Summary
Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.
Abstract
L’adhésion roulante, facilitée par des interactions médiées par la sélection, est une motilité passive très dynamique dans le recrutement des leucocytes sur le site de l’inflammation. Ce phénomène se produit dans les veinules postcapillaires, où le flux sanguin pousse les leucocytes dans un mouvement roulant sur les cellules endothéliales. Un laminage stable nécessite un équilibre délicat entre la formation de liaisons d’adhérence et leur dissociation mécanique, permettant à la cellule de rester attachée à la surface tout en roulant dans le sens de l’écoulement. Contrairement à d’autres processus d’adhérence se produisant dans des environnements relativement statiques, l’adhérence au roulement est très dynamique car les cellules de laminage se déplacent sur des milliers de microns à des dizaines de microns par seconde. Par conséquent, les méthodes de mécanobiologie conventionnelles telles que la microscopie à force de traction ne conviennent pas à la mesure des événements d’adhésion individuels et des forces moléculaires associées en raison de la courte échelle de temps et de la sensibilité élevée requises. Ici, nous décrivons notre dernière implémentation du test d’empreinte d’adhérence pour imager les interactions P-selectin: PSGL-1 dans l’adhésion laminée au niveau moléculaire. Cette méthode utilise des attaches de jauge de tension irréversibles à base d’ADN pour produire un historique permanent des événements d’adhésion moléculaire sous la forme de pistes de fluorescence. Ces pistes peuvent être imagées de deux manières: (1) assembler des milliers d’images limitées par diffraction pour produire un grand champ de vision, permettant l’extraction de l’empreinte d’adhérence de chaque cellule roulante sur des milliers de microns de longueur, (2) effectuer DNA-PAINT pour reconstruire des images super-résolution des pistes de fluorescence dans un petit champ de vision. Dans cette étude, le test d’empreinte d’adhérence a été utilisé pour étudier les cellules HL-60 roulant à différentes contraintes de cisaillement. Ce faisant, nous avons pu imager la distribution spatiale de l’interaction P-selectin: PSGL-1 et mieux comprendre leurs forces moléculaires grâce à l’intensité de la fluorescence. Ainsi, cette méthode fournit les bases de l’étude quantitative des différentes interactions cellule-surface impliquées dans l’adhésion au roulement au niveau moléculaire.
Introduction
La cascade d’adhésion roulante décrit comment les cellules circulantes s’attachent et roulent le long de la paroi des vaisseaux sanguins1. Le laminage passif est principalement médié par les sélectines, une classe majeure de molécules d’adhésion cellulaire (MCA)1. Sous le flux de cisaillement du sang, les leucocytes exprimant le ligand 1 de la glycoprotéine P-sélectine (PSGL-1) forment des liaisons hautement transitoires avec la P-sélectine, qui peuvent être exprimées à la surface des cellules endothéliales enflammées. Ce processus est essentiel pour que les leucocytes migrent vers un site d’inflammation2. En outre, PSGL-1 est également un récepteur mécanosensible capable de déclencher l’étape d’adhésion ferme ultérieure de la cascade d’adhésion roulante lors de son engagement avec P-selectin3.
Les mutations génétiques affectant la fonction CAM peuvent affecter gravement le système immunitaire, comme dans la maladie rare du déficit en adhésion leucocytaire (LAD), où le dysfonctionnement des molécules d’adhésion médiant le roulement conduit à des individus gravement immunodéprimés4,5,6. En outre, il a été démontré que les cellules tumorales circulantes migrent à la suite d’un processus de roulement similaire, conduisant à des métastases7,8. Cependant, parce que le laminage cellulaire est rapide et dynamique, les méthodes expérimentales conventionnelles de mécanobiologie ne conviennent pas à l’étude des interactions moléculaires pendant le laminage cellulaire. Bien que les méthodes de manipulation à cellule unique et à molécule unique telles que la microscopie à force atomique et la pince optique aient pu étudier les interactions moléculaires telles que l’interaction dépendante de la force de la P-sélectine avec PSGL-1 au niveau de la molécule unique9, elles ne conviennent pas à l’étude des événements d’adhésion en direct pendant le roulement cellulaire. De plus, l’interaction caractérisée in vitro ne peut pas répondre directement à la question de l’adhésion moléculaire in vivo. Par exemple, quelle plage de tension moléculaire est biologiquement pertinente lorsque les cellules fonctionnent dans leur environnement natif? Les méthodes de calcul telles que la simulation de la dynamique des adhésifs10 ou le modèle simple à l’état d’équilibre11 ont capturé certains détails moléculaires et leur influence sur le comportement de roulement, mais dépendent fortement de la précision des paramètres et des hypothèses de modélisation. D’autres techniques telles que la microscopie à force de traction peuvent détecter les forces lors de la migration cellulaire, mais ne fournissent pas une résolution spatiale suffisante ou des informations quantitatives sur la tension moléculaire. Aucune de ces techniques ne peut fournir d’observations expérimentales directes de la dynamique temporelle, de la distribution spatiale et de l’hétérogénéité de magnitude des forces moléculaires, qui sont directement liées à la fonction et au comportement des cellules dans leur environnement natif.
Par conséquent, la mise en œuvre d’un capteur de force moléculaire capable de mesurer avec précision les interactions médiées par la sélection est cruciale pour améliorer notre compréhension de l’adhérence au roulement. Nous décrivons ici le protocole pour le test d’empreinte d’adhérence12 où des billes revêtues de PSGL-1 sont roulées sur une surface présentant des attaches de jauge de tension fonctionnalisées p-selectin (TGT)13. Ces TGT sont des capteurs de force irréversibles basés sur l’ADN qui entraînent un historique permanent des événements de rupture sous forme de lecture de fluorescence. Ceci est réalisé par la rupture du TGT (dsDNA), puis le marquage ultérieur du TGT rompu (ssDNA) avec un brin complémentaire marqué par fluorescence. L’un des principaux avantages de ce système est sa compatibilité avec l’imagerie à diffraction limitée et l’imagerie à super résolution. Le brin complémentaire marqué par fluorescence peut être lié de manière permanente (>12 pb) pour l’imagerie à diffraction limitée ou transitoirement lié (7-9 pb) pour l’imagerie à super-résolution par DNA PAINT. Il s’agit d’un système idéal pour étudier l’adhérence au laminage car les TGT sont rompus pendant le laminage actif, mais la lecture de fluorescence est analysée après le laminage. Les deux méthodes d’imagerie offrent également à l’utilisateur plus de liberté pour étudier l’adhérence au roulement. En règle générale, l’imagerie à diffraction limitée est utile pour extraire la force de rupture moléculaire par l’intensité de fluorescence13, tandis que l’imagerie à super-résolution permet une analyse quantitative de la densité des récepteurs. Avec la capacité d’étudier ces propriétés d’adhérence au laminage, cette approche fournit une plate-forme prometteuse pour comprendre le mécanisme de régulation de la force sur l’adhésion moléculaire des cellules de laminage sous écoulement de cisaillement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Marquage et hybridation des oligonucléotides
- Réduction des liaisons disulfure de protéine G
- Dissoudre 10 mg de protéine G (ProtG) dans 1 mL d’eau ultrapure.
REMARQUE: La protéine G ici est modifiée avec un seul résidu de cystéine à l’extrémité C et une étiquette poly-histidine N-terminus. - Échange tampon ≥20 μL de ProtG (10 mg/mL) en 1x PBS (pH 7,2) avec une colonne P6.
- Mesurer la concentration en protéines après échange de tampon.
REMARQUE: Concentration typique de 7-8 mg / mL. - Préparer 120 mM de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) en dissolvant 3 mg de TCEP dans 90 μL de 1x PBS (pH 7,2) suivi de 10 μL de 0,5 M EDTA.
REMARQUE: TCEP doit être fraîchement préparé. - Ajouter 4 μL de TCEP de 120 mM (480 nmol) à 20 μL de ProtG (4-5 nmol).
REMARQUE: Visez un rapport molaire d’environ 100: 1 TCEP à la protéine. - Laissez la réaction se poursuivre pendant 30 min à température ambiante (RT).
- Enlevez l’excès de TCEP du ProtG réduit avec une colonne P6 (tampon échangé en 1x PBS, pH 7,2).
- Mesurez la concentration du ProtG réduit avec un spectrophotomètre UV/Vis et enregistrez les spectres.
REMARQUE: Concentration typique de 3,5-4,5 mg / mL.
- Dissoudre 10 mg de protéine G (ProtG) dans 1 mL d’eau ultrapure.
- Réaction d’ADNSs marqué aux amines avec Sulfo-SMCC
- Dissoudre l’ADNSs amine marqué (amine-ADNS) dans de l’eau sans nucléase à une concentration de 1 mM. Vérifiez la concentration du brin à l’aide d’un spectrophotomètre UV/Vis.
- Préparer une solution de sulfo-SMCC de 11,5 mM (un réticulant hétéro-bifonctionnel avec ester de sulfo-NHS et maléimide) fraîche en dissolvant 2 mg de sulfo-SMCC dans 400 μL d’eau ultrapure et de vortex à mélanger.
- Ajouter 6 μL de 1 mM d’amine-SsDNA (6 nmol) à 5,2 μL de 11,5 mM de sulfo-SMCC (60 nmol) et 88,8 μL de 1x PBS (pH 7,2). Vortex pendant 5 s suivi d’une centrifugation à 8600 x g pendant 3 min.
- Laissez la réaction se poursuivre pendant 30 min à RT.
- Éliminer l’excès de sulfo-SMCC de l’ADNs-amine conjugué au CCSM (mal-ADNS) à l’aide d’une colonne P6 (tampon échangé en 1x PBS, pH 7,2).
- Mesurez la concentration du mal-ssDNA avec un spectrophotomètre UV/Vis et enregistrez les spectres.
REMARQUE: Concentration typique de 35-45 μM.
- Conjugaison ProtG-ssDNA
- Ajouter 21 μL de ProtG réduit de 4,5 mg/mL (3 nmol) au mal-ssDNA (~4-5 nmol).
REMARQUE: Les volumes et les concentrations sont ici des valeurs typiques. Ajuster en fonction de la mesure expérimentale individuelle. Assurez-vous toujours d’une quantité excessive de mal-ssDNA par rapport à ProtG dans un rapport de ~ 1,5: 1. - Vortex pendant 5 s et laisser la réaction se dérouler pendant 3 h à RT.
- Ajouter 21 μL de ProtG réduit de 4,5 mg/mL (3 nmol) au mal-ssDNA (~4-5 nmol).
- Purification et caractérisation de l’ADNS ProtG-ssDNA
- Purifier le ProtG-ssDNA conjugué grâce à son isolement avec des billes magnétiques d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA).
- Retirer l’excès d’imidazole (tampon d’élution Ni-NTA) du produit à l’aide d’une colonne P6 (tampon échangé en 1x PBS, pH 7,2).
NOTE: Cette étape est essentielle pour quantifier la conjugaison, car l’imidazole a une absorption significative à 280 nm. - Utilisez un spectrophotomètre UV/Vis pour enregistrer les spectres du produit ProtG-ssDNA ainsi que le tampon d’élution Ni-NTA (1x).
REMARQUE: L’absorbance typique de ProtG-ssDNA à 260 nm et 280 nm est de 0,8 et 0,6, respectivement. - Pour déterminer l’efficacité de conjugaison et le rapport de ProtG à ssDNA, utilisez le script MATLAB écrit sur mesure (fichier de codage supplémentaire 1) pour décomposer le spectre du produit final en fonction des trois spectres collectés précédemment (ProtG, BRIN SMCC, tampon d’élution de billes Ni-NTA).
REMARQUE : En bref, le code fonctionne comme décrit dans les étapes 1.4.5 à 1.4.8. La concentration typique est de 4 μM de ProtG-ssDNA avec ProtG et ssDNA à un rapport molaire d’environ 1:1 (Figure 2A). - Entrez ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer et les spectres ProtG-ssDNA UV/Vis dans le script MATLAB
- Effectuer une minimisation non linéaire multidimensionnelle sans contrainte pour reconstruire les spectres ProtG-ssDNA à partir des spectres sources (spectres tampon d’élution protG, BRIN SMCC et Tampon d’élution de perle Ni-NTA)
REMARQUE: La fonction de minimisation produit trois facteurs de transformation, un pour chaque spectre source. - Reconstruisez les spectres ProtG-ssDNA en multipliant les spectres par leur facteur correspondant et en combinant les spectres sources transformés.
- Multiplier la concentration initiale du Brin ProtG et du brin SMCC par les facteurs de transformation correspondants pour déterminer les concentrations du brin SMCC et du ProtG dans le produit ProtG-ssDNA.
- (FACULTATIF) Exécutez PAGE natif conformément à la Figure 2B pour vous assurer que chaque composant et étape fonctionne comme prévu.
- Hybridation TGT
- Hybrider ProtG-ssDNA (brin supérieur) avec le brin inférieur biotinylé à un rapport molaire de 1,2:1 avec des concentrations de 240 nM et 200 nM respectivement dans le tampon T50M5 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) pour hybrider la construction TGT complète. Laisser hybrider à RT ≥1 h.
2. PEGylation de surface
- Nettoyage des surfaces
- Nettoyez une fiole d’Erlenmeyer et deux pots de coloration pour chaque 8 couvercles. Remplissez chaque récipient avec une solution KOH de 1 M et soniquez pendant 1 h à RT. Lavez soigneusement chaque récipient avec de l’eau ultrapure et séchez-le avec du N2 ou dans un four.
REMARQUE: Remplissez le KOH en haut pour toucher le couvercle, afin qu’ils soient également nettoyés. - Rincez soigneusement chaque couvercle avec de l’eau ultrapure et placez-les dans l’un des pots de coloration nettoyés.
REMARQUE: Assurez-vous qu’ils ne sont pas collés les uns aux autres ou à la paroi des pots de coloration. - Dans une hotte, préparer fraîchement une solution de piranha en ajoutant 30 mL de peroxyde d’hydrogène (30%) à 90 mL d’acide sulfurique concentré (95%-98%) dans un bécher de 250 mL.
ATTENTION : L’acide sulfurique concentré est très corrosif. Ajouter le peroxyde d’hydrogène très lentement à l’acide sulfurique et faire tourbillonner soigneusement pour mélanger. - Immergez complètement les couvercles dans le pot de coloration avec la solution de piranha. Laissez les couvercles dans le piranha pendant 30 minutes dans la hotte.
ATTENTION : Refroidir la solution de piranha à une température maximale de 80 °C avant de la verser pour éviter de fissurer le pot de coloration. - Jeter la solution de piranha dans un bécher de 1000 ml et neutraliser avec le KOH de 1 M du nettoyage du verre.
- (FACULTATIF) Répétez le nettoyage du piranha (étapes 2.1.3-2.1.5) avec une solution de piranha fraîche.
- Rincez les couvercles avec de grandes quantités d’eau ultrapure pour éliminer toute solution résiduelle de piranha. Secouez doucement le pot de coloration à chaque levée pour faciliter l’élimination (10 rinçages sont recommandés).
- Rincez les couvercles avec du méthanol 3 fois pour éliminer l’eau de la surface du couvercle et garder les couvercles immergés dans le méthanol.
- Nettoyez une fiole d’Erlenmeyer et deux pots de coloration pour chaque 8 couvercles. Remplissez chaque récipient avec une solution KOH de 1 M et soniquez pendant 1 h à RT. Lavez soigneusement chaque récipient avec de l’eau ultrapure et séchez-le avec du N2 ou dans un four.
- Silanisation de surface
- Préparer une solution d’aminosilane à 1 % en mélangeant soigneusement 94 mL de méthanol, 1 mL d’aminosilane et 5 mL d’acide acétique glacial dans la fiole d’Erlenmeyer nettoyée et séchée. Verser dans le deuxième pot de coloration nettoyé et séché14.
- Transférer les couvercles immergés sous la solution de méthanol dans le pot de coloration contenant une solution d’aminosilane à 1% et garder le pot couvert.
REMARQUE: Ne laissez pas les couvercles sécher pendant le transfert à l’aminosilane pour limiter l’exposition de la surface du verre à l’air. - Incuber le pot de coloration contenant des couvercles dans de l’aminosilane pendant 1 h à 70 °C dans un four15.
- Jetez soigneusement la solution d’aminosilane dans un récipient à déchets séparé et rincez les couvercles dans le pot de coloration avec du méthanol 5 fois pour éliminer la solution d’aminosilane.
- Rincez les couvercles dans le pot de coloration avec de l’eau ultrapure 5 fois et séchez-les avec du N2.
- Cuire les couvercles séchés dans le pot de coloration dans un four à 110 °C pendant 20 min. Laissez les couvercles refroidir à RT, puis placez-les sur le rack PEGylation.
REMARQUE: Couvrez le pot de coloration avec un couvercle pendant la cuisson pour minimiser les dépôts particuliers et chimiques sur la surface15.
- Préparation de la solution PEG
- Décongeler le PEG (polyéthylène glycol) et le PEG-biotine en RT pendant environ 30 min.
REMARQUE: Cette étape minimise la condensation de l’humidité qui peut dégrader l’ester NHS sur PEG. - Faire tampon PEG en ajoutant 84 mg de bicarbonate de sodium à 10 mL d’eau ultrapure. Cette formulation doit fournir un tampon à pH 8,4.
- Pour 8 coverslips, chacun avec un côté PEGylated avec 20:1 PEG:PEG-biotine: mesurez 100 mg de PEG et 5 mg de PEG-biotine pour ajouter à 400 μL de tampon PEG. Vortex la solution pendant 30 s et centrifuger pendant 1 min à la vitesse maximale (≥18000 x g).
REMARQUE: Cette étape est sensible au temps, car l’hydrolyse de l’ester SVA NHS commence immédiatement et a une demi-vie de 34 minutes à pH 8,0, avec une demi-vie plus courte à pH 8,4.
- Décongeler le PEG (polyéthylène glycol) et le PEG-biotine en RT pendant environ 30 min.
- Incubation de PEG et stockage par couvercle
- Installez la chambre d’humidité et placez les couvercles à l’intérieur.
- Ajouter 90 μL de solution de PEG à un couvercle dans la chambre d’humidité et placer un deuxième couvercle sur le dessus de la solution de PEG à l’aide d’une pince à pince à couvercle pour répartir uniformément la solution de PEG.
- Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la solution tombée sur le couvercle. Abaissez une extrémité du deuxième couvercle sur le premier couvercle et laissez tomber lentement l’autre extrémité afin qu’il n’y ait pas de bulles prises en sandwich entre les couvercles.
REMARQUE: Les bulles entraîneront une mauvaise peGylated de certaines zones. - Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les couvercles aient du PEG (c.-à-d. 8 couvercles = 4 sandwichs PEG). Incuber les solutions PEG pendant la nuit (~12 h) à RT dans une chambre d’humidité dans l’obscurité16.
- Séparez les paires de couvercles et placez-les dans un pot à taches. Notez les côtés PEGylated.
- Rincez soigneusement les couvercles à l’eau ultrapure et séchez-les avec du N2.
REMARQUE: Tenez les couvercles avec une pince à épiler et soufflez du N2 sur la surface vers la pince à épiler pour empêcher les contaminants de sécher sur la surface. - Marquez le côté non PEGylated avec un point dans un coin à l’aide d’un marqueur permanent ou d’un stylo diamanté.
- Placez 2 couvercles PEGylated dans des tubes postaux avec les côtés PEGylated face à face pour aider à identifier le côté PEGylated avant utilisation.
- Aspirez le tube pendant 5 min et remplissez-le avec du N2. Scellez le tube avec un parafilm.
- Conservez les couvercles PEGylated à -20 °C dans les tubes postaux scellés jusqu’à 6 mois.
REMARQUE: Réchauffez les tubes de stockage à RT avant l’assemblage de la puce. La condensation sur les couvercles pendant l’étanchéité provoquera des fuites.
3. Préparation de la chambre d’écoulement
- Assemblage de puces
- Étaler finement une petite quantité d’époxy des deux côtés du ruban adhésif double face avec une lame de rasoir.
REMARQUE: Trop d’époxy peut se propager dans le canal pendant l’assemblage. - Découpe au laser du ruban enduit d’époxy pour créer 4 canaux. Créez la puce d’écoulement en prenant en sandwich le ruban époxy entre une glissière à 4 trous et un couvercle PEG (Figure 1A).
- À l’aide d’une pointe de pipette, appliquez une légère pression sur toute la longueur des canaux pour créer une bonne étanchéité. Durcir l’époxy pendant ≥1 h.
REMARQUE: Ne cisaillez pas le verre pour éviter de glisser contre l’époxy.
- Étaler finement une petite quantité d’époxy des deux côtés du ruban adhésif double face avec une lame de rasoir.
- Assemblée de la Chambre
- Alignez la puce de manière à ce que l’ouverture de chaque canal soit positionnée au centre de l’adaptateur (Figure 1A). Placez deux entretoises en acrylique transparent sur le dessus de la puce, appliquez une pression ferme au milieu du bloc et vissez deux vis 4-40 aux extrémités de chaque entretoise.
REMARQUE: Ne forcez pas la vis ou appuyez trop fort sur les entretoises, sinon la puce pourrait se fissurer. - De l’autre côté du support, vissez les entrées dans les trous filetés. Surveillez l’état d’étanchéité à travers le bloc acrylique transparent.
- Lorsque le tube entre en contact avec l’ouverture de la puce, scellez la connexion en tordant doucement le tube dans le sens des aiguilles d’une montre.
REMARQUE: Les entrées trop serrées peuvent provoquer un blocage de l’écoulement, tandis que les contacts lâches provoqueront des fuites.
- Alignez la puce de manière à ce que l’ouverture de chaque canal soit positionnée au centre de l’adaptateur (Figure 1A). Placez deux entretoises en acrylique transparent sur le dessus de la puce, appliquez une pression ferme au milieu du bloc et vissez deux vis 4-40 aux extrémités de chaque entretoise.
4. Préparation de la surface
REMARQUE : Reportez-vous à la Figure 1B pour le flux de travail global.
- Agents bloquants pour empêcher la liaison non spécifique
- Utilisez une pipette pour faire couler 200 μL de tampon de lavage (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 et 2 mM CaCl2, 0,05 % Tween 20) dans la chambre pour vérifier les fuites. Si des bulles se forment dans le canal, poussez agressivement 200 μL supplémentaires pour éliminer les bulles.
REMARQUE: Les grosses bulles d’air non enlevées à cette étape peuvent déloger et détruire la fonctionnalisation de la surface plus tard. - Ajouter 40 μL de BSA (1 % p/v) à la chambre d’écoulement pour éviter toute liaison non spécifique et incuber pendant 10 min.
- Assurez-vous d’ajouter suffisamment de volume pendant chaque période d’incubation pour remplir les chambres d’écoulement et former des gouttelettes aux entrées et aux sorties. Ajustez les volumes d’incubation en conséquence et effectuez toutes les incubations dans une chambre d’humidité.
- Ajouter 40 μL de Tween 20 (5 % v/v) à la chambre d’écoulement. Incuber pendant 10 min pour réduire davantage la liaison non spécifique.
- (FACULTATIF) Vérifiez que la surface n’est passivée adéquatement en faisant couler des billes de polystyrène à travers le canal. Ajouter 40 μL de billes de polystyrène revêtues de ProtG (0,01 % p/v) et imager à l’aide d’un microscope à fond noir avec objectif 10x. Si les perles n’adhèrent pas à la surface, passez à l’étape suivante.
- Lavez le canal avec 200 μL de tampon de lavage pour éliminer tous les agents de passivation.
- Utilisez une pipette pour faire couler 200 μL de tampon de lavage (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 et 2 mM CaCl2, 0,05 % Tween 20) dans la chambre pour vérifier les fuites. Si des bulles se forment dans le canal, poussez agressivement 200 μL supplémentaires pour éliminer les bulles.
- Fonctionnalisation de la surface de la chambre
- Ajouter 40 μL de streptavidine (100 μg/mL) dans la chambre d’écoulement et incuber pendant 20 min. Ensuite, lavez avec 200 μL de tampon de lavage.
- Ajouter 40 μL de ProtG-TGT hybridé (100 nM) à la chambre d’écoulement et incuber pendant 20 min. Ensuite, lavez avec un tampon de lavage de 200 μL.
- Ajouter 40 μL de brin supérieur ProtG-TGT (100 nM) pendant 20 min pour compléter tout brin inférieur TGT non hybridé sur la surface. Laver avec 200 μL de tampon de lavage.
- Ajouter 40 μL de P-selectin-Fc (10 μg/mL) dans la chambre d’écoulement et incuber pendant 60 min. Ensuite, lavez avec 200 μL de tampon de lavage.
REMARQUE: La durée d’incubation est critique.
5. Expérience et imagerie
- Configuration du système de flux
- Remplissez une seringue en verre de 5 mL avec le tampon de laminage (HBSS avec 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue en tapotant les côtés de la seringue pour déloger les bulles et en les poussant vers l’extérieur lorsqu’elles flottent vers la pointe.
- Insérez une aiguille stérile (26 G, longueur de 5/8 pouce) dans un tube en polyéthylène d’environ 200 mm (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) et connectez l’aiguille à la seringue en verre.
REMARQUE: Assurez-vous qu’aucun air n’est emprisonné n’importe où dans le connecteur de l’aiguille. - Fixez la seringue sur la pompe à seringue et inclinez la pompe à seringue de manière à ce que le côté du piston soit surélevé pour empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le canal. Insérez l’extrémité du tube dans l’entrée de la chambre d’écoulement.
REMARQUE: Assurez-vous du contact liquide-liquide lors de la connexion en déposant des gouttelettes sur les entrées et en ayant des gouttelettes à l’extrémité du tuyau de la seringue. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne pénètre dans le canal en laissant une petite goutte se former à l’extrémité du tube de la seringue avant de l’insérer dans l’entrée. - Insérez une extrémité d’un autre 200 mm du tube en polyéthylène dans la sortie, et l’autre extrémité immergée dans un bécher à déchets.
- Configuration pour le roulement de cellules
- Cultiver des cellules HL-60 dans des flacons de culture ventilés de 25 cm2 dans des milieux IMDM complétés par 20% de sérum bovin fœtal et 1% d’antibiotiques à 37 °C avec 5% de CO2. Maintenir des densités cellulaires comprises entre 1 x 105-2 × 106 cellules/mL.
- (FACULTATIF) Différencier les cellules HL-60 dans un milieu IMDM complet contenant 1,25% de DMSO à une densité initiale de 2 x 105 cellules/mL. Incuber les cellules pour être plus actives pendant 5-6 jours.
- Prélever un échantillon (1-2 mL) de la suspension cellulaire et centrifuger (200 x g, 3 min) pour granuler les cellules.
- Retirez le milieu et remettez doucement les cellules en suspension dans 500 μL du tampon de laminage. Répétez l’étape de lavage deux fois pour éliminer les débris cellulaires.
- Mesurez la densité cellulaire avec un hémocytomètre. Remettre en suspension les pastilles de cellules avec un tampon de laminage à une densité de 2 x 105 cellules/mL.
- Débranchez soigneusement le tube des entrées/sorties et pipettez 40 μL de la suspension de la cellule dans la chambre d’écoulement. Reconnectez le tube comme décrit précédemment, assurez-vous qu’aucune bulle n’est introduite dans le canal d’écoulement.
- Commencez l’expérience de laminage cellulaire en démarrant la pompe à seringue aux débits souhaités.
REMARQUE : L’intensité des pistes fluorescentes dépend de la contrainte de cisaillement, et une contrainte de cisaillement de cellule plus faible/vitesse de cellule produira généralement des pistes de gradation (Figure 4A). Évitez une densité de cellules élevée à la surface ou une durée de laminage excessive pour assurer la séparation des voies à cellule unique (Figure 4B, C). - Utilisez un microscope à fond noir avec un objectif 10x pour vous assurer que le roulement des cellules est observé.
- Une fois l’expérience terminée, retirez les cellules du canal en injectant le tampon de laminage à 100 mL / h jusqu’à ce que la surface soit exempte de cellules.
- Imagerie de pistes locales par « Accumulation de points basée sur l’ADN pour l’imagerie en topographie à l’échelle nanométrique » (DNA-PAINT)
- Ajouter 40 μL de brin imageur ADN-PAINT (500 pM) dans le tampon DNA-PAINT (0,05 % Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) au canal.
- Effectuer une microscopie à fluorescence totale par réflexion interne (TIRF) à l’aide d’une lentille d’objectif TIRF à immersion dans l’huile 100x. Acquérez plus de 40000 images avec un temps d’exposition de 25 ms par image à un gain de multiplication d’électrons (EM) de 300 à l’aide d’une caméra EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device).
- Utilisez le progiciel Picasso17 pour localiser et restituer les images en super-résolution (Figure 4D) en suivant les étapes 5.3.4 à 5.3.5.
- Chargez le film DNA-PAINT dans le programme Localize pour déterminer la localisation de chaque fluorophore dans chaque image.
REMARQUE: Optimisez la longueur latérale de la boîte et les paramètres Min. Net Gradient jusqu’à ce que seuls les fluorophores soient suivis avec précision. Min. Le paramètre Net Gradient peut souvent aller au-dessus de 100000 pour obtenir un suivi optimal. Réglage de l’ajustement: MLE, méthode gaussienne intégrée produit le meilleur résultat. Enfin, si le film est trop long, divisez-le en piles de 10000 images afin que le suivi de l’aperçu dans Localize fonctionne correctement avant de les recombiner dans un fichier hdf5 final. - Ensuite, chargez le fichier hdf5 résultant dans le programme Render pour effectuer la correction et le rendu de la dérive.
REMARQUE: Effectuez plusieurs corrections de dérive via Undrift par RCC pour améliorer le résultat final.
- Imagerie de longues pistes par étiquetage permanent
- Ajoutez le brin d’imageur permanent et incubez pendant 120 s dans le tampon T50M5. Lavez le canal en injectant 200 μL de tampon de lavage.
- Enregistrez une image avec le laser d’excitation désactivé pour obtenir le bruit de fond de la caméra. Imagez une grande surface dans un motif de grille par microscopie TIRF.
REMARQUE: Le chevauchement d’image sur image de ≥10% est recommandé pour les coutures ultérieures. - Programmez le microscope pour qu’il scanne sur une surface de 400 x 50 images (20000 images au total). En utilisant le programme FIJI, divisez les données brutes en fichiers tiff individuels, chacun contenant un maximum de 10000 images.
- Aplatissez toutes les images à l’aide du profil d’éclairage (Figure 3A-C) en suivant les étapes 5.4.5 à 5.4.7.
- Soustrayez le bruit de la caméra de fond de chaque image. Obtenez la projection moyenne de la pile (profil d’éclairage) de chaque image soustraite en arrière-plan.
- Normalisez le profil d’éclairage par sa valeur maximale. Divisez chaque image soustraite d’arrière-plan par le profil d’éclairage normalisé.
- Redimensionnez les images corrigées à la plage appropriée pour la profondeur de bits correspondante.
- Utilisez MIST18 pour assembler les images (Figure 3D,E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le protocole ci-dessus décrit la procédure expérimentale du test d’empreinte d’adhérence. Le flux de travail général de l’expérience est illustré à la Figure 1, de l’assemblage de la chambre d’écoulement (Figure 1A) à la fonctionnalisation de surface (Figure 1B) et aux étapes d’expérimentation et d’imagerie (Figure 1C).
La figure 2 est un résultat représentatif de la caractérisation de la bioconjugation de l’ADNS ProtG-ssDNA. Les spectres UV/Vis de trois composants du produit final, à savoir le ProtG, le mal-aDNS et le tampon d’élution de l’imidazole, ont été collectés avant la conjugaison finale (figure 2A), chacun correspondant à une concentration connue. Ces spectres forment la base orthogonale pour s’adapter au spectre des produits de bioconjugation, où les trois paramètres inconnus sont leurs concentrations. Une fonction personnalisée dans MATLAB a été utilisée pour déterminer les concentrations. Les résultats montrent un rapport de près de 1:1 de ProtG à l’ADNSS (Figure 2A). C’est comme prévu parce que l’ADNSs n’a qu’une seule modification amine, et le ProtG a une seule cystéine conçue à son terminus C. Cette approche est plus avantageuse que l’approche précédemment rapportée19 utilisant un seul ADN modifié au thiol pour cibler la multitude d’amines primaires sur ProtG, où le rapport de conjugaison ne peut pas être facilement maintenu.
De plus, page native a été utilisée pour confirmer la bioconjugation (figure 2B). L’ADN est coloré par GelGreen et les protéines par le bleu de Coomassie, respectivement. Comme GelGreen colore l’ADNds plus fortement que l’ADNss, on s’attend à ce que toutes les bandes d’ADNSs soient plus faibles que la concentration molaire égale des bandes d’ADNds (voies 3, 4). Étant donné que le ProtG stock contient un résidu de cystéine C-terminal, une fraction des protéines forment des dimères par une liaison disulfure, comme on le voit dans la voie 5 (Figure 2B). Le ProtG réduit, en revanche, montre une seule bande (voie 6). Lors de l’utilisation directe du ProtG de base dans la conjugaison de l’ADN, le ProtG dimérisé au disulfure ne réagit pas à l’ADN et apparaît sous forme de bande sans aucune coloration GelGreen (voies 7, 8). La bande dimère ProtG disparaît dans le produit de conjugaison en utilisant ProtG réduit (voies 9, 10). Étant donné qu’un excès de mal-ssDNA en ProtG (1,5:1) est utilisé pendant la conjugaison, seules les bandes TGT sont visibles dans le produit de conjugaison final (voies 8, 10). Les bandes GelGreen brillantes coïncidant avec la bande monomère ProtG indiquent une conjugaison réussie et un bon rendement.
La figure 3 illustre des images de microscopie brute représentatives et le flux de travail pour les corriger en vue d’une assemblage et d’une analyse d’images ultérieurs. Le profil d’éclairage TIRF introduit à partir d’une fibre monomode est généralement plus lumineux au milieu du champ de vision et plus faible autour des bords (Figure 3A, B). Pour compenser l’éclairage inégal et aplatir les images pour une analyse quantitative, le profil d’éclairage a été déterminé en faisant la moyenne de milliers d’images individuelles (Figure 3B). Les images aplaties ont été produites en soustrayant le bruit de la caméra des profils bruts et d’éclairage, puis en normalisant par le profil d’éclairage (Figure 3C). L’effet de l’aplatissement de l’image est clairement illustré lorsque les images sont assemblées pour former une grande image. L’intensité de l’image dans les régions d’arrière-plan sans aucune trace de cellule montre des motifs périodiques clairs correspondant aux images non corrigées (Figure 3D). Le même champ de vision assemblé à partir d’images aplaties produit un arrière-plan plat (Figure 3E). Avoir un arrière-plan plat est essentiel pour interpréter les fluctuations d’intensité le long d’une piste de cellule. Dans un premier temps, un profil d’écoulement de montée en puissance similaire à celui illustré à la figure 3F est utilisé pour déterminer la plage de contrainte de cisaillement appropriée à l’expérience, garantissant à la fois un laminage stable des cellules et des pistes de cellules fluorescentes claires. Une empreinte d’adhérence typique d’une seule cellule sous ce profil d’écoulement est illustrée à la figure 3G, où l’intensité augmente à mesure que la contrainte de cisaillement augmente jusqu’à ce que la cellule ne puisse plus supporter le laminage à une contrainte de cisaillement élevée et se détacher de la surface, marquant l’extrémité d’une seule voie.
La figure 4 illustre les résultats expérimentaux potentiels, qu’il s’agisse de résultats expérimentaux représentatifs sous-optimaux ou optimaux. La figure 4A illustre un résultat sous-optimal où les pistes fluorescentes ont un faible rapport signal/bruit. Ceci est probablement causé par une faible densité de surface des sondes entièrement conjuguées ou un faible débit. La figure 4B illustre un autre résultat sous-optimal où les pistes fluorescentes sont trop denses pour résoudre et isoler les pistes individuelles en vue d’une analyse ultérieure. La figure 4C est un exemple de bon résultat où les pistes individuelles peuvent être résolues sur une longue distance et dégagées en arrière-plan. La figure 4D est un exemple de l’image TIRF à diffraction limitée (moitié gauche) par rapport à la même piste imagée par DNA-PAINT (moitié droite). L’ADN-PAINT dans cette configuration produit une précision NeNA (analyse basée sur le plus proche voisin) de 28,8 nm.
Figure 1 : Flux de travail expérimental du test d’empreinte d’adhérence. (A) Assemblage de la cellule d’écoulement et de la chambre d’écoulement. (B) Passivation et fonctionnalisation de surface. Chaque étape d’incubation est marquée par la durée, suivie d’une étape de lavage. (C) Expérience de laminage cellulaire et imagerie. Les cellules roulant sur la surface vont décompresser l’ADN où se forment les interactions d’adhésion, laissant l’ADNS sur la surface qui marque l’emplacement de chaque événement d’adhésion. La surface est étiquetée avec l’imageur permanent ssDNA pour une imagerie de zone étendue, nécessitant une coloration de 2 minutes avant le lavage. Pour l’imagerie DNA-PAINT à super-résolution, le brin de l’imageur est conservé dans le tampon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation de la bioconjugation. (A) Absorbance UV-VIS du produit de bioconjugation purifié Ni-NTA (bleu) et ajustement de la courbe (rouge) pour déterminer le rapport de conjugaison. Les spectres d’absorption du ProtG (magenta), du mal-ssDNA (vert) et de l’imidazole (gris) ont été utilisés comme composants pour créer le meilleur ajustement (rouge) au spectre de produits (bleu). Le résidu de l’ajustement est représenté par la ligne pointillée noire. Cela nous permet de déterminer la concentration de ProtG et d’ADNSS dans le produit de bioconjugation purifié et leur rapport molaire. (B) PAGE native des composants dans la procédure de bioconjugation. La première voie montre une échelle d’ADN de faible poids moléculaire (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). L’image du gel est de fausse couleur, avec gelgreen colorant l’ADN en vert et coloration à la protéine bleu Coomassie (inversée) en magenta. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Traitement de l’image et résultats représentatifs de l’imagerie de zones étendues. (A) Des milliers d’images BRUTES de la FRBR carrent une vaste zone. (B) Profil d’éclairage dérivé des images brutes. (C) Correction des images en aplatissant le profil d’éclairage. (D) Image cousue à partir de tuiles d’image brutes. Le profil d’éclairage inégal peut être vu comme des motifs périodiques dans l’image. Les cases bleues et rouges indiquent les sections d’image où les profils d’intensité moyenne sont projetés (traces bleues et rouges). Les valeurs d’intensité moyenne (unité arbitraire) représentent celles des images 8 bits (0-255). (E) Même zone que (D) mais cousue à l’aide d’images aplaties. Les projections ne montrent pas de modèles périodiques à grande échelle. (F) Le profil de contrainte de cisaillement à utiliser dans les expériences pour déterminer la gamme de contraintes de cisaillement qui entraînent le laminage des cellules et les pistes de fluorescence d’élasticité. (G) Un échantillon de piste fluorescente provenant d’une seule cellule sous le profil d’écoulement illustré en (F). La cellule se déplace de gauche à droite, l’intensité de fluorescence augmente à mesure que la contrainte de cisaillement augmente jusqu’à ce que la cellule ne puisse plus supporter le roulement et se détache de la surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats sous-optimaux et optimaux représentatifs. (A) Un exemple de pistes fluorescentes avec un contraste insuffisant. (B) Un exemple de densité de voie fluorescente excessive. (C) Un exemple de densité et de contraste optimaux de la voie. Les trois images ont été acquises dans le même état, aplaties et cousues. Les cases rouges de chaque image représentent la zone où les projections d’intensité (à droite) ont été prises. (D) Une piste fluorescente montrée en imagerie à diffraction limitée (moitié gauche) et ADN-PAINT (moitié droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Problème | Raison possible | Solution | |
| Le ruban époxy n’est pas coupé correctement | Couche époxy trop épaisse | Fluidifiez la couche époxy autant que possible avec la lame du rasoir | |
| Puissance et vitesse du graveur laser non optimisées | Optimisez la puissance et la vitesse du graveur laser | ||
| Bulles collées sur les côtés de la chambre d’écoulement | Introduction initiale incorrecte de liquide | Poussez les solutions tampons à travers un canal à haut débit pour laver les bulles | |
| Les bulles traversent la chambre d’écoulement | Introduction incorrecte de liquide à l’entrée et à la sortie | Assurez-vous qu’une gouttelette de liquide se trouve sur le tuyau d’entrée pour assurer le contact liquide-liquide entre l’extrémité de la pipette et l’entrée | |
| Les bulles de la seringue sont entrées dans la conduite d’écoulement | Inclinez la pompe à seringue pour vous assurer que les bulles sont piégées à l’extrémité du piston | ||
| Le liquide ne peut pas entrer dans les canaux | Entrées vissées trop serrées | Ajustez pour optimiser l’étanchéité. Le tube d’entrée doit simplement toucher l’ouverture du canal lorsqu’il est vissé correctement. | |
| Fuite de canal | L’époxy n’a pas complètement durci | Refaire les canaux, assurer en utilisant 5 min d’époxy à durcissement rapide et laisser durcir pendant au moins 1 h | |
| Les entrées ne scellent pas correctement | Ajuster pour optimiser l’étanchéité | ||
| Cellules bloquées | Mauvaise PEGylation conduisant à une liaison non spécifique | Idéalement, refaites PEG. En outre, peut essayer d’incuber des agents bloquants supplémentaires (BSA & Tween-20) et ajouter des agents bloquants au tampon de lavage. | |
| Passivation de surface détruite par de grandes bulles d’air traversant le canal | Assurez-vous qu’aucune bulle ne traverse le canal | ||
| Problème avec les cellules | Utilisez HL-60 2 semaines après le redémarrage de la culture cellulaire congelée. Confirmez le laminage de la cellule sur la surface de contrôle avec uniquement P-selectin. | ||
| Les cellules n’ont pas ou ont des interactions clairsemées avec la surface | Densité de P-sélectine trop faible, en raison d’une mauvaise fonctionnalisation de surface et/ou d’une mauvaise bioconjugation | Tout d’abord, utilisez ProtG-biotine au lieu de ProtG-TGT comme contrôle pour déterminer si le problème est dû à la bioconjugation ou à la densité de biotine de surface. Après avoir assuré la qualité de la bioconjugation et la densité de biotine de surface, augmentez la concentration et le temps d’incubation de TGT-ProtG et de P-selectin-Fc. | |
| Les cellules roulent mais ne produisent pas de traces fluorescentes | Interactions d’adhérence trop faibles pour rompre le TGT | Augmenter le débit pendant l’expérience de laminage pour augmenter la force d’interaction. Nous recommandons un profil d’écoulement initial de montée en puissance (Figure 3F) pour trouver le débit optimal qui produit à la fois des pistes de laminage et de fluorescence stables (Figure 3G) | |
| Une surface de mauvaise qualité entraîne une fluorescence de fond élevée et un contraste insuffisant pour voir les traces | Vérifier la passivation de surface | ||
Tableau 1 : Dépannage. Le tableau répertorie les raisons et les solutions possibles pour les problèmes survenant lors de l’exécution de ce test
Fichier de codage supplémentaire 1 : Le script MATLAB écrit sur mesure pour décomposer le spectre du produit final en fonction des trois spectres collectés précédemment (ProtG, SMCC-strand, tampon d’élution de billes Ni-NTA) afin de déterminer l’efficacité de conjugaison et le rapport de ProtG à ssDNA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le test d’empreinte d’adhérence permet de visualiser les événements d’adhésion moléculaire entre PSGL-1 et P-selectin pendant l’adhésion au roulement cellulaire. Ce processus est initié par la capture médiée par la sélection P suivie d’un laminage sous contrainte de cisaillement fluidique. Les problèmes potentiels au cours de l’expérience impliquent généralement un mauvais roulement cellulaire ou des pistes fluorescentes manquantes, même lorsque les cellules roulent bien. Ces problèmes résultent souvent de contrôles de qualité aux étapes critiques du protocole, comme indiqué dans le tableau de dépannage (Tableau 1).
Les biomolécules et les tampons doivent être filtrés et stockés à 4 °C pour éviter toute contamination, car la préparation de surface comporte plusieurs étapes. Une passivation de surface de haute qualité est une exigence pour atteindre une densité de fonctionnalisation de surface appropriée et réduire la liaison non spécifique des biomolécules. La liaison non spécifique des biomolécules à la surface peut créer un fond de fluorescence élevé, interférant avec l’imagerie de fluorescence à molécule unique et l’analyse de données statistiques. Plusieurs facteurs peuvent affecter la passivation de surface. L’hydrolyse de l’aminosilane et du PEG-NHS donne une efficacité beaucoup plus faible de la PEGylation. Un lavage KOH suffisant et un nettoyage du piranha améliorent l’hydrophilie en générant des groupes hydroxyles libres sur la surface du verre, augmentant ainsi la densité du groupe chimiquement réactif. Les cellules seraient collées sur des surfaces mal passivées. La qualité de la passivation de surface est vérifiée en mesurant l’intensité de fluorescence de fond avant et après PEGylation à l’aide de biomolécules fluorescentes.
La densité de surface des ligands est un facteur critique pour le laminage cellulaire, qui est contrôlé par le rapport PEG: PEG-biotine, l’hybridation TGT et la liaison P-sélectine. Dans ce système, un rapport PEG: PEG-biotine de 20:1 est suffisant pour la fonctionnalisation de surface avec suffisamment de P-sélectine pour le laminage cellulaire. L’hybridation TGT efficace améliore également la densité de surface et le rapport signal/bruit des pistes fluorescentes. Ce protocole comprend une étape de réapprovisionnement du brin supérieur TGT-ProtG pour s’assurer que tout brin inférieur TGT non hybride est complété avant les expériences. La conjugaison de l’ADN au ProtG affecte également la densité de surface. L’agent de liaison Sulfo-SMCC a été ajouté à l’ADN à un excès molaire de 10 fois de sorte que tout l’ADN réagissait avec l’agent de liaison. ProtG avec un seul résidu de cystéine (ProtG-Cys) à l’extrémité C a été utilisé pour obtenir un rapport de conjugaison ADN:ProtG de 1:1. Parce que le ProtG-Cys peut former des dimères par des liaisons disulfure, le traitement du TCEP est nécessaire pour réduire la liaison disulfure avant les réactions de réticulation sulfhydryl-réactives. L’hybridation de l’ADN conjugué aux protéines et du TGT peut être validée avec une analyse PAGE native, dans laquelle l’ADN conjugué et le duplex de l’ADN montreront la mobilité retardée due à l’augmentation du poids moléculaire. L’efficacité de l’assemblage peut également être estimée par densitométrie sur gel (Figure 2B). Les processus minutieux de PEGylation et de bioconjugation sont cruciaux pour produire une surface cohérente. Parfois, l’état de la cellule peut affecter le roulement de la cellule et la formation de la piste. Bien que l’expression de PSGL-1 sur la densité cellulaire n’ait pas été rapportée, la densité cellulaire est un puissant régulateur du cycle cellulaire et de l’expression des protéines pendant la phase de croissance.
Étant donné que PSGL-1 fonctionne également comme un récepteur de transduction du signal et régule la prolifération cellulaire20,21, les conditions de culture telles que la densité cellulaire sont maintenues pour un niveau d’expression constant et une capacité de liaison de PSGL-1. La fixation de la P-selectin-Fc médiée par ProtG sur la surface est cruciale pour l’adhérence et le laminage des cellules. La cinétique de liaison de la P-sélectine au ProtG dépend de la concentration. Des concentrations plus faibles de P-sélectine entraînent une augmentation du temps nécessaire pour atteindre l’équilibre. Au moins 30 minutes sont nécessaires pour la liaison à la saturation pour des concentrations inférieures à 100 nM22. 10 nM de P-sélectine ont été utilisés pour réduire la liaison non spécifique à la surface et augmenter le temps d’incubation pour une interaction suffisante avec ProtG. Une incubation de 1 h est suffisante pour induire l’adhésion cellulaire et le roulement dans ce système.
Le TGT et sa durée de vie dépendante de la force correspondante sont un facteur important dans les résultats de ce test. Pendant l’adhérence au roulement, la force sur l’attache est transmise à la fois par le TGT et le P-selectin: interaction PSGL-1. Chacun de ces composants individuels a une durée de vie unique en fonction de la force, et en fonction de la force appliquée, la probabilité de rupture favorisera l’un par rapport à l’autre. Par exemple, il a été démontré que lors de l’utilisation du TGT décrit dans cet article, à des forces inférieures à 13,6 pN, P-selectin: PSGL-1 se dissocie principalement, tandis qu’au-dessus de 13,6 pN, le TGT dissocie principalement13. Ceci est important à comprendre lors de l’exécution de ce test, car si la contrainte de cisaillement est trop faible ou si les billes roulent trop lentement, les événements de rupture seront principalement l’interaction P-selectin: PSGL-1, et il y aura peu ou pas de signal de fluorescence mesurable des TGT. Le seuil de tension du TGT influencera également les résultats. Si le TGT se rompt à une force trop élevée, les événements de rupture seront principalement P-selectin: PSGL-1, et il y aura un signal de fluorescence minimal.
La méthode décrite ici permet d’analyser les forces de rupture moléculaire, ainsi que les emplacements des événements d’adhésion moléculaire impliqués dans l’adhésion au roulement. Au lieu de la détection en temps réel de l’adhérence, l’avantage le plus important de cette méthode est qu’elle permet l’imagerie et l’analyse post-expérience. Une fois que l’empreinte d’adhérence a été laissée à la surface sous forme d’ADNs, les pistes peuvent encore être imagées après 12 h si les canaux d’écoulement sont maintenus dans un réfrigérateur à 4 °C dans une chambre d’humidité sombre avec les entrées et les sorties bloquées pour éviter le séchage. L’interprétation de la lecture de fluorescence pour ce test dépend de la méthode d’imagerie choisie. Grâce à l’imagerie à super-résolution, ce test atteint une résolution spatiale élevée (<50 nm) qui permet une analyse quantitative de la densité des TGT rompus13. L’analyse de la densité du récepteur ou de la densité TGT rompue serait utile pour étudier le comportement d’adhérence au roulement dans différentes conditions. Au contraire, l’imagerie à diffraction limitée ne fournit pas une résolution spatiale élevée; cependant, il permet d’imager une grande surface pour analyser les traces de fluorescence de plusieurs perles sur des centaines de champs de vision. Ceci est avantageux car l’intensité de fluorescence d’une piste peut être analysée pour une seule bille sur une grande distance fournissant des informations sur les changements de comportement de roulement au fil du temps. Un tel exemple consiste à modifier la contrainte de cisaillement au fil du temps et à observer les changements correspondants dans l’intensité de fluorescence. Récemment, il a été démontré que grâce à un modèle simple, l’intensité de fluorescence des pistes peut être utilisée pour estimer la distribution de la force moléculaire13. Il existe également une application potentielle de méthodes ratiométriques pour obtenir une quantification de la force avec ce test23.
Parce que le roulement cellulaire se produit rapidement (10s de μm / s) et sur une distance étendue (1000s de μm), l’étude de leur tension moléculaire a été difficile avec les capteurs de tension moléculaire traditionnels en temps réel. Le test d’empreinte d’adhérence brise cette contrainte exigeante pour permettre l’imagerie post-événement. Bien que l’événement de rupture TGT ne rapporte pas directement l’ampleur de la tension subie avant la rupture, des développements prometteurs ont été réalisés dans l’analyse des pistes de fluorescence pour permettre l’étude quantitative des forces moléculaires impliquées dans l’adhérence au roulement13,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation canadienne de l’innovation (FCI 35492), la Subvention de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN-2017-04407), le Fonds Nouvelles frontières en recherche (NFRFE-2018-00969), la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé (SCH-2020-0559) et le Fonds Eminence de l’Université de la Colombie-Britannique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
