Summary
Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.
Abstract
Die rollende Adhäsion, die durch selektinvermittelte Wechselwirkungen erleichtert wird, ist eine hochdynamische, passive Motilität bei der Rekrutierung von Leukozyten an der Entzündungsstelle. Dieses Phänomen tritt in postkapillaren Venolen auf, wo der Blutfluss Leukozyten in einer rollenden Bewegung auf die Endothelzellen drückt. Stabiles Walzen erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Bildung von Adhäsionsbindungen und deren mechanisch angetriebener Dissoziation, so dass die Zelle während des Walzens in Strömungsrichtung an der Oberfläche befestigt bleibt. Im Gegensatz zu anderen Adhäsionsprozessen, die in relativ statischen Umgebungen ablaufen, ist die Rolladhäsion hochdynamisch, da sich die Rollelzellen mit mehreren zehn Mikrometern pro Sekunde über Tausende von Mikrometern bewegen. Konventionelle mechanoologische Methoden wie die Zugkraftmikroskopie sind daher aufgrund der kurzen Zeitskala und der erforderlichen hohen Sensitivität ungeeignet, um die einzelnen Adhäsionsereignisse und die damit verbundenen molekularen Kräfte zu messen. Hier beschreiben wir unsere neueste Implementierung des Adhäsions-Footprint-Assays zur Abbildung des P-Selektins: PSGL-1-Wechselwirkungen in der rollenden Adhäsion auf molekularer Ebene. Diese Methode verwendet irreversible DNA-basierte Spannungsmessstreifenbinder, um eine permanente Historie molekularer Adhäsionsereignisse in Form von Fluoreszenzspuren zu erzeugen. Diese Spuren können auf zwei Arten abgebildet werden: (1) Zusammenfügen von Tausenden von beugungsbegrenzten Bildern, um ein großes Sichtfeld zu erzeugen, das die Extraktion des Adhäsionsfußabdrucks jeder rollenden Zelle über Tausende von Mikrometern Länge ermöglicht, (2) Durchführen von DNA-PAINT, um hochauflösende Bilder der Fluoreszenzspuren in einem kleinen Sichtfeld zu rekonstruieren. In dieser Studie wurde der Adhäsions-Footprint-Assay verwendet, um HL-60-Zellen zu untersuchen, die bei verschiedenen Scherspannungen rollen. Dabei konnten wir die räumliche Verteilung der P-Selektin:PSGL-1-Wechselwirkung abbilden und durch fluoreszenzintensität Einblick in ihre molekularen Kräfte gewinnen. Damit liefert diese Methode die Grundlage für die quantitative Untersuchung der verschiedenen Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen, die an der Rolladhäsion auf molekularer Ebene beteiligt sind.
Introduction
Die rollende Adhäsionskaskade beschreibt, wie zirkulierende Zellen an die Blutgefäßwand binden und entlang dieser rollen1. Passives Walzen wird hauptsächlich durch Selectine vermittelt, eine Hauptklasse zellulärer Adhäsionsmoleküle (CAMs)1. Unter dem Scherfluss des Blutes bilden Leukozyten, die P-Selektin-Glykoprotein-Ligand-1 (PSGL-1) exprimieren, hochtransiente Bindungen mit P-Selektin, die auf der Oberfläche entzündeter Endothelzellen exprimiert werden können. Dieser Prozess ist entscheidend dafür, dass Leukozyten an einen Ort der Entzündung wandern2. Darüber hinaus ist PSGL-1 auch ein mechanosensitiver Rezeptor, der in der Lage ist, die nachfolgende feste Adhäsionsstufe der rollenden Adhäsionskaskade auszulösen, wenn er mit P-Selektin3 interagiert.
Genetische Mutationen, die die CAM-Funktion beeinflussen, können das Immunsystem stark beeinträchtigen, wie z.B. bei der seltenen Erkrankung des Leukozytenadhäsionsmangels (LAD), bei der eine Fehlfunktion der Adhäsionsmoleküle, die das Rollen vermitteln, zu stark immungeschwächten Personen führt4,5,6. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen nach einem ähnlichen Rollprozess wandern, was zu Metastasen führt7,8. Da das Zellrollen jedoch schnell und dynamisch ist, sind herkömmliche experimentelle mechanotische Methoden ungeeignet, um molekulare Wechselwirkungen während des Zellrollens zu untersuchen. Während Einzelzell- und Einzelmolekül-Manipulationsmethoden wie Rasterkraftmikroskopie und optische Pinzette molekulare Wechselwirkungen wie die kraftabhängige Wechselwirkung von P-Selectin mit PSGL-1 auf Einzelmolekülebene untersuchen konnten9, sind sie für die Untersuchung von Live-Adhäsionsereignissen während des Zellrollens ungeeignet. Darüber hinaus kann die in vitro charakterisierte Interaktion die Frage nach der molekularen Adhäsion in vivo nicht direkt beantworten. Welcher molekulare Spannungsbereich ist beispielsweise biologisch relevant, wenn Zellen in ihrer natürlichen Umgebung funktionieren? Berechnungsmethoden wie die Klebstoffdynamiksimulation10 oder das einfache stationäre Modell11 haben bestimmte molekulare Details und deren Einfluss auf das Walzverhalten erfasst, sind aber stark von der Genauigkeit der Modellierungsparameter und -annahmen abhängig. Andere Techniken wie die Zugkraftmikroskopie können Kräfte während der Zellmigration erkennen, liefern jedoch keine ausreichende räumliche Auflösung oder quantitative Informationen über die molekulare Spannung. Keine dieser Techniken kann direkte experimentelle Beobachtungen der zeitlichen Dynamik, der räumlichen Verteilung und der Magnitudenheterogenität molekularer Kräfte liefern, die sich direkt auf die Zellfunktion und das Zellverhalten in ihrer nativen Umgebung beziehen.
Daher ist die Implementierung eines molekularen Kraftsensors, der in der Lage ist, selektive Wechselwirkungen genau zu messen, von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis der Walzadhäsion zu verbessern. Hier beschreiben wir das Protokoll für den Adhäsions-Footprint-Assay12, bei dem PSGL-1-beschichtete Kügelchen auf einer Oberfläche gerollt werden, die p-selektin-funktionalisierte Spannungsmessstreifen-Tethers (TGTs)13 präsentiert. Diese TGTs sind irreversible DNA-basierte Kraftsensoren, die zu einer permanenten Historie von Bruchereignissen in Form von Fluoreszenzanzeigen führen. Dies wird durch das Aufbrechen des TGT (dsDNA) und anschließende Markierung des rupturierten TGT (ssDNA) mit einem fluoreszierend markierten Komplementärstrang erreicht. Ein großer Vorteil dieses Systems ist seine Kompatibilität sowohl mit beugungsbegrenzter als auch mit hochauflösender Bildgebung. Der fluoreszenzmarkierte Komplementärstrang kann entweder dauerhaft gebunden (>12 bp) für die beugungsbegrenzte Bildgebung oder vorübergehend gebunden (7-9 bp) für die hochauflösende Bildgebung durch DNA PAINT. Dies ist ein ideales System, um die Walzhaftung zu untersuchen, da die TGTs während des aktiven Walzens gerissen sind, aber die Fluoreszenzanzeige wird nach dem Walzen analysiert. Die beiden bildgebenden Verfahren geben dem Anwender zudem mehr Freiheit, die Rollhaftung zu untersuchen. Typischerweise ist die beugungsbegrenzte Bildgebung nützlich, um die molekulare Bruchkraft durch Fluoreszenzintensität zu extrahieren13, während die hochauflösende Bildgebung eine quantitative Analyse der Rezeptordichte ermöglicht. Mit der Fähigkeit, diese Eigenschaften der Walzadhäsion zu untersuchen, bietet dieser Ansatz eine vielversprechende Plattform für das Verständnis des Kraftregulationsmechanismus auf die molekulare Adhäsion von rollenden Zellen unter Scherfluss.
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Protocol
1. Oligonukleotid-Markierung und Hybridisierung
- Reduktion von Protein G Disulfidbindungen
- Lösen Sie 10 mg Protein G (ProtG) in 1 ml Reinstwasser auf.
HINWEIS: Das Protein G ist hier mit einem einzelnen Cysteinrest am C-Terminus und einem N-Terminus-Polyhistidin-Tag modifiziert. - Pufferaustausch ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) in 1x PBS (pH 7,2) mit einer P6-Säule.
- Messen Sie die Proteinkonzentration nach dem Pufferaustausch.
ANMERKUNG: Typische Konzentration von 7-8 mg/ml. - Herstellen von 120 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) durch Lösen von 3 mg TCEP in 90 μL 1x PBS (pH 7,2), gefolgt von 10 μL 0,5 M EDTA.
HINWEIS: TCEP sollte frisch zubereitet werden. - Fügen Sie 4 μL 120 mM TCEP (480 nmol) zu 20 μL ProtG (4-5 nmol) hinzu.
HINWEIS: Streben Sie ein molares Verhältnis von ~ 100: 1 TCEP zu Protein an. - Lassen Sie die Reaktion 30 minuten bei Raumtemperatur (RT) ablaufen.
- Entfernen Sie überschüssiges TCEP aus dem reduzierten ProtG mit einer P6-Säule (Puffer ausgetauscht in 1x PBS, pH 7,2).
- Messen Sie die Konzentration des reduzierten ProtG mit einem UV/Vis-Spektralphotometer und speichern Sie die Spektren.
ANMERKUNG: Typische Konzentration von 3,5-4,5 mg/ml.
- Lösen Sie 10 mg Protein G (ProtG) in 1 ml Reinstwasser auf.
- Amin-markierte ssDNA-Reaktion mit Sulfo-SMCC
- Amin-markiertes ssDNA (Amine-ssDNA) in nukleasefreiem Wasser auf eine Konzentration von 1 mM auflösen. Überprüfen Sie die Strangkonzentration mit einem UV/Vis-Spektralphotometer.
- 11,5 mM Sulfo-SMCC (ein hetero-bifunktioneller Vernetzer mit Sulfo-NHS-Ester und Maleimid) Lösung frisch zubereiten, indem 2 mg Sulfo-SMCC in 400 μL Reinstwasser und Wirbel zum Mischen gelöst werden.
- 6 μL des 1 mM Amin-ssDNA (6 nmol) auf 5,2 μL 11,5 mM Sulfo-SMCC (60 nmol) und 88,8 μL 1x PBS (pH 7,2) gegeben. Wirbel für 5 s, gefolgt von Zentrifugation bei 8600 x g für 3 min.
- Lassen Sie die Reaktion bei RT 30 Minuten lang ablaufen.
- Entfernen Sie überschüssiges Sulfo-SMCC aus dem SMCC-konjugierten Amine-ssDNA (mal-ssDNA) mit einer P6-Säule (Puffer ausgetauscht in 1x PBS, pH 7,2).
- Messen Sie die Konzentration der Mal-ssDNA mit einem UV/Vis-Spektralphotometer und speichern Sie die Spektren.
ANMERKUNG: Typische Konzentration von 35-45 μM.
- ProtG-ssDNA-Konjugation
- 21 μL von 4,5 mg/ml reduziertem ProtG (3 nmol) zur mal-ssDNA (~4-5 nmol) geben.
HINWEIS: Volumina und Konzentrationen sind hier typische Werte. Passen Sie sie entsprechend der individuellen experimentellen Messung an. Stellen Sie immer eine überschüssige Menge an Mal-ssDNA über ProtG in einem Verhältnis von ~ 1,5: 1 sicher. - Wirbeln Sie für 5 s und lassen Sie die Reaktion für 3 h bei RT ablaufen.
- 21 μL von 4,5 mg/ml reduziertem ProtG (3 nmol) zur mal-ssDNA (~4-5 nmol) geben.
- ProtG-ssDNA Reinigung und Charakterisierung
- Reinigen Sie die konjugierte ProtG-ssDNA durch His-Tag-Isolierung mit magnetischen Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) -Perlen.
- Entfernen Sie überschüssiges Imidazol (Ni-NTA-Elutionspuffer) mit einer P6-Säule (Puffer ausgetauscht in 1x PBS, pH 7,2) aus dem Produkt.
HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Quantifizierung der Konjugation unerlässlich, da Imidazol eine signifikante Absorption bei 280 nm aufweist. - Verwenden Sie ein UV/Vis-Spektralphotometer, um die Spektren des Produkts ProtG-ssDNA sowie den Ni-NTA-Elutionspuffer (1x) aufzuzeichnen.
HINWEIS: Die typische ProtG-ssDNA-Absorption bei 260 nm und 280 nm beträgt 0,8 bzw. 0,6 nm. - Um die Konjugationseffizienz und das Verhältnis von ProtG zu ssDNA zu bestimmen, verwenden Sie das benutzerdefinierte MATLAB-Skript (Supplemental Coding File 1), um das Endproduktspektrum basierend auf den drei zuvor gesammelten Spektren (ProtG, SMCC-Strang, Ni-NTA-Bead-Elutionspuffer) zu zerlegen.
Hinweis: Kurz gesagt, der Code funktioniert wie in den Schritten 1.4.5-1.4.8 beschrieben. Die typische Konzentration beträgt 4 μM ProtG-ssDNA mit ProtG und ssDNA bei einem molaren Verhältnis von ~1:1 (Abbildung 2A). - Geben Sie ProtG, SMCC-Strang, Ni-NTA-Perlen-Elutionspuffer und die ProtG-ssDNA UV/Vis-Spektren in das MATLAB-Skript ein
- Führen Sie eine mehrdimensionale uneingeschränkte nichtlineare Minimierung durch, um die ProtG-ssDNA-Spektren aus den Quellspektren (ProtG-, SMCC-Strang- und Ni-NTA-Perlenelutionspufferspektren) zu rekonstruieren.
HINWEIS: Die Minimierungsfunktion gibt drei Transformationsfaktoren aus, einen für jedes Quellspektren. - Rekonstruieren Sie die ProtG-ssDNA-Spektren, indem Sie die Spektren mit ihrem entsprechenden Faktor multiplizieren und die transformierten Quellenspektren kombinieren.
- Multiplizieren Sie die Anfangskonzentration des ProtG- und SMCC-Strangs mit den entsprechenden Transformationsfaktoren, um die Konzentrationen von SMCC-Strang und ProtG im ProtG-ssDNA-Produkt zu bestimmen.
- (OPTIONAL) Führen Sie die systemeigene PAGE gemäß Abbildung 2B aus , um sicherzustellen, dass jede Komponente und jeder Schritt wie erwartet funktioniert.
- TGT-Hybridisierung
- Hybridisieren Sie ProtG-ssDNA (oberer Strang) mit biotinyliertem unterem Strang in einem molaren Verhältnis von 1,2:1 mit Konzentrationen von 240 nM bzw. 200 nM im T50M5-Puffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2), um das gesamte TGT-Konstrukt zu hybridisieren. Lassen Sie bei RT ≥1 h hybridisieren.
2. Oberflächen-PEGylierung
- Oberflächenreinigung
- Reinigen Sie einen Erlenmeyerkolben und zwei Färbegläser pro 8 Deckgläser. Füllen Sie jeden Behälter mit 1 M KOH-Lösung und sonicisieren Sie für 1 h bei RT. Waschen Sie jeden Behälter gründlich mit Reinstwasser und trocknen Sie ihn mit N2 oder in einem Ofen.
HINWEIS: Füllen Sie den KOH nach oben, um den Deckel zu berühren, damit sie auch gereinigt werden. - Spülen Sie jeden Deckglas gründlich mit Reinstwasser ab und legen Sie ihn in eines der gereinigten Färbegläser.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sie nicht aneinander oder an der Wand der Färbegläser kleben. - In einem Abzug eine Piranha-Lösung frisch zubereiten, indem Sie 30 ml Wasserstoffperoxid (30%) zu 90 ml konzentrierter (95% -98%) Schwefelsäure in einem 250-ml-Becherglas hinzufügen.
VORSICHT: Konzentrierte Schwefelsäure ist stark korrosiv. Fügen Sie das Wasserstoffperoxid sehr langsam zur Schwefelsäure hinzu und schwenken Sie es vorsichtig zum Mischen. - Tauchen Sie die Deckgläser mit der Piranha-Lösung vollständig in das Färbeglas. Deckgläser in Piranha für 30 min im Abzug lassen.
ACHTUNG: Kühlen Sie die Piranha-Lösung vor dem Gießen auf nicht mehr als 80 ° C ab, um ein Reißen des Färbeglases zu vermeiden. - Die Piranha-Lösung in ein 1000-ml-Becherglas entsorgen und mit dem 1 M KOH aus der Glasreinigung neutralisieren.
- (OPTIONAL) Wiederholen Sie die Piranha-Reinigung (Schritte 2.1.3-2.1.5) mit einer frischen Piranha-Lösung.
- Spülen Sie die Deckgläser mit reichlich Reinstwasser ab, um alle restlichen Piranha-Lösungen zu entfernen. Schütteln Sie das Färbeglas bei jedem Aufstehen vorsichtig, um die Entfernung zu erleichtern (10 Spülungen werden empfohlen).
- Spülen Sie die Deckgläser 3 Mal mit Methanol ab, um Wasser von der Deckglasoberfläche zu entfernen, und halten Sie die Deckgläser in Methanol getaucht.
- Reinigen Sie einen Erlenmeyerkolben und zwei Färbegläser pro 8 Deckgläser. Füllen Sie jeden Behälter mit 1 M KOH-Lösung und sonicisieren Sie für 1 h bei RT. Waschen Sie jeden Behälter gründlich mit Reinstwasser und trocknen Sie ihn mit N2 oder in einem Ofen.
- Oberflächen-Silanisierung
- Bereiten Sie eine 1% ige Aminosilanlösung vor, indem Sie 94 ml Methanol, 1 ml Aminosilan und 5 ml Eisessig in dem gereinigten und getrockneten Erlenmeyerkolben gründlich mischen. In das zweite gereinigte und getrocknete Färbeglas gießen14.
- Die Deckgläser, die unter die Methanollösung getaucht sind, in das Färbeglas mit 1% iger Aminosilanlösung geben und das Glas abgedeckt halten.
HINWEIS: Lassen Sie die Deckgläser während des Übergangs zu Aminosilan nicht trocknen, um die Exposition der Glasoberfläche gegenüber Luft zu begrenzen. - Das Färbeglas mit Den Deckgläsern in Aminosilan 1 h bei 70 °C in einem Ofen inkubieren15.
- Entsorgen Sie die Aminosilanlösung vorsichtig in einem separaten Abfallbehälter und spülen Sie die Deckgläser im Färbeglas 5 Mal mit Methanol ab, um die Aminosilanlösung zu entfernen.
- Deckgläser im Färbeglas 5 Mal mit Reinstwasser abspülen und mit N2 trocknen.
- Die getrockneten Deckgläser im Färbeglas im Backofen bei 110 °C 20 min backen. Lassen Sie die Deckgläser auf RT abkühlen und legen Sie sie dann auf das PEGylierungsgestell.
HINWEIS: Decken Sie das Färbeglas während des Backens mit einem Deckel ab, um besondere und chemische Ablagerungen auf der Oberfläche zu minimieren15.
- Vorbereitung von PEG-Lösungen
- Auftauen von PEG (Polyethylenglykol) und PEG-Biotin auf RT für ca. 30 min.
HINWEIS: Dieser Schritt minimiert die Feuchtigkeitskondensation, die den NHS-Ester auf PEG abbauen kann. - Machen Sie PEG-Puffer, indem Sie 84 mg Natriumbicarbonat zu 10 ml Reinstwasser hinzufügen. Diese Formulierung sollte einen Puffer bei pH 8,4 bereitstellen.
- Für 8 Deckgläser, jeweils mit einer PEGylierten Seite mit 20:1 PEG:PEG-Biotin: 100 mg PEG und 5 mg PEG-Biotin messen, um 400 μL PEG-Puffer hinzuzufügen. Wirbeln Sie die Lösung für 30 s und zentrifugieren Sie für 1 min mit der maximalen Geschwindigkeit (≥18000 x g).
HINWEIS: Dieser Schritt ist zeitkritisch, da die SVA NHS-Ester-Hydrolyse sofort beginnt und eine Halbwertszeit von 34 min bei pH 8,0 hat, mit einer kürzeren Halbwertszeit bei pH 8,4.
- Auftauen von PEG (Polyethylenglykol) und PEG-Biotin auf RT für ca. 30 min.
- PEG-Inkubation und Deckglaslagerung
- Stellen Sie die Feuchtigkeitskammer auf und legen Sie die Deckgläser hinein.
- Geben Sie 90 μL PEG-Lösung zu einem Deckglas in der Feuchtigkeitskammer hinzu und legen Sie einen zweiten Deckglas mit einer Deckglas-Pinzette auf die PEG-Lösung, um die PEG-Lösung gleichmäßig zu verteilen.
- Stellen Sie sicher, dass die Lösung, die auf den Deckslip fällt, keine Blasen enthält. Untere ein Ende des zweiten Deckglases auf dem ersten Deckglas und lassen Sie das andere Ende langsam fallen, so dass keine Blasen zwischen den Deckgläsern eingeklemmt sind.
HINWEIS: Blasen führen dazu, dass bestimmte Bereiche schlecht PEGyliert sind. - Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Deckgläser PEG haben (d. h. 8 Deckgläser = 4 PEG-Sandwiches). Inkubieren Sie die PEG-Lösungen über Nacht (~12 h) bei RT in einer Feuchtigkeitskammer im Dunkeln16.
- Trennen Sie die Deckglaspaare und legen Sie sie in ein Färbeglas. Beachten Sie die PEGylierten Seiten.
- Die Deckgläser gründlich mit Reinstwasser abspülen und mit N2 abtrocknen.
HINWEIS: Halten Sie die Deckgläser mit einer Pinzette und blasen Sie N2 über die Oberfläche in Richtung Pinzette, um zu verhindern, dass Verunreinigungen auf der Oberfläche austrocknen. - Markieren Sie die nicht PEGylierte Seite mit einem Punkt an einer Ecke mit einem Permanentmarker oder einem Diamantstift.
- Legen Sie 2 PEGylierte Deckgläser in Mailer-Tuben, wobei die PEGylierten Seiten einander zugewandt sind, um die PEGylierte Seite vor dem Gebrauch zu identifizieren.
- Saugen Sie die Röhre für 5 min ab und füllen Sie sie mit N2 ab. Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm.
- Lagern Sie die PEGylierten Deckgläser bei -20 °C in den versiegelten Mailertuben bis zu 6 Monate.
HINWEIS: Erwärmen Sie die Speicherrohre vor der Chipmontage auf RT. Kondensation auf den Deckgläsern während des Versiegelns führt zu Undichtigkeiten.
3. Vorbereitung der Durchflusskammer
- Chipmontage
- Eine kleine Menge Epoxidharz auf beiden Seiten doppelseitigem Klebeband mit einer Rasierklinge dünn verteilen.
HINWEIS: Während der Montage kann sich zu viel Epoxidharz in den Kanal ausbreiten. - Laserschneiden Sie das epoxidbeschichtete Klebeband, um 4 Kanäle zu erzeugen. Erstellen Sie den Flow-Chip, indem Sie das Epoxidband zwischen einem 4-Loch-Schlitten und einem PEG-Deckglas platzieren (Abbildung 1A).
- Üben Sie mit einer Pipettenspitze sanften Druck entlang der Länge der Kanäle aus, um eine gute Abdichtung zu erzeugen. Härten Sie das Epoxidharz für ≥1 h aus.
HINWEIS: Scheren Sie das Glas nicht, um ein Gleiten gegen Epoxidharz zu vermeiden.
- Eine kleine Menge Epoxidharz auf beiden Seiten doppelseitigem Klebeband mit einer Rasierklinge dünn verteilen.
- Kammermontage
- Richten Sie den Chip so aus, dass die Öffnung jedes Kanals in der Mitte des Adapters positioniert ist (Abbildung 1A). Legen Sie zwei transparente Acryl-Abstandshalter auf den Chip, üben Sie festen Druck in der Mitte des Blocks aus und schrauben Sie zwei 4-40 Schrauben an den Enden jedes Abstandhalters ein.
HINWEIS: Drücken Sie die Schraube nicht und drücken Sie nicht zu stark auf die Abstandshalter, da sonst der Chip reißen kann. - Schrauben Sie auf der anderen Seite der Halterung die Einlässe in die Gewindebohrungen. Überwachen Sie den Dichtungszustand durch den transparenten Acrylblock.
- Wenn der Schlauch mit der Öffnung des Chips in Kontakt kommt, versiegeln Sie die Verbindung, indem Sie den Schlauch vorsichtig im Uhrzeigersinn drehen.
HINWEIS: Überverspannte Einlässe können zu Strömungsverstopfungen führen, während lose Kontakte zu Leckagen führen.
- Richten Sie den Chip so aus, dass die Öffnung jedes Kanals in der Mitte des Adapters positioniert ist (Abbildung 1A). Legen Sie zwei transparente Acryl-Abstandshalter auf den Chip, üben Sie festen Druck in der Mitte des Blocks aus und schrauben Sie zwei 4-40 Schrauben an den Enden jedes Abstandhalters ein.
4. Oberflächenvorbereitung
HINWEIS: Den gesamten Workflow finden Sie in Abbildung 1B .
- Blockiermittel zur Vermeidung unspezifischer Bindungen
- Verwenden Sie eine Pipette, um 200 μL Waschpuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) in die Kammer zu leiten, um nach Leckagen zu suchen. Wenn sich Blasen im Kanal bilden, drücken Sie aggressiv zusätzliche 200 μL, um die Blasen zu entfernen.
HINWEIS: Große Luftblasen, die bei diesem Schritt nicht entfernt werden, können sich später lösen und die Oberflächenfunktionalisierung zerstören. - 40 μL BSA (1% w/v) in die Durchflusskammer geben, um unspezifische Bindungen zu verhindern, und 10 min inkubieren.
- Stellen Sie sicher, dass Sie während jeder Inkubationszeit genügend Volumen hinzufügen, um die Durchflusskammern zu füllen und Tröpfchen an den Ein- und Auslässen zu bilden. Passen Sie das Inkubationsvolumen entsprechend an und führen Sie alle Inkubationen in einer Feuchtigkeitskammer durch.
- 40 μL Tween 20 (5% v/v) in die Durchflusskammer geben. Inkubieren Sie für 10 min, um die unspezifische Bindung weiter zu reduzieren.
- (OPTIONAL) Überprüfen Sie die Oberfläche auf ausreichende Passivierung, indem Sie Polystyrolperlen durch den Kanal strömen lassen. Fügen Sie 40 μL ProtG-beschichtete Polystyrolperlen (0,01% w/v) hinzu und machen Sie ein Bild mit einem Dunkelfeldmikroskop mit 10-fachem Objektiv. Wenn Perlen nicht an der Oberfläche haften, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
- Waschen Sie den Kanal mit 200 μL Waschpuffer, um alle Passivierungsmittel zu entfernen.
- Verwenden Sie eine Pipette, um 200 μL Waschpuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) in die Kammer zu leiten, um nach Leckagen zu suchen. Wenn sich Blasen im Kanal bilden, drücken Sie aggressiv zusätzliche 200 μL, um die Blasen zu entfernen.
- Funktionalisierung der Kammeroberfläche
- 40 μL Streptavidin (100 μg/ml) in die Durchflusskammer geben und 20 min inkubieren. Dann mit 200 μL Waschpuffer waschen.
- 40 μL hybridisiertes ProtG-TGT (100 nM) in die Durchflusskammer geben und 20 min inkubieren. Anschließend mit 200 μL Waschpuffer waschen.
- Fügen Sie 40 μL ProtG-TGT Oberstrang (100 nM) für 20 min hinzu, um jeden unhybridisierten TGT-Unterstrang auf der Oberfläche zu vervollständigen. Mit 200 μL Waschpuffer waschen.
- 40 μL P-Selectin-Fc (10 μg/ml) in die Durchflusskammer geben und 60 min inkubieren. Dann mit 200 μL Waschpuffer waschen.
HINWEIS: Die Inkubationsdauer ist entscheidend.
5. Experiment und Bildgebung
- Einrichtung des Flow-Systems
- Füllen Sie eine 5 mL Glasspritze mit dem Walzpuffer (HBSS mit 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden, indem Sie auf die Seiten der Spritze klopfen, um die Blasen zu entfernen und sie herauszudrücken, während sie in Richtung der Spitze schweben.
- Führen Sie eine sterile Nadel (26 G, 5/8 Zoll Länge) in einen ~200 mm Polyethylenschlauch (ID: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) und verbinden Sie die Nadel mit der Glasspritze.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luft irgendwo im Nadelverbinder eingeschlossen ist. - Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe und neigen Sie die Spritzenpumpe so, dass die Kolbenseite angehoben ist, um zu verhindern, dass Luftblasen in den Kanal gelangen. Setzen Sie das Ende des Rohrs in den Einlass der Durchflusskammer ein.
HINWEIS: Stellen Sie beim Herstellen der Verbindung den Kontakt von Flüssigkeit zu Flüssigkeit sicher, indem Sie Tröpfchen auf die Einlässe ablagern und Tröpfchen am Ende des Spritzenschlauchs haben. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Kanal gelangen, indem Sie einen kleinen Tropfen am Ende des Spritzenschlauchs bilden lassen, bevor Sie ihn in den Einlass einführen. - Legen Sie ein Ende eines weiteren 200 mm des Polyethylenschlauchs in den Auslass und das andere Ende in ein Abfallbecherglas.
- Einrichten für das Rollen von Zellen
- Züchtung von HL-60-Zellen in 25 cm2 belüfteten Kulturflaschen in IMDM-Medien, ergänzt mit 20% fetalem Rinderserum und 1% Antibiotika bei 37 °C mit 5% CO2. Halten Sie die Zelldichten zwischen 1 x 105-2 × 106 Zellen / ml aufrecht.
- (OPTIONAL) Differenzieren Sie die HL-60-Zellen in einem vollständigen IMDM-Medium mit 1,25% DMSO bei einer Anfangsdichte von 2 x 105 Zellen/ml. Inkubieren Sie Zellen, um für 5-6 Tage am aktivsten zu sein.
- Nehmen Sie eine Probe (1-2 ml) aus der Zellsuspension und Zentrifuge (200 x g, 3 min), um die Zellen zu pelletieren.
- Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 500 μL des Walzpuffers. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal, um Zellablagerungen zu entfernen.
- Messen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer. Resuspendieren Sie die Zellpellets mit rollendem Puffer auf eine Dichte von 2 x 105 Zellen/ml.
- Trennen Sie den Schlauch vorsichtig von den Einlässen/Auslässen und pipettieren Sie 40 μL der Zellsuspension in die Durchflusskammer. Schließen Sie den Schlauch wie zuvor beschrieben wieder an und stellen Sie sicher, dass keine Blasen in den Strömungskanal eingeführt werden.
- Beginnen Sie das Zellwalzexperiment, indem Sie die Spritzenpumpe mit den gewünschten Durchflussraten starten.
HINWEIS: Die Intensität der Fluoreszenzspuren hängt von der Scherspannung ab, und eine geringere Zellgeschwindigkeitsscherspannung /Zellgeschwindigkeit erzeugt im Allgemeinen dunklere Spuren (Abbildung 4A). Vermeiden Sie eine hohe Zelldichte auf der Oberfläche oder eine übermäßige Rolldauer, um trennbare Einzelzellspuren zu gewährleisten (Abbildung 4B,C). - Verwenden Sie ein Dunkelfeldmikroskop mit einem 10-fachen Objektiv, um sicherzustellen, dass das Zellrollen beobachtet wird.
- Sobald das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zellen aus dem Kanal, indem Sie den Walzpuffer mit 100 ml / h infundieren, bis die Oberfläche zellfrei ist.
- Imaging local tracks by "DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography" (DNA-PAINT)
- 40 μL DNA-PAINT Imager-Strang (500 pM) in DNA-PAINT-Puffer (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) in den Kanal geben.
- Führen Sie eine TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) mit einer 100-fachen ÖLimmersions-TIRF-Objektivlinse durch. Erfassen Sie mehr als 40000 Bilder mit 25 ms Belichtungszeit pro Bild bei einer Elektronenmultiplikationsverstärkung (EM) von 300 mit einer EMCCD-Kamera (Electron-multiplying charge-coupled device).
- Verwenden Sie Picasso-Softwarepaket17 , um die hochauflösenden Bilder (Abbildung 4D) gemäß den Schritten 5.3.4-5.3.5 zu lokalisieren und zu rendern.
- Laden Sie den DNA-PAINT-Film in das Localize-Programm, um die Lokalisierung jedes Fluorophors in jedem Frame zu bestimmen.
HINWEIS: Optimieren Sie die Boxseitenlänge und die Min. Net Gradient-Parameter, bis nur noch Fluorophore genau verfolgt werden. Min. Der Nettogradientenparameter kann oft über 100000 gehen, um eine optimale Verfolgung zu erreichen. Passformeinstellung: MLE, integrierte Gaußsche Methode liefert das beste Ergebnis. Wenn der Film zu lang ist, teilen Sie ihn in Stapel von 10000 Bildern auf, damit die Vorschauverfolgung in Localize ordnungsgemäß funktioniert, bevor Sie sie zu einer endgültigen hdf5-Datei neu kombinieren. - Laden Sie dann die resultierende hdf5-Datei in das Render-Programm, um Driftkorrektur und Rendering durchzuführen.
HINWEIS: Führen Sie mehrere Driftkorrekturen über Undrift by RCC durch , um das Endergebnis zu verbessern.
- Abbildung langer Spuren durch permanente Beschriftung
- Fügen Sie den permanenten Imager-Strang hinzu und inkubieren Sie für 120 s im T50M5-Puffer. Waschen Sie den Kanal, indem Sie 200 μL Waschpuffer infundieren.
- Nehmen Sie ein Bild mit ausgeschaltetem Anregungslaser auf, um Hintergrundrauschen der Kamera zu erhalten. Stellen Sie eine große Fläche in einem Gittermuster mit TIRF-Mikroskopie dar.
HINWEIS: Für das anschließende Stitching wird eine Frame-over-Frame-Überlappung von ≥10% empfohlen. - Programmieren Sie das Mikroskop so, dass es über die Fläche von 400 x 50 Bildern (insgesamt 20000 Bilder) scannt. Teilen Sie die Rohdaten mit dem FIJI-Programm in einzelne TIFF-Dateien auf, die jeweils maximal 10000 Bilder enthalten.
- Reduzieren Sie alle Bilder mithilfe des Beleuchtungsprofils (Abbildung 3A-C) gemäß den Schritten 5.4.5-5.4.7.
- Subtrahieren Sie das Hintergrundrauschen der Kamera von jedem Bild. Erhalten Sie die mittlere Stapelprojektion (Beleuchtungsprofil) jedes hintergrundsubtrahierten Frames.
- Normalisieren Sie das Beleuchtungsprofil durch seinen maximalwert. Teilen Sie jeden hintergrundsubtrahierten Frame durch das normalisierte Beleuchtungsprofil.
- Skalieren Sie die korrigierten Frames auf den entsprechenden Bereich für die entsprechende Bittiefe.
- Verwenden Sie MIST18, um die Bilder zu stitchen (Abbildung 3D,E).
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Representative Results
Das obige Protokoll beschreibt das experimentelle Verfahren des Adhäsion Footprint Assays. Der allgemeine Experimentablauf ist in Abbildung 1 dargestellt, von der Durchflusskammeranordnung (Abbildung 1A) über die Oberflächenfunktionalisierung (Abbildung 1B) bis hin zu den Experiment- und Bildgebungsschritten (Abbildung 1C).
Abbildung 2 ist ein repräsentatives Ergebnis für die ProtG-ssDNA-Biokonjugationscharakterisierung. Die UV/Vis-Spektren von drei Komponenten im Endprodukt, nämlich ProtG, mal-ssDNA und Imidazol-Elutionspuffer, wurden vor der endgültigen Konjugation gesammelt (Abbildung 2A), die jeweils einer bekannten Konzentration entsprechen. Diese Spektren bilden die orthogonale Grundlage für die Anpassung an das Produktspektrum der Biokonjugation, wobei die drei unbekannten Parameter ihre Konzentrationen sind. Eine benutzerdefinierte Funktion in MATLAB wurde verwendet, um die Konzentrationen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen ein nahezu 1:1-Verhältnis von ProtG zu ssDNA (Abbildung 2A). Dies ist wie erwartet, da die ssDNA nur eine Aminmodifikation hat und das ProtG ein einzelnes Cystein an seinem C-Terminus entwickelt hat. Dieser Ansatz ist vorteilhafter gegenüber dem zuvor berichteten Ansatz19 , bei dem eine einzige Thiol-modifizierte DNA verwendet wird, um auf die Vielzahl der primären Amine auf ProtG abzuzielen, wo das Konjugationsverhältnis nicht einfach aufrechterhalten werden kann.
Zusätzlich wurde natives PAGE verwendet, um die Biokonjugation zu bestätigen (Abbildung 2B). DNA wird von GelGreen bzw. Proteinen von Coomassie Blue gefärbt. Da GelGreen dsDNA stärker färbt als ssDNA, wird erwartet, dass alle ssDNA-Bänder dunkler sind als die gleiche molare Konzentration von dsDNA-Bändern (Lanes 3, 4). Da der Stamm ProtG einen C-terminalen Cysteinrest enthält, bildet ein Teil der Proteine dimere durch eine Disulfidbindung, wie in Bahn 5 zu sehen ist (Abbildung 2B). Das reduzierte ProtG hingegen zeigt ein einzelnes Band (Bahn 6). Bei direkter Verwendung des Standard-ProtG in der DNA-Konjugation reagiert das disulfiddimerisierte ProtG nicht auf die DNA und zeigt sich als Band ohne GelGreen-Färbung (Bahnen 7, 8). Das ProtG-Dimerband verschwindet im Konjugationsprodukt mit reduziertem ProtG (Bahnen 9, 10). Da während der Konjugation ein Überschuss an mal-ssDNA zu ProtG (1,5:1) verwendet wird, sind im endgültigen Konjugationsprodukt (Bahnen 8, 10) nur TGT-Bänder sichtbar. Die hellen GelGreen-Bänder, die mit dem monomeren ProtG-Band zusammenfallen, deuten auf eine erfolgreiche Konjugation und eine gute Ausbeute hin.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Rohmikroskopiebilder und den Workflow, um sie für das anschließende Bild-Stitching und die anschließende Analyse zu korrigieren. Das von einer Singlemode-Faser eingeführte TIRF-Beleuchtungsprofil ist im Allgemeinen in der Mitte des Sichtfelds heller und an den Rändern dunkler (Abbildung 3A,B). Um die ungleichmäßige Ausleuchtung auszugleichen und die Bilder für die quantitative Analyse abzuflachen, wurde das Beleuchtungsprofil durch Mittelung tausender Einzelbilder bestimmt (Abbildung 3B). Abgeflachte Bilder wurden erzeugt, indem das Kamerarauschen sowohl von Roh- als auch von Beleuchtungsprofilen subtrahiert und dann durch das Beleuchtungsprofil normalisiert wurde (Abbildung 3C). Der Effekt der Bildverflachung wird deutlich, wenn die Bilder zu einem großen Bild zusammengefügt werden. Die Bildintensität in den Hintergrundbereichen ohne Zellspuren zeigt klare periodische Muster, die den unkorrigierten Bildern entsprechen (Abbildung 3D). Das gleiche Sichtfeld, das aus abgeflachten Bildern zusammengefügt wurde, erzeugt einen flachen Hintergrund (Abbildung 3E). Ein flacher Hintergrund ist entscheidend für die Interpretation der Intensitätsschwankungen entlang einer Zellspur. Als erstes Experiment wird ein Ramp-up-Strömungsprofil ähnlich dem in Abbildung 3F dargestellten verwendet, um den für das Experiment geeigneten Schubspannungsbereich zu bestimmen, der sowohl ein stabiles Zellrollen als auch klare fluoreszierende Zellspuren gewährleistet. Ein typischer Einzelzell-Adhäsions-Footprint unter diesem Strömungsprofil ist in Abbildung 3G dargestellt, wo die Intensität mit zunehmender Scherspannung zunimmt, bis die Zelle das Rollen bei hoher Scherspannung nicht mehr aufrechterhalten und sich von der Oberfläche lösen kann, was das Ende einer einzigen Spur markiert.
Abbildung 4 zeigt mögliche Ergebnisse von suboptimalen bis hin zu optimalen repräsentativen experimentellen Ergebnissen. Abbildung 4A zeigt ein suboptimales Ergebnis, bei dem die Fluoreszenzspuren ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen. Dies wird wahrscheinlich entweder durch eine geringe Oberflächendichte der vollständig konjugierten Sonden oder eine geringe Durchflussrate verursacht. Abbildung 4B zeigt ein weiteres suboptimales Ergebnis, bei dem die Fluoreszenzspuren zu dicht gepackt sind, um einzelne Spuren für die nachfolgende Analyse aufzulösen und zu isolieren. Abbildung 4C ist ein Beispiel für ein gutes Ergebnis, bei dem einzelne Spuren über eine lange Distanz auflösbar und im Hintergrund klar sind. Abbildung 4D ist ein Beispiel für das beugungsbegrenzte TIRF-Bild (linke Hälfte) im Vergleich zu der gleichen Spur, die von DNA-PAINT (rechte Hälfte) aufgenommen wurde. Die DNA-PAINT in diesem Setup erzeugt eine NeNA-Präzision (Nearest-Neighbor-Based Analysis) von 28,8 nm.
Abbildung 1: Experimentablauf des Adhäsion Footprint Assays. (A) Montage der Durchflusszelle und der Durchflusskammer. (B) Oberflächenpassivierung und -funktionalisierung. Jeder Inkubationsschritt ist durch die Dauer gekennzeichnet, gefolgt von einem Waschschritt. (C) Zellrollenexperiment und Bildgebung. Zellen, die auf der Oberfläche rollen, öffnen die DNA dort, wo sich Adhäsionswechselwirkungen bilden, und hinterlassen ssDNA auf der Oberfläche, die den Ort jedes Adhäsionsereignisses markiert. Die Oberfläche ist mit dem permanenten Imager ssDNA für eine großflächige Bildgebung gekennzeichnet, die vor dem Abwaschen eine 2-minütige Färbung erfordert. Für die hochauflösende DNA-PAINT-Bildgebung wird der Imager-Strang im Puffer gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung der Biokonjugation. (A) UV-VIS-Absorption des Ni-NTA-gereinigten Biokonjugationsprodukts (blau) und die Kurvenanpassung (rot) zur Bestimmung des Konjugationsverhältnisses. Die Absorptionsspektren von ProtG (Magenta), Mal-ssDNA (grün) und Imidazol (grau) wurden als Komponenten verwendet, um die beste Anpassung (rot) an das Produktspektrum (blau) zu erzielen. Der Rest der Passung wird als schwarz gestrichelte Linie dargestellt. Dies ermöglicht es uns, die Konzentration von ProtG und ssDNA im gereinigten Biokonjugationsprodukt und deren molares Verhältnis zu bestimmen. (B) Native PAGE von Komponenten im Biokonjugationsverfahren. Die erste Spur zeigt eine niedermolekulare DNA-Leiter (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). Das Gelbild ist falsch gefärbt, mit DNA-färbendem GelGreen in Grün und Coomassie Blue Protein Stain (inversiert) in Magenta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bildverarbeitung und repräsentative Ergebnisse aus umfangreicher Flächenbildgebung. (A) Tausende von TIRF-Rohbildern, die einen ausgedehnten Bereich kacheln. (B) Aus den Rohbildern abgeleitetes Beleuchtungsprofil. (C) Korrigierte Bilder durch Reduzieren des Beleuchtungsprofils. (D) Zusammengefügtes Bild aus Rohbildkacheln. Das ungleichmäßige Beleuchtungsprofil kann als periodische Muster im Bild gesehen werden. Die blauen und roten Kästchen zeigen die Bildausschnitte an, in die die mittleren Intensitätsprofile projiziert werden (blaue und rote Spuren). Die mittleren Intensitätswerte (beliebige Einheit) stellen die von 8-Bit-Bildern (0-255) dar. (E) Gleicher Bereich wie (D), aber mit abgeflachten Bildern zusammengefügt. Die Projektionen zeigen keine großräumigen periodischen Muster. (F) Das Scherspannungsprofil, das in den Experimenten verwendet werden soll, um den Bereich der Schubspannungen zu bestimmen, die zu Zellwalzen und Fluoreszenzspuren führen. (G) Eine Probenfluoreszenzspur aus einer einzelnen Zelle unter dem in (F) dargestellten Strömungsprofil. Die Zelle bewegt sich von links nach rechts, die Fluoreszenzintensität nimmt zu, wenn die Scherspannung zunimmt, bis die Zelle das Rollen nicht mehr aufrechterhalten kann und sich von der Oberfläche löst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative suboptimale und optimale Ergebnisse. (A) Ein Beispiel für fluoreszierende Spuren mit unzureichendem Kontrast. (B) Ein Beispiel für eine übermäßige fluoreszierende Spurdichte. (C) Ein Beispiel für optimale Spurdichte und Kontrast. Alle drei Bilder wurden unter dem gleichen Zustand aufgenommen, abgeflacht und zusammengefügt. Die roten Kästchen in jedem Bild stellen den Bereich dar, in dem die Intensitätsprojektionen (rechts) aufgenommen wurden. (D) Eine Fluoreszenzspur, die in beugungsbegrenzter (linke Hälfte) und DNA-PAINT-Bildgebung (rechte Hälfte) dargestellt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Problem | Möglicher Grund | Lösung | |
| Epoxidband nicht richtig geschnitten | Epoxidschicht zu dick | Verdünnen Sie die Epoxidschicht so weit wie möglich mit der Razerklinge | |
| Leistung und Geschwindigkeit des Lasergravierers nicht optimiert | Optimieren Sie die Leistung und Geschwindigkeit des Lasergravierers | ||
| Blasen, die an den Seiten der Strömungskammer kleben | Unsachgemäße anfängliche Flüssigkeitseinleitung | Schieben Sie Pufferlösungen mit hoher Durchflussrate durch den Kanal, um die Blasen auszuwaschen | |
| Blasen passieren die Strömungskammer | Unsachgemäße Flüssigkeitseinleitung durch Ein- und Auslass | Stellen Sie sicher, dass sich ein Flüssigkeitstropfen auf dem Einlassschlauch befindet, um den Flüssigkeitskontakt zwischen der Pipettenspitze und dem Einlass sicherzustellen. | |
| Blasen aus der Spritze gelangten in die Fließlinie | Kippen Sie die Spritzenpumpe, um sicherzustellen, dass Blasen am Kolbenende eingeschlossen sind | ||
| Flüssigkeit kann nicht in Kanäle eindringen | Einlässe zu fest angeschraubt | Anpassen, um die Dichtung zu optimieren. Der Einlassschlauch sollte beim richtigen Einschrauben nur die Kanalöffnung berühren. | |
| Kanalleckage | Epoxidharz ist noch nicht vollständig ausgehärtet | Machen Sie die Kanäle neu, stellen Sie sicher, dass Sie 5 min schnell aushärtendes Epoxidharz verwenden und mindestens 1 h aushärten lassen | |
| Einlässe schließen nicht richtig ab | Anpassen zur Optimierung der Dichtung | ||
| Zellen stecken fest | Schlechte PEGylierung führt zu unspezifischer Bindung | Idealerweise remake PEG. Zusätzlich kann versucht werden, zusätzliche Blockierungsmittel (BSA & Tween-20) zu inkubieren und Blockiermittel zum Waschpuffer hinzuzufügen. | |
| Oberflächenpassivierung zerstört durch große Luftblasen, die durch den Kanal strömen | Stellen Sie sicher, dass keine Blasen durch den Kanal gehen | ||
| Problem mit den Zellen | Verwenden Sie HL-60 2 Wochen nach dem Neustart der Zellkultur aus dem Gefrorenen. Bestätigen Sie das Rollen der Zelle auf der Steueroberfläche mit nur P-Selectin. | ||
| Zellen haben keine oder nur spärliche Wechselwirkungen mit der Oberfläche | P-Selektindichte zu niedrig, als Folge einer schlechten Oberflächenfunktionalisierung und/oder schlechten Biokonjugation | Verwenden Sie zunächst ProtG-Biotin anstelle von ProtG-TGT als Kontrolle, um festzustellen, ob das Problem auf Biokonjugation oder Oberflächenbiotindichte zurückzuführen ist. Nachdem die Biokonjugationsqualität und die Oberflächenbiotindichte sichergestellt sind, erhöhen Sie die TGT-ProtG- und P-Selectin-Fc-Konzentration und inkubationszeit. | |
| Zellen rollen, erzeugen aber keine fluoreszierenden Spuren | Adhäsionswechselwirkungen zu schwach, um TGT zu reißen | Erhöhen Sie die Durchflussrate während des Rollversuchs, um die Wechselwirkungskraft zu erhöhen. Wir empfehlen ein anfängliches Ramp-up-Strömungsprofil (Abbildung 3F), um die optimale Durchflussrate zu finden, die sowohl stabile Walz- als auch Fluoreszenzspuren erzeugt (Abbildung 3G). | |
| Schlechte Oberflächenqualität führt zu hoher Hintergrundfluoreszenz und unzureichendem Kontrast, um Spuren zu sehen | Oberflächenpassivierung prüfen | ||
Tabelle 1: Problembehandlung. Die Tabelle listet die möglichen Gründe und Lösungen für Probleme auf, die bei der Durchführung dieses Assays auftreten.
Ergänzende Codierungsdatei 1: Das kundenspezifisch geschriebene MATLAB-Skript zur Zerlegung des Endproduktspektrums basierend auf den drei zuvor gesammelten Spektren (ProtG, SMCC-Strang, Ni-NTA-Perlenelutionspuffer), um die Konjugationseffizienz und das Verhältnis von ProtG zu ssDNA zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der Adhäsions-Footprint-Assay ermöglicht die Visualisierung der molekularen Adhäsionsereignisse zwischen PSGL-1 und P-Selektin während der Zellrollenadhäsion. Dieser Prozess wird durch P-Selektin-vermittelte Erfassung eingeleitet, gefolgt von einem Walzen unter fluidischer Scherspannung. Mögliche Probleme während des Experiments beinhalten in der Regel ein schlechtes Zellrollen oder fehlende fluoreszierende Spuren, selbst wenn die Zellen gut rollen. Diese Probleme resultieren häufig aus Qualitätskontrollen an den kritischen Schritten im Protokoll, wie in der Fehlerbehebungstabelle (Tabelle 1) aufgeführt.
Biomoleküle und Puffer müssen gefiltert und bei 4 °C gelagert werden, um eine Kontamination zu vermeiden, da die Oberflächenvorbereitung mehrere Schritte umfasst. Eine hochwertige Oberflächenpassivierung ist voraussetzung, um eine angemessene Oberflächenfunktionalisierungsdichte zu erreichen und die unspezifische Bindung von Biomolekülen zu reduzieren. Die unspezifische Bindung von Biomolekülen an die Oberfläche kann einen hohen Fluoreszenzhintergrund erzeugen, der die Einzelmolekül-Fluoreszenzbildgebung und die statistische Datenanalyse stört. Mehrere Faktoren können die Oberflächenpassivierung beeinflussen. Die Hydrolyse von Aminosilan und PEG-NHS führt zu einer viel geringeren Effizienz der PEGylierung. Ausreichende KOH-Wäsche und Piranha-Reinigung erhöhen die Hydrophilie, indem freie Hydroxylgruppen auf der Glasoberfläche erzeugt werden, wodurch die Dichte der chemisch reaktiven Gruppe erhöht wird. Zellen würden auf schlecht passivierten Oberflächen stecken bleiben. Die Qualität der Oberflächenpassivierung wird überprüft, indem die Hintergrundfluoreszenzintensität vor und nach der PEGylierung mit fluoreszierenden Biomolekülen gemessen wird.
Die Oberflächendichte von Liganden ist ein kritischer Faktor für das Zellwalzen, der durch das PEG: PEG-Biotin-Verhältnis, TGT-Hybridisierung und P-Selektinbindung gesteuert wird. In diesem System reicht ein PEG:PEG-Biotin-Verhältnis von 20:1 für die Oberflächenfunktionalisierung mit ausreichend P-Selektin für das Zellwalzen aus. Eine effiziente TGT-Hybridisierung verbessert auch die Oberflächendichte und das Signal-Rausch-Verhältnis der Fluoreszenzspuren. Dieses Protokoll beinhaltet einen Nachschubschritt von Top-Strang-TGT-ProtG, um sicherzustellen, dass jeder unhybridisierte TGT-Bottom-Strang vor Experimenten ergänzt wird. Die Konjugation von DNA zu ProtG beeinflusst auch die Oberflächendichte. Der Sulfo-SMCC-Linker wurde der DNA mit einem 10-fachen molaren Überschuss zugesetzt, so dass die gesamte DNA mit dem Linker reagierte. ProtG mit einem einzelnen Cysteinrest (ProtG-Cys) am C-Terminus wurde verwendet, um ein DNA:ProtG-Konjugationsverhältnis von 1:1 zu erreichen. Da die ProtG-Cys Dimere durch Disulfidbindungen bilden können, ist eine Behandlung von TCEP erforderlich, um die Disulfidbindung vor Sulfhydryl-reaktiven Vernetzungsreaktionen zu reduzieren. Proteinkonjugierte DNA- und TGT-Hybridisierung kann mit der nativen PAGE-Analyse validiert werden, bei der konjugierte DNA und DNA-Duplex die verzögerte Mobilität aufgrund der Erhöhung des Molekulargewichts zeigen. Die Montageeffizienz kann auch durch Geldensitometrie abgeschätzt werden (Abbildung 2B). Die sorgfältigen PEGylierungs- und Biokonjugationsprozesse sind entscheidend für die Herstellung einer gleichmäßigen Oberfläche. Gelegentlich kann der Zellzustand das Zellrollen und die Spurbildung beeinflussen. Obwohl die PSGL-1-Expression über der Zelldichte nicht berichtet wurde, ist die Zelldichte ein starker Regulator des Zellzyklus und der Proteinexpression während der Wachstumsphase.
Da PSGL-1 auch als Signaltransduktionsrezeptor fungiert und die Zellproliferation reguliert20,21, werden Kulturbedingungen wie die Zelldichte für ein konsistentes Expressionsniveau und eine konsistente Bindungsfähigkeit von PSGL-1 aufrechterhalten. Die Anlagerung von P-Selektin-Fc, das durch ProtG vermittelt wird, auf der Oberfläche ist entscheidend für die Adhäsion und das Walzen von Zellen. Die Bindungskinetik von P-Selektin an ProtG ist von der Konzentration abhängig. Niedrigere Konzentrationen von P-Selektin führen zu einer Verlängerung der Zeit, um das Gleichgewicht zu erreichen. Für die Sättigungsbindung sind bei Konzentrationen unter 100 nM22 mindestens 30 min erforderlich. 10 nM P-Selektin wurde verwendet, um die unspezifische Bindung an die Oberfläche zu reduzieren und die Inkubationszeit für eine ausreichende Wechselwirkung mit ProtG zu erhöhen. Eine 1-stündige Inkubation ist genug Zeit, um die Zelladhäsion und das Walzen in diesem System zu induzieren.
Der TGT und seine entsprechende kraftabhängige Lebensdauer ist ein wichtiger Faktor für die Ergebnisse dieses Assays. Während der Rollhaftung wird die Kraft auf das Seil sowohl durch die TGT- als auch durch die P-Selektin-PSGL-1-Wechselwirkung übertragen. Jede dieser einzelnen Komponenten hat eine einzigartige kraftabhängige Lebensdauer, und abhängig von der ausgeübten Kraft begünstigt die Bruchwahrscheinlichkeit eine gegenüber der anderen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass bei Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen TGT bei Kräften unter 13,6 pN P-Selektin: PSGL-1 hauptsächlich dissoziiert, während oberhalb von 13,6 pN das TGT hauptsächlich dissoziiert13. Dies ist wichtig zu verstehen, wenn dieser Assay durchgeführt wird, denn wenn die Scherspannung zu niedrig ist oder die Kügelchen zu langsam rollen, sind die Bruchereignisse in erster Linie die P-Selectin: PSGL-1-Wechselwirkung, und es wird ein minimales oder kein messbares Fluoreszenzsignal von den TGTs geben. Die Spannungsschwelle des TGT beeinflusst ebenfalls die Ergebnisse. Wenn der TGT mit einer zu hohen Kraft reißt, sind die Bruchereignisse in erster Linie P-Selektin: PSGL-1, und es wird ein minimales Fluoreszenzsignal geben.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Analyse der molekularen Bruchkräfte sowie der Orte molekularer Adhäsionsereignisse, die an der Rolladhäsion beteiligt sind. Anstelle der Echtzeit-Erkennung der Adhäsion besteht der wichtigste Vorteil dieser Methode darin, dass sie eine Bildgebung und Analyse nach dem Experiment ermöglicht. Nachdem die Adhäsionsfläche in Form von ssDNA auf der Oberfläche belassen wurde, können die Spuren auch nach 12 h noch abgebildet werden, wenn die Strömungskanäle in einem 4 °C-Kühlschrank in einer dunklen Feuchtigkeitskammer mit blockierten Ein- und Auslässen aufrechterhalten werden, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Interpretation der Fluoreszenzanzeige für diesen Assay ist abhängig von der gewählten bildgebenden Methode. Durch hochauflösende Bildgebung erreicht dieser Assay eine hohe räumliche Auflösung (<50 nm), die eine quantitative Analyse der Dichte von rupturierten TGTs13 ermöglicht. Die Analyse der Rezeptordichte oder der rupturierten TGT-Dichte wäre nützlich, um das Rolladhäsionsverhalten unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Im Gegensatz dazu bietet die beugungsbegrenzte Bildgebung keine hohe räumliche Auflösung; Es ermöglicht jedoch die Abbildung einer großen Oberfläche, um die Fluoreszenzspuren mehrerer Perlen über Hunderte von Sichtfeldern zu analysieren. Dies ist vorteilhaft, da die Fluoreszenzintensität einer Spur für eine einzelne Perle über eine große Entfernung analysiert werden kann und Informationen über Änderungen des Rollverhaltens im Laufe der Zeit liefert. Ein solches Beispiel ist die Veränderung der Schubspannung im Laufe der Zeit und die Beobachtung der entsprechenden Änderungen der Fluoreszenzintensität. Kürzlich wurde gezeigt, dass durch ein einfaches Modell die Fluoreszenzintensität der Spuren verwendet werden kann, um die molekulare Kraftverteilung abzuschätzen13. Es gibt auch eine mögliche Anwendung ratiometrischer Methoden, um mit diesem Assay eine Kraftquantifizierung zu erreichen23.
Da das Rollen von Zellen schnell (10s von μm / s) und über eine längere Entfernung (1000s von μm) erfolgt, war die Untersuchung ihrer molekularen Spannung mit herkömmlichen Echtzeit-Molekularspannungssensoren eine Herausforderung. Der Adhäsions-Footprint-Assay durchbricht diese anspruchsvolle Einschränkung, um eine Bildgebung nach dem Ereignis zu ermöglichen. Obwohl das TGT-Bruchereignis nicht direkt über die Größe der vor dem Bruch aufgetretenen Spannung berichtet, wurden vielversprechende Entwicklungen bei der Analyse der Fluoreszenzspuren erzielt, um die quantitative Untersuchung der molekularen Kräfte zu ermöglichen, die an der Walzadhäsion beteiligt sind13,23,24.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), dem New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), der Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) und dem University of British Columbia Eminence Fund unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
