifik binding og inkubation i 10 min.
- Sørg for at tilføje nok volumen i hver inkubationsperiode til at fylde flowkamrene og danne dråber ved indløb og afsætningsmuligheder. Juster inkubationsmængderne i overensstemmelse hermed og udfør alle inkubationer i et fugtighedskammer.
- Der tilsættes 40 μL mellem 20 (5% v/v) til flowkammeret. Inkuber i 10 min for yderligere at reducere uspecifik binding.
- (VALGFRIT) Kontroller overfladen for tilstrækkelig passivation ved at flyde polystyren perler gennem kanalen. Tilsæt 40 μL protG coated polystyren perler (0,01% w / v) og billede ved hjælp af en darkfield mikroskop med 10x mål. Hvis perler ikke klæber til overfladen, fortsæt til næste trin.
- Vask kanalen med 200 μL vaskebuffer for at fjerne alle passiveringsmidler.
- Brug en pipette til at strømme 200 μL vaskebuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 og 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) ind i kammeret for at kontrollere for lækage. Hvis der dannes bobler i kanalen, skal du aggressivt skubbe yderligere 200 μL for at fjerne boblerne.
- Funktionalisering af kammeroverflader
- Der tilsættes 40 μL streptavidin (100 μg/mL) til flowkammeret og inkuberes i 20 min. Vask derefter med 200 μL vaskebuffer.
- Der tilsættes 40 μL hybridiseret ProtG-TGT (100 nM) til flowkammeret og inkuberes i 20 min. Vask derefter med 200 μL vaskebuffer.
- Der tilsættes 40 μL ProtG-TGT top streng (100 nM) i 20 minutter for at fuldføre enhver uhybridiseret TGT bundstreng på overfladen. Vask med 200 μL vaskebuffer.
- Der tilsættes 40 μL P-selectin-Fc (10 μg/mL) til flowkammeret og inkuberes i 60 min. Vask derefter med 200 μL vaskebuffer.
BEMÆRK: Inkubationsvarigheden er kritisk.
5. Eksperiment og billeddannelse
- Opsætning af Flow-system
- Fyld en 5 mL glassprøjte med rullebufferen (HBSS med 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Sørg for, at der ikke er luftbobler i sprøjten ved at trykke på siderne af sprøjten for at løsne boblerne og skubbe dem ud, når de flyder mod spidsen.
- Sæt en steril nål (26 G, 5/8 Tommer Længde) i en ~200 mm polyethylenslange (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) og tilslut nålen til glassprøjten.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er fanget luft nogen steder i nålestikket. - Fastgør sprøjten på sprøjtepumpen, og vip sprøjtepumpen, så stemplet er hævet for at forhindre luftbobler i at komme ind i kanalen. Sæt enden af røret ind i flowkammerets indløb.
BEMÆRK: Sørg for væske til væskekontakt, når forbindelsen skal til ved at sætte dråber på indløbene og have dråber for enden af sprøjteslangen. Sørg for, at der ikke kommer luftbobler ind i kanalen ved at lade en lille dråbe dannes for enden af sprøjteslangen, før den sættes ind i indløbet. - Sæt den ene ende af en anden 200 mm af polyethylens slanger i stikkontakten, og den anden ende nedsænket i et affaldsbæger.
- Opsætning af rullende celler
- Dyrk HL-60-celler i 25 cm2 ventilerede kulturflasker i IMDM-medier suppleret med 20% fosterkvægsserum og 1% antibiotika ved 37 °C med 5% CO2. Vedligehold celletæthed mellem 1 x 105-2 × 106 celler/mL.
- (VALGFRIT) Skelne HL-60 celler i en komplet IMDM medium, der indeholder 1,25% DMSO ved en indledende tæthed af 2 x 105 celler / mL. Inkuber celler til at være mest aktive i 5-6 dage.
- Tag en prøve (1-2 mL) fra celleaffjedringen og centrifugen (200 x g, 3 min) for at pille cellerne.
- Fjern mediet, og brug forsigtigt cellerne igen i 500 μL af den rullende buffer. Gentag vasketrinnet to gange for at fjerne celleaffald.
- Mål celletætheden med et hæmocytometer. Brug cellepillerne igen med rullebuffer til en densitet på 2 x 105 celler/mL.
- Afbryd slangen forsigtigt fra indløb/udløb og pipetten 40 μL af celleaffjedringen ind i flowkammeret. Tilslut slangen igen som beskrevet tidligere, sørg for, at der ikke indføres bobler i flowkanalen.
- Begynd cellerullende eksperiment ved at starte sprøjtepumpen med de ønskede strømningshastigheder.
BEMÆRK: Intensiteten af fluorescerende spor afhænger af forskydningsstress, og lavere cellehastighedsforskydnings-/cellehastighed vil generelt producere lysdæmperspor (Figur 4A). Undgå høj celletæthed på overfladen eller for lang rullende varighed for at sikre adskillelige encellespor (Figur 4B, C). - Brug et darkfield mikroskop med et 10x mål for at sikre cellerullende observeres.
- Når forsøget er afsluttet, skal du fjerne cellerne fra kanalen ved at tilføre den rullende buffer ved 100 mL/h, indtil overfladen er cellefri.
- Billeddannelse lokale spor af "DNA-baseret pointakkumulering for billeddannelse i nanoskala topografi" (DNA-PAINT)
- Tilføj 40 μL DNA-PAINT-billedstreng (500 pM) i DNA-PAINT-buffer (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) til kanalen.
- Udfør Total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi ved hjælp af en 100x olie-nedsænkning TIRF objektive linse. Indshent 40000+ rammer med 25 ms eksponeringstid pr. ramme ved en em-gevinst (Electron-multiplying) på 300 ved hjælp af et EMCCD-kamera (Electron-multiplying Charge-Coupled Device).
- Brug Picasso-softwarepakken17 til at lokalisere og gengive billederne i superopløsning (Figur 4D) efter trin 5.3.4-5.3.5.
- Indlæs DNA-PAINT-filmen i lokalisere programmet for at bestemme lokaliseringen af hvert fluorophore i hver ramme.
BEMÆRK: Optimer boksens sidelængde og min. Net Gradient parametre, indtil kun fluorophores spores nøjagtigt. Min. Net Gradient parameter kan ofte gå over 100000 for at opnå optimal sporing. Fit indstilling: MLE, integreret Gaussian metode giver det bedste resultat. Endelig, hvis filmen er for lang, opdele den i stakke af 10000 billeder, for at forhåndsvisningssporingen i Lokaliserer for at fungere korrekt, før de kombineres i en endelig HDF5-fil. - Derefter skal du indlæse den resulterende hdf5-fil i Render-programmet for at udføre driftkorrektion og gengivelse.
BEMÆRK: Udfør flere drift korrektion via Undrift af RCC at forbedre det endelige resultat.
- Billedbehandling lange spor ved permanent mærkning
- Tilsæt den permanente imager streng og inkubere for 120 s i T50M5 buffer. Vask kanalen ved at tilføre 200 μL vaskebuffer.
- Optag et billede med excitation laser off for at få baggrundskamera støj. Billede et stort område i et gitter mønster af TIRF mikroskopi.
BEMÆRK: Frame-over-frame overlapning af ≥10% anbefales til efterfølgende syninger. - Programmer mikroskopet til at scanne over området 400 x 50 billeder (20000 billeder i alt). Ved hjælp af FIJI-programmet skal du opdele rådata i individuelle tiff-filer, der hver indeholder maksimalt 10000 billeder.
- Alle billeder med en flader alle billeder ved hjælp af belysningsprofilen (figur 3A-C) efter trin 5.4.5-5.4.7.
- Træk baggrundskamerastøjen fra hver ramme. Opnå den gennemsnitlige stakprojektion (belysningsprofil) for hver baggrundstrukket ramme.
- Normaliser belysningsprofilen med den maksimale værdi. Del hver baggrundstrukket ramme med den normaliserede belysningsprofil.
- Skaler de korrigerede rammer til det relevante område for den tilsvarende bitdybde.
- Brug MIST18 til at sy billederne (Figur 3D, E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen ovenfor beskriver den eksperimentelle procedure for vedhæftning fodaftryk assay. Den generelle eksperimentarbejdsgang er illustreret i figur 1, fra flowkammersamlingen (figur 1A) til overfladefunktionalisering (figur 1B) og eksperiment- og billedtrin (figur 1C).
Figur 2 er et repræsentativt resultat for ProtG-ssDNA biokonjugationskarakterisering. UV/Vis-spektret af tre komponenter i slutproduktet, nemlig ProtG, mal-ssDNA og imidazole elution buffer, blev indsamlet forud for den endelige bøjning (figur 2A), der hver svarede til en kendt koncentration. Disse spektre danner det ortogonale grundlag for montering på biokonjugationsproduktspektret, hvor de tre ukendte parametre er deres koncentrationer. En brugerdefineret funktion i MATLAB blev brugt til at bestemme koncentrationerne. Resultaterne viser et næsten 1:1-forhold mellem ProtG og ssDNA (Figur 2A). Dette er som forventet, fordi ssDNA kun har en amine modifikation, og ProtG har en enkelt cystein manipuleret på sin C-endestation. Denne tilgang er mere fordelagtig for den tidligere rapporterede tilgang19 ved hjælp af et enkelt thiol modificeret DNA til at målrette de mange primære aminer på ProtG, hvor bøjningsforholdet ikke let kan opretholdes.
Derudover blev native PAGE brugt til at bekræfte biokonjugationen (figur 2B). DNA er plettet af GelGreen og proteiner af Coomassie blå, henholdsvis. Da GelGreen pletter dsDNA stærkere end ssDNA, forventes det, at eventuelle ssDNA-bånd er svagere end den lige molarkoncentration af dsDNA-bånd (vognbaner 3, 4). Fordi bestanden ProtG indeholder en C-terminal cystein rest, en brøkdel af proteinerne danner dimers gennem en disulfid obligation, som det ses i bane 5 (Figur 2B). Den reducerede ProtG viser derimod et enkelt bånd (bane 6). Når du bruger bestanden ProtG i DNA-bøjningen direkte, reagerer den disulfiddæmiserede ProtG ikke på DNA'et og viser som et bånd uden GelGreen-farvning (vognbaner 7, 8). ProtG-dimerbåndet forsvinder i bøjningsproduktet ved hjælp af reduceret ProtG (vognbane 9, 10). Da der anvendes et overskud af mal-ssDNA til ProtG (1.5:1) under bøjningen, er TGT kun bånd synlige i det endelige bøjningsprodukt (vognbane 8, 10). De lyse GelGreen bands, der falder sammen med det monomeriske ProtG-bånd, indikerer vellykket bøjning og godt udbytte.
Figur 3 illustrerer repræsentative rå mikroskopibilleder og arbejdsgangen for at rette dem til efterfølgende billedsting og analyse. TIRF belysning profil indført fra en enkelt-mode fiber er generelt lysere i midten af synsfeltet og lysdæmper omkring kanterne (Figur 3A,B). For at kompensere for den ujævne belysning og flade billederne til kvantitativ analyse blev belysningsprofilen bestemt ved i gennemsnit tusindvis af individuelle rammer (figur 3B). Flade billeder blev produceret ved at trække kamerastøj fra både rå og belysning profiler og derefter normalisere ved belysning profil (Figur 3C). Effekten af billedet udfladning er tydeligt illustreret, når billederne er syet til at danne et stort billede. Billedintensiteten i baggrundsområderne uden cellespor viser klare periodiske mønstre svarende til de ikke-korrigerede billeder (Figur 3D). Det samme synsfelt syet fra flade billeder giver en flad baggrund (Figur 3E). At have en flad baggrund er afgørende for fortolkningen af intensitetsudsvingene langs et cellespor. Som et første eksperiment bruges en ramp-up flow profil svarende til den, der er illustreret i Figur 3F, til at bestemme det interval af forskydningsstress, der er egnet til eksperimentet, hvilket sikrer både stabile cellerullende og klare fluorescerende cellespor. Et typisk enkeltcellet vedhæftningsfodaftryk under denne flowprofil er vist i figur 3G, hvor intensiteten øges, efterhånden som forskydningsstresset øges, indtil cellen ikke længere kan opretholde rullende ved høj forskydningsstress og løsnes fra overfladen, hvilket markerer enden af et enkelt spor.
Figur 4 illustrerer potentielle resultater fra suboptimale til optimale repræsentative eksperimentelle resultater. Figur 4A illustrerer et suboptimalt resultat, hvor lysstofrørene har et lavt signal-til-støj-forhold. Dette skyldes sandsynligvis enten en lav overfladetæthed af de fuldt konjugerede sonder eller en lav strømningshastighed. Figur 4B illustrerer et andet suboptimalt resultat, hvor de fluorescerende spor er for tætpakkede til at løse og isolere individuelle spor til efterfølgende analyse. Figur 4C er et eksempel på et godt resultat, hvor individuelle spor kan løses over en lang afstand og klare mod baggrunden. Figur 4D er et eksempel på det diffraktionsbefængte TIRF-billede (venstre halvdel) sammenlignet med det samme spor, der er afbildet af DNA-PAINT (højre halvdel). DNA-PAINT i denne opsætning producerer en NeNA (nærmeste nabo-baseret analyse) præcision på 28,8 nm.
Figur 1: Eksperiment arbejdsgang af vedhæftning fodaftryk assay. A) Samling af flowcellen og flowkammeret. (B) Overflade passivering og funktionalisering. Hvert inkubationstrin er markeret med varigheden efterfulgt af et vasketrin. (C) Cell rullende eksperiment og billeddannelse. Celler, der ruller på overfladen, vil lyne DNA'et op, hvor vedhæftning af interaktioner dannes, hvilket efterlader ssDNA på overfladen, der markerer placeringen af hver vedhæftning begivenhed. Overfladen er mærket med den permanente imager ssDNA for omfattende område billeddannelse, der kræver 2 min farvning før vask. Ved DNA-PAINT-billeddannelse i superopløsning opbevares billedstrengen i bufferen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Biodommen karakterisering. A) UV-VIS-absorbansen af Ni-NTA-det rensede biokonjugationsprodukt (blå) og kurven passer (rød) til at bestemme bøjningsforholdet. Absorptionsspektre af ProtG (magenta), mal-ssDNA (grøn) og imidazole (grå) blev brugt som komponenter til at skabe den bedste pasform (rød) til produktspektret (blå). Resterne af pasformen vises som den sorte stiplede linje. Dette giver os mulighed for at bestemme koncentrationen af ProtG og ssDNA i det rensede biokonjugationsprodukt og deres molarforhold. (B) Native PAGE af komponenter i biokonjugationsproceduren. Den første bane viser en lav molekylvægt DNA stige (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). Gelbilledet er falsk farvet, med DNA-farvning GelGreen i grøn og Coomassie blå protein plet (inversed) i magenta. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Billedbehandling og repræsentative resultater fra omfattende områdebilleddannelse. (A) Tusindvis af rå TIRF billeder flisebelagt et omfattende område. (B) Belysningsprofil afledt af de rå billeder. (C) Korrigerede billeder ved at flade belysningsprofilen ud. (D) Syet billede fra rå billedfliser. Den ujævne belysningsprofil kan ses som periodiske mønstre i billedet. De blå og røde bokse angiver de billedsektioner, hvor middelintensitetsprofilerne projiceres (blå og røde spor). Middelintensitetsværdierne (vilkårlig enhed) repræsenterer værdierne for 8-bit billeder (0-255). (E) Samme område som (D), men syet ved hjælp af flade billeder. Fremskrivningerne viser ingen store periodiske mønstre. (F) Den forskydningsstressprofil, der skal bruges i forsøgene til at bestemme rækkevidden af forskydningsspændinger, der resulterer i cellerullende og giver fluorescensspor. (G) Et prøvelysstofrør fra en enkelt celle under den flowprofil, der er illustreret i (F). Cellen bevæger sig fra venstre mod højre, fluorescensintensiteten øges, da forskydningsstressen ramper op, indtil cellen ikke længere kan opretholde rullende og løsner sig fra overfladen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative suboptimale og optimale resultater. (A) Et eksempel på lysstofrør med utilstrækkelig kontrast. (B) Et eksempel på overdreven fluorescerende sportæthed. (C) Et eksempel på optimal sportæthed og kontrast. Alle tre billeder blev erhvervet under samme tilstand, fladtrykt og syet. De røde bokse i hvert billede repræsenterer det område, hvor intensitetsfremskrivningerne (til højre) blev taget. (D) Et lysstofrør vist i diffraktionsbeskæmet (venstre halvdel) og DNA-PAINT (højre halvdel) billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Problem | Mulig årsag | Opløsning | |
| Epoxytape skæres ikke korrekt | Epoxylag for tykt | Tynd epoxylaget så meget som muligt med razerbladet | |
| Lasergraver effekt og hastighed ikke optimeret | Optimer lasergraverkraft og -hastighed | ||
| Bobler sidder fast på siderne af flowkammeret | Forkert indledende væske introduktion | Skub bufferløsninger gennem kanal ved høj strømningshastighed for at vaske boblerne ud | |
| Bobler passerer gennem flowkammer | Forkert væskeindføring gennem indløb og udløb | Sørg for, at der er en flydende dråbe på indløbsrøret for at sikre væske-til-væske kontakt mellem pipettespidsen og indløbet | |
| Bobler fra sprøjten kom ind i flowlinjen | Vip sprøjtepumpen for at sikre, at boblerne er fanget i stempelafslutningen | ||
| Væske kan ikke komme ind i kanaler | Indløb skruet for stramt | Juster for at optimere forseglingen. Indløbsslangen skal bare røre ved kanalåbningen, når den skrues ordentligt ind. | |
| Kanallækage | Epoxy har ikke helbredt helt | Re-make kanaler, sikre ved hjælp af 5 min hurtig hærdning epoxy og lad helbrede i mindst 1 time | |
| Indløb forsegler ikke ordentligt | Juster for at optimere forseglingen | ||
| Celler sidder fast | Dårlig PEGylation, der fører til ikke-specifik binding | Ideelt set genindspilNING PEG. Derudover kan forsøge at inkubere yderligere blokeringsmidler (BSA &Tween-20) og tilføje blokeringsmidler til at vaske buffer. | |
| Overflade passivering ødelagt af store luftbobler passerer gennem kanalen | Sørg for, at ingen bobler går gennem kanalen | ||
| Problem med cellerne | Brug HL-60 2 uger efter genstart cellekultur fra frosne. Bekræft cellerullende på kontroloverfladen med kun P-selectin. | ||
| Celler har ikke eller har sparsomme interaktioner med overfladen | P-selectin-tæthed for lav som følge af dårlig overfladefunktionalisering og/eller dårlig biokonjugation | For det første skal du bruge ProtG-biotin i stedet for ProtG-TGT som en kontrol for at afgøre, om problemet skyldes biokonjugation eller overfladebiotintæthed. Efter at have sikret biokonjugation kvalitet og overflade biotin tæthed, øge TGT-ProtG og P-selectin-Fc koncentration og inkubationstid. | |
| Celler ruller, men producerer ikke fluorescerende spor | Vedhæftning interaktioner for svag til brud TGT | Øg flowhastigheden under rullende eksperiment for at øge interaktionskraften. Vi anbefaler en indledende rampe op flow profil (Figur 3F) for at finde den optimale strømningshastighed, der producerer både stabil rullende og fluorescens spor (Figur 3G) | |
| Dårlig kvalitet overflade fører til høj baggrund fluorescens og utilstrækkelig kontrast til at se spor | Kontroller overflade passivering | ||
Tabel 1: Fejlfinding. Tabellen viser de mulige årsager og løsninger på problemer, der opstår, når denne analyse udføres
Supplerende Coding File 1: Det specialskrevne MATLAB-script til nedbrydning af det endelige produktspektrum baseret på de tre spektre, der tidligere er indsamlet (ProtG, SMCC-streng, Ni-NTA perle elutionsbuffer) for at bestemme bøjningseffektiviteten og forholdet mellem ProtG og ssDNA. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vedhæftning fodaftryk assay muliggør visualisering af molekylær vedhæftning begivenheder mellem PSGL-1 og P-selectin under celle rullende vedhæftning. Denne proces er initieret af P-selectin-medieret optagelse efterfulgt af rullende under fluidisk forskydning stress. Potentielle problemer i løbet af eksperimentet involverer normalt dårlig celle rullende eller manglende fluorescerende spor, selv når cellerne ruller godt. Disse problemer skyldes ofte kvalitetskontrol ved de kritiske trin i protokollen, som angivet i fejlfindingstabellen (tabel 1).
Biomolekyler og buffere skal filtreres og opbevares ved 4 °C for at forhindre forurening, fordi overfladeforberedelse indebærer flere trin. Overfladebe passivering af høj kvalitet er et krav for at opnå passende overfladefunktionaliseringstæthed og reducere den uspecifikke binding af biomolekyler. Uspecifik binding af biomolekyler til overfladen kan skabe en høj fluorescens baggrund, der forstyrrer enkeltmolekylet fluorescensbilleddannelse og statistisk dataanalyse. Flere faktorer kan påvirke overflade passivering. Hydrolyse af aminosilane og PEG-NHS giver meget lavere effektivitet af PEGylation. Tilstrækkelig KOH vask og piranha rengøring forbedre hydrofilitet ved at generere gratis hydroxyl grupper på glasoverfladen, øge tætheden af den kemisk reaktive gruppe. Celler ville blive hængende på dårligt passiverede overflader. Kvaliteten af overflade passivering kontrolleres ved at måle baggrund fluorescens intensitet før og efter PEGylation ved hjælp af fluorescerende biomolekyler.
Ligandernes overfladetæthed er en kritisk faktor for cellerullende, som styres af PEG: PEG-biotin-forholdet, TGT-hybridisering og P-selectin-binding. I dette system er et PEG: PEG-biotin-forhold på 20:1 tilstrækkeligt til overfladefunktionalisering med tilstrækkelig P-selectin til cellerulle. Effektiv TGT-hybridisering forbedrer også overfladetætheden og signal-til-støj-forholdet mellem de fluorescerende spor. Denne protokol indeholder et genopfyldningstrin af top-strand-TGT-ProtG for at sikre, at enhver uhybridiseret TGT-bundstreng suppleres før eksperimenter. Bøjning af DNA til ProtG påvirker også overfladetætheden. Sulfo-SMCC linker blev tilføjet til DNA ved 10-fold molar overskydende, så alle DNA reagerede med linker. ProtG med en enkelt cysteinrester (ProtG-Cys) ved C-endestationen blev brugt til at opnå et 1:1 DNA: ProtG-bøjningsforhold. Da ProtG-Cys kan danne dimers gennem disulfidbindinger, er behandling af TCEP nødvendig for at reducere disulfidbindingen før sulhydrylreaktive krydsbindingsreaktioner. Proteinkonjugeret DNA og TGT hybridisering kan valideres med native PAGE-analyse, hvor konjugat-DNA og DNA-duplex vil vise den retarderede mobilitet på grund af stigningen i molekylvægten. Samlingseffektivitet kan også estimeres ved gel densitometri (figur 2B). De omhyggelige PEGylation- og biokonjugationsprocesser er afgørende for at producere en ensartet overflade. Lejlighedsvis kan celletilstand påvirke cellerullende og spordannelsen. Selvom PSGL-1 udtryk over celletæthed ikke er blevet rapporteret, celletæthed er en potent regulator af cellecyklus og protein udtryk i vækstfasen.
I betragtning af at PSGL-1 også fungerer som en signaltransduktionsreceptor og regulerer cellespredning20,21, opretholdes kulturforhold som celletæthed for ensartet udtryksniveau og bindende evne til PSGL-1. Fastgørelse af P-selectin-Fc medieret af ProtG på overfladen er afgørende for vedhæftning og rulning af celler. De bindende kinetikere af P-selectin til ProtG afhænger af koncentrationen. Lavere koncentrationer af P-selectin fører til en stigning i tiden for at nå ligevægt. Der kræves mindst 30 min til mætningsbinding for koncentrationer under 100 nM22. 10 nM P-selectin blev anvendt til at reducere den uspecifikke binding til overfladen og øget inkubationstid for tilstrækkelig interaktion med ProtG. En 1 time inkubation er nok tid til at fremkalde celle vedhæftning og rullende i dette system.
TGT og dens tilsvarende kraftafhængige levetid er en vigtig faktor i resultaterne af denne analyse. Under rullende vedhæftning overføres kraften på tether gennem både TGT og P-selectin: PSGL-1 interaktionen. Hver af disse individuelle komponenter har en unik kraftafhængig levetid, og afhængigt af den anvendte kraft vil bristesandsynligheden favorisere den ene frem for den anden. For eksempel har det vist sig, at når du bruger TGT beskrevet i denne artikel, på kræfter under 13,6 pN, P-selectin: PSGL-1 primært dissociates, mens over 13,6 pN, TGT primært dissocierer13. Dette er vigtigt at forstå, når du udfører denne analyse, fordi hvis forskydningen stress er for lav eller perlerne ruller for langsomt, vil brud begivenheder primært være P-selectin: PSGL-1 interaktion, og der vil være minimal eller ingen målbar fluorescens signal fra TGT'er. Spændingstærsklen for TGT vil også påvirke resultaterne. Hvis TGT brister for højt af en kraft, vil brudhændelserne primært være P-selectin: PSGL-1, og der vil være minimal fluorescenssignal.
Den metode, der er beskrevet her, giver mulighed for analyse af de molekylære brudkræfter samt placeringen af molekylære vedhæftning begivenheder involveret i rullende vedhæftning. I stedet for realtidsdetektering af vedhæftning er den største fordel ved denne metode, at den giver mulighed for billeddannelse og analyse efter eksperimentet. Når vedhæftningsfodaftrykket er blevet efterladt på overfladen i form af ssDNA, kan sporene stadig afbildes efter 12 timer, hvis flowkanalerne opretholdes i et køleskab på 4 °C i et mørkt fugtighedskammer med både indløb og udløb blokeret for at forhindre tørring. Fortolkningen af fluorescensudlæsningen for denne analyse afhænger af den valgte billeddannelsesmetode. Gennem super-opløsning billeddannelse, denne analyse opnår høj rumlig opløsning (<50 nm), der giver mulighed for kvantitativ analyse af tætheden af bristede TGTs13. Analysen af receptortæthed eller bristet TGT-tæthed ville være nyttig til at undersøge rullende vedhæftningsadfærd under forskellige forhold. Tværtimod giver diffraktionsbeskrædtet billeddannelse ikke en høj rumlig opløsning. Det gør det dog muligt at afbilde et stort overfladeareal for at analysere fluorescenssporene af flere perler over hundredvis af synsfelter. Dette er fordelagtigt, da fluorescensintensiteten af et spor kan analyseres for en enkelt perle over en stor afstand, der giver oplysninger om ændringer i rullende adfærd over tid. Et sådant eksempel er at ændre forskydningsstress over tid og observere de tilsvarende ændringer i fluorescensintensiteten. For nylig har det vist sig, at gennem en simpel model kan sporens fluorescensintensitet bruges til at estimere molekylær kraftfordeling13. Der er også potentiel anvendelse af ratiometriske metoder til at opnå kraft kvantificering med denne analyse23.
Da cellerullende sker hurtigt (10'erne af μm / s) og over en længere afstand (1000'erne af μm), har det været udfordrende at studere deres molekylære spænding med traditionelle realtids molekylære spændingssensorer. Vedhæftningsfodaftryksanalysen bryder denne krævende begrænsning for at give mulighed for post-event imaging. Selv om TGT-brudshændelsen ikke direkte rapporterer omfanget af de spændinger, der oplevedes før brud, er der sket lovende udviklinger i analysen af fluorescenssporene for at muliggøre en kvantitativ undersøgelse af de molekylære kræfter, der er involveret i rullende vedhæftning13,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) og University of British Columbia Eminence Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
