Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

Published: September 27, 2021 doi: 10.3791/63013
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,2, *1,2, 2, 1,3, 1,2
1Department of Chemistry, The University of British Columbia, 2Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, 3Faculty of Medicine, The University of British Columbia
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

Abstract

הידבקות מתגלגלת, הקלה על ידי אינטראקציות בתיווך סלקטיבי, היא תנועתיות דינמית מאוד, פסיבית בגיוס לויקוציטים לאתר של דלקת. תופעה זו מתרחשת venules postcapillary, שבו זרימת הדם דוחפת לויקוציטים בתנועה מתגלגלת על תאי האנדותל. גלגול יציב דורש איזון עדין בין היווצרות קשר הידבקות לבין הניתוק המכני שלהם, ומאפשר לתא להישאר מחובר לפני השטח תוך כדי גלגול לכיוון הזרימה. שלא כמו תהליכי הידבקות אחרים המתרחשים בסביבות סטטיות יחסית, הידבקות מתגלגלת היא דינמית מאוד כאשר התאים המתגלגלים נעים על פני אלפי מיקרון בעשרות מיקרון לשנייה. כתוצאה מכך, שיטות מכניות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה אינם מתאימים למדידת אירועי הידבקות בודדים ואת הכוחות המולקולריים הקשורים בשל ציר הזמן הקצר ורגישות גבוהה הנדרשים. כאן, אנו מתארים את היישום האחרון שלנו של טביעת הרגל הידבקות assay כדי לדמיין את P-selectin: אינטראקציות PSGL-1 בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית. שיטה זו משתמשת רצועות מד מתח מבוססות DNA בלתי הפיכות כדי לייצר היסטוריה קבועה של אירועי הידבקות מולקולרית בצורה של מסלולי פלואורסצנטיות. ניתן לדמיין מסלולים אלה בשתי דרכים: (1) תפירת אלפי תמונות מוגבלות עקיפה כדי לייצר שדה ראייה גדול, המאפשרת הפקת טביעת רגל של הידבקות של כל תא מתגלגל לאורך אלפי מיקרון, (2) ביצוע DNA-PAINT כדי לשחזר תמונות ברזולוציית-על של מסלולי הפלואורסצנטיות בתוך שדה ראייה קטן. במחקר זה, נעשה שימוש ב-90% מטביעת הרגל של הידבקות כדי לחקור תאי HL-60 המתגלגלים בלחצי גיסה שונים. בעשותנו כן, הצלחנו לדמיין את ההתפלגות המרחבית של P-selectin: אינטראקציית PSGL-1 ולקבל תובנה על הכוחות המולקולריים שלהם באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות. לפיכך, שיטה זו מספקת את היסודות לחקירה כמותית של אינטראקציות פני התא השונות המעורבות בהידבקות מתגלגלת ברמה המולקולרית.

Introduction

מפל ההדבקה המתגלגל מתאר כיצד תאים במחזור לקשור ולהתגלגל לאורך קיר כלי הדם1. גלגול פסיבי הוא בעיקר בתיווך selectins, מחלקה עיקרית של מולקולות הידבקות הסלולר (CAMs)1. תחת זרם הגיזה של דם, לויקוציטים המבטאים P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1) יוצרים קשרים ארעיים מאוד עם P-selectin, אשר עשוי לבוא לידי ביטוי על פני השטח של תאי אנדותל מודלקים. תהליך זה הוא קריטי עבור לויקוציטים לעבור לאתר של דלקת2. בנוסף, PSGL-1 הוא גם קולטן mechanosensitive מסוגל להפעיל את שלב הידבקות המשרד הבאים של מפל הידבקות מתגלגל על מעורבותו עם P-selectin3.

מוטציות גנטיות המשפיעות על תפקוד CAM יכולות להשפיע קשות על המערכת החיסונית, כגון במחלה הנדירה של מחסור בהידבקות לויקוציטים (LAD), שבה תקלה במולקולות הידבקות המתווכות בגלגול מובילה לאנשים אימונו-מוגעים קשות4,5,6. בנוסף, תאים סרטניים במחזור הוכחו לנדוד בעקבות תהליך גלגול דומה, המוביל גרורות7,8. עם זאת, מכיוון שגלגול תאים הוא מהיר ודינמי, שיטות מכניות ניסיוניות קונבנציונליות אינן מתאימות לחקר אינטראקציות מולקולריות במהלך גלגול תאים. בעוד ששיטות מניפולציה של תאים יחידים ומולקולה אחת כמו מיקרוסקופיה של כוח אטומי ופינצטה אופטית הצליחו לחקור אינטראקציות מולקולריות כגון האינטראקציה התלויה בכוח של P-selectin עם PSGL-1 ברמת המולקולה הבודדת9, הן אינן מתאימות לחקירת אירועי הידבקות חיה במהלך גלגול תאים. בנוסף, האינטראקציה המאופיינת במבחנה אינה יכולה לענות ישירות על השאלה על הידבקות מולקולרית ב- vivo. לדוגמה, איזה טווח מתח מולקולרי רלוונטי מבחינה ביולוגית כאשר תאים מתפקדים בסביבתם הטבעית? שיטות חישוביות כגון סימולציית דינמיקה דבק10 או מודל מצב יציב פשוט11 לכדו פרטים מולקולריים מסוימים וכיצד הם משפיעים על ההתנהגות המתגלגלת אך תלויים מאוד בדיוק הפרמטרים וההנחות של המודל. טכניקות אחרות כגון מיקרוסקופיה כוח המתיחה יכול לזהות כוחות במהלך נדידת תאים אבל לא מספקים רזולוציה מרחבית מספקת או מידע כמותי על מתח מולקולרי. אף אחת מהטכניקות הללו אינה יכולה לספק תצפיות ניסיוניות ישירות של הדינמיקה הזמנית, ההטרוגניות המרחבית וההטרוגניות בעוצמה של כוחות מולקולריים, המתייחסים ישירות לתפקוד התא ולהתנהגות בסביבתם הטבעית.

לכן, יישום חיישן כוח מולקולרי המסוגל למדוד במדויק אינטראקציות בתיווך סלקטיבי חיוני לשיפור הבנתנו של הידבקות מתגלגלת. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור טביעת הרגל הידבקות assay12 שבו חרוזים מצופים PSGL-1 מגולגלים על משטח המציג p-selectin פונקציונלי מד צמיגים (TGTs)13. TGTs אלה הם חיישני כוח מבוססי DNA בלתי הפיכים שגורמים להיסטוריה קבועה של אירועי קרע בצורה של קריאת פלואורסצנטיות. זה מושג באמצעות הקרע של TGT (dsDNA) ולאחר מכן תיוג לאחר מכן של TGT קרוע (ssDNA) עם גדיל משלימה תווית פלואורסצנטית. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו הוא התאימות שלה הן להדמיה מוגבלת עקיפה והן עם רזולוציית-על. הגדיל המשלים המסומן באופן פלואורסצנטי יכול להיות מאוגד לצמיתות (>12 bp) להדמיה מוגבלת עקיפה או כבול באופן חולף (7-9 bp) להדמיה ברזולוציית-על באמצעות DNA PAINT. זוהי מערכת אידיאלית לחקור הידבקות מתגלגלת כמו TGTs נקרעים במהלך גלגול פעיל, אבל קריאת פלואורסצנטיות מנותח לאחר גלגול. שתי שיטות ההדמיה מספקות גם למשתמש יותר חופש לחקור הידבקות מתגלגלת. בדרך כלל, הדמיה מוגבלת עקיפה שימושית לחילוץ כוח קרע מולקולרי באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות13, ואילו הדמיה ברזולוציית-על מאפשרת ניתוח כמותי של צפיפות הקולטן. עם היכולת לחקור תכונות אלה של הידבקות מתגלגלת, גישה זו מספקת פלטפורמה מבטיחה להבנת מנגנון ויסות הכוח על הידבקות מולקולרית של תאים מתגלגלים תחת זרימת גיסת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תיוג והיברידיה של אוליגונוקלאוטיד

  1. הפחתת קשרים דיסולפידים של חלבון G
    1. יש להמיס 10 מ"ג חלבון G (ProtG) ב-1 מ"ל של מים אולטרה-תותים.
      הערה: החלבון G כאן משתנה עם שאריות ציסטאין בודדות בטרמינל C ותג פולי-היסטידין N-טרמינוס.
    2. חילופי חוצצים ≥20 μL של ProtG (10 מ"ג /מ"ל) לתוך 1x PBS (pH 7.2) עם עמודת P6.
    3. מדוד את ריכוז החלבון לאחר חילופי חיץ.
      הערה: ריכוז אופייני של 7-8 מ"ג/מ"ל.
    4. הכן 120 mM טריס (2-קרבוקסיתיל)פוספין (TCEP) על ידי המסת 3 מ"ג TCEP לתוך 90 μL של 1x PBS (pH 7.2) ואחריו 10 μL של 0.5 M EDTA.
      הערה: TCEP צריך להיות מוכן טרי.
    5. הוסף 4 μL של 120 mM TCEP (480 נמול) ל 20 μL של ProtG (4-5 נמול).
      הערה: כוון ליחס טוחנת של ~ 100:1 TCEP לחלבון.
    6. אפשר לתגובה להמשיך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    7. הסר TCEP עודף מה- ProtG המופחת עם עמודת P6 (מאגר שהוחלף ב- 1x PBS, pH 7.2).
    8. למדוד את הריכוז של ProtG מופחת עם ספקטרופוטומטר UV / Vis ולשמור את הספקטרום.
      הערה: ריכוז אופייני של 3.5-4.5 מ"ג/מ"ל.
  2. תגובת SSDNA עם סולפו-SMCC עם תוויות אמין
    1. יש להמיס ssDNA (amine-ssDNA) עם תווית אמין במים נטולי נוקלאז לריכוז של 1 מ"מ. אמת את ריכוז הגדילים עם ספקטרופוטומטר UV/Vis.
    2. הכן 11.5 mM סולפו-SMCC (קישור הטרו-ביפונקטורי עם אסתר סולפו-NHS ו maleimide) פתרון טרי על ידי המסת 2 מ"ג של סולפו-SMCC ב 400 μL של מים אולטרה-סעיפים מערבולת לערבב.
    3. הוסף 6 μL של 1 mM אמין-ssDNA (6 נמול) כדי 5.2 μL של 11.5 מ"מ סולפו-SMCC (60 נמול) ו 88.8 μL של 1x PBS (pH 7.2). מערבולת עבור 5 s ואחריו צנטריפוגה ב 8600 x g במשך 3 דקות.
    4. אפשר לתגובה להמשיך במשך 30 דקות ב- RT.
    5. הסר עודף גופרתי-SMCC מן SMCC מצומד אמין-ssDNA (mal-ssDNA) עם עמודת P6 (חוצץ הוחלף 1x PBS, pH 7.2).
    6. למדוד את הריכוז של mal-ssDNA עם ספקטרופוטומטר UV / Vis ולשמור את הספקטרום.
      הערה: ריכוז אופייני של 35-45 מיקרומטר.
  3. הטיות ProtG-ssDNA
    1. הוסף 21 μL של 4.5 מ"ג / מ"ל פרוטG מופחת (3 נמול) למאל-SSDNA (~ 4-5 נמול).
      הערה: אמצעי אחסון וריכוזים כאן הם ערכים אופייניים. התאימו בהתאם למדידה ניסיונית אישית. תמיד להבטיח כמות עודפת של mal-ssDNA על ProtG ביחס של ~ 1.5:1.
    2. מערבולת עבור 5 s ולאפשר את התגובה להמשיך במשך 3 שעות ב RT.
  4. טיהור ואפיון ProtG-ssDNA
    1. לטהר את ProtG-ssDNA מצומד באמצעות בידוד תג שלו עם חרוזים מגנטי ניקל-nitrilotriacetic (Ni-NTA).
    2. הסר imidazole עודף (מאגר elution Ni-NTA) מהמוצר עם עמודת P6 (חוצץ הוחלף 1x PBS, pH 7.2).
      הערה: שלב זה חיוני לכימות ההטיות, שכן לאמידזול יש ספיגה משמעותית ב-280 ננומטר.
    3. השתמש בספקטרופוטומטר UV/Vis כדי להקליט את הספקטרום של המוצר ProtG-ssDNA, כמו גם את מאגר ה- Elution Ni-NTA (1x).
      הערה: ספיגת ProtG-ssDNA טיפוסית ב- 260 ננומטר ו- 280 ננומטר היא 0.8 ו- 0.6, בהתאמה.
    4. כדי לקבוע את יעילות ההטיה ואת היחס של ProtG ל- ssDNA, השתמש בתסריט MATLAB הכתוב בהתאמה אישית (קובץ קידוד משלים 1) כדי לפרק את ספקטרום המוצר הסופי בהתבסס על שלוש הספקטרום שנאסף בעבר (ProtG, SMCC-strand, חיץ חרוז Ni-NTA).
      הערה: בקצרה, הקוד פועל כמתואר בשלבים 1.4.5-1.4.8. הריכוז הטיפוסי הוא 4 מיקרומטר של ProtG-ssDNA עם ProtG ו- ssDNA ביחס טוחנת ~ 1:1 (איור 2A).
    5. Input ProtG, SMCC-strand, חיץ חרוז Ni-NTA, ואת ספקטרום ProtG-ssDNA UV/Vis לתוך סקריפט MATLAB
    6. בצע מזעור לא ליניארי רב-ממדי בלתי מרוסן כדי לשחזר את ספקטרום הספקטרום ProtG-ssDNA מפרטטרום המקור (ProtG, SMCC-strand, וספקטרום מאגר חרוז Ni-NTA)
      הערה: פונקציית המזעור מפיקה שלושה גורמי טרנספורמציה, אחד עבור כל ספקטרום מקור.
    7. לשחזר את ספקטרום ProtG-ssDNA על ידי הכפלת הספקטרום על ידי הגורם המתאים שלהם ושילוב ספקטרום המקור שהשתנה.
    8. הכפל את הריכוז הראשוני של ProtG ו- SMCC-גדיל על ידי גורמי הטרנספורמציה המתאימים כדי לקבוע את הריכוזים של SMCC-גדיל ו ProtG במוצר ProtG-ssDNA.
    9. (אופציונלי) הפעל דף מקורי לפי איור 2B כדי להבטיח שכל רכיב וצעד יפעלו כצפוי.
  5. הכלאה של TGT
    1. היברידי ProtG-ssDNA (גדיל עליון) עם גדיל תחתון ביוטיניל ביחס טוחנת של 1.2:1 עם ריכוזים של 240 ננומטר ו 200 ננומטר בהתאמה במאגר T50M5 (10 mM טריס, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl2) כדי להיברידי את מבנה TGT המלא. בואו היברידית ב RT ≥1 h.

2. חלוקת פני השטח

  1. ניקוי משטחים
    1. נקה בקבוק ארלנמייר אחד ושתי צנצנות מכתימות על כל 8 כיסויים. מלאו כל מיכל בתמיסת 1 M KOH וסוניאט למשך שעה אחת ב-RT. שטפו היטב כל מיכל במים אולטרה-תפוניים ויבשו עם N2 או בתנור.
      הערה: מלאו את ה-KOH למעלה כדי לגעת במכסה, כך שהם גם מנוקים.
    2. שוטפים היטב כל כיסוי במים אולטרה-תותים ומניחים אותם באחת מצנצנות הכתמים המנוקות.
      הערה: ודא שהם לא דבוקים זה לזה או לקיר צנצנות הכתמים.
    3. במכסה המנוע אדים, להכין טרי פתרון פיראנה על ידי הוספת 30 מ"ל של מי חמצן (30%) עד 90 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת (95%-98%) בכוורת 250 מ"ל.
      זהירות: חומצה גופרתית מרוכזת היא מאכלת מאוד. מוסיפים את מי חמצן לאט מאוד לחומצה הגופרתית ומערבבים בזהירות לערבב.
    4. שקועים באופן מלא את כיסויי הכתמים בצנצנת הכתמים עם תמיסת פיראנה. השאירו כיסויים בפיראנה למשך 30 דקות במכסה המנוע.
      אזהרה: מצננים את תמיסת הפיראנה ללא יותר מ-80 מעלות צלזיוס לפני ההשפכה כדי למנוע פיצוח צנצנת הכתמים.
    5. יש להשליך את תמסת הפיראנה לכוס 1000 מ"ל ולנטרל עם 1 M KOH מניקוי זכוכית.
    6. (אופציונלי) יש לחזור על ניקוי פיראנה (שלבים 2.1.3-2.1.5) עם תמיסה טרייה של פיראנה.
    7. לשטוף את כיסויים עם כמויות גדולות של מים אולטרה-תפירה כדי להסיר את כל פתרון פיראנה שיורית. יש לנער בעדינות את צנצנת הכתמים במהלך כל עלייה כדי להקל על ההסרה (מומלץ לבצע 10 שטיפות).
    8. שוטפים את כיסויי המכסים במתנול 3 פעמים כדי להסיר מים מפני השטח של כיסוי ולשמור על כיסויים שקועים מתנול.
  2. סילאניזציה של פני השטח
    1. הכן פתרון אמינוסילן 1% על ידי ערבוב יסודי של 94 מ"ל של מתנול, 1 מ"ל של אמינוסילן, ו 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית בבקבוק ארלנמאייר המנוקה והמיובש. יוצקים לתוך השני ניקה מיובש מכתים צנצנת 14.
    2. מעבירים את כיסויי הכיסוי השקועים מתחת לתמיסת המתנול לצנצנת הכתמים המכילה תמיסת אמינוסילן של 1% ושומרים על הצנצנת מכוסה.
      הערה: אין לאפשר כיסויים להתייבש בעת המעבר aminosilane כדי להגביל את החשיפה משטח זכוכית לאוויר.
    3. לדגור על צנצנת הכתמים המכילה כיסויים באמינסילאן במשך שעה אחת ב 70 °C בתנור15.
    4. יש להשליך בזהירות את תמיסת אמינוסילן במיכל פסולת נפרד ולשטוף את כיסויי המכסים בצנצנת הכתמים במתנול 5 פעמים כדי להסיר את תמיסת אמינוסילן.
    5. יש לשטוף את הכיסויים בצנצנת הכתמים במים אולטרה-תפומיים 5 פעמים ולייבש אותם ב-N2.
    6. אופים את הכיסויים היבשים בצנצנת הכתמים בתנור ב 110 °C (20 דקות). אפשר כיסויים להתקרר RT, ולאחר מכן למקם אותם על מדף PEGylation.
      הערה: מכסים את צנצנת הכתמים במכסה במהלך האפייה כדי למזער תצהיר מיוחד וכימי על פני השטח15.
  3. הכנת פתרון PEG
    1. הפשר PEG (פוליאתילן גליקול) ו PEG-ביוטין ל- RT במשך כ -30 דקות.
      הערה: שלב זה ממזער עיבוי לחות שיכול לבזות את אסתר NHS על PEG.
    2. הפוך חוצץ PEG על ידי הוספת 84 מ"ג של סודיום ביקרבונט ל 10 מ"ל של מים אולטרה-תות. ניסוח זה אמור לספק חוצץ ב- pH 8.4.
    3. עבור 8 כיסויים, כל אחד עם צד PEGylated אחד עם 20:1 PEG:PEG-ביוטין: למדוד 100 מ"ג של PEG ו 5 מ"ג של PEG-ביוטין להוסיף 400 μL של חוצץ PEG. מערבולת הפתרון עבור 30 s וצנטריפוגה במשך 1 דקות במהירות המרבית (≥18000 x גרם).
      הערה: שלב זה הוא זמן רגיש, כמו הידרוליזה SVA NHS-אסתר מתחיל מיד ויש לו מחצית חיים של 34 דקות ב pH 8.0, עם מחצית חיים קצרה יותר ב pH 8.4.
  4. PEG דגירה ואחסון כיסוי
    1. הגדירו את תא הלחות והכניסו פנימה את כיסויי המכסים.
    2. הוסף 90 μL של פתרון PEG לכיסוי בתא הלחות והנח כיסוי שני על גבי פתרון PEG באמצעות פינצטה מחזיקה כיסוי כדי להפיץ באופן שווה את פתרון PEG.
    3. ודא שאין בועות בפתרון שהושלכו על כיסוי. מנמיכים קצה אחד של השני מכסה על כיסוי הראשון לאט טיפה הקצה השני, כך שאין בועות תקועים בין כיסויים.
      הערה: בועות יגרמו לאזורים מסוימים להיות PEGylated גרוע.
    4. חזור על הפעולה עד שלכל כיסויי הכיסוי יש PEG (כלומר, 8 כיסויים = 4 כריכי PEG). לדגור על פתרונות PEG בן לילה (~ 12 שעות) ב RT בתא לחות בחושך16.
    5. מפרידים את זוגות הכיסויים ומניחים אותם בצנצנת כתמים. שימו לב לצדדים המנומרים.
    6. יש לשטוף היטב את הכיסויים במים אולטרה-תפופים ולייבש עם N2.
      הערה: החזק את כיסויי עם פינצטה ולפוצץ N2 על פני השטח לכיוון פינצטה כדי למנוע מזהמים להתייבש על פני השטח.
    7. סמן את הצד שאינו מנוצל באמצעות נקודה בפינה באמצעות סמן קבוע או עט יהלום.
    8. מקם 2 כיסויי PEGylated בצינורות דואר עם הצדדים PEGylated אחד מול השני כדי לעזור לזהות את הצד PEGylated לפני השימוש.
    9. שואבים את הצינור במשך 5 דקות ומילוי אחורי עם N2. לאטום את הצינור עם parafilm.
    10. יש לאחסן את כיסויי PEGylated ב-20 °C (70 °F) בצינורות הדיוור האטומים למשך עד 6 חודשים.
      הערה: חממו את צינורות האחסון ל- RT לפני הרכבת השבבים. עיבוי על כיסויים במהלך האיטום יגרום לדליפה.

3. הכנת תא זרימה

  1. הרכבת שבב
    1. מורחים דק כמות קטנה של אפוקסי משני צידי הסרט הדו-צדדי עם סכין גילוח.
      הערה: אפוקסי רב מדי עלול להתפשט לערוץ במהלך ההרכבה.
    2. חותכים בלייזר את הסרט מצופה אפוקסי כדי ליצור 4 ערוצים. צרו את שבב הזרימה על ידי כריכת סרט האפוקסי בין שקופית בת 4 גומות לכיסוי PEG (איור 1A).
    3. בעזרת קצה פיפטה, יש להפעיל לחץ עדין לאורך הערוצים כדי ליצור אטם טוב. רפא את האפוקסי ≥1 שעות.
      הערה: אין לגזז את הזכוכית כדי למנוע החלקה נגד אפוקסי.
  2. הרכבה קאמרית
    1. יישר את השבב כך שפתיחת כל ערוץ תוצב במרכזי המתאם (איור 1A). מניחים שני מרווחי אקריל שקופים על גבי השבב, מפעילים לחץ מוצק באמצע הבלוק, ומברגים בשני ברגים 4-40 בקצת כל מרווח.
      הערה: אין לכפות את הבורג או ללחוץ חזק מדי על המרווחים, או שהשבב עלול להיסדק.
    2. בצד השני של הסוגר, בורג הכניסות לתוך החורים המושרשרים. נטר את מצב האיטום דרך בלוק האקריליק השקוף.
    3. כאשר הצינורות יוצרים קשר עם פתח השבב, אטמו את החיבור על ידי פיתול עדין של הצינורות בכיוון השעון.
      הערה: מפרצונים לחוצים עלולים לגרום לחסימת זרימה, בעוד שמגעים רופפים יגרמו לדליפה.

4. הכנת משטח

הערה: עיין באיור 1B עבור זרימת העבודה הכוללת.

  1. חסימת סוכנים למניעת איגוד לא מינוי
    1. השתמש pipette להזרים 200 μL של חוצץ לשטוף (10 mM טריס, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 ו 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20) לתוך התא כדי לבדוק דליפה. אם נוצרות בועות בערוץ, דחוף באגרסיביות 200 μL נוספים כדי להסיר את הבועות.
      הערה: בועות אוויר גדולות שלא הוסרו בשלב זה יכולות להתנתק ולהרוס פונקציונליזציה של פני השטח מאוחר יותר.
    2. הוסף 40 μL של BSA (1% w/v) לתא הזרימה כדי למנוע כריכה לא-מינית ודגרה למשך 10 דקות.
    3. הקפד להוסיף מספיק נפח במהלך כל תקופת דגירה כדי למלא את תאי הזרימה וליצור טיפות בפרצונים ובשקעים. התאם את נפחי הדגירה בהתאם ובצע את כל הדגירה בתא לחות.
    4. הוסף 40 μL של Tween 20 (5% v/v) לתא הזרימה. דגירה במשך 10 דקות כדי להפחית עוד יותר כריכה לא מינית.
    5. (אופציונלי) בדוק את פני השטח עבור פסיביציה נאותה על ידי זרימת חרוזי פוליסטירן דרך הערוץ. הוסף 40 μL של חרוזי פוליסטירן מצופים ProtG (0.01% w/v) ותמונה באמצעות מיקרוסקופ Darkfield עם מטרה 10x. אם חרוזים אינם נדבקים לפני השטח, המשך לשלב הבא.
    6. לשטוף את הערוץ עם 200 μL של חוצץ לשטוף כדי להסיר את כל סוכני passivation.
  2. פונקציונליזציה של פני השטח של התא
    1. הוסף 40 μL של סטרפטאבידין (100 מיקרוגרם / מ"ל) לתא הזרימה ודגרה במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם 200 μL של חוצץ לשטוף.
    2. הוסף 40 μL של ProtG-TGT היברידי (100 ננומטר) לתא הזרימה ודגרה במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם חוצץ לשטוף 200 μL.
    3. הוסף 40 μL של גדיל עליון ProtG-TGT (100 ננומטר) למשך 20 דקות כדי להשלים כל גדיל תחתון TGT לא מרוסן על פני השטח. לשטוף עם 200 μL של חוצץ לשטוף.
    4. הוסף 40 μL של P-selectin-Fc (10 מיקרוגרם / מ"ל) לתא הזרימה ודגרה במשך 60 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם 200 μL של חוצץ לשטוף.
      הערה: משך הדגירה הוא קריטי.

5. ניסויים והדמיה

  1. כיוונון מערכת זרימה
    1. מלא מזרק זכוכית 5 מ"ל עם חוצץ מתגלגל (HBSS עם 2 מ"מ CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0.1% BSA). ודא שאין בועות אוויר במזרק על ידי הקשה על צידי המזרק כדי להוציא את הבועות ולדחוף אותם החוצה כפי שהם צפים לכיוון הקצה.
    2. הכנס מחט סטרילית (26 G, 5/8 אינץ 'אורך) לתוך ~ 200 מ"מ של צינורות פוליאתילן (I.D. : 0.38 מ"מ; O.D: 1.09 מ"מ) ולחבר את המחט למזרק הזכוכית.
      הערה: ודא שאין אוויר לכוד בשום מקום במחבר המחט.
    3. תקן את המזרק על משאבת המזרק והטה את משאבת המזרק כך שצד הבוכנה מוגבה כדי למנוע מבועות אוויר להיכנס לערוץ. הכנס את קצה הצינור לתוך הכניסה של תא הזרימה.
      הערה: יש להבטיח מגע נוזלי לנוזל בעת ביצוע החיבור על ידי הפקדת טיפות על המפרצונים והשלכת טיפות בסוף צינורות המזרק. ודא שאין בועות אוויר להיכנס לערוץ על ידי מתן טיפה קטנה להיווצר בקצה צינורות המזרק לפני החדרת אותו לתוך הכניסה.
    4. הכנס קצה אחד של עוד 200 ממ של צינורות פוליאתילן לתוך השקע, ואת הקצה השני שקוע פסולת.
  2. הגדרה עבור גלגול תאים
    1. לגדל תאי HL-60 ב 25 ס"מ2 צלוחיות תרבית מאווררת במדיה IMDM בתוספת 20% סרום בקר עוברי ו 1% אנטיביוטיקה ב 37 °C עם 5% CO2. לשמור על צפיפות תאים בין 1 x 105-2 × 106 תאים / מ"ל.
    2. (אופציונלי) להבדיל את תאי HL-60 במדיום IMDM מלא המכיל 1.25% DMSO בצפיפות ראשונית של 2 x 105 תאים /mL. תאי דגירה להיות הפעיל ביותר במשך 5-6 ימים.
    3. קח דגימה (1-2 מ"ל) מהשעיית התא וצנטריפוגה (200 x גרם, 3 דקות) כדי לכדור את התאים.
    4. הסר את המדיום בעדינות resuspend התאים ב 500 μL של המאגר המתגלגל. חזור על שלב הכביסה פעמיים כדי להסיר פסולת סלולרית.
    5. מדוד את צפיפות התא עם המוציטומטר. resuspend כדורי התא עם חוצץ מתגלגל לצפיפות של 2 x 105 תאים / מ"ל.
    6. בזהירות לנתק את הצינורות מן הכניסות / שקע ו pipette 40 μL של השעיית התא לתוך תא הזרימה. קשר מחדש את הצינורות כמתואר קודם לכן, ודא שלא הוכנסו בועות לערוץ הזרימה.
    7. התחל ניסוי גלגול תאים על ידי הפעלת משאבת המזרק בקצבי הזרימה הרצויים.
      הערה: עוצמת מסלולי הפלואורסצנטי תלויה בלחץ הגיסה, ומהירות הגימור/מהירות התא של מהירות התא נמוכה יותר תיצור בדרך כלל רצועות עמומות יותר (איור 4A). הימנע מצפיפות תאים גבוהה על פני השטח או ממשך גלגול מוגזם כדי להבטיח רצועות חד-תאיות נפרדות (איור 4B,C).
    8. השתמש במיקרוסקופ Darkfield עם מטרה של פי 10 כדי להבטיח שצפייה בגלגול תאים.
    9. לאחר השלמת הניסוי, הסר את התאים מהערוץ על ידי החדירה של המאגר המתגלגל במהירות של 100 מ"ל/שעה עד שהמשטח יהיה נקי מתא.
  3. הדמיית מסלולים מקומיים על ידי "הצטברות נקודות מבוססת DNA להדמיה בטופוגרפיה ננומטרית" (DNA-PAINT)
    1. הוסף 40 μL של גדיל צלם DNA-PAINT (500 pM) במאגר DNA-PAINT (0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) לערוץ.
    2. בצע מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת (TIRF) באמצעות עדשת יעד TIRF טבילת שמן 100x. רכוש 40000+ פריימים עם זמן חשיפה של 25 אלפיות שניים לכל מסגרת ברווח של 300 אלקטרון באמצעות מצלמת התקן מצמיד מטען (EMCCD) המתרבה אלקטרונים.
    3. השתמש בחבילת התוכנה של פיקאסו17 כדי להתאים לשפות לשפות ועבד את התמונות ברזולוציית-על (איור 4D) בעקבות שלבים 5.3.4-5.3.5.
    4. טען את סרט DNA-PAINT לתוכנית לוקליזציה כדי לקבוע את לוקליזציה של כל פלואורופור בכל פריים.
      הערה: מטב את אורך הצד של התיבה ואת הפרמטרים של Min. Net Gradient עד למעקב מדויק אחר פלואורופורים בלבד. הפרמטר Min. Net Gradient יכול לעתים קרובות לעבור מעל 100000 כדי להשיג מעקב אופטימלי. הגדרת התאמה: MLE, שיטת גאוס משולבת מייצרת את התוצאה הטובה ביותר. לבסוף, אם הסרט ארוך מדי, פצל אותו לערימות של 10000 פריימים כדי שעקבות התצוגה המקדימה ב- Localize יפעלו כראוי לפני שילובן מחדש לקובץ HDF5 סופי.
    5. לאחר מכן, טען את קובץ HDF5 המתקבל לתוכנית Render כדי לבצע תיקון ועיבוד סחף.
      הערה: בצע תיקון סחף מרובה באמצעות Undrift על-ידי RCC כדי לשפר את התוצאה הסופית.
  4. הדמיית מסלולים ארוכים על-ידי תיוג קבוע
    1. הוסף את גדיל הדמיה הקבוע ודגרה עבור 120 s במאגר T50M5. לשטוף את הערוץ על ידי infusing 200 μL של חוצץ לשטוף.
    2. הקלט תמונה עם לייזר העירור כבוי כדי להשיג רעש מצלמת רקע. תמונה של שטח גדול בתבנית רשת על-ידי מיקרוסקופיית TIRF.
      הערה: מומלץ לתפרר לאחר מכן חפיפה של מסגרת מעל מסגרת של 10% ≥.
    3. תכנת את המיקרוסקופ כדי לסרוק את השטח של 400 x 50 תמונות (20000 תמונות בסך הכל). באמצעות תוכנית FIJI, לפצל נתונים גולמיים לתוך קבצי tiff בודדים, כל אחד המכיל מקסימום של 10000 תמונות.
    4. שיטחו את כל התמונות באמצעות פרופיל התאורה (איור 3A-C) בעקבות שלבים 5.4.5-5.4.7.
    5. הפחת את רעש מצלמת הרקע מכל פריים. השג את הקרנת הערימה הממוצעת (פרופיל תאורה) של כל מסגרת מופחתת ברקע.
    6. נרמל את פרופיל התאורה לפי הערך המרבי שלו. חלק כל מסגרת מופחתת ברקע לפי פרופיל התאורה המנורמל.
    7. שינוי קנה המידה של המסגרות המתוקנות לטווח המתאים עבור עומק הסיביות המתאים.
    8. השתמש ב- MIST18 כדי לתפור את התמונות (איור 3D,E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליך הניסיוני של תוחם טביעת הרגל של הידבקות. זרימת העבודה של הניסוי הכללי מודגמת באיור 1, החל מהרכבת תא הזרימה (איור 1A) וכלה בפונקציונליזציה של פני השטח (איור 1B) ושלבי הניסוי וההדמיה (איור 1C).

איור 2 הוא תוצאה מייצגת לאפיון הביו-שיתוף הביולוגי ProtG-ssDNA. הספקטרום UV/Vis של שלושה רכיבים במוצר הסופי, כלומר, ProtG, mal-ssDNA, ו- imidazole elution buffer, נאספו לפני ההטיה הסופית (איור 2A), כל אחד מתאים לריכוז ידוע. ספקטרום זה יוצר את הבסיס האורתוגונלי להתאמה לספקטרום המוצר הביו-כבידתי, שבו שלושת הפרמטרים הלא ידועים הם הריכוזים שלהם. פונקציה מותאמת אישית ב- MATLAB שימשה לקביעת הריכוזים. התוצאות מראות יחס של כמעט 1:1 בין ProtG ל-ssDNA (איור 2A). זה כצפוי כי ssDNA יש רק שינוי אמין אחד, ואת ProtG יש ציסטאין יחיד מהונדס ב- C-terminus שלה. גישה זו מועילה יותר לגישה שדווחה בעבר19 באמצעות DNA אחד שונה תיול כדי למקד את ריבוי אמינים ראשוניים על ProtG, שם יחס ההטיה לא ניתן לשמור בקלות.

בנוסף, נעשה שימוש ב-PAGE מקורי לאישור התנאים הביולוגיים (איור 2B). DNA מוכתם על ידי GelGreen וחלבונים על ידי כחול קומאסי, בהתאמה. כמו GelGreen כתמים dsDNA חזק יותר מאשר ssDNA, זה צפוי כי כל רצועות ssDNA להיות עמום יותר מאשר ריכוז טוחנת שווה של רצועות dsDNA (נתיבים 3, 4). מכיוון שהמלאי ProtG מכיל שאריות ציסטאין C-terminal, שבריר מהחלבונים יוצרים עמעום באמצעות קשר דיסולפיד, כפי שניתן לראות בנתיב 5 (איור 2B). ProtG מופחת, לעומת זאת, מראה להקה אחת (נתיב 6). בעת שימוש ProtG המניה בהטיית DNA ישירות, ProtG מעומעם דיסולפיד אינו מגיב ל- DNA ומראה כמו להקה ללא כל כתמי GelGreen (נתיבים 7, 8). רצועת הדימר ProtG נעלמת במוצר ההטיות באמצעות ProtG מופחת (נתיבים 9, 10). מכיוון שנעשה שימוש בעודף של mal-ssDNA ל- ProtG (1.5:1) במהלך ההטיות, רק רצועות TGT נראות במוצר ההטיות הסופי (נתיבים 8, 10). להקות GelGreen הבהירות בקנה אחד עם הלהקה המונומרית ProtG מצביעות על הטיות מוצלחות ותשואה טובה.

איור 3 ממחיש תמונות מיקרוסקופיות גולמיות מייצגות ואת זרימת העבודה כדי לתקן אותן לתפירת תמונות וניתוח לאחר מכן. פרופיל התאורה של TIRF המוצג מסיבים במצב יחיד בהיר יותר בדרך כלל באמצע שדה הראייה ומעמעם סביב הקצוות (איור 3A, B). כדי לפצות על התאורה הלא אחידה ולשטח את התמונות לניתוח כמותי, פרופיל התאורה נקבע על ידי ממוצע של אלפי פריימים בודדים (איור 3B). תמונות שטוחות הופקו על-ידי חיסור רעש המצלמה מפרופילי הגולם וההארה ולאחר מכן בנרמול פרופיל התאורה (איור 3C). ההשפעה של שיטוח התמונה מודגמת בבירור כאשר התמונות תפורות ליצירת תמונה גדולה. עוצמת התמונה באזורי הרקע ללא רצועות תא מציגה דוגמאות תקופתיות ברורות המתאימות לתמונות שלא אומתו (איור 3D). אותו שדה ראייה התפור מתמונות שטוחות יוצר רקע שטוח (איור 3E). רקע שטוח הוא קריטי לפרשנות תנודות העוצמות לאורך מסלול התא. כניסוי ראשון, פרופיל זרימה משתולל דומה לזה המודגם באיור 3F משמש לקביעת טווח הלחץ הגניסלר המתאים לניסוי המבטיח הן גלגול תאים יציב והן עקבות תאים פלואורסצנטיים ברורים. טביעת רגל טיפוסית של הידבקות בתא יחיד מתחת לפרופיל זרימה זה מוצגת באיור 3G, שבו העוצמה עולה ככל שמתח הגיסה גדל עד שהתא כבר לא יכול לקיים גלגול בלחץ גיסה גבוה ולנתק מפני השטח, מה שמסמן את סופו של רצועה אחת.

איור 4 ממחיש את התוצאות האפשריות מתת-אופטימליות לתוצאות ניסוי מייצגות אופטימליות. איור 4A ממחיש תוצאה תת-אופטימלית שבה למעקבי הפלואורסצנטיים יש יחס אות לרעש נמוך. זה נגרם ככל הנראה על ידי צפיפות פני השטח נמוכה של בדיקות מצומדות לחלוטין או קצב זרימה נמוך. איור 4B ממחיש תוצאה תת-אופטימלית נוספת שבה מסלולי הפלואורסצנטיות עמוסים מדי מכדי לפתור ולבודד מסלולים בודדים לניתוח הבא. איור 4C הוא דוגמה לתוצאה טובה שבה מסלולים בודדים ניתנים לפתיר למרחקים ארוכים וברורים על רקע. איור 4D הוא דוגמה לתמונת TIRF המוגבלת בעקיפה (חצי שמאלי) בהשוואה לאותו מסלול שצוטט על-ידי DNA-PAINT (חצי ימני). DNA-PAINT במערך זה מייצר דיוק NeNA (ניתוח מבוסס שכנים הקרוב ביותר) של 28.8 ננומטר.

Figure 1
איור 1: התנסות בזרימת העבודה של טביעת הרגל של הידבקות. (א) הרכבה של תא הזרימה ותא הזרימה. (ב) פסיביות ופונקציונליזציה של פני השטח. כל שלב דגירה מסומן על ידי משך הזמן, ואחריו צעד כביסה. (ג) ניסוי הדמיה מתגלגל תא. תאים המתגלגלים על פני השטח יפתחו את ה- DNA שבו נוצרות אינטראקציות הידבקות, וישאירו את ssDNA על פני השטח המסמנים את המיקום של כל אירוע הידבקות. המשטח מסומן עם ssDNA התמונה הקבוע להדמיה נרחבת באזור, הדורש 2 דקות כתמים לפני הכביסה. להדמיית DNA-PAINT ברזולוציית-על, גדיל הדמיה נשמר במאגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אפיון ביו-כבידתי. (A) ספיגת UV-VIS של מוצר הביו-ספיגה המטוהר של Ni-NTA (כחול) והעקומה מתאימה (אדומה) כדי לקבוע את יחס ההטיות. ספקטרום הספיגה של ProtG (מגנטה), mal-ssDNA (ירוק) ו imidazole (אפור) שימשו רכיבים כדי ליצור את ההתאמה הטובה ביותר (אדום) לספקטרום המוצר (כחול). שאריות ההתאמה מוצגות כקו המקווקו השחור. זה מאפשר לנו לקבוע את הריכוז של ProtG ו ssDNA במוצר bioconjugation מטוהר ואת היחס הטוחן שלהם. (B) דף מקורי של רכיבים בהליך הביו-כבידה. הנתיב הראשון מציג סולם DNA במשקל מולקולרי נמוך (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). תמונת הג'ל בצבע כוזב, עם GelGreen מכתים DNA בכתם חלבון כחול ירוק ו Coomassie (הפוך) במגנטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עיבוד תמונה ותוצאות מייצגות של הדמיה נרחבת באזור. (A) אלפי תמונות TIRF גולמיות המשתפשפות בשטח נרחב. (B) פרופיל תאורה הנגזר מהתמונות הגולמיות. (ג) לתקן תמונות על-ידי שיטוח פרופיל התאורה. (D) תמונה תפורה מאריחי תמונה גולמיים. ניתן לראות את פרופיל התאורה הלא אחיד כתבניות תקופתיות בתמונה. התיבות הכחולות והאדומות מציינות את מקטעי התמונה שבהם מוקרנים פרופילי העוצמה הממוצעת (עקבות כחול ואדום). ערכי העוצמה הממוצעת (יחידה שרירותית) מייצגים את ערכי התמונות של 8 סיביות (0-255). (ה) אותו אזור כמו (D) אך תפור באמצעות תמונות שטוחות. התחזיות אינן מציגות דפוסים תקופתיים בקנה מידה גדול. (ו) פרופיל הלחץ הגניסאי לשימוש בניסויים כדי לקבוע את טווח לחצי הגימור שגורמים לגלגל תאים ולהניב מסלולי פלואורסצנטיות. (ז) מסלול פלואורסצנטי לדוגמה מתא בודד מתחת לפרופיל הזרימה המומחשה ב- (F). התא נע משמאל לימין, עוצמת הפלואורסצנטיות עולה ככל שמתח הגיסה משתולל עד התא כבר לא יכול לקיים גלגול ומתנתק מפני השטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות תת-אופטימליות ומציגות. (א) דוגמה למסלולי פלורסנט עם ניגודיות מספקת. (B) דוגמה לצפיפות מסלול פלואורסצנטית מוגזמת. (ג) דוגמה לצפיפות וניגודיות אופטימליות של המסלול. כל שלוש התמונות נרכשו באותו מצב, שטוחות ותפרו. התיבות האדומות בכל תמונה מייצגות את האזור שבו צולמו הקרנות האינטנסיביות (מימין). (D) מסלול פלואורסצנטי המוצג בהדמיה מוגבלת עקיפה (חצי שמאלי) ו- DNA-PAINT (חצי ימני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעיה סיבה אפשרית תמיסה
סרט אפוקסי לא נחתך כראוי שכבת אפוקסי עבה מדי דק את שכבת האפוקסי ככל האפשר עם להב razer
עוצמת החריטה והמהירות של החריטה בלייזר אינן ממוטבות מיטוב עוצמת החריטה והמהירות של החריטה בלייזר
בועות תקועות בצדי תא הזרימה הקדמה נוזלית ראשונית לא נכונה לדחוף פתרונות חוצץ דרך ערוץ בקצב זרימה גבוה לשטוף את הבועות החוצה
בועות עוברות דרך תא הזרימה מבוא נוזלי לא תקין דרך הכניסה והשקע ודאו שטיפת נוזל נמצאת על צינורות המפרצון כדי להבטיח מגע בין נוזל לנוזל בין קצה הפיפטה למפרצון
בועות מהמזרק נכנסו לקו הזרימה הטה את משאבת המזרק כדי להבטיח שהבועות נלכדות בקצה הבוכנה
לנוזל אין אפשרות להזין ערוצים מפרצונים דפוקים חזק מדי התאימו כדי למטב את האטם. צינורות ההפרצון צריכים פשוט לגעת בפתיחת הערוץ כאשר הם מוברגים כראוי.
דליפת ערוץ אפוקסי לא נרפא לחלוטין הפוך מחדש ערוצים, להבטיח באמצעות אפוקסי ריפוי מהיר 5 דקות ולתת לרפא לפחות 1 שעות
מפרצונים לא אטומים כראוי כוונן כדי למטב את האטם
תאים תקועים PEGylation גרוע המוביל כריכה לא ספציפית באופן אידיאלי, גרסה מחודשת PEG. בנוסף, יכול לנסות לדגור על סוכני חסימה נוספים (BSA ו- Tween-20) ולהוסיף סוכני חסימה לשטוף חוצץ.
פסיבציה על פני השטח נהרסה על ידי בועות אוויר גדולות העוברות דרך התעלה ודא שאף בועות לא עוברות דרך הערוץ
בעיה עם התאים השתמש ב- HL-60 2 שבועות לאחר הפעלה מחדש של תרבית התאים מהקפאה. אשר גלגול תאים על משטח בקרה עם P-selectin בלבד.
לתאים אין או שיש אינטראקציות דלילות עם פני השטח צפיפות P-selectin נמוכה מדי, כתוצאה מפונקציונליזציה לקויה של פני השטח ו/או ביו-כבידה לקויה ראשית, להשתמש ProtG-ביוטין במקום ProtG-TGT כבקרה כדי לקבוע אם הבעיה נובעת bioconjugation או צפיפות ביוטין פני השטח. לאחר הבטחת איכות הביו-כלכלה וצפיפות הביוטין על פני השטח, הגדל את זמן הריכוז והדגירה של TGT-ProtG ו-P-selectin-Fc.
תאים מתגלגלים אך אינם מייצרים רצועות פלואורסצנטיות אינטראקציות הידבקות חלשות מכדי לקרוע את TGT הגדל את קצב הזרימה במהלך ניסוי מתגלגל כדי להגדיל את כוח האינטראקציה. אנו ממליצים על פרופיל זרימה ראשוני (איור 3F) כדי למצוא את קצב הזרימה האופטימלי שמייצר מסלולי גלגול יציבים ומסלולי פלואורסצנטיות (איור 3G)
משטח באיכות גרועה מוביל לפלורסצנטיות רקע גבוהה וניגודיות לא מספקת כדי לראות רצועות בדוק פסיבציה של פני השטח

טבלה 1: פתרון בעיות. הטבלה מפרטת את הסיבות והפתרונות האפשריים לבעיות המתרחשות בעת ביצוע מעש זה

קובץ קידוד משלים 1: סקריפט MATLAB שנכתב בהתאמה אישית כדי לפרק את ספקטרום המוצר הסופי בהתבסס על שלוש הספקטרום שנאספו בעבר (ProtG, SMCC-strand, חיץ חרוז Ni-NTA) כדי לקבוע את יעילות ההטיה ואת היחס של ProtG ל- ssDNA. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טביעת הרגל של הידבקות מאפשרת הדמיה של אירועי הידבקות מולקולרית בין PSGL-1 ו- P-selectin במהלך הידבקות מתגלגלת תאים. תהליך זה מופעל על ידי לכידה בתיווך P-selectin ואחריו מתגלגל תחת לחץ גיזום נוזלי. בעיות פוטנציאליות במהלך הניסוי כרוכות בדרך כלל גלגול תאים עניים או חסר מסלולי פלורסנט גם כאשר תאים מתגלגלים היטב. בעיות אלה נובעות לעתים קרובות מבקרי איכות בשלבים הקריטיים בפרוטוקול, כמפורט בטבלה לפתרון בעיות (טבלה 1).

ביומולקולס ומאגרים נדרשים להיות מסוננים ומאוחסנים ב 4 °C (4 °F) כדי למנוע זיהום כי הכנת פני השטח כרוך צעדים מרובים. פסיבציה משטח באיכות גבוהה היא דרישה כדי להשיג צפיפות פונקציונליזציה פני השטח המתאימה ולהפחית את הכריכה הלא-מדעית של biomolecules. כריכה לא-מדעית של ביומולקולות על פני השטח יכולה ליצור רקע פלואורסצנטי גבוה, המפריע להדמיית פלואורסצנטיות של מולקולה אחת וניתוח נתונים סטטיסטיים. גורמים מרובים יכולים להשפיע על פסיבציה על פני השטח. הידרוליזה של אמינוסילן ו PEG-NHS מניבים יעילות נמוכה בהרבה של PEGylation. מספיק KOH כביסה וניקוי פיראנה לשפר את ההידרופיליות על ידי יצירת קבוצות הידרוקסיל חינם על פני הזכוכית, הגדלת הצפיפות של הקבוצה תגובתי כימית. תאים יהיו תקועים על משטחים פסיבים בצורה גרועה. איכות הפסיבציה על פני השטח נבדקת על ידי מדידת עוצמת פלואורסצנטיות ברקע לפני ואחרי PEGylation באמצעות ביומולקולים פלואורסצנטיים.

צפיפות פני השטח של ליגנדים היא גורם קריטי לגלגל תאים, הנשלט על ידי PEG: יחס PEG-ביוטין, הכלאת TGT, ו- P-selectin מחייב. במערכת זו, PEG: יחס PEG-ביוטין של 20:1 מספיק לפונקציונליזציה של פני השטח עם מספיק P-selectin לגלגל תאים. הכלאה יעילה של TGT משפרת גם את צפיפות פני השטח ואת יחס האות לרעש של מסלולי הפלורסנט. פרוטוקול זה כולל שלב חידוש מלאי של גדיל עליון-TGT-ProtG כדי להבטיח כל גדיל תחתון TGT לא מרוסן משלים לפני ניסויים. הטיות של DNA ל- ProtG משפיעות גם על צפיפות פני השטח. מקשר סולפו-SMCC נוסף לדנ"א בעודף טוחנת פי 10 כך שכל הדנ"א הגיב עם המקשר. ProtG עם שאריות ציסטאין יחיד (ProtG-Cys) בטרמינל C שימש להשגת 1:1 DNA: יחס הטיות ProtG. מכיוון שה- ProtG-Cys יכול ליצור עמעום באמצעות קשרים דיסולפידים, יש צורך בטיפול ב- TCEP כדי להפחית את הקשר הדיסולפיד לפני תגובות מקשרות צולבות סולפיהידיל-תגובתי. ניתן לאמת דנ"א מצומד בחלבון והיברידיזציה של TGT באמצעות ניתוח דף מקורי, שבו DNA מצומד ודופלקס DNA יציגו את הניידות המפגרת בשל העלייה במשקל המולקולרי. ניתן להעריך את יעילות ההרכבה גם לפי צפיפות ג'ל (איור 2B). תהליכי PEGylation וביו-כבידה זהירים חיוניים לייצור משטח עקבי. לעתים, מצב התא עשוי להשפיע על גלגול התא ולעקוב אחר היווצרות. למרות ביטוי PSGL-1 על צפיפות התא לא דווח, צפיפות התא הוא רגולטור חזק של מחזור התא וביטוי חלבון במהלך שלב הצמיחה.

בהתחשב בכך PSGL-1 מתפקד גם כקולטן התמרת אותות ומווסת את התפשטות התאים20,21, תנאי תרבות כגון צפיפות תאים נשמרים לרמת ביטוי עקבית ויכולת מחייבת של PSGL-1. צירוף של P-selectin-Fc בתיווך ProtG על פני השטח הוא חיוני להידבקות ולגלגול של תאים. הקינטיקה המחייבת של P-selectin ל- ProtG תלויה בריכוז. ריכוזים נמוכים יותר של P-selectin להוביל לעלייה של זמן כדי להגיע שיווי משקל. נדרשים לפחות 30 דקות עבור כריכת רוויה לריכוזים הנמוכים מ- 100 nM22. 10 ננומטר של P-selectin שימש כדי להפחית את הכריכה הלא-מדעית לפני השטח וזמן דגירה מוגבר לאינטראקציה מספקת עם ProtG. דגירה של שעה אחת מספיקה זמן כדי לגרום להידבקות תאים ולהתגלגל במערכת זו.

TGT ואת החיים המתאימים שלה תלוי כוח הוא גורם חשוב בתוצאות של מבחנ זה. במהלך הידבקות מתגלגלת, הכוח על הרצועה מועבר הן דרך TGT והן דרך P-selectin: אינטראקציית PSGL-1. לכל אחד מרכיבים בודדים אלה יש חיים ייחודיים תלויי כוח, ובהתאם לכוח המיושם, הסתברות הקרע תעדיף אחד על פני השני. לדוגמה, הוכח כי בעת שימוש TGT המתואר במאמר זה, בכוחות מתחת 13.6 pN, P-selectin: PSGL-1 בעיקר dissociates, ואילו מעל 13.6 pN, TGT בעיקר dissociates13. זה חשוב להבין בעת ביצוע בדיקה זו כי אם הלחץ הגיאה הוא נמוך מדי או החרוזים מתגלגלים לאט מדי, אירועי הקרע יהיה בעיקר P-selectin: אינטראקציה PSGL-1, ויהיה אות פלואורסצנטי מינימלי או לא מדיד מן TGTs. סף המתח של TGT ישפיע גם על התוצאות. אם TGT נקרע ב גבוה מדי של כוח, אירועי הקרע יהיה בעיקר P-selectin: PSGL-1, ויהיה אות פלואורסצנטי מינימלי.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת ניתוח של כוחות הקרע המולקולרי, כמו גם את מיקומם של אירועי הידבקות מולקולרית המעורבים בהידבקות מתגלגלת. במקום זיהוי בזמן אמת של הידבקות, היתרון המשמעותי ביותר של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה וניתוח לאחר ניסוי. לאחר טביעת הרגל הידבקות הושאר על פני השטח בצורה של ssDNA, הרצועות עדיין ניתן לדמיין לאחר 12 שעות אם ערוצי הזרימה נשמרים במקרר 4 °C בתא לחות כהה עם פתחים ושקעים חסומים כדי למנוע ייבוש. הפרשנות של קריאת הפלואורסצנטיות לבדיקה זו תלויה בשיטת ההדמיה שנבחרה. באמצעות הדמיה ברזולוציית-על, בדיקה זו משיגה רזולוציה מרחבית גבוהה (<50 ננומטר) המאפשרת ניתוח כמותי של הצפיפות של TGTs קרוע13. ניתוח של צפיפות קולטן או צפיפות TGT קרוע יהיה שימושי בחקירת התנהגות הידבקות מתגלגלת בתנאים שונים. לעומת זאת, הדמיה מוגבלת עקיפה אינה מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה; עם זאת, הוא מאפשר לדמיין שטח פנים גדול כדי לנתח את מסלולי הפלואורסצנטיות של חרוזים מרובים על פני מאות שדות ראייה. זה יתרון כמו עוצמת פלואורסצנטיות של מסלול ניתן לנתח עבור חרוז יחיד על פני מרחק גדול מתן מידע על שינויים בהתנהגות מתגלגלת לאורך זמן. דוגמה כזו היא שינוי הלחץ הגיסתי לאורך זמן והתבוננות בשינויים המתאימים בעוצמת הפלואורסצנטיות. לאחרונה, הוכח כי באמצעות מודל פשוט, עוצמת הפלואורסצנטיות של המסלולים יכולה לשמש להערכת התפלגות הכוח המולקולרי13. יש גם יישום פוטנציאלי של שיטות יחס כדי להשיג כימות כוח עם assay23 זה.

מכיוון שגלגול תאים מתרחש במהירות (10 מיקרומטר/s) ובמרחק ממושך (1000 מיקרומטר), חקר המתח המולקולרי שלהם היה מאתגר עם חיישני מתח מולקולריים מסורתיים בזמן אמת. בדיקת טביעת הרגל של ההידבקות שוברת את האילוץ התובעני הזה כדי לאפשר הדמיה לאחר האירוע. למרות שאירוע הקרע TGT אינו מדווח ישירות על עוצמת המתח שחווה לפני הקרע, התפתחויות מבטיחות נעשו בניתוח מסלולי הפלואורסצנטיות כדי לאפשר חקירה כמותית של הכוחות המולקולריים המעורבים בהידבקות מתגלגלת13,23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנדה לחדשנות (CFI 35492), המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה דיסקברי גרנט (RGPIN-2017-04407), גבולות חדשים בקרן המחקר (NFRFE-2018-00969), קרן מייקל סמית לחקר הבריאות (SCH-2020-0559) וקרן אמיליה הבריטית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel drill guide Custom made 3D printed with ABS filament
4-holes slide Custom made Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone VWR BDH1101-4LP
Acrylic spacer Custom made Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder Custom made Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane AlfaAesar L14043 CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution Cytiva HyClone SV3007901 Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene Spherotech PGP-60-5
Bovine serum albumin VWR 332
Buffer, DNA PAINT 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride VWR BDH9224
Cell culture flasks VWR 10062-868
Concentrated sulfuric acid VWR BDH3072-2.5LG 95-98%
Coverslip holding tweezers Techni-Tool 758TW150
Diamond-coated drill bits Abrasive technology C5250510 0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand) IDT DNA Custom oligo CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) IDT DNA Custom oligo /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT IDT DNA Custom oligo GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling IDT DNA Custom oligo CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape Scotch 237 3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA Thermofisher 15575020 0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy Gorilla 42001 5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS) Avantor 97068-085
GelGreen Biotium 41005
Glacial acetic acid VWR BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips Fisher Scientific 12-548-5P
Glass, Microscope slide VWR 48300-026 75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar VWR 74830-150 Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) Lonza 04-315Q
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA
HL-60 cells ATCC CCL-240
Humidity chamber slide support Custom made 3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide VWR BDH7690-1 30%
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Inlets/outlets Custom made Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) Lonza 12-722F
Magnesium chloride VWR BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads Invitrogen 10103D
Mailer tubes EMS EMS71406-10
Methanol VWR BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns Biorad 7326200 In SSC Buffer
PEG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
PEG-biotin Laysan Bio Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide VWR 470302-132
Protein, Protein G Abcam ab155724 N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc R&D System 137-PS Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin Cedarlane CL1005-01-5MG
Pump Syringe Harvard Apparatus 704801
Sodium bicarbonate Ward’s Science 470302-444
Sodium chloride VWR 97061-274
Sulfo-SMCC Thermofisher 22322
Syringe Hamilton 81520 Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles BD 305115 Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP Sigma-Aldrich C4706-2G
Tris VWR BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor Tygon ABW00001 Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene BD Intramedic 427406 Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20 Sigma-Aldrich 93773

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 175 הידבקות מתגלגלת לויקוציט סלטין P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1) חיישן כוח מולקולרי בדיקת טביעת רגל של הידבקות חבל מד מתח (TGT) הצטברות נקודות מבוססת DNA להדמיה בטופוגרפיה ננומטרית (DNA-PAINT)
הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

An, S. M., Kim, S. H., White, V. J., … More

An, S. M., Kim, S. H., White, V. J., Yasunaga, A. B., McMahon, K. M., Murad, Y., Li, I. T. S. Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay. J. Vis. Exp. (175), e63013, doi:10.3791/63013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter