Summary
Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.
Abstract
Rollende adhesie, vergemakkelijkt door selectin-gemedieerde interacties, is een zeer dynamische, passieve beweeglijkheid bij het rekruteren van leukocyten naar de plaats van ontsteking. Dit fenomeen treedt op in postcapillaire venules, waar de bloedstroom leukocyten in een rollende beweging op de endotheelcellen duwt. Stabiel rollen vereist een delicaat evenwicht tussen de vorming van hechtingsbindingen en hun mechanisch aangedreven dissociatie, waardoor de cel aan het oppervlak vast kan blijven zitten tijdens het rollen in de stroomrichting. In tegenstelling tot andere hechtingsprocessen die plaatsvinden in relatief statische omgevingen, is de rolhechting zeer dynamisch omdat de rollende cellen over duizenden micron reizen met tientallen micron per seconde. Bijgevolg zijn conventionele mechanobiologische methoden zoals tractiekrachtmicroscopie ongeschikt voor het meten van de individuele adhesiegebeurtenissen en de bijbehorende moleculaire krachten vanwege de korte tijdschaal en hoge gevoeligheid die vereist is. Hier beschrijven we onze nieuwste implementatie van de adhesievoetafdruktest om de P-selectine in beeld te brengen: PSGL-1-interacties bij rollende adhesie op moleculair niveau. Deze methode maakt gebruik van onomkeerbare DNA-gebaseerde spanningsmeter-tethers om een permanente geschiedenis van moleculaire adhesiegebeurtenissen te produceren in de vorm van fluorescentiesporen. Deze sporen kunnen op twee manieren worden afgebeeld: (1) het samenvoegen van duizenden diffractie-beperkte beelden om een groot gezichtsveld te produceren, waardoor de adhesievoetafdruk van elke rollende cel over duizenden micron lang kan worden geëxtraheerd, (2) DNA-PAINT uitvoeren om superresolutiebeelden van de fluorescentiesporen binnen een klein gezichtsveld te reconstrueren. In deze studie werd de adhesievoetafdruktest gebruikt om HL-60-cellen te bestuderen die rollen bij verschillende schuifspanningen. Daarbij konden we de ruimtelijke verdeling van de P-selectine: PSGL-1 interactie in beeld brengen en inzicht krijgen in hun moleculaire krachten door fluorescentie-intensiteit. Deze methode vormt dus de basis voor het kwantitatieve onderzoek van de verschillende cel-oppervlakte-interacties die betrokken zijn bij de roladhesie op moleculair niveau.
Introduction
De rollende adhesiecascade beschrijft hoe circulerende cellen aan de bloedvatwand vastklampen en langs de bloedvatwand rollen1. Passief rollen wordt voornamelijk gemedieerd door selectins, een belangrijke klasse van cellulaire adhesiemoleculen (CAMs)1. Onder de schuifstroom van bloed vormen leukocyten die P-selectine glycoproteïneligand-1 (PSGL-1) tot expressie brengen, zeer voorbijgaande bindingen met P-selectine, die tot expressie kunnen komen op het oppervlak van ontstoken endotheelcellen. Dit proces is van cruciaal belang voor leukocyten om te migreren naar een plaats van ontsteking2. Bovendien is PSGL-1 ook een mechanosensitieve receptor die in staat is om de daaropvolgende stevige adhesiefase van de rollende adhesiecascade te activeren bij zijn betrokkenheid bij P-selectin3.
Genetische mutaties die de CAM-functie beïnvloeden, kunnen het immuunsysteem ernstig beïnvloeden, zoals bij de zeldzame ziekte van leukocytenadhesiedeficiëntie (LAD), waar storing van adhesiemoleculen die het rollen bemiddelen, leidt tot ernstig immuungecompromitteerde individuen4,5,6. Bovendien is aangetoond dat circulerende tumorcellen migreren volgens een vergelijkbaar rollend proces, wat leidt tot metastase7,8. Omdat celrollen echter snel en dynamisch is, zijn conventionele experimentele mechanobiologische methoden niet geschikt voor het bestuderen van moleculaire interacties tijdens het rollen van cellen. Hoewel manipulatiemethoden met één cel en één molecuul, zoals atoomkrachtmicroscopie en optisch pincet, moleculaire interacties zoals de krachtafhankelijke interactie van P-selectine met PSGL-1 op het niveau van één molecuul9 konden bestuderen, zijn ze niet geschikt voor het onderzoeken van live adhesiegebeurtenissen tijdens het rollen van cellen. Bovendien kan de in vitro gekarakteriseerde interactie de vraag over moleculaire adhesie in vivo niet direct beantwoorden. Welk moleculair spanningsbereik is bijvoorbeeld biologisch relevant wanneer cellen in hun oorspronkelijke omgeving functioneren? Computationele methoden zoals lijmdynamicasimulatie10 of eenvoudig steady-state model11 hebben bepaalde moleculaire details vastgelegd en hoe ze het rolgedrag beïnvloeden, maar zijn sterk afhankelijk van de nauwkeurigheid van de modelleringsparameters en aannames. Andere technieken zoals tractiekrachtmicroscopie kunnen krachten detecteren tijdens celmigratie, maar bieden onvoldoende ruimtelijke resolutie of kwantitatieve informatie over moleculaire spanning. Geen van deze technieken kan directe experimentele observaties bieden van de temporele dynamica, ruimtelijke verdeling en magnitude heterogeniteit van moleculaire krachten, die rechtstreeks verband houden met celfunctie en gedrag in hun oorspronkelijke omgeving.
Daarom is het implementeren van een moleculaire krachtsensor die in staat is om selectin-gemedieerde interacties nauwkeurig te meten cruciaal voor het verbeteren van ons begrip van rollende adhesie. Hier beschrijven we het protocol voor de adhesievoetafdruktest12 waarbij PSGL-1 gecoate kralen worden gerold op een oppervlak dat p-selectin gefunctionaliseerde spanningsmeter tethers (TGT's) presenteert13. Deze TGT's zijn onomkeerbare DNA-gebaseerde krachtsensoren die resulteren in een permanente geschiedenis van breukgebeurtenissen in de vorm van fluorescentie-uitlezing. Dit wordt bereikt door het scheuren van de TGT (dsDNA) en vervolgens het labelen van de gescheurde TGT (ssDNA) met een fluorescerend gelabelde complementaire streng. Een groot voordeel van dit systeem is de compatibiliteit met zowel diffractie-beperkte als superresolutie beeldvorming. De fluorescerend gelabelde complementaire streng kan permanent gebonden zijn (>12 bp) voor diffractie-beperkte beeldvorming of tijdelijk gebonden (7-9 bp) voor superresolutie beeldvorming via DNA PAINT. Dit is een ideaal systeem om de rolhechting te bestuderen, omdat de TGT's tijdens actief rollen worden gescheurd, maar de fluorescentie-uitlezing na het rollen wordt geanalyseerd. De twee beeldvormingsmethoden bieden de gebruiker ook meer vrijheid om rolhechting te onderzoeken. Doorgaans is diffractie-beperkte beeldvorming nuttig voor het extraheren van moleculaire breukkracht door fluorescentie-intensiteit13, terwijl superresolutiebeeldvorming kwantitatieve analyse van receptordichtheid mogelijk maakt. Met de mogelijkheid om deze eigenschappen van rolhechting te onderzoeken, biedt deze aanpak een veelbelovend platform voor het begrijpen van het krachtregulatiemechanisme op de moleculaire adhesie van rollende cellen onder schuifstroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oligonucleotide labeling en hybridisatie
- Vermindering van eiwit G-disulfidebindingen
- Los 10 mg eiwit G (ProtG) op in 1 ml ultrapuur water.
OPMERKING: Het eiwit G wordt hier gemodificeerd met een enkel cysteïneresidu aan de C-terminus en een N-terminus poly-histidine-tag. - Bufferuitwisseling ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) in 1x PBS (pH 7,2) met een P6-kolom.
- Meet de eiwitconcentratie na bufferuitwisseling.
OPMERKING: Typische concentratie van 7-8 mg / ml. - Bereid 120 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) door 3 mg TCEP op te lossen in 90 μL van 1x PBS (pH 7,2) gevolgd door 10 μL van 0,5 M EDTA.
OPMERKING: TCEP moet vers worden bereid. - Voeg 4 μL van 120 mM TCEP (480 nmol) toe aan 20 μL ProtG (4-5 nmol).
OPMERKING: Streef naar een molaire verhouding van ~ 100: 1 TCEP tot eiwit. - Laat de reactie 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) doorgaan.
- Verwijder overtollige TCEP uit de gereduceerde ProtG met een P6-kolom (buffer uitgewisseld in 1x PBS, pH 7,2).
- Meet de concentratie van de gereduceerde ProtG met een UV/Vis spectrofotometer en sla de spectra op.
OPMERKING: Typische concentratie van 3,5-4,5 mg / ml.
- Los 10 mg eiwit G (ProtG) op in 1 ml ultrapuur water.
- Amine-gelabelde ssDNA-reactie met Sulfo-SMCC
- Los amine-gelabeld ssDNA (amine-ssDNA) op in nucleasevrij water tot een concentratie van 1 mM. Controleer de strengconcentratie met een UV/Vis-spectrofotometer.
- Bereid 11,5 mM sulfo-SMCC (een hetero-bifunctionele crosslinker met sulfo-NHS ester en maleimide) oplossing vers door 2 mg sulfo-SMCC op te lossen in 400 μL ultrapuur water en vortex om te mengen.
- Voeg 6 μL van het 1 mM amine-ssDNA (6 nmol) toe aan 5,2 μL van 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) en 88,8 μL van 1x PBS (pH 7,2). Vortex gedurende 5 s gevolgd door centrifugatie bij 8600 x g gedurende 3 min.
- Laat de reactie 30 minuten doorgaan bij RT.
- Verwijder overtollig sulfo-SMCC uit het SMCC geconjugeerde amine-ssDNA (mal-ssDNA) met een P6-kolom (buffer uitgewisseld in 1x PBS, pH 7,2).
- Meet de concentratie van het mal-ssDNA met een UV/Vis-spectrofotometer en sla de spectra op.
OPMERKING: Typische concentratie van 35-45 μM.
- ProtG-ssDNA-vervoeging
- Voeg 21 μL van 4,5 mg /ml gereduceerde ProtG (3 nmol) toe aan het mal-ssDNA (~ 4-5 nmol).
OPMERKING: Volumes en concentraties zijn hier typische waarden. Pas aan volgens individuele experimentele meting. Zorg altijd voor een teveel aan mal-ssDNA ten opzichte van ProtG in een verhouding van ~1,5:1. - Vortex gedurende 5 s en laat de reactie 3 uur doorgaan bij RT.
- Voeg 21 μL van 4,5 mg /ml gereduceerde ProtG (3 nmol) toe aan het mal-ssDNA (~ 4-5 nmol).
- ProtG-ssDNA zuivering en karakterisering
- Zuiver de geconjugeerde ProtG-ssDNA door zijn-tag isolatie met magnetische nikkel-nitrilotriacetinezuur (Ni-NTA) kralen.
- Verwijder overtollig imidazool (Ni-NTA-elutiebuffer) uit het product met een P6-kolom (buffer uitgewisseld in 1x PBS, pH 7,2).
OPMERKING: Deze stap is essentieel voor het kwantificeren van de conjugatie, omdat imidazool een significante absorptie heeft bij 280 nm. - Gebruik een UV/Vis-spectrofotometer om de spectra van het product ProtG-ssDNA en de Ni-NTA-elutiebuffer (1x) vast te leggen.
OPMERKING: De typische ProtG-ssDNA-absorptie bij 260 nm en 280 nm is respectievelijk 0,8 en 0,6. - Om de conjugatie-efficiëntie en -verhouding van ProtG tot ssDNA te bepalen, gebruikt u het op maat geschreven MATLAB-script (Supplemental Coding File 1) om het uiteindelijke productspectrum te ontbinden op basis van de drie eerder verzamelde spectra (ProtG, SMCC-streng, Ni-NTA bead elution buffer).
OPMERKING: In het kort werkt de code zoals beschreven in stappen 1.4.5-1.4.8. De typische concentratie is 4 μM ProtG-ssDNA met ProtG en ssDNA bij een molaire verhouding van ~1:1 (figuur 2A). - Voer ProtG, SMCC-streng, Ni-NTA-oplossingsbuffer en de ProtG-ssDNA UV/Vis-spectra in het MATLAB-script in
- Voer een multidimensionale ongelimiteerde niet-lineaire minimalisatie uit om de ProtG-ssDNA-spectra uit de bronspectra (ProtG, SMCC-streng en Ni-NTA-oplossingsbufferspectra) te reconstrueren
OPMERKING: De minimalisatiefunctie voert drie transformatiefactoren uit, één voor elke bronspectra. - Reconstrueer de ProtG-ssDNA spectra door de spectra te vermenigvuldigen met hun overeenkomstige factor en de getransformeerde bronspectra te combineren.
- Vermenigvuldig de beginconcentratie van de ProtG- en SMCC-streng met de overeenkomstige transformatiefactoren om de concentraties smcc-streng en protg in het ProtG-ssDNA-product te bepalen.
- (OPTIONEEL) Voer native PAGE uit volgens Figuur 2B om ervoor te zorgen dat elk onderdeel en elke stap werkt zoals verwacht.
- TGT hybridisatie
- Hybridiseer ProtG-ssDNA (bovenste streng) met gebiotinyleerde onderstreng in een molaire verhouding van 1,2:1 met concentraties van respectievelijk 240 nM en 200 nM in T50M5-buffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) om de volledige TGT-constructie te hybridiseren. Laat hybridiseren bij RT ≥1 uur.
2. Oppervlakte PEGylation
- Oppervlaktereiniging
- Reinig één Erlenmeyer en twee vlekkenpotten voor elke 8 dekplaten. Vul elke container met 1 M KOH-oplossing en soniceer gedurende 1 uur bij RT. Was elke container grondig met ultrapuur water en droog met N2 of in een oven.
OPMERKING: Vul de KOH tot de bovenkant om het deksel aan te raken, zodat ze ook worden schoongemaakt. - Spoel elke dekplaat grondig af met ultrapuur water en plaats ze in een van de gereinigde vlekkenpotten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat ze niet aan elkaar of aan de muur van de vlekkenpotten worden geplakt. - Bereid in een zuurkast een piranha-oplossing door 30 ml waterstofperoxide (30%) toe te voegen aan 90 ml geconcentreerd (95% -98%) zwavelzuur in een bekerglas van 250 ml.
LET OP: Geconcentreerd zwavelzuur is zeer corrosief. Voeg de waterstofperoxide heel langzaam toe aan het zwavelzuur en draai voorzichtig om te mengen. - Dompel de dekzeilen volledig onder in de kleurpot met de piranha-oplossing. Laat coverslips in piranha 30 min in de zuurkast zitten.
LET OP: Koel de piranha-oplossing af tot niet meer dan 80 °C voordat u gaat gieten om te voorkomen dat de vlekkenpot barst. - Gooi de piranha-oplossing weg in een bekerglas van 1000 ml en neutraliseer met de 1 M KOH van glasreiniging.
- (OPTIONEEL) Herhaal piranhareiniging (stappen 2.1.3-2.1.5) met een verse piranha-oplossing.
- Spoel de coverslips af met overvloedige hoeveelheden ultrapuur water om alle resterende piranha-oplossing te verwijderen. Schud de vlekkenpot voorzichtig tijdens elke verhoging om het verwijderen te vergemakkelijken (10 spoelingen worden aanbevolen).
- Spoel de coverslips 3 keer af met methanol om water van het coverslipoppervlak te verwijderen en de coverslips ondergedompeld te houden in methanol.
- Reinig één Erlenmeyer en twee vlekkenpotten voor elke 8 dekplaten. Vul elke container met 1 M KOH-oplossing en soniceer gedurende 1 uur bij RT. Was elke container grondig met ultrapuur water en droog met N2 of in een oven.
- Oppervlakte silanisatie
- Bereid een 1% aminosilaanoplossing door 94 ml methanol, 1 ml aminosilaan en 5 ml ijsazijn grondig te mengen in de gereinigde en gedroogde Erlenmeyer. Giet in de tweede schoongemaakte en gedroogde vlekkenpot14.
- Breng de afgedekte de dekplaten ondergedompeld onder de methanoloplossing over in de kleurpot met 1% aminosilaanoplossing en houd de pot bedekt.
OPMERKING: Laat de coverslips niet drogen tijdens het overbrengen naar aminosilaan om de blootstelling van het glasoppervlak aan lucht te beperken. - Incubeer de kleurpot met coverslips in aminosilaan gedurende 1 uur bij 70 °C in een oven15.
- Gooi de aminosilaanoplossing voorzichtig weg in een aparte afvalcontainer en spoel de dekplaten in de kleurpot 5 keer met methanol om de aminosilaanoplossing te verwijderen.
- Spoel coverslips in de kleurpot 5 keer af met ultrapuur water en droog ze met N2.
- Bak de gedroogde dekplaatjes in de kleurpot in een oven op 110 °C gedurende 20 min. Laat de coverslips afkoelen tot RT en plaats ze vervolgens op het PEGylation-rek.
OPMERKING: Bedek de vlekkenpot tijdens het bakken met een deksel om bepaalde en chemische afzetting op het oppervlak te minimaliseren15.
- Peg-oplossing voorbereiding
- Ontdooi PEG (polyethyleenglycol) en PEG-biotine tot RT gedurende ongeveer 30 min.
OPMERKING: Deze stap minimaliseert vochtcondensatie die de NHS-ester op PEG kan afbreken. - Maak PEG-buffer door 84 mg natriumbicarbonaat toe te voegen aan 10 ml ultrapuur water. Deze formulering moet een buffer bieden bij pH 8,4.
- Voor 8 coverslips, elk met één PEGylated kant met 20:1 PEG:PEG-biotine: meet 100 mg PEG en 5 mg PEG-biotine om toe te voegen aan 400 μL PEG-buffer. Vortex de oplossing voor 30 s en centrifugeer gedurende 1 min met de maximale snelheid (≥18000 x g).
OPMERKING: Deze stap is tijdgevoelig, omdat de SVA NHS-esterhydrolyse onmiddellijk begint en een halfwaardetijd heeft van 34 minuten bij pH 8,0, met een kortere halfwaardetijd bij pH 8,4.
- Ontdooi PEG (polyethyleenglycol) en PEG-biotine tot RT gedurende ongeveer 30 min.
- PEG-incubatie en coverslip opslag
- Plaats de vochtigheidskamer en plaats de dekplaten erin.
- Voeg 90 μL PEG-oplossing toe aan een afdekplaat in de vochtkamer en plaats een tweede afdekplaat bovenop de PEG-oplossing met behulp van een afdekplaatpincet om de PEG-oplossing gelijkmatig te verdelen.
- Zorg ervoor dat er geen bubbels in de oplossing op de deklip vallen. Laat het ene uiteinde van de tweede coverslip op de eerste coverslip zakken en laat het andere uiteinde langzaam vallen, zodat er geen bubbels tussen de coverslips zitten.
OPMERKING: Bubbels zullen ervoor zorgen dat bepaalde gebieden slecht PEGylated zijn. - Herhaal dit totdat alle coverslips PEG hebben (d.w.z. 8 coverslips = 4 PEG sandwiches). Incubeer de PEG-oplossingen 's nachts (~ 12 uur) bij RT in een vochtigheidskamer in het donker16.
- Scheid de deklipparen en plaats ze in een vlekkenpot. Let op de PEGylated zijkanten.
- Spoel de coverslips grondig af met ultrapuur water en droog met N2.
OPMERKING: Houd de afdekplaten vast met een pincet en blaas N2 over het oppervlak naar het pincet om te voorkomen dat verontreinigingen op het oppervlak drogen. - Markeer de niet-PEGylated kant met een stip op een hoek met behulp van een permanente marker of een diamanten pen.
- Plaats 2 PEGylated coverslips in mailer tubes met de PEGylated zijden naar elkaar toe om de PEGylated kant te helpen identificeren voor gebruik.
- Stofzuig de buis gedurende 5 minuten en vul op met N2. Sluit de buis af met parafilm.
- Bewaar de PEGylated coverslips bij -20 °C in de verzegelde mailerbuizen gedurende maximaal 6 maanden.
OPMERKING: Verwarm de opslagbuizen tot RT voordat de chip wordt gemonteerd. Condensatie op de coverslips tijdens het afdichten zal lekkage veroorzaken.
3. Voorbereiding van de stroomkamer
- Chip assemblage
- Verdeel een kleine hoeveelheid epoxy aan beide zijden van dubbelzijdige tape dun met een scheermesje.
OPMERKING: Te veel epoxy kan zich tijdens de montage in het kanaal verspreiden. - Lasergesneden de epoxy gecoate tape om 4 kanalen te creëren. Maak de flowchip door de epoxytape tussen een 4-gaats slide en PEG coverslip te sandwichen (Figuur 1A).
- Gebruik een pipetpunt en oefen zachte druk uit over de lengte van de kanalen om een goede afdichting te creëren. Laat de epoxy ≥1 uur uitharden.
OPMERKING: Breek het glas niet om te voorkomen dat het tegen epoxy glijdt.
- Verdeel een kleine hoeveelheid epoxy aan beide zijden van dubbelzijdige tape dun met een scheermesje.
- Kamervergadering
- Lijn de chip zo uit dat de opening van elk kanaal zich in het midden van de adapter bevindt (figuur 1A). Plaats twee transparante acrylafstandhouders bovenop de chip, oefen stevige druk uit in het midden van het blok en schroef twee 4-40 schroeven in aan de uiteinden van elke afstandhouder.
OPMERKING: Forceer de schroef niet en druk niet te hard op de afstandhouders, anders kan de chip barsten. - Schroef aan de andere kant van de beugel de inlaten in de gaten met schroefdraad. Bewaak de afdichtingsconditie door het transparante acrylblok.
- Terwijl de slang contact maakt met de opening van de chip, sluit u de verbinding af door de slang voorzichtig met de klok mee te draaien.
OPMERKING: Te strak aangeklede inlaten kunnen stroomverstopping veroorzaken, terwijl losse contacten lekkage veroorzaken.
- Lijn de chip zo uit dat de opening van elk kanaal zich in het midden van de adapter bevindt (figuur 1A). Plaats twee transparante acrylafstandhouders bovenop de chip, oefen stevige druk uit in het midden van het blok en schroef twee 4-40 schroeven in aan de uiteinden van elke afstandhouder.
4. Oppervlaktevoorbereiding
OPMERKING: Raadpleeg figuur 1B voor de algemene workflow.
- Blokkeringsagenten om niet-specifieke binding te voorkomen
- Gebruik een pipet om 200 μL wasbuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 en 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) in de kamer te laten stromen om te controleren op lekkage. Als er bubbels in het kanaal ontstaan, duw dan agressief nog eens 200 μL om de bubbels te verwijderen.
OPMERKING: Grote luchtbellen die bij deze stap niet worden verwijderd, kunnen later losraken en de functionaliteit van het oppervlak vernietigen. - Voeg 40 μL BSA (1% w/v) toe aan de stroomkamer om niet-specifieke binding te voorkomen en incubeer gedurende 10 minuten.
- Zorg ervoor dat u tijdens elke incubatieperiode voldoende volume toevoegt om de stroomkamers te vullen en druppels te vormen bij de in- en uitlaten. Pas de incubatievolumes dienovereenkomstig aan en voer alle incubaties uit in een vochtigheidskamer.
- Voeg 40 μL Tween 20 (5% v/v) toe aan de stroomkamer. Incubeer gedurende 10 minuten om de niet-specifieke binding verder te verminderen.
- (OPTIONEEL) Controleer het oppervlak op voldoende passivering door polystyreenparels door het kanaal te laten stromen. Voeg 40 μL ProtG gecoate polystyreen kralen (0,01% w /v) toe en beeld met een darkfield microscoop met 10x objectief. Als kralen zich niet aan het oppervlak hechten, gaat u verder met de volgende stap.
- Was het kanaal met 200 μL wasbuffer om alle passiveringsmiddelen te verwijderen.
- Gebruik een pipet om 200 μL wasbuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 en 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) in de kamer te laten stromen om te controleren op lekkage. Als er bubbels in het kanaal ontstaan, duw dan agressief nog eens 200 μL om de bubbels te verwijderen.
- Functionalisering van het kameroppervlak
- Voeg 40 μL streptavidin (100 μg/ml) toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten. Was vervolgens met 200 μL wasbuffer.
- Voeg 40 μL gehybridiseerde ProtG-TGT (100 nM) toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten. Was vervolgens met een wasbuffer van 200 μL.
- Voeg gedurende 20 minuten 40 μL ProtG-TGT-bovenstreng (100 nM) toe om een ongehybridiseerde TGT-onderstreng op het oppervlak te voltooien. Wassen met 200 μL wasbuffer.
- Voeg 40 μL P-selectin-Fc (10 μg/ml) toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 60 minuten. Was vervolgens met 200 μL wasbuffer.
OPMERKING: Incubatieduur is van cruciaal belang.
5. Experiment en beeldvorming
- Flow systeem instellen
- Vul een glazen spuit van 5 ml met de rolbuffer (HBSS met 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten door op de zijkanten van de spuit te tikken om de bubbels los te maken en ze naar buiten te duwen terwijl ze naar de punt drijven.
- Steek een steriele naald (26 G, 5/8 inch lengte) in een polyethyleenbuis van ~ 200 mm (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) en sluit de naald aan op de glazen spuit.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er nergens lucht in de naaldconnector wordt opgesloten. - Bevestig de spuit op de spuitpomp en kantel de spuitpomp zodanig dat de zuigerzijde verhoogd is om te voorkomen dat luchtbellen het kanaal binnendringen. Steek het uiteinde van de buis in de inlaat van de stroomkamer.
OPMERKING: Zorg voor contact tussen vloeistof en vloeistof bij het maken van de verbinding door druppels op de inlaten te deponeren en druppels aan het einde van de spuitbuis te hebben. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het kanaal komen door een kleine druppel op het uiteinde van de spuitbuis te laten vormen voordat u deze in de inlaat inbrengt. - Steek het ene uiteinde van nog eens 200 mm van de polyethyleenbuis in de uitlaat en het andere uiteinde ondergedompeld in een afvalbeker.
- Instellen voor het rollen van cellen
- Kweek HL-60 cellen in 25 cm2 geventileerde kweekkolven in IMDM media aangevuld met 20% foetaal runderserum en 1% antibiotica bij 37 °C met 5% CO2. Houd celdichtheden tussen 1 x 105-2 × 106 cellen / ml.
- (OPTIONEEL) Differentieer de HL-60-cellen in een compleet IMDM-medium met 1,25% DMSO bij een initiële dichtheid van 2 x 105 cellen/ml. Incubate cellen om het meest actief te zijn gedurende 5-6 dagen.
- Neem een monster (1-2 ml) uit de celsuspensie en centrifuge (200 x g, 3 min) om de cellen te pelleteren.
- Verwijder het medium en resuspend de cellen voorzichtig in 500 μL van de rolbuffer. Herhaal de wasstap twee keer om cellulair vuil te verwijderen.
- Meet de celdichtheid met een hemocytometer. Resuspend de celkorrels met rolbuffer tot een dichtheid van 2 x 105 cellen/ml.
- Koppel de slang voorzichtig los van de inlaten/uitlaat en pipetteer 40 μL van de celsuspensie in de stroomkamer. Sluit de slang opnieuw aan zoals eerder beschreven, zorg ervoor dat er geen bellen in het stroomkanaal worden gebracht.
- Begin het celrolexperiment door de spuitpomp met de gewenste stroomsnelheden te starten.
OPMERKING: De intensiteit van fluorescerende sporen is afhankelijk van de schuifspanning en een lagere celsnelheidsschuifspanning / celsnelheid zal over het algemeen dimmersporen produceren (figuur 4A). Vermijd een hoge celdichtheid op het oppervlak of een te lange rolduur om scheidbare eencellige sporen te garanderen (figuur 4B,C). - Gebruik een darkfield microscoop met een 10x objectief om ervoor te zorgen dat het rollen van cellen wordt waargenomen.
- Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u de cellen uit het kanaal door de rolbuffer met 100 ml /h toe te voegen totdat het oppervlak celvrij is.
- Imaging local tracks by "DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography" (DNA-PAINT)
- Voeg 40 μL DNA-PAINT imager streng (500 pM) in DNA-PAINT buffer (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) toe aan het kanaal.
- Voer total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie uit met behulp van een 100x olie-onderdompeling TIRF objectieflens. Verkrijg meer dan 40000 frames met een belichtingstijd van 25 ms per frame bij een elektronenvermenigvuldigende (EM) winst van 300 met behulp van een ELECTRON-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera.
- Gebruik Picasso-softwarepakket17 om de afbeeldingen met superresolutie (figuur 4D) te lokaliseren en weer te geven volgens stappen 5.3.4-5.3.5.
- Laad de DNA-PAINT-film in het localize-programma om de lokalisatie van elke fluorofoor in elk frame te bepalen.
OPMERKING: Optimaliseer de lengte van de boxzijde en de parameters van min. nettogradiënt totdat alleen fluoroforen nauwkeurig worden bijgehouden. Min. Net Gradient parameter kan vaak boven de 100000 gaan om optimale tracking te bereiken. Fit setting: MLE, geïntegreerde Gaussische methode produceert het beste resultaat. Als de film te lang is, splits u deze ten slotte in stapels van 10000 frames zodat de voorvertoning in Localize correct werkt voordat u ze opnieuw combineert in een definitief hdf5-bestand. - Laad vervolgens het resulterende hdf5-bestand in het renderprogramma om driftcorrectie en rendering uit te voeren.
OPMERKING: Voer meerdere driftcorrecties uit via Undrift by RCC om het eindresultaat te verbeteren.
- Lange sporen in beeld brengen door permanente labeling
- Voeg de permanente imager-streng toe en incubeer gedurende 120 s in T50M5-buffer. Was het kanaal door 200 μL wasbuffer toe te voegen.
- Neem een afbeelding op met de excitatielaser uit om achtergrondcameraruis te verkrijgen. Stel een groot gebied in een rasterpatroon voor met TIRF-microscopie.
OPMERKING: Frame-over-frame overlap van ≥10% wordt aanbevolen voor latere stiksels. - Programmeer de microscoop om te scannen over het gebied van 400 x 50 afbeeldingen (20000 afbeeldingen in totaal). Met behulp van FIJI-programma, splits onbewerkte gegevens in individuele tiff-bestanden, elk met een maximum van 10000 afbeeldingen.
- Vlak alle afbeeldingen af met behulp van het verlichtingsprofiel (figuur 3A-C) volgens de stappen 5.4.5-5.4.7.
- Trek de achtergrondcameraruis van elk frame af. Verkrijg de gemiddelde stapelprojectie (verlichtingsprofiel) van elk frame met aftrek van de achtergrond.
- Normaliseer het verlichtingsprofiel met de maximale waarde. Deel elk frame dat op de achtergrond is afgetrokken door het genormaliseerde verlichtingsprofiel.
- Schaal de gecorrigeerde frames opnieuw naar het juiste bereik voor de bijbehorende bitdiepte.
- Gebruik MIST18 om de afbeeldingen te naaien (Figuur 3D,E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het bovenstaande protocol beschrijft de experimentele procedure van de adhesievoetafdruktest. De algemene experimentworkflow wordt geïllustreerd in figuur 1, van de assemblage van de stroomkamer (figuur 1A) tot de oppervlaktefunctionalisatie (figuur 1B) en experiment- en beeldvormingsstappen (figuur 1C).
Figuur 2 is een representatief resultaat voor de ProtG-ssDNA bioconjugatiekarakterisering. De UV/Vis-spectra van drie componenten in het eindproduct, namelijk ProtG, mal-ssDNA en imidazole-elutiebuffer, werden verzameld voorafgaand aan de uiteindelijke conjugatie (figuur 2A), die elk overeenkomen met een bekende concentratie. Deze spectra vormen de orthogonale basis voor aanpassing aan het bioconjugatieproductspectrum, waarbij de drie onbekende parameters hun concentraties zijn. Een aangepaste functie in MATLAB werd gebruikt om de concentraties te bepalen. De resultaten tonen een verhouding van bijna 1:1 van ProtG tot ssDNA (figuur 2A). Dit is zoals verwacht omdat de ssDNA slechts één aminemodificatie heeft en de ProtG een enkele cysteïne heeft die op zijn C-eindpunt is ontwikkeld. Deze benadering is voordeliger dan de eerder gerapporteerde aanpak19 met behulp van een enkel thiol gemodificeerd DNA om de veelheid aan primaire amines op ProtG te richten, waar de conjugatieverhouding niet gemakkelijk kan worden gehandhaafd.
Daarnaast werd native PAGE gebruikt om de bioconjugatie te bevestigen (figuur 2B). DNA wordt gekleurd door respectievelijk GelGreen en eiwitten door Coomassie blue. Omdat GelGreen dsDNA sterker kleurt dan ssDNA, wordt verwacht dat eventuele ssDNA-banden zwakker zijn dan de gelijke molaire concentratie van dsDNA-banden (lanes 3, 4). Omdat de voorraad ProtG een C-terminaal cysteïneresidu bevat, vormt een fractie van de eiwitten dimeren door een disulfidebinding, zoals te zien in baan 5 (figuur 2B). De gereduceerde ProtG daarentegen toont een enkele band (baan 6). Bij direct gebruik van de stock ProtG in de DNA-conjugatie reageert het disulfide gedimde ProtG niet op het DNA en toont zich als een band zonder enige GelGreen-kleuring (lanes 7, 8). De ProtG-dimeerband verdwijnt in het conjugatieproduct met gereduceerde ProtG (lanes 9, 10). Omdat tijdens de conjugatie een teveel aan mal-ssDNA naar ProtG (1,5:1) wordt gebruikt, zijn in het uiteindelijke conjugatieproduct alleen TGT-banden zichtbaar (lanes 8, 10). De heldere GelGreen-banden die samenvallen met de monomere ProtG-band duiden op een succesvolle vervoeging en een goede opbrengst.
Figuur 3 illustreert representatieve onbewerkte microscopiebeelden en de workflow om ze te corrigeren voor latere beeldstiksels en analyse. Het TIRF-verlichtingsprofiel dat wordt geïntroduceerd door een single-mode vezel is over het algemeen helderder in het midden van het gezichtsveld en dimmer rond de randen (figuur 3A, B). Om de ongelijke verlichting te compenseren en de beelden af te vlakken voor kwantitatieve analyse, werd het verlichtingsprofiel bepaald door het gemiddelde van duizenden afzonderlijke frames (figuur 3B). Afgevlakte beelden werden geproduceerd door de cameraruis af te trekken van zowel raw- als verlichtingsprofielen en vervolgens te normaliseren door het verlichtingsprofiel (figuur 3C). Het effect van de afvlakking van het beeld wordt duidelijk geïllustreerd wanneer de afbeeldingen worden gestikt tot een groot beeld. De beeldintensiteit in de achtergrondgebieden zonder celsporen toont duidelijke periodieke patronen die overeenkomen met de ongecorrigeerde afbeeldingen (figuur 3D). Hetzelfde gezichtsveld dat is gestikt uit afgeplatte afbeeldingen produceert een vlakke achtergrond (figuur 3E). Het hebben van een vlakke achtergrond is van cruciaal belang voor het interpreteren van de intensiteitsfluctuaties langs een celspoor. Als eerste experiment wordt een opvoerstroomprofiel gebruikt dat vergelijkbaar is met het profiel in figuur 3F om het bereik van schuifspanning te bepalen dat geschikt is voor het experiment en dat zowel stabiele celrollen als heldere fluorescerende celsporen garandeert. Een typische eencellige adhesievoetafdruk onder dit stromingsprofiel wordt weergegeven in figuur 3G, waar de intensiteit toeneemt naarmate de schuifspanning toeneemt totdat de cel het rollen niet langer kan volhouden bij hoge schuifspanning en loskomt van het oppervlak, waardoor het einde van een enkel spoor wordt gemarkeerd.
Figuur 4 illustreert mogelijke uitkomsten van suboptimale tot optimale representatieve experimentele resultaten. Figuur 4A illustreert een suboptimale uitkomst waarbij de fluorescerende sporen een lage signaal-ruisverhouding hebben. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een lage oppervlaktedichtheid van de volledig geconjugeerde sondes of een laag debiet. Figuur 4B illustreert een andere suboptimale uitkomst waarbij de fluorescerende sporen te dicht op elkaar zijn gepakt om individuele sporen op te lossen en te isoleren voor latere analyse. Figuur 4C is een voorbeeld van een goede uitkomst waarbij individuele tracks over een lange afstand oplosbaar zijn en duidelijk tegen de achtergrond. Figuur 4D is een voorbeeld van het diffractie-beperkte TIRF-beeld (linkerhelft) in vergelijking met hetzelfde spoor dat door DNA-PAINT (rechterhelft) is afgebeeld. De DNA-PAINT in deze opstelling produceert een NeNA (nearest-neighbor-based analysis) precisie van 28,8 nm.
Figuur 1: Experimenteerworkflow van de adhesievoetafdruktest. (A) Montage van de stroomcel en de stroomkamer. (B) Oppervlaktepassivering en functionalisering. Elke incubatiestap wordt gemarkeerd door de duur, gevolgd door een wasstap. (C) Celrollend experiment en beeldvorming. Cellen die op het oppervlak rollen, ritsen het DNA uit waar adhesie-interacties zich vormen, waardoor ssDNA overblijft op het oppervlak dat de locatie van elke adhesiegebeurtenis markeert. Het oppervlak is gelabeld met de permanente imager ssDNA voor uitgebreide gebiedsbeeldvorming, waarbij 2 minuten vlekken nodig zijn voordat ze worden afgespoeld. Voor superresolutie DNA-PAINT-beeldvorming wordt de imager-streng in de buffer gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bioconjugatie karakterisering. (A) UV-VIS-absorptie van het Ni-NTA gezuiverde bioconjugatieproduct (blauw) en de curve fit (rood) om de conjugatieverhouding te bepalen. De absorptiespectra van ProtG (magenta), mal-ssDNA (groen) en imidazool (grijs) werden gebruikt als componenten om de beste pasvorm (rood) voor het productspectrum (blauw) te creëren. Het residu van de pasvorm wordt weergegeven als de zwarte stippellijn. Dit stelt ons in staat om de concentratie van ProtG en ssDNA in het gezuiverde bioconjugatieproduct en hun molaire verhouding te bepalen. (B) Native PAGE van componenten in de bioconjugatieprocedure. De eerste baan toont een DNA-ladder met een laag molecuulgewicht (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). Het gelbeeld is vals gekleurd, met DNA-kleuring GelGreen in groen en Coomassie blauwe eiwitvlek (omgekeerd) in magenta. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beeldverwerking en representatieve resultaten van uitgebreide gebiedsbeeldvorming. (A) Duizenden onbewerkte TIRF-beelden die een groot gebied betegelen. (B) Verlichtingsprofiel afgeleid van de onbewerkte afbeeldingen. (C) Gecorrigeerde beelden door het verlichtingsprofiel af te vlakken. (D) Gestikte afbeelding van onbewerkte afbeeldingstegels. Het ongelijke verlichtingsprofiel kan worden gezien als periodieke patronen in het beeld. De blauwe en rode vakken geven de afbeeldingssecties aan waar de gemiddelde intensiteitsprofielen worden geprojecteerd (blauwe en rode sporen). De gemiddelde intensiteitswaarden (willekeurige eenheid) vertegenwoordigen die van 8-bits afbeeldingen (0-255). (E) Hetzelfde gebied als (D), maar gestikt met afgeplatte afbeeldingen. De projecties laten geen grootschalige periodieke patronen zien. (F) Het schuifspanningsprofiel dat in de experimenten moet worden gebruikt om het bereik van schuifspanningen te bepalen die resulteren in celrollen en fluorescentiesporen opleveren. (G) Een fluorescerend monster van een enkele cel onder het in (F) afgebeelde stroomprofiel. De cel reist van links naar rechts, de fluorescentie-intensiteit neemt toe naarmate de schuifspanning toeneemt totdat de cel het rollen niet langer kan volhouden en loskomt van het oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve suboptimale en optimale resultaten. (A) Een voorbeeld van fluorescerende sporen met onvoldoende contrast. (B) Een voorbeeld van overmatige fluorescerende spoordichtheid. (C) Een voorbeeld van optimale spoordichtheid en contrast. Alle drie de beelden zijn onder dezelfde conditie verkregen, afgeplat en gestikt. De rode vakken in elke afbeelding vertegenwoordigen het gebied waar de intensiteitsprojecties (rechts) zijn genomen. (D) Een fluorescerend spoor weergegeven in diffractie-beperkte (linkerhelft) en DNA-PAINT (rechterhelft) beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Probleem | Mogelijke reden | Oplossing | |
| Epoxy tape niet goed gesneden | Epoxylaag te dik | Dun de epoxylaag zoveel mogelijk uit met het razerblad | |
| Lasergraveervermogen en -snelheid niet geoptimaliseerd | Optimaliseer het vermogen en de snelheid van lasergraveerders | ||
| Bubbels die aan de zijkanten van de stromingskamer zijn geplakt | Onjuiste initiële vloeistofinbrenging | Duw bufferoplossingen door het kanaal met een hoog debiet om de bubbels eruit te spoelen | |
| Bubbels gaan door stroomkamer | Onjuiste vloeistofinbrenging via in- en uitlaat | Zorg ervoor dat er een vloeistofdruppel op de inlaatbuis zit om vloeistof-op-vloeistofcontact tussen pipetpunt en de inlaat te garanderen | |
| Bubbels uit de spuit kwamen in de stroomleiding terecht | Kantel de spuitpomp om ervoor te zorgen dat er bellen vastzitten aan het uiteinde van de zuiger | ||
| Vloeistof kan geen kanalen binnendringen | Inlaten te strak vastgeschroefd | Aanpassen om de afdichting te optimaliseren. De inlaatslang moet gewoon de kanaalopening raken wanneer deze op de juiste manier is vastgeschroefd. | |
| Kanaallekkage | Epoxy is niet volledig uitgehard | Maak kanalen opnieuw, zorg voor het gebruik van 5 minuten snel uithardende epoxy en laat minstens 1 uur uitharden | |
| Inlaten sluiten niet goed af | Aanpassen om de afdichting te optimaliseren | ||
| Cellen vastgelopen | Slechte PEGylation leidt tot niet-specifieke binding | Idealiter, remake PEG. Bovendien kunt u proberen extra blokkeringsagenten (BSA & Tween-20) te incuberen en blokkeringsagenten toe te voegen om de buffer te wassen. | |
| Oppervlaktepassivering vernietigd door grote luchtbellen die door het kanaal gaan | Zorg ervoor dat er geen bubbels door het kanaal gaan | ||
| Probleem met de cellen | Gebruik HL-60 2 weken na het opnieuw opstarten van de celkweek van bevroren. Bevestig het rollen van cellen op het bedieningsoppervlak met alleen P-selectin. | ||
| Cellen hebben geen of hebben schaarse interacties met het oppervlak | P-selectinedichtheid te laag, als gevolg van slechte oppervlaktefunctionalisatie en/of slechte bioconjugatie | Gebruik eerst ProtG-biotine in plaats van ProtG-TGT als controle om te bepalen of het probleem te wijten is aan bioconjugatie of oppervlaktebiotinedichtheid. Na het waarborgen van de bioconjugatiekwaliteit en oppervlaktebiotinedichtheid, verhoogt u de TGT-ProtG- en P-selectine-Fc-concentratie en incubatietijd. | |
| Cellen rollen maar produceren geen fluorescerende sporen | Adhesie-interacties te zwak om TGT te scheuren | Verhoog de stroomsnelheid tijdens het rollend experiment om de interactiekracht te vergroten. We raden een eerste opvoerstroomprofiel aan (figuur 3F) om het optimale debiet te vinden dat zowel stabiele rol- als fluorescentiesporen produceert (figuur 3G) | |
| Oppervlak van slechte kwaliteit leidt tot hoge achtergrondfluorescentie en onvoldoende contrast om sporen te zien | Controleer de oppervlaktepassivering | ||
Tabel 1: Problemen oplossen. De tabel bevat de mogelijke redenen en oplossingen voor problemen die zich voordoen bij het uitvoeren van deze test
Aanvullend coderingsbestand 1: Het op maat geschreven MATLAB-script om het uiteindelijke productspectrum te ontbinden op basis van de drie eerder verzamelde spectra (ProtG, SMCC-streng, Ni-NTA-oplossingsbuffer) om de conjugatie-efficiëntie en verhouding van ProtG tot ssDNA te bepalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De adhesievoetafdruktest maakt visualisatie mogelijk van de moleculaire adhesiegebeurtenissen tussen PSGL-1 en P-selectine tijdens celrollende adhesie. Dit proces wordt geïnitieerd door P-selectin-gemedieerde opname gevolgd door rollen onder vloeistofschuifspanning. Mogelijke problemen tijdens het experiment hebben meestal betrekking op slecht rollen van cellen of het missen van fluorescerende sporen, zelfs als cellen goed rollen. Deze problemen zijn vaak het gevolg van kwaliteitscontroles bij de kritieke stappen in het protocol, zoals vermeld in de tabel voor probleemoplossing (tabel 1).
Biomoleculen en buffers moeten worden gefilterd en opgeslagen bij 4 °C om verontreiniging te voorkomen, omdat de oppervlaktevoorbereiding meerdere stappen omvat. Hoogwaardige oppervlaktepassivering is een vereiste om de juiste oppervlaktefunctionalisatiedichtheid te bereiken en de niet-specifieke binding van biomoleculen te verminderen. Niet-specifieke binding van biomoleculen aan het oppervlak kan een hoge fluorescentieachtergrond creëren, waardoor de fluorescentiebeeldvorming met één molecuul en statistische gegevensanalyse worden verstoord. Meerdere factoren kunnen de oppervlaktepassivering beïnvloeden. Hydrolyse van aminosilaan en PEG-NHS leveren een veel lagere efficiëntie van PEGylation op. Voldoende KOH-reiniging en piranha-reiniging verbeteren de hydrofilie door vrije hydroxylgroepen op het glasoppervlak te genereren, waardoor de dichtheid van de chemisch reactieve groep toeneemt. Cellen zouden vastzitten op slecht gepassiveerde oppervlakken. De kwaliteit van de oppervlaktepassivering wordt gecontroleerd door de achtergrondfluorescentie-intensiteit voor en na PEGylation te meten met behulp van fluorescerende biomoleculen.
De oppervlaktedichtheid van liganden is een kritische factor voor celrollen, die wordt geregeld door de PEG: PEG-biotineverhouding, TGT-hybridisatie en P-selectinebinding. In dit systeem is een PEG: PEG-biotineverhouding van 20:1 voldoende voor oppervlaktefunctionalisatie met voldoende P-selectine voor celrollen. Efficiënte TGT-hybridisatie verbetert ook de oppervlaktedichtheid en de signaal-ruisverhouding van de fluorescerende sporen. Dit protocol bevat een aanvullingsstap van top-streng-TGT-ProtG om ervoor te zorgen dat elke ongehybridiseerde TGT-onderste streng wordt aangevuld voordat experimenten worden uitgevoerd. Vervoeging van DNA naar ProtG heeft ook invloed op de oppervlaktedichtheid. Sulfo-SMCC linker werd toegevoegd aan DNA op 10-voudige molaire overmaat, zodat al het DNA reageerde met de linker. ProtG met een enkel cysteïneresidu (ProtG-Cys) aan de C-terminus werd gebruikt om een 1:1 DNA: ProtG-conjugatieverhouding te bereiken. Omdat de ProtG-Cys dimeren kunnen vormen door disulfidebindingen, is behandeling van TCEP nodig om de disulfidebinding te verminderen vóór sulfhydryl-reactieve cross-linking reacties. Eiwit-geconjugeerd DNA en TGT hybridisatie kunnen worden gevalideerd met native PAGE-analyse, waarbij geconjugeerd DNA en DNA-duplex de vertraagde mobiliteit als gevolg van de toename van het molecuulgewicht zullen laten zien. De efficiëntie van de assemblage kan ook worden geschat door geldensitometrie (figuur 2B). De zorgvuldige PEGylation- en bioconjugatieprocessen zijn cruciaal voor het produceren van een consistent oppervlak. Af en toe kan de celtoestand het rollen van de cel en de spoorvorming beïnvloeden. Hoewel PSGL-1-expressie over celdichtheid niet is gemeld, is celdichtheid een krachtige regulator van de celcyclus en eiwitexpressie tijdens de groeifase.
Aangezien PSGL-1 ook functioneert als een signaaltransductiereceptor en celproliferatie reguleert20,21, worden kweekomstandigheden zoals celdichtheid gehandhaafd voor een consistent expressieniveau en bindingsvermogen van PSGL-1. Aanhechting van P-selectin-Fc gemedieerd door ProtG op het oppervlak is cruciaal voor de hechting en het rollen van cellen. De bindingskinetiek van P-selectine aan ProtG is afhankelijk van de concentratie. Lagere concentraties P-selectine leiden tot een toename van de tijd om evenwicht te bereiken. Voor de verzadigingsbinding is ten minste 30 minuten nodig voor concentraties lager dan 100 nM22. 10 nM P-selectine werd gebruikt om de niet-specifieke binding aan het oppervlak te verminderen en de incubatietijd te verlengen voor voldoende interactie met ProtG. Een incubatie van 1 uur is voldoende tijd om celadhesie en rollen in dit systeem te induceren.
De TGT en de bijbehorende krachtafhankelijke levensduur is een belangrijke factor in de resultaten van deze test. Tijdens de rolhechting wordt de kracht op de tether overgedragen via zowel de TGT als de P-selectin: PSGL-1 interactie. Elk van deze individuele componenten heeft een unieke krachtafhankelijke levensduur en afhankelijk van de uitgeoefende kracht zal de breukkans de ene boven de andere bevoordelen. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat bij gebruik van de in dit artikel beschreven TGT, bij krachten onder 13,6 pN, P-selectine: PSGL-1 voornamelijk dissocieert, terwijl boven 13,6 pN, de TGT voornamelijk dissocieert13. Dit is belangrijk om te begrijpen bij het uitvoeren van deze test, want als de schuifspanning te laag is of de kralen te langzaam rollen, zullen de breukgebeurtenissen voornamelijk de P-selectine zijn: PSGL-1-interactie en er zal minimaal of geen meetbaar fluorescentiesignaal van de TGT's zijn. Ook de spanningsdrempel van de TGT zal van invloed zijn op de resultaten. Als de TGT bij een te hoge kracht scheurt, zullen de breukgebeurtenissen voornamelijk P-selectine zijn: PSGL-1, en zal er een minimaal fluorescentiesignaal zijn.
De hier beschreven methode maakt de analyse van de moleculaire breukkrachten mogelijk, evenals de locaties van moleculaire adhesiegebeurtenissen die betrokken zijn bij rollende adhesie. In plaats van real-time detectie van adhesie, is het belangrijkste voordeel van deze methode dat het beeldvorming en analyse na het experiment mogelijk maakt. Zodra de hechtingsvoetafdruk in de vorm van ssDNA op het oppervlak is achtergelaten, kunnen de sporen na 12 uur nog steeds worden afgebeeld als de stroomkanalen worden gehandhaafd in een koelkast van 4 ° C in een donkere vochtigheidskamer met zowel inlaten als uitlaten geblokkeerd om uitdroging te voorkomen. De interpretatie van de fluorescentie-uitlezing voor deze test is afhankelijk van de gekozen beeldvormingsmethode. Door middel van superresolutie beeldvorming bereikt deze test een hoge ruimtelijke resolutie (<50 nm) die kwantitatieve analyse van de dichtheid van gescheurde TGT's13 mogelijk maakt. De analyse van receptordichtheid of gescheurde TGT-dichtheid zou nuttig zijn bij het onderzoeken van rollend adhesiegedrag onder verschillende omstandigheden. Integendeel, diffractie-beperkte beeldvorming biedt geen hoge ruimtelijke resolutie; het maakt het echter mogelijk om een groot oppervlak in beeld te brengen om de fluorescentiesporen van meerdere kralen over honderden gezichtsvelden te analyseren. Dit is voordelig omdat de fluorescentie-intensiteit van een spoor kan worden geanalyseerd voor een enkele kraal over een grote afstand en informatie kan verschaffen over veranderingen in rolgedrag in de loop van de tijd. Zo'n voorbeeld is het veranderen van de schuifspanning in de loop van de tijd en het observeren van de overeenkomstige veranderingen in fluorescentie-intensiteit. Onlangs is aangetoond dat door middel van een eenvoudig model de fluorescentie-intensiteit van de sporen kan worden gebruikt om de moleculaire krachtverdeling te schatten13. Er is ook mogelijke toepassing van ratiometrische methoden om krachtkwantificering te bereiken met deze assay23.
Omdat het rollen van cellen snel gebeurt (10s van μm / s) en over een langere afstand (1000s van μm), is het bestuderen van hun moleculaire spanning een uitdaging geweest met traditionele real-time moleculaire spanningssensoren. De adhesievoetafdruktest doorbreekt deze veeleisende beperking om beeldvorming na de gebeurtenis mogelijk te maken. Hoewel de TGT-breuk niet direct de omvang van de spanning voorafgaand aan de breuk rapporteert, zijn er veelbelovende ontwikkelingen gemaakt in de analyse van de fluorescentiesporen om het kwantitatieve onderzoek van de moleculaire krachten die betrokken zijn bij de roladhesie mogelijk te maken13,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) en het Eminence Fund van de University of British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
