Summary
このプロトコルは、高速細胞圧延接着中に接着イベントを画像化するために、接着フットプリントアッセイを実行するための実験的手順を提示する。
Abstract
転動接着は、選択的に媒介される相互作用によって促進され、炎症部位に白血球を採用する上で非常に動的で受動的な運動性である。この現象は、血流が内皮細胞の転動で白血球を押し出す後毛細血管小胞で起こる。安定した転がりは、接着結合形成と機械的に駆動された解離との微妙なバランスを必要とし、細胞が流れの方向に転がり続けながら表面に付着したままにする。比較的静的な環境で発生する他の接着プロセスとは異なり、転がり細胞は毎秒数十ミクロンで数千ミクロンにわたって移動するので、圧着は非常にダイナミックです。その結果、トラクションフォース顕微鏡などの従来のメカノバイオロジー法は、短いタイムスケールと高感度が要求されるため、個々の接着事象および関連する分子力を測定するのには適していません。ここでは、P-セレクチン:分子レベルでの圧延接着におけるPSGL-1相互作用をイメージする接着フットプリントアッセイの最新の実装について説明します。この方法は、不可逆的なDNAベースの張力計テザーを利用して、蛍光トラックの形態で分子接着事象の永久履歴を生成する。これらのトラックは、(1)大きな視野を生み出すために何千もの回折限画像をつなぎ合わせ、長さ数千ミクロンにわたって各転球細胞の接着フットプリントを抽出し、(2)DNA-PAINTを実行して小さな視野内の蛍光トラックの超解像画像を再構築するという2つの方法で画像化することができます。本研究では、接着フットプリントアッセイを用いて、異なるせん断応力で転がるHL-60細胞を研究した。そうすることで、P-セレクチンの空間分布をイメージすることができました:PSGL-1相互作用と蛍光強度を通じて分子力に関する洞察を得ることができました。このように、この方法は、分子レベルでの圧延接着に関与する種々の細胞表面相互作用の定量的調査のための基礎を提供する。
Introduction
転がり接着カスケードは、循環細胞が血管壁1に沿ってどのようにテザーおよび転がするかを記述する。受動圧延は主に細胞接着分子(CAM)1の主要クラスであるセレクチンによって媒介される。血液のせん断流の下で、P-セレクチン糖タンパクリガンド-1(PSGL-1)を発現する白血球はP-セレクチンとの非常に一過性の結合を形成し、炎症を起こした内皮細胞の表面に発現し得る。このプロセスは、白血球が炎症部位に移行するために重要です2.さらに、PSGL-1はまた、P-selectin3との関与時に転がり接着カスケードのその後の堅接着段階を引き起こすことができるメカノイアセンセプターである。
CAM機能に影響を与える遺伝子変異は、白血球接着欠損症(LAD)の稀な疾患など免疫系に深刻な影響を及ぼし、転がりを媒介する接着分子の機能不全が重度の免疫不全個体4,5,6に至る。さらに、循環腫瘍細胞は、同様の圧延過程に従って移行することが示されており、転移7,8に至る。しかし、細胞の転がりは速く動的であるため、従来の実験的メカノバイオロジー法は、細胞転動時の分子相互作用を研究するのには適していません。原子間力顕微鏡や光ツイーツァーなどの単一細胞および単一分子操作法は、P-selectinのPSGL-1とPSGL-1との力依存相互作用などの分子相互作用を単一分子レベル9で研究することができたが、細胞転動中の生きた接着事象の調査には不向きである。さらに、インビトロで特徴付けられる相互作用は、生体内での分子接着に関する質問に直接答えることができない。例えば、細胞が本来の環境で機能している場合、生物学的に関連する分子張力範囲は何ですか?粘着力学simulation10や単純定常モデル11のような計算方法は、特定の分子の詳細を捉え、それらが転がり行動にどのように影響するか、モデリングパラメータおよび仮定の精度に大きく依存している。牽引力顕微鏡のような他の技術は細胞の移動の間に力を検出することができるが、十分な空間分解能または分子張力に関する定量的な情報を提供しない。これらの技術のいずれも、自生環境における細胞機能と挙動に直接関係する分子力の時間ダイナミクス、空間分布、および大きさの不均一性の直接的な実験的観察を提供することはできません。
そのため、転がり接着性の理解を深める上で、選択イン媒介相互作用を正確に測定できる分子力センサを実装することが重要です。ここでは、PSGL-1被覆ビーズが機能性テンションゲージテザー(TG)13 を提示する表面上に転がされる接着フットプリントassay12のプロトコルについて説明する。これらのTGは、蛍光読み出しの形で破裂事象の永久的な歴史をもたらす不可逆的なDNAベースの力センサーです。これは、TGT(dsDNA)の破裂後、破裂したTGT(ssDNA)を蛍光標識された相補鎖で標識することによって達成されます。このシステムの大きな利点の1つは、回折限と超解像イメージングの両方との互換性です。蛍光標識された相補鎖は、回折限定画像撮影のために永久に結合(>12 bp)、またはDNA PAINTを介した超解像イメージングのために一過性(7-9 bp)結合することができる。これは、TGがアクティブローリング中に破裂する際にローリング接着を研究するのに理想的なシステムですが、蛍光読み出しは転がり後に分析されます。また、2つのイメージング方法は、ローリング接着を調査する自由度をユーザに提供します。典型的には、回折限定画像は蛍光強度13を介して分子破裂力を抽出するのに有用であるが、超解像イメージングは受容体密度の定量的分析を可能にする。このアプローチは、圧延接着のこれらの特性を調査する能力を持ち、せん断流下の転動細胞の分子接着に関する力制御機構を理解するための有望なプラットフォームを提供する。
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Protocol
1. オリゴヌクレオチド標識とハイブリダイゼーション
- プロテインGジスルフィド結合の還元
- 1mLの超純水にプロテインG(ProtG)10mgを溶かします。
注:ここでのプロテインGは、C末端の単一のシステイン残基とN末端ポリヒスチジンタグで修飾されています。 - バッファー交換≥20 μL ProtG (10 mg/mL) を P6 カラムを使用して 1x PBS (pH 7.2) に交換します。
- バッファー交換後のタンパク質濃度を測定します。
注:7-8 mg/mLの典型的な濃度。 - 120 mM トリス(2-カルボクセチル)ホスフィン(TCEP)を90 μLの1x PBS(pH 7.2)に溶解し、次いで0.5 M EDTAの10 μLを調製します。
注: TCEP は、新たに準備する必要があります。 - 120 mM TCEP (480 nmol) の 4 μL を ProtG (4-5 nmol) の 20 μL に加えます。
注:タンパク質に対するTCEPのモル比は、100:1です。 - 室温(RT)で30分間反応を進行させます。
- P6 カラム(1x PBS、pH 7.2 で交換されるバッファ)を使用して、減少した ProtG から余分な TCEP を除去します。
- UV/Vis分光光度計で減少したProtGの濃度を測定し、スペクトルを保存します。
注:典型的な濃度は3.5-4.5 mg/mL。
- 1mLの超純水にプロテインG(ProtG)10mgを溶かします。
- スルホ-SMCCとのアミン標識 ssDNA 反応
- アミン標識 ssDNA (アミン-ssDNA) をヌクレアーゼを含まない水に 1 mM の濃度に溶解します。UV/Vis分光光度計でストランド濃度を確認します。
- 2 mgのスルフォ-SMCCを400μLの超純水と渦を混合して溶解して、新鮮な11.5 mMスルフォ-SMCC(スルフォ-NHSエステルとマレイミドを含むヘテロ二官能架橋剤)溶液を調製します。
- 1 mMアミン-ssDNA(6 nmol)の6 μLを11.5 mMスルフォ-SMCC(60 nmol)の5.2 μLに加え、1x PBS(pH 7.2)の88.8 μLを加えます。5 sの渦は、8600 x g で3分間遠心分離が続く。
- RTで30分間反応を進行させる。
- P6カラム(1x PBS、pH 7.2で交換されたバッファー)を有するSMCCコンジュゲートアミン-ssDNA(mal-ssDNA)から余分なスルホ-SMCCを除去する。
- UV/Vis分光光度計でmal-ssDNAの濃度を測定し、スペクトルを保存します。
注:35-45 μMの典型的な濃度。
- プロトグ-ssDNA結合
- 4.5 mg/mLの21 μLを加え、ProtG(3 nmol)をmal-ssDNA(〜4-5 nmol)に加えます。
注: ここでのボリュームと濃度は、典型的な値です。個々の実験測定に従って調整します。常に~1.5:1の比率でProtG上のmal-ssDNAの過剰な量を確保してください。 - 5sの渦を、RTで3時間進行させる反応を可能にする。
- 4.5 mg/mLの21 μLを加え、ProtG(3 nmol)をmal-ssDNA(〜4-5 nmol)に加えます。
- プロトグ-ssDNAの精製と特性評価
- 磁気ニッケル-ニトリロトリアセク酸(Ni-NTA)ビーズとのタグ分離を介して結合プロトグ-ssDNAを精製します。
- P6カラム(1x PBS、pH 7.2で交換されたバッファー)を用いて、製品から余分なイミダゾール(Ni-NTA溶出バッファー)を除去します。
注: イミダゾールは280 nmで有意な吸収を有するので、このステップは、結合を定量化するために不可欠です。 - UV/Vis分光光度計を使用して、製品ProtG-ssDNAのスペクトルとNi-NTA溶出バッファ(1x)を記録します。
注: 260 nm および 280 nm の標準的な ProtG-ssDNA 吸光度は、それぞれ 0.8 および 0.6 です。 - ProtG と ssDNA に対する共役効率と比率を決定するには、カスタム記述 MATLAB スクリプト (補足コーディング ファイル 1) を使用して、以前に収集した 3 つのスペクトル (ProtG、SMCC-strand、Ni-NTA ビーズ溶出バッファー) に基づいて最終製品スペクトルを分解します。
注: 簡単に説明すると、コードは手順 1.4.5~ 1.4.8 の手順で説明したとおりに動作します。典型的な濃度は、プロトグとssDNAを持つProtG-ssDNAの4μMであり、〜1:1モル比である(図2A)。 - 入力プロトグ、SMCC-ストランド、Ni-NTAビード溶出バッファー、および MATLAB スクリプトへの ProtG-ssDNA UV/Vis スペクトル
- 多次元非線形最小化を実行して、ソーススペクトル(ProtG、SMCC-strand、およびNi-NTAビード溶出バッファースペクトル)からProtG-ssDNAスペクトルを再構築します。
注: 最小化関数は、ソーススペクトルごとに 1 つずつ、3 つの変換係数を出力します。 - スペクトルに対応する因子を掛け合わせ、変換されたソーススペクトルを組み合わせることにより、ProtG-ssDNAスペクトルを再構築します。
- ProtGおよびSMCC-strandの初期濃度に対応する変換因子を掛け合わせて、ProtG-ssDNA生成物におけるSMCC-ストランドとProtGの濃度を求めます。
- (オプション) 図 2B に従ってネイティブ PAGE を実行して、各コンポーネントとステップが期待どおりに動作することを確認します。
- TGT ハイブリダイゼーション
- T50M5バッファー(10 mM Tris、50 mM NaCl、5 mM MgCl2)でそれぞれ240 nMと200 nMの濃度で1.2:1のモル比でビオチン化された底鎖を持つProtG-ssDNA(上鎖)をハイブリダイズし、完全なTGTをハイブリダイズします。RT ≥1 hでハイブリダイズしましょう。
2. 表面のペギレーション
- 表面洗浄
- 8つのカバーリップごとに1つのエルレンマイヤーフラスコと2つの染色瓶をきれいにします。RTで1 M KOH溶液と1時間の超音波処理を各容器に充填し、徹底的に超純水で各容器を洗浄し、N2 またはオーブンで乾燥させます。
メモ:KOHを上に充填して蓋に触れ、清掃してください。 - 各カバースリップを超純水で十分に洗い流し、洗浄された染色瓶の1つに入れます。
注:お互いに、または汚れ瓶の壁に貼り付けされていないことを確認してください。 - ヒュームフードでは、250 mLビーカーに30 mLの過酸化水素(30%)を90mLの濃縮(95%-98%)硫酸を加えてピラニア溶液を作製します。
注意:濃縮硫酸は腐食性が高い。過酸化水素を硫酸に非常にゆっくりと加え、慎重に渦巻いて混ぜます。 - ピラニア溶液で染色瓶にカバースリップを完全に浸します。カバースリップをピラニアに30分間煙のフードに入れておきます。
注意:汚れ瓶を割るのを防ぐために注ぐ前に、ピラニア溶液を80°C以下に冷却してください。 - ピラニア溶液を1000 mLビーカーに捨て、ガラス洗浄から1M KOHで中和します。
- (オプション)ピラニア洗浄(ステップ2.1.3-2.1.5)を新鮮なピラニア溶液で繰り返します。
- カバーリップを大量の超純水ですすいで、残留ピラニア溶液をすべて除去します。取り除きが容易にするため、各上昇の間に染色瓶を軽く振ります(10リンスをお勧めします)。
- カバーリップをメタノールで3回リンスし、カバースリップ表面から水を取り除き、カバーリップをメタノールに沈めておきます。
- 8つのカバーリップごとに1つのエルレンマイヤーフラスコと2つの染色瓶をきれいにします。RTで1 M KOH溶液と1時間の超音波処理を各容器に充填し、徹底的に超純水で各容器を洗浄し、N2 またはオーブンで乾燥させます。
- 表面のサイラン化
- 94mLのメタノール、1mLのアミノシラン、および5mLの氷酢酸を洗浄し乾燥したアーレンマイヤーフラスコに十分に混合して1%アミノシラン溶液を調製します。2番目の洗浄され、乾燥染色jar14に注ぎます。
- メタノール溶液の下に沈んだカバーリップを1%アミノシラン溶液を含む染色瓶に移し、瓶を覆い続ける。
注:ガラス表面の空気への露出を制限するために、アミノシランに転送する際にカバーリップを乾燥させないでください。 - カバースリップを含む染色瓶を70°Cでアミノシランに1時間含有する染色瓶をオーブン15でインキュベートする。
- アミノシラン溶液を別の廃液に入れ、メタノールでカバーリップを5回メタノールでリンスし、アミノシラン溶液を除去します。
- 超純水で染色瓶のカバーリップを5回すすいで、N2で乾燥させます。
- 乾燥したカバーリップを110°Cのオーブンで20分間オーブンで染色瓶に入れ、焼きます。カバーリップをRTに冷却させ、PEGylationラックに置きます。
注:表面15上の特定の化学的堆積を最小限に抑えるために、ベーク中に蓋で染色瓶を覆います。
- PEG ソリューションの準備
- PEG(ポリエチレングリコール)およびPEGビオチンを約30分間RTに解凍する。
注:このステップはPEGのNHSエステルを低下させることができる水分凝縮を最小にする。 - 84mgの炭酸水素ナトリウムを10mLの超純水に加えてPEGバッファーを作ります。この製剤は、pH 8.4でバッファーを提供する必要があります。
- 8つのカバーリップの場合、それぞれ20:1 PEG:PEG-ビオチンを備えた1つのPEGylateed側:PEGの100mgとPEG-ビオチンの5mgを測定し、PEGバッファーの400 μLに加えます。最大速度(≥18000 x g)で1分間、30 sと遠心分離機の溶液をボルテックス。
注:SVA NHSエステル加水分解はすぐに始まり、pH 8.0で34分の半減期を有し、pH 8.4で短い半減期を有するため、このステップは時間に敏感である。
- PEG(ポリエチレングリコール)およびPEGビオチンを約30分間RTに解凍する。
- PEG インキュベーションおよびカバースリップストレージ
- 湿度室を設置し、カバースリップを内部に置きます。
- 湿度チャンバのカバースリップに90 μLのPEG溶液を追加し、カバースリップ保持ピンセットを使用してPEG溶液の上に2番目のカバースリップを置き、PEG溶液を均等に広げます。
- 溶液にカバースリップに落とされた泡がないことを確認します。最初のカバースリップの2番目のカバースリップの一方の端を下げ、カバーリップの間に挟まれた泡がないようにゆっくりともう一方の端を落とします。
注: 気泡は、特定の領域が貧弱な PEGylateed を引き起こす原因となります。 - すべてのカバーリップがPEG(すなわち、8カバーリップ=4 PEGサンドイッチ)を持つまで繰り返します。PEG溶液を一晩(約12時間)に、暗闇の中の湿度チャンバーのRTでインキュベートする。
- カバースリップのペアを分離し、染色瓶に入れます。PEGylated の側面に注意してください。
- 超純水でカバーリップを十分に洗い流し、N2で乾燥させます。
注:ピンセットでカバースリップを保持し、汚染物質が表面に乾燥するのを防ぐために、ピンセットに向かって表面を横切ってN2 を吹きます。 - 固定マーカーまたはダイヤモンドペンを使用して、コーナーに非 PEGylated 側を点でマークします。
- PEGylated側が互いに向いているメーラーチューブに2 PEGylatedカバースリップを置き、使用前にPEGylated側を識別するのに役立ちます。
- チューブを5分間真空にし、N2でバックフィルします。パラフィルムでチューブを密封します。
- 密閉されたメーラーチューブに-20 °CのPEGylatedカバーリップを6ヶ月間保管してください。
メモ:チップアセンブリの前に、ストレージチューブをRTに温めます。シール中にカバースリップの凝縮は漏れを引き起こす。
3.フローチャンバーの準備
- チップアセンブリ
- カミソリの刃が付いた両面テープの両側に少量のエポキシを薄く広げる。
注: あまりにも多くのエポキシは、組み立て中にチャネルに広がる可能性があります。 - エポキシコーティングテープをレーザーカットして、4つのチャンネルを作成します。4ホールスライドとPEGカバースリップの間にエポキシテープを挟んでフローチップを作成します(図1A)。
- ピペットチップを使用して、チャネルの長さに沿って穏やかな圧力をかけ、良好なシールを作成します。エポキシを≥1時間硬化させる。
メモ:エポキシに対する滑りを避けるためにガラスをせん断しないでください。
- カミソリの刃が付いた両面テープの両側に少量のエポキシを薄く広げる。
- チャンバーアセンブリ
- 各チャンネルの開口部がアダプタの中央に配置されるようにチップを位置合わせします(図1A)。チップの上に透明なアクリルスペーサーを2つ置き、ブロックの中央にしっかりとした圧力をかけ、各スペーサーの端に2本の4-40ネジでねじ込みます。
メモ:スクリューを無理に押したり、スペーサーを強く押したり、チップが割れる場合があります。 - ブラケットの反対側で、入り口をねじ穴にねじ込みます。透明アクリルブロックを通してシール状態を監視します。
- チューブがチップの開口部に接触する場合は、チューブを時計回りに軽くねじって接続を密封します。
注:入り口を締め過ぎると流れが妨げられますが、接触が緩んでいると漏出が発生します。
- 各チャンネルの開口部がアダプタの中央に配置されるようにチップを位置合わせします(図1A)。チップの上に透明なアクリルスペーサーを2つ置き、ブロックの中央にしっかりとした圧力をかけ、各スペーサーの端に2本の4-40ネジでねじ込みます。
4. 表面の準備
注: 全体的なワークフローについては 、図 1B を参照してください。
- 非特異的なバインドを防止するエージェントをブロックする
- ピペットを使用して200 μLの洗浄バッファー(10 mMトリス、50 mM NaCl、5 mM MgCl2 および 2 mM CaCl2、0.05% Tween 20)をチャンバーに流し、漏出がないか確認します。気泡がチャネルに形成された場合は、積極的に気泡を除去するために、さらに200 μLを押します。
注: このステップで取り外されない大きな気泡は、後で表面の機能を取り除き、破壊することができます。 - 非特異的結合を防止し、10分間インキュベートするために、40 μLのBSA(1%w/v)をフローチャンバーに加えます。
- 各インキュベーション期間中に十分な量を追加して、流入口と出口でフローチャンバーを充填し、液滴を形成します。それに応じてインキュベーション量を調整し、湿度チャンバ内のすべてのインキュベーションを実行します。
- 40 μLの Tween 20 (5% v/v) をフローチャンバーに加えます。非特異的結合をさらに低減するために10分間インキュベートする。
- (オプション)チャネルを通してポリスチレンビーズを流すことによって十分なパッシベーションのための表面を確認してください。ProtGコーティングされたポリスチレンビーズ(0.01%w/v)の40 μLと、10倍の目的を持つダークフィールド顕微鏡を使用して画像を追加します。ビーズが表面に付着しない場合は、次のステップに進みます。
- 200 μL の洗浄バッファーでチャネルを洗浄し、すべてのパッシベーション剤を取り除きます。
- ピペットを使用して200 μLの洗浄バッファー(10 mMトリス、50 mM NaCl、5 mM MgCl2 および 2 mM CaCl2、0.05% Tween 20)をチャンバーに流し、漏出がないか確認します。気泡がチャネルに形成された場合は、積極的に気泡を除去するために、さらに200 μLを押します。
- チャンバー表面機能化
- 40 μLのストレプトアビジン(100 μg/mL)をフローチャンバーに加え、20分間インキュベートします。その後、200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
- 40 μLのハイブリダイズプログ-TGT(100 nM)をフローチャンバーに加え、20分間インキュベートします。その後、200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
- ProtG-TGTトップストランド(100 nM)を40 μL20分間追加し、表面に未ハイブリッド化TGT底鎖を完成させます。200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
- 40 μLのP-セレクチンFc(10 μg/mL)をフローチャンバーに加え、60分間インキュベートします。その後、200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
メモ:インキュベーションの持続時間は非常に重要です。
5. 実験とイメージング
- フローシステムの設定
- 5 mL ガラスシリンジにローリング バッファー (2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、0.1% BSA を使用した HBSS) を充填します。シリンジの側面をタップして泡を外し、先端に向かって浮くように押し出して、シリンジに気泡がないことを確認します。
- ポリエチレンチューブの約200ミリメートル(I.D:0.38ミリメートル)に滅菌針(26 G、5/8インチの長さ)を挿入します。O.D:1.09mm)をクリックし、針をガラス注射器に接続します。
メモ:針コネクタのどこにも空気が閉じ込めないようにしてください。 - シリンジをシリンジポンプに固定し、気泡がチャネルに入るのを防ぐためにプランジャー側が上昇するようにシリンジポンプを傾けます。チューブの端部を流れチャンバの入口に挿入します。
注:インレットに液滴を堆積させ、シリンジチューブの端に液滴を持つことによって接続を行う際に液体と液体の接触を確認してください。入口に挿入する前に、シリンジチューブの端に小さな落下を形成させることによって、気泡がチャネルに入らないようにします。 - 別の200mmのポリエチレンチューブの一方の端を出口に挿入し、もう一方の端を廃棄物ビーカーに沈めます。
- セルローリングの設定
- 25 cm2 換気培養フラスコで HL-60 細胞を成長させる 20% 牛血清と 5% CO2 で 37 °C で 1% 抗生物質を補った IMDM メディアで.1 x 105-2 × 106 セル/mL の間のセル密度を維持します。
- (オプション)初期密度2 x 105細胞/mLで1.25%DMSOを含む完全なIMDM培地でHL-60細胞 を区別します。5〜6日間最も活性となる細胞をインキュベートする。
- 細胞懸濁液と遠心分離機(200 x g,3分)からサンプル(1〜2 mL)を採取し、細胞をペレットにします。
- 培地を取り出し、転がりバッファーの500 μLで細胞を静かに再懸濁します。洗浄工程を2回繰り返して、細胞の破片を除去します。
- ヘモサイトメーターで細胞密度を測定します。転がりバッファーを持つセルペレットを 2 x 105 細胞/mL の密度に再懸濁します。
- インレット/出口からチューブを慎重に取り外し、40μLの細胞懸濁液をフローチャンバーに取り出します。前述のようにチューブを再接続し、フロー チャネルに気泡が入らないようにします。
- 所望の流速でシリンジポンプを開始して細胞の転がり実験を開始します。
注:蛍光トラックの強度はせん断応力に依存し、低いセル速度のせん断応力/細胞速度は一般的に調光トラックを生成します(図4A)。表面の高いセル密度や過度の転がり時間を避けて、分離可能な単一セルトラックを確保します(図4B、C)。 - 細胞の転がりが観察されることを保障するために10xの目的の暗視野の顕微鏡を使用しなさい。
- 実験が完了したら、100 mL/hのローリングバッファを表面が無細胞になるまで注入して、チャネルから細胞を取り除きます。
- 「ナノスケール地形におけるDNAベースの点蓄積」による局所的な軌跡のイメージング(DNA-PAINT)
- 40 μL の DNA-PAINT イメージャーストランド (500 pM) を DNA-PAINT バッファー (0.05% Tween-20, 5 mM トリス, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) に加えます。
- 100x油浸性TIRF対物レンズを使用して、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡を行います。電子乗算電荷結合デバイス(EMCCD)カメラを使用して、電子乗算(EM)ゲイン300でフレームあたり25 msの露出時間を持つ40000以上のフレームを獲得します。
- 手順 5.3.4~5.3.5 に従って、超高解像度イメージ (図 4D) をローカライズおよびレンダリングするには、ピカソソフトウェア package17 を使用します。
- DNA-PAINTムービーをローカライズプログラムにロードして、各フレーム内の各蛍光色素の局在を決定します。
注: フルオロフォアだけが正確に追跡されるまで、ボックス側の長さと最小のネットグラデーションのパラメータを最適化します。Min. ネットグラデーションパラメータは、多くの場合、最適なトラッキングを達成するために100000を超えることができます。フィット設定:MLE、統合ガウス法は最良の結果を生成します。最後に、ムービーが長すぎる場合は、最終的な hdf5 ファイルに再結合する前に、Localize のプレビュー トラッキングが正しく動作するように、10000 フレームのスタックに分割します。 - 次に、結果の hdf5 ファイルを Render プログラムにロードして、ドリフト補正とレンダリングを実行します。
注意: RCCによるアンドリフトを 介して複数のドリフト補正を実行して、最終結果を改善します。
- 永久的なラベル付けによる長いトラックのイメージング
- 永久イメージャーストランドを追加し、T50M5バッファに120 sのインキュベートを行います。200 μLの洗浄バッファーを注入して、チャネルを洗浄します。
- 励起レーザーをオフにして画像を記録し、カメラの背景ノイズを取得します。TIRF顕微鏡法によるグリッドパターンの大きな領域を画像化します。
注記:フレームオーバーのオーバー≥10%のオーバーラップは、後続のステッチに推奨されます。 - 400 x 50画像(合計20000枚)の領域をスキャンするように顕微鏡をプログラムします。フィジープログラムを使用して、生データを個々のTIFFファイルに分割し、それぞれに最大10000枚の画像が含まれています。
- イルミネーション プロファイル(図 3A-C)を使用してすべてのイメージを平らにします(図 3A-C) 手順 5.4.5~5.4.7 に従います。
- すべてのフレームからバックグラウンドカメラのノイズを減算します。背景から減算されたフレームの平均スタック投影(照明プロファイル)を取得します。
- 最大値で照度プロファイルを正規化します。すべての背景を減算したフレームを正規化された照明プロファイルで割ります。
- 修正したフレームを、対応するビット深度に対応する適切な範囲に再スケールします。
- MIST18 を使用して画像をステッチします(図 3D、E)。
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Representative Results
上記のプロトコルは、接着フットプリントアッセイの実験手順を説明する。一般的な実験ワークフローを 図1に示し、流れチャンバアセンブリ(図1A)から表面官能化(図1B)および実験およびイメージングステップ(図1C)までを示す。
図2 は、ProtG-ssDNAバイオコンジュゲーション特性評価の代表的な結果である。最終製品における3つの成分のUV/Visスペクトル、すなわち、ProtG、mal-ssDNA、およびイミダゾール溶出緩衝液を、最終的な結合の前に収集した(図2A)、それぞれ既知の濃度に対応する。これらのスペクトルは、3つの未知のパラメータがそれらの濃度である生体共役生成スペクトルに適合するための直交基礎を形成する。MATLABのカスタム関数を使用して濃度を決定しました。結果は、SsDNAに対するProtGのほぼ1:1の比率を示しています(図2A)。これは、ssDNAがアミン修飾を1つしかなく、ProtGがそのC末語で単一のシステインを設計しているため、予想通りです。このアプローチは、従来報告されたアプローチ19 に対して、単一のチオール修飾DNAを使用して、多数の一次アミンをProtG上で標的化し、結合比を容易に維持できない場合に有利である。
さらに、ネイティブPAGEを使用して、生体共役を確認した(図2B)。DNAは、それぞれ、クーマシーブルーによりGelGreenとタンパク質によって染色される。GelGreenはssDNAよりも強くdsDNA染色するので、ssDNAバンドはdsDNAバンドの等モル濃度(レーン3、4)よりも薄暗くなることが期待されます。ストックProtGはC末端システイン残基を含むため、レーン5に見られるように、タンパク質の一部がジスルフィド結合を介してダイマーを形成する(図2B)。一方、還元されたProtGは、単一のバンド(レーン6)を示す。DNA結合でストックProtGを直接使用する場合、ジスルフィド二量体化ProtGはDNAに反応せず、GelGreen染色なしのバンドとして示す(レーン7、8)。ProtGダイマーバンドは、還元されたProtG(レーン9、10)を使用して共役生成物で消失する。結合中にProtG(1.5:1)に対するmal-ssDNAの過剰量が使用されるため、TGTは最終的な共役生成物(レーン8、10)にバンドのみが見える。単量体ProtGバンドと一致する明るいGelGreenバンドは、成功した共役と良好な収率を示しています。
図 3 は、代表的な生顕微鏡画像と、その後の画像ステッチおよび解析のためにそれらを修正するワークフローを示しています。シングルモードファイバから導入されたTIRF照明プロファイルは、一般に視野の中央で明るく、エッジの周囲が暗くなります(図3A、B)。不均一な照明を補正し、定量的な分析のために画像を平らにするために、照明プロファイルは、個々のフレームの数千を平均することによって決定した(図3B)。平坦化された画像は、生プロファイルと照明プロファイルの両方からカメラノイズを引き出し、照明プロファイルで正規化することによって生成されました(図3C)。画像の平坦化の効果は、画像がステッチされて大きな画像を形成する際に明確に示されます。セルトラックのない背景領域の画像の強度は、補正されていない画像に対応する明確な周期パターンを示しています(図3D)。平坦化された画像からステッチされた同じ視野は、平坦な背景を生成します(図3E)。平坦な背景を持つことは、セルトラックに沿った強度の変動を解釈するために重要です。最初の実験として、 図3F に示したものと同様のランプアップ流れプロファイルを使用して、安定した細胞圧延と透明蛍光細胞の両方のトラックを確保する実験に適したせん断応力の範囲を決定します。このフロープロファイルの下の一般的な単一細胞接着フットプリントは 図3Gに示されており、セルが高いせん断応力で転がり続け、表面から切り離すまでせん断応力が増加するにつれて強度が増加し、単一のトラックの終わりを示します。
図4 は、最適でない代表的な実験結果に最適でない結果を示す。 図4A は、蛍光トラックの信号対雑音比が低い最適ではない結果を示しています。これは、完全結合プローブの表面密度が低いか、または流量が低い場合に発生する可能性があります。 図4B は、蛍光トラックが密にパックされすぎて、その後の分析のために個々のトラックを解決して分離するのに最適でない別の結果を示しています。 図4C は、個々のトラックが長距離にわたって解決可能で、バックグラウンドに対して明確である良い結果の一例である。 図4D は、DNA-PAINT(右半分)で画像化された同一のトラックと比較した回折限定TIRF画像(左半分)の一例である。このセットアップのDNA-PAINTは28.8 nmのNeNA(最も近い隣人ベースの分析)の精密を作り出す。
図1:接着フットプリントアッセイの実験ワークフロー(A) フローセル及びフローチャンバの組み立て。 (B) 表面のパッシベーションと機能化。各インキュベーションステップは、持続時間によってマークされ、続いて洗浄ステップが続く。 (C) 細胞圧延実験及びイメージング。表面を転がす細胞は、接着相互作用が形成されるDNAを解凍し、各接着事象の位置を示す表面にssDNAを残します。表面は広範囲のイメージ投射のための永久的なイメージャーssDNAと標識され、洗浄する前に2分の染色を要求する。超解像DNA-PAINTイメージングの場合、イメージャーストランドはバッファに保持されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:バイオコンジュゲーション特性(A) NI-NTA精製バイオコンジュゲーション製品(青色)と曲線適合(赤色)のUV-VIS吸光度を、共役比を決定する。ProtG(マゼンタ)、マルスDNA(緑色)、イミダゾール(グレー)の吸収スペクトルを、製品スペクトル(青)に最適なフィット感(赤)を作成する成分として使用した。適合の残渣は黒い破線として示される。これにより、精製バイオコンジュゲーション生成物中のProtGとssDNAの濃度とモル比を決定することができます。 (B) バイオコンジュゲーション手順における成分のネイティブPAGE。第1のレーンは、低分子量のDNAラダー(25、50、75、100、150、200、250、300、350、500、766bp)を示す。ゲル画像は偽色で、緑色のゲルグリーンをDNA染色し、マゼンタにクマシーブルーのタンパク質染色(逆)を使用します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:広範囲な画像撮影による画像処理および代表的な結果。(A) 広大な領域をタイリングする何千もの未加工のTIRF画像。 (B) 生画像から得られる照明プロファイル。 (C) 照明プロファイルを平坦化して画像を補正。 (D) 生画像タイルからステッチされた画像。不均一な照明プロファイルは、画像内の周期的なパターンとして見ることができます。青と赤のボックスは、平均強度プロファイルが投影されるイメージセクションを示します(青と赤のトレース)。平均強度値(任意の単位)は、8ビット画像(0~255)の値を表します。 (E) (D) と同じ領域が、平坦化された画像を使用してステッチ。この投影では、大規模な周期パターンは示されていません。 (F) 細胞の転がりと収量の蛍光トラックをもたらすせん断応力の範囲を決定するために実験で使用するせん断応力プロファイル。 (G) (F)に示すフロープロファイル下の単一細胞からの蛍光トラックのサンプル。細胞は左から右に移動し、剪断応力が上昇するにつれて蛍光強度が増加し、細胞が転がり続けなくなり、表面から切り離されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:最適で最適でない結果を示す。(A) コントラストが不十分な蛍光軌跡の一例。 (B) 過剰蛍光トラック密度の一例。 (C) 最適なトラック密度とコントラストの例。3つの画像はすべて同じ条件で取得され、平らにされ、ステッチされました。各画像の赤いボックスは、強度投影(右)が撮影された領域を表します。 (D) 回折限定(左半分)およびDNA-PAINT(右半分)イメージングで示される蛍光トラック。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 問題 | 考えられる理由 | 解決 | |
| エポキシテープが正しくカットされない | エポキシ層が厚すぎる | レイザーブレードでエポキシ層を可能な限り薄くする | |
| レーザー彫刻機能のパワーと速度が最適化されていません | レーザー彫刻機のパワーとスピードを最適化 | ||
| 流れチャンバーの側面に立ち往生気泡 | 不適切な初期液体の導入 | 気泡を洗い流す高い流量のチャネルを通して押しバッファの解決 | |
| 気泡は流れチャンバーを通過する | 入口および出口からの不適切な液体の導入 | ピペットチップと入口との間の液体間の接触を確実にするために、液体の液滴が入口のチューブにあることを確認する | |
| シリンジからの泡がフローラインに入った | シリンジポンプを傾けて、気泡がプランジャーエンドに閉じ込められていることを確認します | ||
| 液体はチャネルを入力できません | 入れ口がきつすぎる | シールを最適化するために調整します。入口チューブは、適切にねじ込まれたときにチャネル開口部に触れる必要があります。 | |
| チャネル漏洩 | エポキシは完全に治癒していない | チャネルを作り直し、5分速硬化エポキシを使用して、少なくとも1時間の治療を行います | |
| 入口が正しく密封されない | シールを最適化するために調整 | ||
| 立ち往生したセル | 非特異的結合につながる貧弱なPEGYL化 | 理想的には、PEG をリメイクします。さらに、追加のブロッキング剤(BSA及びTween-20)をインキュベートし、ブロッキング剤を洗浄バッファに追加することができます。 | |
| 大きな気泡が流路を通過して破壊された表面パッシベーション | 泡がチャネルを通過しないようにする | ||
| セルに関する問題 | HL-60を凍結から細胞培養を再開した後2週間使用してください。P-selectinのみでコントロール面でセルの転がりを確認します。 | ||
| セルがサーフェスと疎な相互作用を持たない、または疎な相互作用を持たない | P-selectin密度が低すぎるため、表面の機能性が悪かったり、バイオコンジュゲーションが悪かったりする | まず、ProtG-TGTの代わりにProtG-ビオチンをコントロールとして使用し、問題がバイオコンジュゲーションまたは表面ビオチン密度によるものかどうかを判断します。バイオコンジュゲーション品質と表面ビオチン密度を確保した後、TGT-ProtGおよびP-セレクチン-Fc濃度とインキュベーション時間を増加させます。 | |
| 細胞はロールするが、蛍光トラックを生成しない | 接着相互作用が弱すぎてTGTを破裂できない | ローリング実験中の流量を増加させ、相互作用力を高める。安定したローリングトラックと蛍光トラックの両方を生成する最適な流量を見つけるために、最初のランプアップフロープロファイル(図3F)をお勧めします(図3G)。 | |
| 悪い品質の表面は、高い背景の蛍光と不十分なコントラストのトラックを見るにつながります | 表面パッシベーションのチェック | ||
表 1: トラブルシューティングこの表は、このアッセイを実行する際に発生する問題の考えられる理由と解決策を示しています。
補足符号化ファイル1:カスタム記述MATLABスクリプトは、以前に収集した3つのスペクトル(ProtG、SMCC-strand、Ni-NTAビード溶出バッファー)に基づいて最終製品スペクトルを分解し、ProtGとssDNAの共役効率および比を決定する。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
接着フットプリントアッセイにより、細胞圧延接着中のPSGL-1とP-セレクチン間の分子接着事象の可視化が可能になります。このプロセスは、P-selectin媒介捕捉によって開始され、その後、流体せん断応力下での転がりが続きます。実験中の潜在的な問題は、通常、細胞がうまく転がっていても、細胞の転がりが悪かったり、蛍光トラックが欠落したりする。これらの問題は、多くの場合、プロトコルの重要なステップでの品質管理が原因で発生します (表 1)。
表面調製には複数のステップが必要なため、汚染を防ぐために生体分子とバッファーを4°Cで濾過して保管する必要があります。高品質の表面パッシベーションは、適切な表面官能化密度を達成し、生体分子の非特異的結合を低減するための要件です。表面に生体分子の非特異的結合は、高い蛍光の背景を作成することができ、単一分子蛍光イメージングおよび統計データ分析を妨害する。複数の要因が表面のパッシベーションに影響を与える可能性があります。アミノシランおよびPEG-NHSの加水分解は、PEGylationのはるかに低い効率をもたらす。十分なKOH洗浄およびピラニア洗浄は、ガラス表面に遊離水酸基を生成することによって親水性を高め、化学的反応基の密度を高める。細胞は、不十分なパッシベーション表面に立ち往生するだろう。蛍光生体分子を用いたPEGylation前後のバックグラウンド蛍光強度を測定することにより、表面パッシベーションの品質を確認します。
リガンドの表面密度は、PEG(PEG-ビオチン比、TGTハイブリダイゼーション、P-セレクチン)結合によって制御される細胞転動にとって重要な因子です。このシステムにおいて、PEG:PEG-ビオチン比20:1は、細胞圧延に十分なP-セレクチンを有する表面官能化に十分である。効率的なTGTハイブリダイゼーションは、蛍光トラックの表面密度と信号対雑音比も向上します。このプロトコルは、実験の前に任意の非ハイブリッドTGT底鎖が補完されることを保証するために、トップストランド-TGT-ProtGの補充ステップを含む。ProtGへのDNAの結合もまた、表面密度に影響を与える。スルフォ-SMCCリンカーを10倍のモル過剰でDNAに添加し、すべてのDNAがリンカーと反応するようにした。 C末で単一のシステイン残基(ProtG-Cys)を有するProtGを用いて、1:1 DNA:ProtG結合比を達成した。ProtG-Cysはジスルフィド結合を介してダイマーを形成することができるため、スルフヒドリル反応性架橋反応の前にジスルフィド結合を減少させるためにTCEPの治療が必要である。タンパク質共役DNAとTGTハイブリダイゼーションは、共役DNAとDNA二重が分子量の増加による遅滞移動性を示すネイティブPAGE分析で検証することができます。組立効率は、ゲルデンセメトリーによっても推定することができる(図2B)。慎重なPEGylationとバイオコンジュゲーションプロセスは、一貫した表面を作り出す上で非常に重要です。時折、細胞状態は、細胞の転がりおよびトラック形成に影響を与える可能性がある。細胞密度に対するPSGL-1発現は報告されていないが、細胞密度は増殖期における細胞周期およびタンパク質発現の強力な調節因子である。
PSGL-1はシグナル伝達受容体としても機能し、細胞増殖を調節する20,21であることを考えると、細胞密度などの培養条件は、PSGL-1の一貫した発現量および結合能のために維持される。ProtGによって表面に媒介されるP-セレクチン-Fcの付着は、細胞の接着および転動にとって極めて重要である。プロトグに対するP-セレクチンの結合動態は、濃度に依存する。P-セレクチンの低濃度は、平衡に達する時間の増加につながります.100 nM22未満の濃度の飽和結合には、少なくとも30分が必要です。10 nMのP-セレクチンを用いて、表面への非特異的結合を低減し、ProtGとの十分な相互作用のためにインキュベーション時間を増加させた。1時間のインキュベーションは、このシステムで細胞接着および転がりを誘導するのに十分な時間である。
TGTおよびそれに対応する力依存性寿命は、このアッセイの結果において重要な要因である。 圧延接着の間、テザー上の力はTGTおよびP-セレクチン:PSGL-1相互作用の両方を介して伝達される。これらの個々のコンポーネントのそれぞれは、一意の力依存寿命を持っており、適用された力に応じて、破裂確率は他方よりも一方を優先します。例えば、この記事で説明したTGTを使用する場合、13.6pN未満の力で、P-selectin:PSGL-1は主に解化し、13.6pNを超えるのに対し、TGTは主に解酸塩13を示している。せん断応力が低すぎる場合や、ビーズが遅すぎる場合、破裂事象は主にP-selectin:PSGL-1相互作用であり、TGsからの測定可能な蛍光信号が最小または測定可能な場合があるため、このアッセイを行う際に理解することが重要です。TGT のテンションしきい値も結果に影響します。TGTが高すぎる力で破裂した場合、破裂事象は主にP-セレクチン:PSGL-1であり、蛍光信号は最小限になります。
ここで説明する方法は、分子破裂力の分析だけでなく、ローリング接着に関与する分子接着イベントの場所を可能にする。接着のリアルタイム検出の代わりに、この方法の最も重要な利点は、実験後のイメージングと分析を可能にすることです。接着フットプリントがssDNAの形で表面に残されると、フローチャネルが暗い湿度室の4°C冷蔵庫に維持され、入口と出口の両方が乾燥を防ぐためにブロックされた場合、トラックは12時間後に画像化することができます。このアッセイに対する蛍光読み出しの解釈は、選択されたイメージング方法に依存する。超解像イメージングにより、このアッセイは高い空間分解能(<50 nm)を実現し、破裂TGTs13の密度を定量的に分析することができます。受容体密度または破裂したTGT密度の分析は、異なる条件下での圧延接着挙動を調査するのに有用であろう。逆に、回折限定のイメージングは高い空間分解能を提供しません。しかし、それは、大きな表面積を画像化して、何百もの視野上の複数のビーズの蛍光トラックを分析することを可能にする。これは、トラックの蛍光強度を、時間の経過に伴う転がり行動の変化に関する情報を提供する大きな距離にわたって単一のビーズについて分析することができるので有利である。このような例は、時間の経過とともにせん断応力を変化させ、蛍光強度の対応する変化を観察することです。 近年、単純なモデルを通して、その線路の蛍光強度を用い、分子力分布13を推定することができることが示されている。このassay23で力定量を達成するためのレシオメトリック法の潜在的な適用もあります。
細胞の転動は急速に(10μm/s)、および長距離(1000μm)にわたって起こるため、従来のリアルタイム分子張力センサでは分子張力の研究が困難でした。接着フットプリントアッセイは、イベント後のイメージングを可能にするために、この厳しい制約を破ります。TGT破裂事象は、破裂前に経験した緊張の大きさを直接報告するものではありませんが、転がり接着に関与する分子力の定量的な調査を可能にするために、蛍光トラックの分析において有望な開発がなされています13,23,24。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、カナダイノベーション財団(CFI 35492)、カナダディスカバリーグラント自然科学工学研究評議会(RGPIN-2017-04407)、研究基金のニューフロンティア(NFRFE-2018-00969)、マイケル・スミス健康研究財団(SCH-2020-0559)、ブリティッシュコロンビア大学エミンズ基金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
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