Summary
이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.
Abstract
셀렉틴 매개 상호 작용에 의해 촉진되는 압연 접착은 염증 부위에 백혈구를 모집하는 데 매우 역동적이고 수동적인 운동성입니다. 이 현상은 혈액 흐름이 내피 세포에 압연 운동에 백혈구를 밀어 하는 포스트 모세관 정맥에서 발생합니다. 안정적인 롤링은 접착 결합 형성과 기계적으로 구동되는 해리 사이의 섬세한 균형을 필요로 하며, 이는 셀이 흐름 방향으로 굴러가면서 표면에 부착된 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 상대적으로 정적 환경에서 발생하는 다른 접착 공정과 달리 압연 세포가 초당 수십 미크론에서 수천 미크론을 이동함에 따라 압연 접착력이 매우 역동적입니다. 따라서, 견인력 현미경검사법과 같은 종래의 메카노생물학 방법은 짧은 시간 스케일 및 고감도로 인해 개별 접착 이벤트 및 관련 분자력을 측정하기에 적합하지 않다. 여기서는 P-selectin: PSGL-1 상호작용을 분자 수준에서 롤링 접착을 이미지화하기 위한 접착 발자국 분석의 최신 구현을 설명합니다. 이 방법은 돌이킬 수 없는 DNA 기반 장력 게이지 테더를 사용하여 형광 트랙의 형태로 분자 접착 이벤트의 영구 역사를 생성합니다. 이 트랙은 두 가지 방법으로 이미지화 될 수있다 : (1) 큰 시야를 생성하기 위해 회절 제한 이미지의 수천을 함께 스티치, 길이의 수천 미크론을 통해 각 롤링 셀의 접착 발자국의 추출을 가능하게, (2) DNA-PAINT를 수행하여 작은 시야 내에서 형광 트랙의 초해상도 이미지를 재구성. 이 연구에서는, 접착 발자국 분석은 다른 전단 응력에서 압연하는 HL-60 세포를 연구하기 위하여 이용되었습니다. 이 과정에서 우리는 P-셀렉틴의 공간 분포를 이미지화할 수 있었습니다: PSGL-1 상호 작용및 형광 강도를 통해 그들의 분자 력에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다. 따라서, 이러한 방법은 분자 수준에서 압연 접착에 관여하는 다양한 세포 표면 상호작용의 정량적 조사를 위한 기초를 제공한다.
Introduction
롤링 접착 캐스케이드는 순환 세포가 혈관 벽을 따라 밧줄을 타고 굴리는 방법을 설명합니다1. 수동 압연은 주로 셀룰러 접착 분자 (CAM)1의 주요 클래스인 셀렉틴에 의해 매개됩니다. 혈액의 전단 흐름하에서, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)을 발현하는 백혈구는 염증이 있는 내피 세포의 표면에 발현될 수 있는 P-selectin과 매우 일시적인 결합을 형성한다. 이 과정은 백혈구가 염증의 사이트로 이동하는 것이 중요합니다2. 또한, PSGL-1은 P-selectin3와의 교전시 압연 접착의 후속 회사 접착 단계를 발동할 수 있는 메카노감감충수용체이다.
CAM 기능에 영향을 미치는 유전 돌연변이는 백혈구 접착 결핍 (LAD)의 희귀 질환과 같은 면역 체계에 가혹하게 영향을 미칠 수 있으며, 압연을 중재하는 접착 분자의 오작동이 심각하게 면역 손상 된 개인4,5,6로 이어집니다. 또한, 순환 종양 세포는 유사한 압연 과정에 따라 이동하여 전이7,8로 이어지는 것으로 나타났다. 그러나 세포 압연은 빠르고 역동적이기 때문에 기존의 실험 적인 메카노생물학 방법은 세포 압연 중 분자 상호 작용을 연구하기에 적합하지 않습니다. 원자력 현미경 및 광학 트위저와 같은 단일 세포 및 단일 분자 조작 방법은 단일 분자 레벨9에서 PSGL-1과 P-selectin의 힘에 의존하는 상호 작용과 같은 분자 상호 작용을 연구할 수 있었지만, 세포 압연 중 살아있는 접착 이벤트를 조사하기에 적합하지 않습니다. 추가적으로, 시험관 내 특징의 상호 작용은 생체 내의 분자 접착에 관하여 질문에 직접 대답할 수 없습니다. 예를 들면, 세포가 그들의 네이티브 환경에서 작동할 때 어떤 분자 장력 범위는 생물학으로 관련있습니까? 접착제 역학 시뮬레이션10 또는 간단한 정상 상태 model11과 같은 계산 방법은 특정 분자 세부 사항과 롤링 거동에 미치는 영향을 캡처했지만 모델링 매개 변수 및 가정의 정확도에 크게 의존합니다. 견인력 현미경과 같은 그밖 기술은 세포 이동 도중 힘을 검출할 수 있습니다 그러나 분자 장력에 충분한 공간 해상도 또는 정량적인 정보를 제공하지 않습니다. 이러한 기술 중 어느 것도 자신의 네이티브 환경에서 세포 기능 및 행동과 직접 관련이 분자 력의 측두역학, 공간 분포 및 크기 이질성의 직접적인 실험 적 관찰을 제공 할 수 없습니다.
따라서 선택 매개 상호 작용을 정확하게 측정할 수 있는 분자력 센서를 구현하는 것은 압연 접착에 대한 이해를 향상시키는 데 매우 중요합니다. 여기서는 PSGL-1 코팅 구슬이 p-selectin 기능화 장력 게이지 테더(TGT)13을 제시하는 표면에 압연되는 접착 발자국 분석12프로토콜을 설명합니다. 이 TGT는 형광 판독의 형태로 파열 사건의 영구적 인 역사를 초래 돌이킬 수없는 DNA 기반 힘 센서입니다. 이는 TGT(dsDNA)의 파열과 형광으로 표기된 보완 가닥으로 파열된 TGT(ssDNA)의 후속 라벨링을 통해 달성된다. 이 시스템의 한 가지 주요 장점은 회절 제한 및 초해상도 이미징과의 호환성입니다. 형광으로 표지된 보완 적 가닥은 DNA PAINT를 통한 초분해능 이미징을 위해 회절 제한 이미징 또는 과도 바인딩(7-9bp)에 영구적으로 > 결합될 수 있다. 이것은 TG가 활성 압연 도중 파열되기 때문에 압연 접착을 연구하기 위한 이상적인 시스템입니다, 그러나 형광 판독은 압연 후 분석됩니다. 두 가지 이미징 방법은 또한 사용자에게 압연 접착력을 조사할 수 있는 더 많은 자유를 제공합니다. 전형적으로, 회절 제한 화상 진찰은 형광 강도를 통해 분자 파열 력을 추출하는 데 유용하지만, 초해상도 이미징은 수용체 밀도의 정량적 분석을 허용한다. 압연 접착의 이러한 특성을 조사하는 기능으로, 이 접근법은 전단 흐름 하에서 압연 세포의 분자 접착에 대한 강제 조절 메커니즘을 이해하기 위한 유망한 플랫폼을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 올리고뉴클레오티드 라벨링 및 혼성화
- 단백질 G 이황화물 결합 감소
- 1mL의 초순수에 10 mg의 단백질 G(ProtG)를 녹입니다.
참고: 여기에 단백질 G는 C-terminus및 N-종자 폴리 히스티딘 꼬리표에 있는 단 하나 시스테인 잔류물로 변형됩니다. - 완충 교환≥20 μL 의 ProtG (10 mg/mL)를 P6 컬럼이있는 1 x PBS (pH 7.2)로 합니다.
- 완충교환 후 단백질 농도를 측정한다.
참고: 7-8 mg/mL의 전형적인 농도. - 120mM Tris(2-carboxyethyl)인 포스핀(TCEP)을 1x PBS(pH 7.2)의 90 μL로 3mg의 TCEP를 용해한 다음 0.5M EDTA의 10μL을 준비한다.
참고 : TCEP는 갓 준비해야합니다. - 120mM TCEP(480nmol)의 4μL을 프로트G(4-5nmol)의 20μL에 추가합니다.
참고: 단백질에 ~100:1 TCEP의 어금니 비율을 목표로 합니다. - 상온(RT)에서 30분 동안 반응을 진행할 수 있도록 한다.
- P6 열(1x PBS, pH 7.2로 교환된 버퍼)을 통해 감소된 ProtG에서 초과 TCEP를 제거합니다.
- UV/비스 분광계로 감소된 프로트G의 농도를 측정하고 스펙트럼을 저장합니다.
참고: 3.5-4.5 mg/mL의 전형적인 농도.
- 1mL의 초순수에 10 mg의 단백질 G(ProtG)를 녹입니다.
- 설포-SMCC를 가진 아민 표지sDNA 반응
- 핵이 없는 물에 아민 라벨sDNA(아민-ssDNA)를 1mM의 농도로 용해하십시오. UV/비스 분광계로 가닥 농도를 확인합니다.
- 11.5 mM sulfo-SMCC(설포-NHS 에스테르및 말리미드를 사용하는 이종염 크로스링커) 용액을 400μL의 초순수수및 소용돌이에 2 mg의 설포-SMCC를 용해하여 신선하게 준비한다.
- 1mM 아민-ssDNA(6nmol)의 6μL을 11.5m 설포-SMCC(60nmol)와 88.8 μL의 1x PBS(pH 7.2)의 5.2 μL에 추가한다. 5초의 소용돌이가 3분 동안 8600 x g 에서 원심분리를 합니다.
- RT에서 30분 동안 반응을 진행할 수 있습니다.
- P6 컬럼(1x PBS, pH 7.2로 교환된 버퍼)을 가진 SMCC 컨쥬게이드 아민-ssDNA(말-ssDNA)에서 과도한 설포-SMCC를 제거한다.
- UV/비스 분광계로 말-ssDNA의 농도를 측정하고 스펙트럼을 저장합니다.
참고: 35-45 μM의 일반적인 농도.
- 프로트G-ssDNA 컨쥬게이션
- 말-ssDNA(~4-5nmol)에 4.5 mg/mL 감소된 ProtG(3nmol)의 21 μL을 추가합니다.
참고: 볼륨과 농도는 일반적인 값입니다. 개별 실험 측정에 따라 조정합니다. 항상 ~ 1.5:1의 비율로 ProtG를 통해 말-ssDNA의 초과 금액을 확인합니다. - 5 s에 대한 소용돌이와 반응이 RT에서 3 시간 동안 진행되도록 허용합니다.
- 말-ssDNA(~4-5nmol)에 4.5 mg/mL 감소된 ProtG(3nmol)의 21 μL을 추가합니다.
- ProtG-ssDNA 정제 및 특성화
- 자기 니켈-니트리로트리아세산(Ni-NTA) 구슬로 태그 절연을 통해 공주된 ProtG-ssDNA를 정화합니다.
- P6 컬럼(1x PBS, pH 7.2로 교환된 버퍼)을 가진 제품으로부터 과도한 imidazole(Ni-NTA 용출 버퍼)을 제거합니다.
참고: 이미다졸은 280nm에서 상당한 흡수를 하기 때문에 이 단계는 연상을 정량화하는 데 필수적입니다. - UV/Vis 분광광계를 사용하여 제품 ProtG-ssDNA의 스펙트럼과 Ni-NTA 용출 버퍼(1x)를 기록합니다.
참고: 260 nm 및 280 nm에서 의 전형적인 ProtG-ssDNA 흡광도는 각각 0.8 및 0.6입니다. - ProtG에서 ssDNA에 대한 ProtG의 결합 효율과 비율을 결정하려면 이전에 수집된 세 가지 스펙트럼(ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA 비드 용출 버퍼)에 따라 최종 제품 스펙트럼을 분해하기 위해 맞춤형 MATLAB 스크립트(보충 코딩 파일 1)를 사용합니다.
참고: 간단히 말해서 코드는 1.4.5-1.4.8 단계에 설명된 대로 작동합니다. 일반적인 농도는 프로트G와 ssDNA를 가진 ProtG-ssDNA의 4 μM이다 ~1:1 어어 비(도 2A). - 입력 프로트G, SMCC-가닥, Ni-NTA 비드 용출 버퍼, 그리고 MATLAB 스크립트에 ProtG-ssDNA UV/Vis 스펙트럼
- 소스 스펙트럼(ProtG, SMCC-strand 및 Ni-NTA 비드 용출 버퍼 스펙트럼)에서 ProtG-ssDNA 스펙트럼을 재구성하기 위해 다차원 비제한 비선형 최소화를 수행합니다.
참고: 최소화 함수는 각 소스 스펙트럼에 대해 하나씩 세 가지 변환 요소를 출력합니다. - 해당 계수에 해당하는 스펙트럼을 곱하고 변형된 소스 스펙트럼을 결합하여 ProtG-ssDNA 스펙트럼을 재구성합니다.
- ProtG-ssDNA 제품에서 SMCC-strand 및 ProtG의 농도를 결정하기 위해 해당 변환 인자에 의해 ProtG 및 SMCC-strand의 초기 농도를 곱한다.
- (선택 사항) 그림 2B 에 따라 네이티브 PAGE를 실행하여 각 구성 요소와 단계가 예상대로 작동하는지 확인합니다.
- TGT 혼성화
- T50M5 버퍼(10mM Tris, 50mM NaCl, 5m MgCl2)의 농도가 각각 240nM 및 200 nM의 다름 비율로 바이오티니징 바닥 가닥을 가진 하이브리드화 ProtG-ssDNA(상단 가닥)는 전체 TGT 구조를 혼성화한다. RT ≥1h에서 혼성화하십시오.
2. 표면 PEGylation
- 표면 청소
- 8개의 커버립마다 에를렌마이어 플라스크 1개와 염색 항아리 2개를 청소하십시오. 각 용기를 1M KOH 용액으로 채우고 RT에서 1시간 동안 초음파 처리합니다.
참고 : 뚜껑을 만지도록 KOH를 상단에 채우기 때문에 청소됩니다. - 각 커버슬립을 초순수물로 철저히 헹구고 청소된 염색 항아리 에 넣습니다.
참고: 서로 붙어 있지 않았는지 또는 염색 된 항아리의 벽에 붙어 있지 않은지 확인하십시오. - 연기 후드에서는 250mL 비커에 과산화수소 30mL(30%)를 농축(95%-98%)의 황산에 90mL에 추가하여 피라냐 용액을 신선하게 준비한다.
주의: 농축 황산은 부식성이 높습니다. 과산화수소는 황산에 매우 천천히 추가하고 조심스럽게 소용돌이 섞습니다. - 피라냐 용액으로 염색 된 항아리의 커버립을 완전히 잠급합니다. 연기 후드에 30 분 동안 피라냐에 커버립을 둡니다.
주의: 피라냐 용액을 80°C 이하로 식히고 붓는 병을 방지하십시오. - 피라냐 용액을 1000mL 비커로 버리고 유리 청소에서 1M KOH로 중화하십시오.
- (선택 사항) 신선한 피라냐 용액으로 피라냐 세척(2.1.3-2.1.5단계)을 반복합니다.
- 커버립을 풍부한 양의 초순수로 헹구어 잔류 피라냐 용액을 모두 제거합니다. 각 상승 시 염색 항아리를 부드럽게 흔들어 제거를 용이하게합니다 (10 개의 헹구는 것이 좋습니다).
- 커버슬립 표면에서 물을 제거하고 커버립을 메탄올로 3번 헹구고 커버립을 메탄올에 담근 상태로 유지합니다.
- 8개의 커버립마다 에를렌마이어 플라스크 1개와 염색 항아리 2개를 청소하십시오. 각 용기를 1M KOH 용액으로 채우고 RT에서 1시간 동안 초음파 처리합니다.
- 표면 격리
- 94mL의 메탄올, 아미노실란 1mL, 빙하 아세트산 5mL을 세척 및 건조된 에렌마이어 플라스크에 철저히 혼합하여 1% 아미노실용액을 준비한다. 두 번째 세척 및 건조 된 염색 jar14에 붓습니다.
- 메탄올 용액 아래에 잠긴 커버립을 1% 아미노시란 용액을 함유한 염색 항아리로 옮기고 항아리를 덮어 보관합니다.
참고: 아미노인으로 옮기는 동안 커버립이 건조되는 것을 허용하지 말고 공기에 유리 표면 노출을 제한합니다. - 오븐15에서 70°C에서 1시간 동안 아미노실레인의 커버립을 함유한 염색 항아리를 배양한다.
- 아미노아일란 용액을 별도의 폐기물 용기에 조심스럽게 버리고 염색 항아리에 커버립을 메탄올5번 헹구어 아미노시란 용액을 제거합니다.
- 염색 항아리에 초순수 수를 5번 헹구고 N2로 건조시다.
- 말린 커버립을 110°C에서 오븐에 넣고 20분간 굽습니다. 커버립을 RT로 식힌 다음 PEGylation 랙에 놓습니다.
참고: 변곡 중에 염색 항아리를 뚜껑으로 덮어 표면의 특정 및 화학 적 침착을 최소화합니다15.
- PEG 솔루션 준비
- THaw PEG (폴리에틸렌 글리콜) 및 PEG 비오틴에 약 30 분 동안 RT.
참고: 이 단계는 PEG의 NHS 에스테르를 저하시킬 수 있는 수분 응축을 최소화합니다. - 초순수 10mL에 중탄산나트륨 84mg을 첨가하여 PEG 버퍼를 만드세요. 이러한 제형은 pH 8.4에서 버퍼를 제공해야 한다.
- 8 커버립의 경우, 각 페이지드 측에 20:1 PEG:PEG-biotin: 측정 100 PEG 의 mg과 5 PEG-비오틴의 mg 을 측정 하여 400 μL의 PEG 버퍼를 추가합니다. 최대 속도(≥18000 x g)에서 1분 동안 30s 및 원심분리기용 용액을 소용돌이시킵니다.
참고: 이 단계는 SVA NHS-에스테르 가수분해가 즉시 시작되고 pH 8.0에서 34분의 반감기를 가지며 pH 8.4에서 더 짧은 반감기를 가지므로 시간에 민감합니다.
- THaw PEG (폴리에틸렌 글리콜) 및 PEG 비오틴에 약 30 분 동안 RT.
- PEG 인큐베이션 및 커버슬립 스토리지
- 습도 챔버를 설정하고 커버립을 내부에 배치합니다.
- 90 μL의 PEG 용액을 습도 챔버의 커버슬립에 추가하고 페그 용액을 고르게 확산하기 위해 핀셋을 들고 있는 커버슬립을 사용하여 PEG 솔루션 위에 두 번째 커버슬립을 놓습니다.
- 용액에 덮개 슬립에 떨어뜨린 거품이 없는지 확인합니다. 첫 번째 커버슬립의 두 번째 커버슬립의 하단을 낮추고 다른 쪽 끝을 천천히 떨어뜨려 커버립 사이에 거품이 끼워 있지 않도록 합니다.
참고: 거품으로 인해 특정 영역이 제대로 페자이드되지 않습니다. - 모든 커버립이 PEG(예: 8개의 커버립 = PEG 샌드위치 4개)가 있을 때까지 반복합니다. 다크16의 습도 챔버에서 RT에서 하룻밤(~12시간)에 PEG 솔루션을 배양합니다.
- 커버슬립 쌍을 분리하고 염색 된 항아리에 넣습니다. PEGylated 측면을 참고하십시오.
- 커버를 초순수물로 철저히 헹구고 N2로 건조시다.
참고: 핀셋으로 커버립을 잡고 표면을 가로질러 N2 를 트위저쪽으로 날려 오염물질이 표면에 건조되는 것을 방지합니다. - 영구 마커 또는 다이아몬드 펜을 사용하여 모서리에 점으로 비 PEGylated 측면을 표시합니다.
- 2 PEGylated 커버립을 우편물 튜브에 배치하여 PEGylated 측이 서로 마주보고 있기 때문에 사용하기 전에 PEGylated 측면을 식별하십시오.
- 튜브를 5분 동안 진공 청소기로 청소하고 N2로 백필하십시오. 파라필름으로 튜브를 밀봉합니다.
- PEGylated 커버립을 밀봉 된 우체 튜브에 -20 °C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
참고: 칩 조립 전에 저장 튜브를 RT로 데우십시오. 밀봉 하는 동안 커버립에 응축 누출 발생 합니다.
3. 플로우 챔버 준비
- 칩 어셈블리
- 면도날이 있는 양면 테이프 양쪽에 소량의 에폭시를 얇게 펴고 있습니다.
참고: 너무 많은 에폭시가 조립 중에 채널로 확산될 수 있습니다. - 에폭시 코팅 테이프를 레이저로 잘라 4 개의 채널을 만듭니다. 4홀 슬라이드와 PEG 커버슬립 사이에 에폭시 테이프를 끼여 유동 칩을 만듭니다(그림 1A).
- 파이펫 팁을 사용하여 채널 의 길이에 따라 부드러운 압력을 적용하여 좋은 씰을 만듭니다. ≥1h용 에폭시를 치료한다.
참고: 에폭시에 대 한 슬라이딩 을 피하기 위해 유리를 전단 하지 마십시오.
- 면도날이 있는 양면 테이프 양쪽에 소량의 에폭시를 얇게 펴고 있습니다.
- 챔버 어셈블리
- 칩을 정렬하여 각 채널의 개구부가 어댑터의 중심에 배치되도록 합니다(그림 1A). 두 개의 투명 아크릴 스페이서를 칩 위에 놓고 블록 중간에 단단한 압력을 가하고 각 스페이서 끝에 있는 4-40 나사 2개에 나사를 놓습니다.
참고: 나사를 강제로 던지거나 스페이서에 너무 강하게 누르거나 칩이 깨질 수 있습니다. - 브래킷의 반대편에 는 입구를 나사 구멍에 나사로 연결합니다. 투명 아크릴 블록을 통해 밀봉 상태를 모니터링합니다.
- 튜브가 칩의 개구부와 접촉할 때, 튜브를 시계 방향으로 부드럽게 비틀어 연결을 밀봉합니다.
참고: 과도하게 조여진 입구는 흐름 막힘을 일으킬 수 있으며 느슨한 접촉은 누출을 유발합니다.
- 칩을 정렬하여 각 채널의 개구부가 어댑터의 중심에 배치되도록 합니다(그림 1A). 두 개의 투명 아크릴 스페이서를 칩 위에 놓고 블록 중간에 단단한 압력을 가하고 각 스페이서 끝에 있는 4-40 나사 2개에 나사를 놓습니다.
4. 표면 준비
참고: 전체 워크플로우의 그림 1B 를 참조하십시오.
- 비특이적 바인딩을 방지하기 위해 에이전트 차단
- 파이펫을 사용하여 200 μL의 세척 버퍼(10m Tris, 50m NaCl, 5mM MgCl2 및 2mM CaCl2, 0.05% Tween 20)를 챔버로 플로우하여 누출 여부를 확인합니다. 채널에서 거품이 형성되면 200 μL을 추가로 밀어 거품을 제거합니다.
참고: 이 단계에서 제거되지 않은 큰 기포는 나중에 표면 기능화를 제거하고 파괴할 수 있습니다. - BSA의 40 μL(1% w/v)을 유량 챔버에 추가하여 비특이적 결합을 방지하고 10분 동안 배양합니다.
- 각 인큐베이션 기간 동안 충분한 부피를 추가하여 유입실과 콘센트에서 유량 챔버를 채우고 액적형태를 형성해야 합니다. 그에 따라 배양 량을 조정하고 습도 챔버에서 모든 배양을 수행합니다.
- 플로우 챔버에 40 μL의 Tween 20 (5 % v /v)를 추가합니다. 비특이적 결합을 더 줄이기 위해 10분 동안 배양합니다.
- (선택 사항) 채널을 통해 폴리스티렌 구슬을 흐르면 표면을 적절한 통과 여부를 확인하십시오. ProtG 코팅 폴리스티렌 구슬 40 μL (0.01 % w /v) 및 10 배 목표를 가진 암장 현미경을 사용하여 이미지를 추가합니다. 구슬이 표면에 부착되지 않으면 다음 단계로 진행합니다.
- 모든 통과제를 제거하기 위해 200 μL의 세척 버퍼로 채널을 세척합니다.
- 파이펫을 사용하여 200 μL의 세척 버퍼(10m Tris, 50m NaCl, 5mM MgCl2 및 2mM CaCl2, 0.05% Tween 20)를 챔버로 플로우하여 누출 여부를 확인합니다. 채널에서 거품이 형성되면 200 μL을 추가로 밀어 거품을 제거합니다.
- 챔버 표면 기능화
- 스테렙타비딘(100 μg/mL)의 40μL을 유량 챔버에 넣고 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 200 μL의 세척 버퍼로 세척하십시오.
- 혼성 ProtG-TGT(100 nM)의 40 μL을 유량 챔버에 넣고 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 200 μL 세척 버퍼로 세척하십시오.
- ProtG-TGT 상단 가닥(100 nM)의 40μL을 20분 간 추가하여 표면에 비혼화된 TGT 바닥 가닥을 완성합니다. 워시 버퍼 200μL로 씻으시다.
- P 셀렉틴 Fc(10 μg/mL)의 40μL을 유량 챔버에 넣고 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 200 μL의 세척 버퍼로 세척하십시오.
참고: 인큐베이션 지속 시간은 매우 중요합니다.
5. 실험 및 이미징
- 흐름 시스템 설정
- 압연 버퍼(2mM CaCl2, 2m MgCl2, 10mM HEPES, 0.1% BSA)로 5mL 유리 주사기를 채웁니다. 주사기의 측면을 눌러 거품을 빼내고 끝을 향해 떠있을 때 밀어 내밀어 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오.
- 멸균 바늘(26G, 5/8 인치 길이)을 ~200mm의 폴리에틸렌 튜브(I.D: 0.38 mm)에 삽입합니다. O.D: 1.09 mm) 및 유리 주사기에 바늘을 연결합니다.
참고: 바늘 커넥터의 아무 공기도 갇혀 있지 않도록 하십시오. - 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 플런저 측이 상승하여 기포가 채널에 유입되는 것을 방지하기 위해 주사기 펌프를 기울입니다. 튜브의 끝을 유량 챔버 입구에 삽입합니다.
참고: 액적방울을 입구에 증착하고 주사기 튜브 끝에 액적물방울을 가두어 연결시 액체 접촉에 액체를 보장하십시오. 유입구에 삽입하기 전에 주사기 튜브 끝에 작은 방울이 형성되도록 하여 기포가 채널에 들어가지 않도록 하십시오. - 폴리에틸렌 튜브의 다른 200mm의 한쪽 끝을 콘센트에 삽입하고 다른 쪽 끝은 폐기물 비커에 잠겨 있습니다.
- 셀 롤링을 위한 설정
- IMDM 배지에서 25cm2 의 환기 배양 플라스크에서 HL-60 세포를 성장시키고 5% CO2로 37°C에서 20%의 태아 소 혈청과 1%의 항생제를 보충한다. 1 x 105-2 × 106 세포/mL 사이의 세포 밀도를 유지합니다.
- (선택 사항) 2 x 105 셀/mL의 초기 밀도에서 1.25% DMSO를 함유하는 완전한 IMDM 배지에서 HL-60 셀을 분화한다. 5-6 일 동안 가장 활성화 될 세포를 배양한다.
- 세포 현탁액 및 원심분리기(200 x g, 3분)로부터 세포를 펠릿으로 샘플(1-2mL)을 채취한다.
- 배지를 제거하고 롤링 버퍼의 500 μL에서 셀을 부드럽게 다시 분리합니다. 셀룰러 이물질을 제거하기 위해 세척 단계를 두 번 반복합니다.
- 혈종계로 세포 밀도를 측정합니다. 압연 버퍼로 세포 펠릿을 2 x 105 세포/mL의 밀도로 재축합니다.
- 셀 서스펜션의 입구/콘센트 및 파이펫 40 μL에서 튜브를 조심스럽게 분리하여 유량 챔버로 연결합니다. 앞서 설명한 대로 튜브를 다시 연결하여 흐름 채널에 거품이 유입되지 않도록 합니다.
- 원하는 유량에서 주사기 펌프를 시작하여 셀 롤링 실험을 시작합니다.
참고: 형광 트랙의 강도는 전단 응력에 따라 다르며, 낮은 세포 속도 전단 응력/세포 속도는 일반적으로 조광선(그림 4A)을 생성합니다. 분리 가능한 단일 셀 트랙을 보장하기 위해 표면의 높은 셀 밀도 또는 과도한 압연 지속 시간을 피하십시오(그림 4B, C). - 세포 압연이 관찰되도록 10배 의 목표를 가진 암장 현미경을 사용합니다.
- 실험이 완료되면 표면이 셀프리가 될 때까지 100mL/h의 롤링 버퍼를 주입하여 채널에서 셀을 제거합니다.
- "나노 스케일 지형에서 이미징을위한 DNA 기반 포인트 축적"(DNA-PAINT)에 의한 지역 트랙 이미징
- DNA 페인트 버퍼(0.05% Tween-20, 5m Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA)에 DNA-PAINT 이미저 가닥(500 pM)의 40μL을 추가합니다.
- 100x 오일 침지 TIRF 객관적렌즈를 사용하여 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 을 수행합니다. 전자곱충전장치(EMCCD) 카메라를 사용하여 300의 전자곱(EM) 게인에서 프레임당 25ms 노출 시간으로 400000+ 프레임을 획득합니다.
- Picasso 소프트웨어 package17 을 사용하여 5.3.4-5.3.5 단계에 따라 초해상도 이미지(그림 4D)를 현지화하고 렌더링합니다.
- DNA-PAINT 영화를 로컬라이제이시 프로그램에 로드하여 각 프레임의 각 플루오로포어의 현지화를 결정합니다.
참고: 형광만 정확하게 추적할 때까지 상자 측면 길이와 최소 및 최소 그라데이션 매개 변수를 최적화합니다. 최소. 넷 그라데이션 매개 변수는 최적의 추적을 달성하기 위해 100000 이상을 초과할 수 있습니다. 맞춤 설정: MLE, 통합 가우시안 방법은 최상의 결과를 생성합니다. 마지막으로 동영상이 너무 길면 로컬화에서 미리 보기 추적이 제대로 작동하기 위해 10000 프레임의 스택으로 분할한 후 최종 HDf5 파일로 재조합합니다. - 그런 다음 결과 HDf5 파일을 Render 프로그램에 로드하여 드리프트 보정 및 렌더링을 수행합니다.
참고: 최종 결과를 개선하기 위해 RCC의 드리프트 해제 를 통해 여러 드리프트 보정을 수행합니다.
- 영구 라벨링으로 긴 트랙 이미징
- T50M5 버퍼에서 영구 이미저 가닥을 추가하고 120s에 대한 인큐베이션을 추가합니다. 200 μL의 세척 버퍼를 주입하여 채널을 세척하십시오.
- 배경 카메라 소음을 얻기 위해 흥분 레이저끄기로 이미지를 기록합니다. TIRF 현미경 검사법에 의해 그리드 패턴의 넓은 영역을 이미지합니다.
참고: 프레임 오버프레임 오버랩은 ≥10%의 오버랩을 후속 스티치에 권장합니다. - 현미경을 프로그래밍하여 400 x 50 이미지(총 20000개의 이미지)를 스캔합니다. FIJI 프로그램을 사용하여 원시 데이터를 개별 tiff 파일로 분할하여 각각 최대 10000개의 이미지를 포함합니다.
- 5.4.5-5.4.7 단계에 따라 조명 프로파일(그림 3A-C)을 사용하여 모든 이미지를 병합합니다.
- 모든 프레임에서 배경 카메라 노이즈를 뺍니다. 모든 배경 빼기 프레임의 평균 스택 프로젝션(조명 프로파일)을 가져옵니다.
- 최대 값으로 조명 프로파일을 정규화합니다. 모든 배경 빼기 프레임을 정규화된 조명 프로파일로 나눕니다.
- 수정된 프레임을 해당 비트 깊이에 대해 적절한 범위로 다시 조정합니다.
- MIST18을 사용하여 이미지를 스티치합니다(그림 3D, E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
위의 프로토콜은 접착 발자국 분석기의 실험 적 절차를 설명합니다. 일반적인 실험 워크플로우는 도 1, 유량 챔버 어셈블리(도 1A)에서 표면 기능화(도 1B) 및 실험 및 이미징 단계(도 1C)에 도시되어 있다.
도 2 는 ProtG-ssDNA 생체 경련 특성화에 대한 대표적인 결과입니다. 최종 제품, 즉 ProtG, 말-sdna 및 imidazole 용출 버퍼에서 3개의 성분의 UV/Vis 스펙트럼은, 공지된 농도에 대응하는 최종 컨쥬게이션(Figure 2A) 전에 수집되었다. 이러한 스펙트럼은 세 가지 알 수없는 매개 변수가 농도인 바이오 컨쥬게이션 제품 스펙트럼에 적합하기 위한 직교 기초를 형성합니다. MATLAB의 사용자 지정 함수를 사용하여 농도를 결정했습니다. 결과는 ssDNA에 ProtG의 거의 1:1 비율을 보여줍니다 (그림 2A). ssDNA는 단 하나의 아민 수정을 가지고 있기 때문에 이것은 예상대로, ProtG는 그것의 C-종점에서 설계된 단일 시스테인이 있습니다. 이러한 접근법은 이전에 보고된 접근법19 에 더 유리하여 단일 티올 변형 DNA를 사용하여 ProtG의 다수의 주요 아민을 표적으로 삼고, 여기서 인주비가 쉽게 유지될 수 없다.
또한, 네이티브 PAGE는 바이오 컨쥬게이션(그림 2B)을 확인하기 위해 사용되었다. DNA는 겔그린과 쿠마시 블루에 의해 단백질에 의해 각각 염색된다. GelGreen은 ssDNA보다 dsDNA를 더 강하게 얼룩지게 하기 때문에, 모든 ssDNA 대역은 dsDNA 대역(차선 3, 4)의 동등한 어금니 농도보다 더 어두워질 것으로 예상됩니다. 주식 ProtG는 C-말단 시스테인 잔류물을 포함하기 때문에, 단백질의 분수는 차선 5에서 볼 수 있듯이, 디설파이드 결합을 통해 희미한 형성(도 2B). 반면에 감소된 ProtG는 단일 밴드(레인 6)를 나타낸다. DNA 연상에 직접 주식 ProtG를 사용하는 경우, 이황화 된 ProtG는 DNA에 반응하지 않으며 GelGreen 염색없이 밴드로 보여줍니다 (차선 7, 8). ProtG 디머 밴드는 감소된 ProtG(차선 9, 10)를 사용하여 컨쥬게이션 제품에서 사라집니다. ProtG(1.5:1)에 대한 말-sDNA의 과잉이 활용되는 동안 사용되기 때문에 TGT만 대역은 최종 컨쥬게이션 생성물(lanes 8, 10)에서 볼 수 있습니다. 단백동화 ProtG 밴드와 일치하는 밝은 GelGreen 밴드는 성공적인 결합과 좋은 수율을 나타냅니다.
그림 3 은 대표적인 원시 현미경 이미지와 후속 이미지 스티치 및 분석을 위해 이를 수정하는 워크플로우를 보여 줍니다. 단일 모드 섬유에서 도입된 TIRF 조명 프로파일은 일반적으로 시야 의 중간에 더 밝고 가장자리 주위의 조광기(그림 3A, B). 고르지 않은 조명을 보정하고 정량적 분석을 위해 이미지를 평평하게 하기 위해 조명 프로파일은 수천 개의 개별 프레임(그림 3B)을 평균화하여 결정되었습니다. 평평한 이미지는 원시 프로파일과 조명 프로파일 모두에서 카메라 노이즈를 빼고 조명 프로파일(그림 3C)에 의해 정상화하여 생성되었습니다. 이미지가 스티치되어 큰 이미지를 형성할 때 이미지 병합의 효과가 명확하게 표시됩니다. 셀 트랙이 없는 백그라운드 영역의 이미지 강도는 수정되지 않은 이미지에 대응하는 명확한 주기패턴을 나타낸다(그림 3D). 평평한 이미지에서 스티치된 동일한 시야는 평평한 배경을 생성합니다(그림 3E). 평평한 배경을 갖는 것은 셀 트랙을 따라 강도 변동을 해석하는 데 중요합니다. 첫 번째 실험으로서, 도 3F 에 도시된 것과 유사한 램프업 유동 프로파일은 안정적인 세포 압연 및 명확한 형광 세포 트랙을 모두 보장하는 실험에 적합한 전단 응력의 범위를 결정하는 데 사용된다. 이 흐름 프로파일 아래의 전형적인 단일 셀 접착 발자국은 도 3G에 표시되며, 전단 응력이 증가하면 전단 응력이 증가하여 세포가 더 이상 높은 전단 응력에서 압연을 유지하고 표면에서 분리하여 단일 트랙의 끝을 표시합니다.
그림 4 는 최적이 아닌 에서 최적의 대표 실험 결과에 이르는 잠재적 결과를 보여 줍니다. 도 4A 는 형광 트랙이 낮은 신호 대 잡음 비율을 갖는 최적이 아닌 결과를 보여줍니다. 이는 완전히 공주된 프로브의 낮은 표면 밀도 또는 낮은 유량으로 인해 발생할 수 있습니다. 도 4B 는 형광 트랙이 너무 조밀하게 포장되어 후속 분석을 위해 개별 트랙을 해결하고 격리하는 또 다른 최적이 아닌 결과를 보여줍니다. 그림 4C 는 개별 트랙이 먼 거리에서 다시 사용할 수 있고 배경에 대해 명확해지는 좋은 결과의 예입니다. 도 4D 는 DNA-PAINT(오른쪽 절반)에 의해 이미지된 동일한 트랙과 비교하여 회절 제한 TIRF 이미지(왼쪽 절반)의 예입니다. 이 설정의 DNA-PAINT는 28.8 nm의 NeNA(가장 가까운 이웃 기반 분석) 정밀도를 생성합니다.
그림 1: 접착 발자국 분석기의 실험 워크플로우입니다. (A) 유동 셀 및 유량 챔버의 조립. (B) 표면 패시베이션 및 기능화. 각 잠복단계는 지속 시간으로 표시되고 세척 단계가 뒤따릅니다. (C) 세포 압연 실험 및 이미징. 표면에 압연하는 세포는 접착 작용이 형성되는 DNA의 압축을 풀고 각 접착 이벤트의 위치를 표시하는 표면에 ssDNA를 남깁니다. 표면은 광범위한 영역 이미징을 위해 영구 이미저 ssDNA로 표시되어 세척하기 전에 2 분 염색이 필요합니다. 초해상도 DNA-PAINT 이미징의 경우 이미저 가닥이 완충제에 보관됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 바이오 컨쥬게이션 특성화. (A) NI-NTA 정제 바이오 컨쥬게이션 생성물(blue)과 커브 핏(red)의 UV-VIS 흡광도는 컨쥬게이션 비율을 결정한다. ProtG(마젠타), 말-ssDNA(녹색), 이미다졸(gray)의 흡수 스펙트럼은 제품 스펙트럼(blue)에 가장 적합한(red)를 만드는 성분으로 사용되었다. 핏의 잔여물은 검은 색 파선으로 표시됩니다. 이를 통해 정제된 생체 경련 제품 및 어금니 비율에서 ProtG 및 ssDNA의 농도를 확인할 수 있습니다. (b) 바이오 컨쥬게이션 절차에서 성분의 네이티브 페이지. 첫 번째 차선은 저분자 DNA 사다리 (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp)를 나타낸다. 젤 이미지는 거짓 색이며, DNA 염색 GelGreen은 녹색으로, 쿠마시 블루 단백질 얼룩 (역) 마젠타에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 광범위한 영역 이미징의 이미지 처리 및 대표적인 결과. (A) 광범위한 영역을 tiling 원시 TIRF 이미지의 수천. (B) 원시 이미지에서 파생된 일루미네이션 프로파일. (C) 조명 프로파일을 평평하게 하여 이미지를 수정했습니다. (D) 원시 이미지 타일에서 스티치 이미지. 고르지 않은 조명 프로파일은 이미지의 주기적인 패턴으로 볼 수 있습니다. 파란색과 빨간색 상자는 평균 강도 프로파일이 투영되는 이미지 섹션(파란색 및 빨간색 추적)을 나타냅니다. 평균 강도 값(임의 단위)은 8비트 이미지(0-255)를 나타냅니다. (E) (D)와 동일한 영역이지만 평평한 이미지를 사용하여 스티치됩니다. 프로젝션에는 대규모 주기패턴이 표시되지 않습니다. (F) 전단 응력 프로파일은 실험에서 세포 압연 및 항복 형광 트랙을 초래하는 전단 응력의 범위를 결정한다. (G) (F)에 도시된 유동 프로파일 하에서 단일 세포로부터의 샘플 형광 트랙. 세포는 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하며, 전단 응력이 증가하면 세포가 더 이상 압연을 유지하고 표면에서 분리할 수 없을 때까지 형광 강도가 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표적인 최적이 아닌 최적의 결과. (A) 콘트라스트가 부족한 형광트랙의 예. (b) 과도한 형광선 밀도의 예. (C) 최적의 트랙 밀도와 대비의 예입니다. 세 개의 이미지는 모두 동일한 상태로 획득되어 평평해지고 바느질되었습니다. 각 이미지의 빨간색 상자는 강도 투영(오른쪽)을 촬영한 영역을 나타냅니다. (D) 회절 제한(왼쪽 절반) 및 DNA-PAINT(오른쪽 절반) 이미징에 도시된 형광 트랙. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 문제 | 가능한 이유 | 용액 | |
| 에폭시 테이프가 제대로 절단되지 않음 | 에폭시 층이 너무 두껍다 | razer 블레이드로 가능한 한 에폭시 층을 얇게 | |
| 레이저 조각기 전력 및 속도 최적화 되지 않은 | 레이저 조각기 의 출력과 속도 최적화 | ||
| 유동 챔버 의 측면에 붙어 거품 | 부적절한 초기 액체 도입 | 높은 유량의 채널을 통해 버퍼 솔루션을 밀어 거품을 씻어 | |
| 거품이 유동 챔버를 통과합니다. | 입구와 콘센트를 통한 부적절한 액체 도입 | 피펫 팁과 입구 사이의 액체-액체 접촉을 보장하기 위해 입구 튜브에 액체 물방울이 있는지 확인하십시오. | |
| 주사기의 거품이 흐름선에 들어갔습니다. | 주사기 펌프를 기울여 플런저 끝에 거품이 갇히도록 합니다. | ||
| 액체는 채널을 입력 할 수 없습니다 | 너무 꽉 에 나사 입구 | 씰을 최적화하려면 조정합니다. 입구 튜브는 제대로 나사 때 채널 오프닝을 터치해야합니다. | |
| 채널 누설 | 에폭시는 완전히 치료되지 않았습니다. | 채널을 다시 만들고, 5분 빠른 경화 에폭시를 사용하고, 최소 1h에 대해 치료할 수 있도록 하십시오. | |
| 입구가 제대로 밀봉되지 않음 | 씰 최적화를 위해 조정 | ||
| 세포가 붙어 | 불쌍한 PEGylation은 비특이적 결합으로 이어진다. | 이상적으로, 못을 리메이크. 또한 추가 차단제(BSA 및 Tween-20)를 배양하고 블로킹제를 추가하여 버퍼를 세척할 수 있습니다. | |
| 채널을 통과하는 큰 기포에 의해 파괴된 표면 통과 | 채널을 통해 거품이 발생하지 않도록 | ||
| 셀 문제 | 냉동에서 세포 배양을 다시 시작한 후 2 주 후에 HL-60을 사용하십시오. P-selectin만으로 제어 표면에 셀 롤링을 확인합니다. | ||
| 세포는 표면과의 희소한 상호 작용을 하지 않거나 | P-selectin 밀도가 너무 낮기 때문에 표면 기능화가 불량하거나 생체 경련이 좋지 않습니다. | 먼저, ProtG-TGT 대신 ProtG-biotin을 사용하여 생체 경련 또는 표면 비오틴 밀도에 의한 문제가 있는지 여부를 결정합니다. 바이오 경련 품질 과 표면 비오틴 밀도를 보장 한 후, TGT-ProtG 및 P-selectin-Fc 농도 및 잠복시간을 증가시면 증가합니다. | |
| 세포는 굴러 가지만 형광 트랙을 생성하지 않습니다. | TGT 파열에 너무 약한 접착 상호 작용 | 롤링 실험 중에 유량을 증가하여 상호 작용 력을 증가시다. 안정적인 압연 및 형광 트랙을 모두 생성하는 최적의 유속속도를 찾기 위해 초기 램프 업 유량 프로파일(그림 3F)을 권장합니다(그림 3G) | |
| 품질이 좋지 않은 표면은 높은 배경 형광과 트랙을 볼 수있는 불충분한 대비로 이어집니다. | 표면 통과 확인 | ||
표 1: 문제 해결. 표에는 이 분석법을 수행할 때 발생하는 문제에 대한 가능한 이유 및 해결 방법
추가 코딩 파일 1: 이전에 수집된 세 가지 스펙트럼(ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA 비드 용출 버퍼)을 기반으로 최종 제품 스펙트럼을 분해하기 위한 맞춤형 MATLAB 스크립트는 ProtG에서 ssDNA에 대한 ProtG의 결합 효율 과 비율을 결정합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
접착 발자국 분석은 세포 압연 접착 시 PSGL-1과 P-selectin 사이의 분자 접착 이벤트를 시각화할 수 있습니다. 이 과정은 P-selectin 매개 캡처에 의해 시작되며 유체 전단 응력하에서 압연됩니다. 실험 도중 잠재적인 문제점은 일반적으로 세포가 잘 굴러도 가난한 세포 압연 또는 누락된 형광 선트랙을 관련시킵니다. 이러한 문제는 문제 해결 테이블(표 1)에 나열된 프로토콜의 중요한 단계에서 품질 제어로 인해 발생하는 경우가 많습니다.
표면 준비는 여러 단계를 수반하기 때문에 생체 분자 및 완충체는 오염을 방지하기 위해 4 °C에서 필터링하고 저장해야합니다. 고품질 표면 패시베이션은 적절한 표면 기능화 밀도를 달성하고 생체 분자의 비특이적 결합을 감소시키는 요구 사항입니다. 표면에 생체 분자의 비특이적 결합은 단일 분자 형광 화상 진찰 및 통계 데이터 분석을 방해하는 높은 형광 배경을 만들 수 있습니다. 여러 요인이 표면 통과에 영향을 줄 수 있습니다. 아미노살란과 PEG-NHS의 가수 분해는 PEGylation의 훨씬 낮은 효율을 산출합니다. 충분한 KOH 세척 및 피라냐 세척은 유리 표면에 무료 하이드록실 그룹을 생성하여 수성성을 향상시켜 화학적 반응성 그룹의 밀도를 증가시킵니다. 세포는 제대로 통과된 표면에 붙어 있을 것입니다. 표면 패시빙의 품질은 형광 생체 분자를 사용하여 PEGylation 전후의 배경 형광 강도를 측정하여 검사됩니다.
리간드의 표면 밀도는 PEG-biotin 비율, TGT 혼성화 및 P-selectin 결합에 의해 제어되는 세포 압연을 위한 중요한 요소입니다. 이 시스템에서, PEG: PEG-비오틴 비 20:1은 세포 압연에 대한 충분한 P-selectin을 가진 표면 기능화를 위해 충분합니다. 효율적인 TGT 혼성화는 또한 형광 선로의 표면 밀도및 신호 대 잡음 비율을 향상시킵니다. 이 프로토콜에는 실험 전에 비혼화된 TGT 바닥 가닥이 보완되도록 하는 최상위 스트랜드-TGT-ProtG의 보충 단계가 포함되어 있습니다. ProtG에 DNA의 결합은 또한 표면 밀도에 영향을 미칩니다. Sulfo-SMCC 링커는 모든 DNA가 링커와 반응하도록 10배 의 어과량으로 DNA에 첨가되었습니다. C-종기에서 단일 시스테인 잔류물(ProtG-Cys)을 사용한 프로트G는 1:1 DNA: ProtG 컨쥬게이션 비율을 달성하는 데 사용되었다. ProtG-Cys는 이황화물 결합을 통해 디머를 형성할 수 있기 때문에, TCEP의 처리는 황화물 건조-반응 교차 연결 반응 의 앞에 이황화물 결합을 감소시키기 위하여 필요합니다. 단백질-컨쥬게이션 된 DNA와 TGT 혼성화는 원점 DNA와 DNA 듀플렉스가 분자량의 증가로 인한 지연 된 이동성을 보여주는 네이티브 PAGE 분석을 통해 검증 될 수 있습니다. 조립 효율은 겔 밀도(도 2B)에 의해 추정될 수 있다. 신중한 PEGylation 및 바이오 컨쥬게이션 공정은 일관된 표면을 생성하는 데 매우 중요합니다. 때때로, 세포 상태는 세포 압연 및 트랙 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 세포 밀도에 대한 PSGL-1 발현은 보고되지 않았지만, 세포 밀도는 성장 단계 동안 세포 주기 및 단백질 발현의 강력한 조절제이다.
PSGL-1은 또한 신호 유도 수용체로서 기능하고 세포 증식을 조절한다는 점을 감안할 때, 세포 밀도와 같은 배양 조건은 PSGL-1의 일관된 발현 수준 및 결합 능력을 위해 유지된다. ProtG가 표면에 중재한 P-selectin-Fc의 부착은 세포의 접착 및 압착에 매우 중요합니다. ProtG에 P-selectin의 결합 운동은 농도에 따라 달라집니다. P-셀렉틴의 농도가 낮을 경우 평형에 도달하는 시간이 증가합니다. 100 nM22 보다 낮은 농도에 대한 포화 바인딩에 최소 30분이 필요합니다. P-selectin의 10 nM은 ProtG와의 충분한 상호 작용을 위해 표면에 비특이적 결합을 감소시키고 인큐베이션 시간을 증가시키는 데 사용되었습니다. 1 h 인큐베이션은 이 시스템에서 세포 접착 및 압연을 유도하기에 충분한 시간입니다.
TGT와 해당 힘 의존 수명은 이 분석 결과의 중요한 요소입니다. 압연 접착 중에 밧줄의 힘은 TGT와 P-셀렉틴: PSGL-1 상호 작용을 통해 전달됩니다. 이러한 각 개별 구성 요소는 고유한 힘 의존 수명을 가지며, 적용된 힘에 따라 파열 확률은 다른 구성 요소보다 하나를 선호합니다. 예를 들어, 본 문서에 설명된 TGT를 사용할 때, 13.6 pN 이하의 힘에서 P-selectin: PSGL-1은 주로 해리되는 반면, 13.6 pN 이상, TGT는 주로 해리13을 나타내고 있다. 전단 응력이 너무 낮거나 구슬이 너무 느리게 굴러가는 경우 파열 이벤트가 주로 P-selectin: PSGL-1 상호 작용이 될 것이고 TGTs에서 측정 가능한 형광 신호가 최소하거나 없을 것이기 때문에이 분석작업을 수행 할 때 이해하는 것이 중요합니다. TGT의 장력 임계값도 결과에 영향을 미칩니다. TGT가 힘이 너무 높게 파열되면 파열 이벤트는 주로 P-selectin: PSGL-1이며, 최소한의 형광 신호가 있을 것입니다.
여기서 설명된 방법은 압연 접착에 관여하는 분자 접착 력뿐만 아니라 분자 파열력의 분석을 허용한다. 접착의 실시간 검출 대신, 이 방법의 가장 중요한 장점은 실험 후 이미징 및 분석을 허용한다는 것입니다. 접착 발자국이 ssDNA의 형태로 표면에 남아 있으면, 흐름 채널이 건조를 방지하기 위해 막힌 어두운 습도 챔버에서 4 °C 냉장고에서 유동 채널을 유지하면 트랙은 여전히 12 시간 후에 이미지를 이미지화 할 수 있습니다. 이 분석법에 대한 형광 판독의 해석은 선택한 이미징 방법에 의존한다. 초해상도 이미징을 통해 이 분석은 파열된 TGTs13의 밀도를 정량적 분석할 수 있는 높은 공간 해상도(<50 nm)를 달성합니다. 수용체 밀도 또는 파열된 TGT 밀도의 분석은 다른 조건하에서 압연 접착 동작을 조사하는 데 유용할 것이다. 반대로, 회절 제한 이미징은 높은 공간 해상도를 제공하지 않습니다. 그러나, 넓은 표면적을 이미지화하여 수백 개의 뷰 필드에 걸쳐 여러 구슬의 형광 트랙을 분석할 수 있습니다. 이는 트랙의 형광 강도가 시간이 지남에 따라 압연 동작의 변화에 대한 정보를 제공하는 먼 거리에서 단일 비드에 대해 분석될 수 있기 때문에 유리하다. 이러한 예는 시간이 지남에 따라 전단 응력을 변화시키고 형광 강도의 해당 변화를 관찰하는 것이다. 최근에는 간단한 모델을 통해 트랙의 형광 강도를 사용하여 분자력 분포를 추정할 수 있는 것으로 나타났다. 또한 이 assay23을 사용하여 강제 정량화를 달성하기 위한 비율 측정 방법의 잠재적 적용도 있습니다.
세포 압연이 급속히 일어나기 때문에(10분의 1μm/s) 및 장거리(1000분의 1)를 통해 분자 장력을 연구하는 것은 전통적인 실시간 분자 장력 센서로 어려움을 겪고 있습니다. 접착 발자국 분석은 이벤트 후 이미징을 허용하기 위해 이 까다로운 제약 조건을 어기고 중단합니다. TGT 파열 사건은 파열 이전에 경험한 긴장의 크기를 직접 보고하지는 않지만, 형광 트랙의 분석에서 유망한 발전이 이루어졌으며, 이는 압착에 관련된 분자력의 정량적 조사를 가능하게 하였다13,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 캐나다 혁신 재단 (CFI 35492), 캐나다 디스커버리 그랜트의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (RGPIN-2017-04407), 연구 기금의 뉴 프론티어 (NFRFE-2018-00969), 건강 연구를위한 마이클 스미스 재단 (SCH-2020-0559), 및 브리티시 컬럼비아 대학의 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
