Summary
Denne protokollen presenterer eksperimentelle prosedyrer for å utføre vedheft fotavtrykk analysen for å avbilde vedheft hendelser under rask celle rullende vedheft.
Abstract
Rullende vedheft, tilrettelagt av selectin-medierte interaksjoner, er en svært dynamisk, passiv motilitet i å rekruttere leukocytter til betennelsesstedet. Dette fenomenet forekommer i postkapillære venuler, hvor blodstrømmen skyver leukocytter i en rullende bevegelse på endotelcellene. Stabil rulling krever en delikat balanse mellom vedheftsbindingsdannelse og deres mekanisk drevne dissosiasjon, slik at cellen forblir festet til overflaten mens den ruller i strømningsretningen. I motsetning til andre vedheftsprosesser som forekommer i relativt statiske miljøer, er rullende vedheft svært dynamisk når rullecellene beveger seg over tusenvis av mikroner ved titalls mikron per sekund. Følgelig er konvensjonelle mekanobiologimetoder som trekkraftmikroskopi uegnet til å måle de enkelte vedheftshendelsene og de tilknyttede molekylære kreftene på grunn av den korte tidsskalaen og høy følsomhet som kreves. Her beskriver vi vår siste implementering av adhesjonsfotavtrykkanalysen for å avbilde P-selectin: PSGL-1-interaksjoner i rullende vedheft på molekylært nivå. Denne metoden benytter irreversible DNA-baserte spenningsmålere for å produsere en permanent historie med molekylære vedheftshendelser i form av fluorescensspor. Disse sporene kan avbildet på to måter: (1) sy sammen tusenvis av diffraksjonsbegrensede bilder for å produsere et stort synsfelt, noe som muliggjør utvinning av vedheftsfotavtrykk for hver rullende celle over tusenvis av mikroner i lengde, (2) utfører DNA-PAINT for å rekonstruere superoppløselige bilder av fluorescenssporene innenfor et lite synsfelt. I denne studien ble adhesjonsfotavtrykksanalysen brukt til å studere HL-60-celler som rullet på forskjellige skjærspenninger. Ved å gjøre det var vi i stand til å se for oss den romlige fordelingen av P-selectin: PSGL-1-interaksjonen og få innsikt i deres molekylære krefter gjennom fluorescensintensitet. Dermed gir denne metoden grunnlaget for den kvantitative undersøkelsen av de ulike celleoverflateinteraksjonene som er involvert i rullende vedheft på molekylært nivå.
Introduction
Den rullende vedheftkaskaden beskriver hvordan sirkulerende celler tether til og ruller langs blodkarveggen1. Passiv rulling formidles primært av selectins, en stor klasse av cellulære vedheftsmolekyler (CAMs)1. Under skjærstrømmen av blod danner leukocytter som uttrykker P-selectin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1) svært forbigående bindinger med P-selectin, som kan uttrykkes på overflaten av betente endotelceller. Denne prosessen er kritisk for leukocytter å migrere til et sted med betennelse2. I tillegg er PSGL-1 også en mekanosensitiv reseptor som er i stand til å utløse det påfølgende faste vedheftsstadiet av den rullende vedheftkaskaden ved sitt engasjement med P-selectin3.
Genetiske mutasjoner som påvirker CAM-funksjonen kan ha stor innvirkning på immunforsvaret, for eksempel ved den sjeldne sykdommen leukocyttadhesjonsmangel (LAD), der funksjonsfeil i vedheftmolekyler som formidler rullende fører til alvorlig immunkompromitterte individer4,5,6. I tillegg har sirkulerende tumorceller vist seg å migrere etter en lignende rulleprosess, noe som fører til metastase7,8. Men fordi cellerulling er rask og dynamisk, er konvensjonelle eksperimentelle mekanobiologimetoder uegnet til å studere molekylære interaksjoner under cellerulling. Mens enkeltcellede og enkeltmolekylelle manipulasjonsmetoder som atomkraftmikroskopi og optisk pinsett var i stand til å studere molekylære interaksjoner som P-selectins kraftavhengige interaksjon med PSGL-1 på enkeltmolekylnivå9, er de uegnet til å undersøke levende vedheftshendelser under cellerulling. I tillegg kan interaksjonen karakterisert in vitro ikke svare direkte på spørsmålet om molekylær vedheft in vivo. For eksempel, hvilket molekylært spenningsområde er biologisk relevant når celler fungerer i sitt opprinnelige miljø? Beregningsmetoder som limdynamikksimulering10 eller enkel steady-state model11 har fanget visse molekylære detaljer og hvordan de påvirker rullende oppførsel, men er svært avhengige av nøyaktigheten av modelleringsparametrene og antagelsene. Andre teknikker som trekkraftmikroskopi kan oppdage krefter under cellemigrering, men gir ikke tilstrekkelig romlig oppløsning eller kvantitativ informasjon om molekylær spenning. Ingen av disse teknikkene kan gi direkte eksperimentelle observasjoner av den tidsmessige dynamikken, romlig fordeling og størrelsen heterogenitet av molekylære krefter, som direkte relaterer seg til cellefunksjon og oppførsel i sitt opprinnelige miljø.
Derfor er implementering av en molekylær kraftsensor som er i stand til nøyaktig måling av selectin-medierte interaksjoner avgjørende for å forbedre vår forståelse av rullende vedheft. Her beskriver vi protokollen for adhesjonsfotavtrykket assay12 der PSGL-1 belagte perler rulles på en overflate som presenterer p-selectin funksjonaliserte spenningsmålerte tthers (TGTs)13. Disse TGTene er irreversible DNA-baserte kraftsensorer som resulterer i en permanent historie med bruddhendelser i form av fluorescensavlesning. Dette oppnås gjennom rupturing av TGT (dsDNA) og deretter etterfølgende merking av ruptured TGT (ssDNA) med en fluorescerende merket komplementær tråd. En stor fordel med dette systemet er kompatibiliteten med både diffraksjonsbegrenset og superoppløsningsavbildning. Den fluorescerende merkede komplementære tråden kan enten være permanent bundet (>12 bp) for diffraksjonsbegrenset avbildning eller forbigående bundet (7-9 bp) for bildebehandling med superoppløsning gjennom DNA PAINT. Dette er et ideelt system for å studere rullende vedheft da TGT-ene brister under aktiv rulling, men fluorescensavlesningen analyseres etter rulling. De to avbildningsmetodene gir også brukeren mer frihet til å undersøke rullende vedheft. Vanligvis er diffraksjonsbegrenset avbildning nyttig for å trekke ut molekylær bruddkraft gjennom fluorescensintensitet13, mens superoppløsningsavbildning gir kvantitativ analyse av reseptortetthet. Med evnen til å undersøke disse egenskapene til rullende vedheft, gir denne tilnærmingen en lovende plattform for å forstå kraftreguleringsmekanismen på molekylær vedheft av rullende celler under skjærstrøm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oligonukleotid merking og hybridisering
- Reduksjon av protein G disulfidbindinger
- Løs opp 10 mg Protein G (ProtG) i 1 ml ultrarent vann.
MERK: Protein G her er modifisert med en enkelt cysteinrester ved C-terminus og en N-terminus poly-histidin tag. - Bufferutveksling ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) til 1x PBS (pH 7,2) med en P6-kolonne.
- Mål proteinkonsentrasjonen etter bufferutveksling.
MERK: Typisk konsentrasjon på 7-8 mg/ml. - Forbered 120 mM Tris(2-karboksyetyl)fosfin (TCEP) ved å oppløse 3 mg TCEP i 90 μL 1x PBS (pH 7,2) etterfulgt av 10 μL 0,5 M EDTA.
MERK: TCEP skal være nytilberedt. - Tilsett 4 μL 120 mM TCEP (480 nmol) til 20 μL ProtG (4-5 nmol).
MERK: Sikt på et molarforhold på ~ 100: 1 TCEP til protein. - La reaksjonen fortsette i 30 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern overflødig TCEP fra den reduserte ProtG med en P6-kolonne (buffer byttet i 1x PBS, pH 7.2).
- Mål konsentrasjonen av det reduserte ProtG med et UV/Vis spektrofotometer og lagre spektraet.
MERK: Typisk konsentrasjon på 3,5-4,5 mg/ml.
- Løs opp 10 mg Protein G (ProtG) i 1 ml ultrarent vann.
- Amine-merket ssDNA-reaksjon med Sulfo-SMCC
- Løs opp amine-merket ssDNA (amin-ssDNA) i nukleasefritt vann til en konsentrasjon på 1 mM. Kontroller strandkonsentrasjonen med uv/vis spektrofotometer.
- Forbered 11,5 mM sulfo-SMCC (en hetero-bifunksjonell krysskobling med sulfo-NHS ester og maleimid) oppløsning frisk ved å oppløse 2 mg sulfo-SMCC i 400 μL ultrarent vann og virvel å blande.
- Tilsett 6 μL av 1 mM amin-ssDNA (6 nmol) til 5,2 μL 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) og 88,8 μL 1x PBS (pH 7,2). Virvel i 5 s etterfulgt av sentrifugering ved 8600 x g i 3 min.
- La reaksjonen fortsette i 30 minutter ved RT.
- Fjern overflødig sulfo-SMCC fra SMCC-konjugert amin-ssDNA (mal-ssDNA) med en P6-kolonne (buffer byttet i 1x PBS, pH 7.2).
- Mål konsentrasjonen av mal-ssDNA med uv/vis spektrofotometer og lagre spektraet.
MERK: Typisk konsentrasjon på 35-45 μM.
- ProtG-ssDNA-konjugering
- Tilsett 21 μL 4,5 mg/ml redusert ProtG (3 nmol) til mal-ssDNA (~4-5 nmol).
MERK: Volumer og konsentrasjoner her er typiske verdier. Juster i henhold til individuell eksperimentell måling. Sørg alltid for en overflødig mengde mal-ssDNA over ProtG med et forhold på ~ 1,5: 1. - Virvel i 5 s og la reaksjonen fortsette i 3 timer ved RT.
- Tilsett 21 μL 4,5 mg/ml redusert ProtG (3 nmol) til mal-ssDNA (~4-5 nmol).
- ProtG-ssDNA rensing og karakterisering
- Rens de konjugerte ProtG-ssDNA gjennom hans tag-isolasjon med magnetiske nikkel-nitrilotriacetiske syre (Ni-NTA) perler.
- Fjern overflødig imidazol (Ni-NTA elutionbuffer) fra produktet med en P6-kolonne (buffer byttet i 1x PBS, pH 7.2).
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å kvantifisere konjugeringen, da imidazol har betydelig absorpsjon ved 280 nm. - Bruk uv/vis spektrofotometer for å registrere spektraet til produktet ProtG-ssDNA samt Ni-NTA elution buffer (1x).
MERK: Typisk ProtG-ssDNA-absorbans ved henholdsvis 260 nm og 280 nm er henholdsvis 0,8 og 0,6. - For å bestemme konjugeringseffektiviteten og forholdet mellom ProtG og ssDNA, bruk det spesialskrevne MATLAB-skriptet (Supplemental Coding File 1) for å dekomponere det endelige produktspekteret basert på de tre spektraene som er samlet tidligere (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer).
MERK: Kort sagt fungerer koden som beskrevet i trinn 1.4.5-1.4.8. Den typiske konsentrasjonen er 4 μM ProtG-ssDNA med ProtG og ssDNA ved et ~1:1 molarforhold (figur 2A). - Input ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer, og ProtG-ssDNA UV/Vis spektra i MATLAB-skriptet
- Utfør en flerdimensjonal ubegrenset ikke-lineær minimering for å rekonstruere ProtG-ssDNA-spektraet fra kildespektraet (ProtG, SMCC-strand og Ni-NTA bead elution buffer spectra)
MERK: Minimeringsfunksjonen gir tre transformasjonsfaktorer, én for hvert kildespektra. - Rekonstruer ProtG-ssDNA-spektraet ved å multiplisere spektraet med tilsvarende faktor og kombinere det transformerte kildespektraet.
- Multipliser den første konsentrasjonen av ProtG og SMCC-tråden med de tilsvarende transformasjonsfaktorene for å bestemme konsentrasjonene av SMCC-tråd og ProtG i ProtG-ssDNA-produktet.
- (VALGFRITT) Kjør opprinnelig SIDE i henhold til figur 2B for å sikre at hver komponent og hvert trinn fungerer som forventet.
- TGT hybridisering
- Hybridiser ProtG-ssDNA (toppstreng) med biotinylert bunnstreng med et molarforhold på 1,2: 1 med konsentrasjoner på henholdsvis 240 nM og 200 nM i T50M5 buffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) for å hybridisere hele TGT-konstruksjonen. La hybridisere ved RT ≥1 t.
2. Overflate PEGylering
- Overflaterengjøring
- Rengjør en Erlenmeyer kolbe og to fargeglass for hver 8 dekslerlips. Fyll hver beholder med 1 M KOH-oppløsning og soniker i 1 time ved RT. Vask hver beholder grundig med ultrarent vann og tørk med N2 eller i en ovn.
MERK: Fyll KOH til toppen for å berøre lokket, slik at de også rengjøres. - Skyll hver deksleslip grundig med ultrarent vann og legg dem i en av de rensede fargeboksene.
MERK: Pass på at de ikke sitter fast i hverandre eller veggen på fargeboksene. - I en avtrekkshette, forbered en piranha-løsning ved å tilsette 30 ml hydrogenperoksid (30%) til 90 ml konsentrert (95% -98%) svovelsyre i et 250 ml beger.
FORSIKTIG: Konsentrert svovelsyre er svært etsende. Tilsett hydrogenperoksidet veldig sakte til svovelsyren og virvle forsiktig for å blande. - Senk dekslene helt ned i fargeboksen med piranha-løsningen. La dekslene ligge i piranha i 30 min i avtrekkshetten.
FORSIKTIG: Avkjøl piranha-oppløsningen til ikke mer enn 80 °C før helling for å unngå å knekke fargekannen. - Kast piranha-oppløsningen i et 1000 ml beger og nøytraliser med 1 M KOH fra glassrengjøring.
- (VALGFRITT) Gjenta piranha rengjøring (trinn 2.1.3-2.1.5) med en frisk piranha-løsning.
- Skyll dekslene med store mengder ultrarent vann for å fjerne all gjenværende piranha-løsning. Rist forsiktig fargekannen under hver stigning for å lette fjerningen (10 skyll anbefales).
- Skyll dekslene med metanol 3 ganger for å fjerne vann fra dekslene og hold dekslene nedsenket i metanol.
- Rengjør en Erlenmeyer kolbe og to fargeglass for hver 8 dekslerlips. Fyll hver beholder med 1 M KOH-oppløsning og soniker i 1 time ved RT. Vask hver beholder grundig med ultrarent vann og tørk med N2 eller i en ovn.
- Overflatesilanisering
- Forbered en 1% aminosilaneløsning ved å blande 94 ml metanol, 1 ml aminosilane og 5 ml issyre i den rensede og tørkede Erlenmeyer-kolben. Hell i den andre rengjorte og tørkede fargingsburken14.
- Overfør dekslene nedsenket under metanoloppløsningen til fargeboksen som inneholder 1% aminosilaneoppløsning og hold krukken dekket.
MERK: Ikke la dekslene tørke under overføring til aminosilane for å begrense glassoverflateeksponeringen for luft. - Inkuber fargekannen som inneholder deksler i aminosilane i 1 time ved 70 °C i en ovn15.
- Kast forsiktig aminosilaneoppløsningen i en separat avfallsbeholder og skyll dekslene i fargekannen med metanol 5 ganger for å fjerne aminosilaneoppløsningen.
- Skyll dekslene i fargeboksen med ultrarent vann 5 ganger og tørk dem med N2.
- Stek de tørkede dekslene i fargeboksen i en ovn ved 110 °C i 20 minutter. La dekslene avkjøles til RT, og plasser dem deretter på PEGylation-stativet.
MERK: Dekk fargekannen med et lokk under stekingen for å minimere bestemt og kjemisk avsetning på overflaten15.
- PEG-løsningsforberedelse
- Tine PEG (polyetylenglykol) og PEG-biotin til RT i ca. 30 min.
MERK: Dette trinnet minimerer fuktkondensasjon som kan forringe NHS-esteren på PEG. - Lag PEG buffer ved å tilsette 84 mg natriumbikarbonat til 10 ml ultrarent vann. Denne formuleringen bør gi en buffer ved pH 8.4.
- For 8 deksler, hver med en PEGylated side med 20:1 PEG:PEG-biotin: mål 100 mg PEG og 5 mg PEG-biotin for å legge til 400 μL PEG-buffer. Virvel løsningen for 30 s og sentrifuge i 1 min ved maksimal hastighet (≥18000 x g).
MERK: Dette trinnet er tidssensitivt, da SVA NHS-ester hydrolyse starter umiddelbart og har en halveringstid på 34 min ved pH 8.0, med kortere halveringstid ved pH 8.4.
- Tine PEG (polyetylenglykol) og PEG-biotin til RT i ca. 30 min.
- PEG inkubasjon og coverlip lagring
- Sett opp fuktighetskammeret og plasser dekslene inni.
- Tilsett 90 μL PEG-oppløsning til en dekslelip i fuktighetskammeret og legg en ekstra dekslelip på toppen av PEG-løsningen ved hjelp av dekslerlip holder pinsett for å jevnt spre PEG-løsningen.
- Pass på at det ikke er noen bobler i oppløsningen som faller på dekslene. Senk den ene enden av den andre dekslen på den første dekslen og slipp sakte den andre enden slik at det ikke er noen bobler mellom dekslene.
MERK: Bobler vil føre til at visse områder blir dårlig PEGylated. - Gjenta til alle deksler har PEG (dvs. 8 deksler = 4 PEG-smørbrød). Inkuber PEG-løsningene over natten (~12 h) ved RT i et fuktighetskammer i mørket16.
- Skill dekslene og legg dem i en fargekanne. Legg merke til PEGylated-sidene.
- Skyll dekslene grundig med ultrarent vann og tørk med N2.
MERK: Hold dekslene med pinsett og blås N2 over overflaten mot pinsett for å hindre at forurensninger tørker på overflaten. - Merk den ikke-PEGylatede siden med en prikk i et hjørne ved hjelp av en permanent markør eller en diamantpenn.
- Plasser 2 PEGylated coverlips i mailerrør med PEGylated-sidene vendt mot hverandre for å identifisere PEGylated-siden før bruk.
- Støvsug røret i 5 min og fyll på nytt med N2. Forsegle røret med parafilm.
- Oppbevar PEGylated coverlips ved -20 °C i de forseglede mailerrørene i opptil 6 måneder.
MERK: Varm lagringsrørene til RT før sponmontering. Kondens på dekslene under tetning vil føre til lekkasje.
3. Forberedelse av strømningskammer
- Brikkemontering
- Spred en liten mengde epoksy på begge sider av dobbeltsidig tape med et barberblad.
MERK: For mye epoksy kan spre seg inn i kanalen under montering. - Laserkuttet epoksybelagt tape for å lage 4 kanaler. Lag strømningsbrikken ved å smøre epoksytapen mellom en 4-hulls sklie og PEG-deksler (figur 1A).
- Bruk en pipettespiss til å påføre forsiktig trykk langs lengden på kanalene for å skape en god forsegling. Herd epoksyet i ≥1 time.
MERK: Ikke skjær glasset for å unngå å gli mot epoksy.
- Spred en liten mengde epoksy på begge sider av dobbeltsidig tape med et barberblad.
- Kammermontering
- Juster brikken slik at åpningen på hver kanal plasseres midt på adapteren (figur 1A). Plasser to gjennomsiktige akryl avstandsstykker på toppen av brikken, påfør fast trykk midt i blokken, og skru inn to 4-40 skruer i enden av hver avstandsstykke.
MERK: Ikke tving skruen eller trykk for hardt på avstandsstykkene, ellers kan brikken sprekke. - På den andre siden av braketten skrur du innløpene inn i de gjengede hullene. Overvåk tetningsforholdet gjennom den gjennomsiktige akrylblokken.
- Når slangen kommer i kontakt med sponåpningen, forsegler du tilkoblingen ved å vri slangen forsiktig med klokken.
MERK: Overtettede viker kan forårsake strømningsblokkering, mens løse kontakter vil forårsake lekkasje.
- Juster brikken slik at åpningen på hver kanal plasseres midt på adapteren (figur 1A). Plasser to gjennomsiktige akryl avstandsstykker på toppen av brikken, påfør fast trykk midt i blokken, og skru inn to 4-40 skruer i enden av hver avstandsstykke.
4. Overflateforberedelse
MERK: Se figur 1B for den totale arbeidsflyten.
- Blokkeringsmidler for å forhindre ikke-spesifikk binding
- Bruk en pipette til å strømme 200 μL vaskebuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 og 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) inn i kammeret for å se etter lekkasje. Hvis det dannes bobler i kanalen, trykk aggressivt ytterligere 200 μL for å fjerne boblene.
MERK: Store luftbobler som ikke fjernes på dette trinnet, kan løsne og ødelegge overflatefunksjonalisering senere. - Tilsett 40 μL BSA (1% m/v) i strømningskammeret for å forhindre ikke-spesifikk binding og inkubere i 10 minutter.
- Sørg for å legge til nok volum i løpet av hver inkubasjonsperiode for å fylle strømningskamrene og danne dråper ved innløpene og uttakene. Juster inkubasjonsvolumene tilsvarende og utfør alle inkubasjoner i et fuktighetskammer.
- Tilsett 40 μL Tween 20 (5 % v/v) i strømningskammeret. Inkuber i 10 min for ytterligere å redusere ikke-spesifikk binding.
- (VALGFRITT) Kontroller overflaten for tilstrekkelig passivisering ved å strømme polystyrenperler gjennom kanalen. Tilsett 40 μL ProtG-belagte polystyrenperler (0,01% m/v) og bilde ved hjelp av et darkfield-mikroskop med 10x mål. Hvis perler ikke fester seg til overflaten, fortsett til neste trinn.
- Vask kanalen med 200 μL vaskebuffer for å fjerne alle passivasjonsmidler.
- Bruk en pipette til å strømme 200 μL vaskebuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 og 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) inn i kammeret for å se etter lekkasje. Hvis det dannes bobler i kanalen, trykk aggressivt ytterligere 200 μL for å fjerne boblene.
- Kammer overflate funksjonalisering
- Tilsett 40 μL streptavidin (100 μg/ml) i strømningskammeret og inkuber i 20 minutter. Vask deretter med 200 μL vaskebuffer.
- Tilsett 40 μL hybridisert ProtG-TGT (100 nM) i strømningskammeret og inkuber i 20 minutter. Vask deretter med 200 μL vaskebuffer.
- Tilsett 40 μL ProtG-TGT toppstreng (100 nM) i 20 min for å fullføre enhver ukybridert TGT bunnstreng på overflaten. Vask med 200 μL vaskebuffer.
- Tilsett 40 μL P-selectin-Fc (10 μg/ml) i strømningskammeret og inkuber i 60 minutter. Vask deretter med 200 μL vaskebuffer.
MERK: Inkubasjonsvarighet er kritisk.
5. Eksperiment og avbildning
- Oppsett av flytsystem
- Fyll en 5 ml glasssprøyte med rullebufferen (HBSS med 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Pass på at det ikke er noen luftbobler i sprøyten ved å tappe sidene av sprøyten for å løsne boblene og skyve dem ut når de flyter mot spissen.
- Sett inn en steril nål (26 G, 5/8 tommers lengde) i en ~200 mm polyetylenrør (DVS: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) og koble kanylen til glasssprøyten.
MERK: Pass på at det ikke er luft i nålekontakten. - Fest sprøyten på sprøytepumpen og vipp sprøytepumpen slik at stempelsiden er forhøyet for å forhindre at luftbobler kommer inn i kanalen. Sett enden av røret inn i strømningskammerets innløp.
MERK: Sørg for væske til væskekontakt når du foretar tilkoblingen ved å deponere dråper på innløpene og ha dråper på enden av sprøyteslangen. Pass på at det ikke kommer luftbobler inn i kanalen ved å la det dannes en liten dråpe på enden av sprøyteslangen før du setter den inn i innløpet. - Sett den ene enden av ytterligere 200 mm av polyetylenslangen inn i utløpet, og den andre enden nedsenket i et avfallsbeger.
- Sette opp for cellerulling
- Vokse HL-60 celler i 25 cm2 ventilerte kulturflasker i IMDM media supplert med 20% foster bovint serum og 1% antibiotika ved 37 °C med 5% CO2. Oppretthold celletetthet mellom 1 x 105-2 × 106 celler/ml.
- (VALGFRITT) Differensier HL-60-cellene i et komplett IMDM-medium som inneholder 1,25 % DMSO ved en innledende tetthet på 2 x 105 celler/ml. Inkuber celler for å være mest aktive i 5-6 dager.
- Ta en prøve (1-2 ml) fra cellefjæringen og sentrifugen (200 x g, 3 min) for å pellet cellene.
- Fjern mediet og resuspender cellene forsiktig i 500 μL av rullebufferen. Gjenta vasketrinnet to ganger for å fjerne cellulært rusk.
- Mål celletettheten med et hemocytometer. Resuspend cellepellets med rullende buffer til en tetthet på 2 x 105 celler / ml.
- Koble slangen forsiktig fra innløpene/utløpet og pipetten 40 μL av celleopphenget inn i strømningskammeret. Koble til slangen igjen som beskrevet tidligere, sørg for at det ikke innføres bobler i strømningskanalen.
- Start cellerullingseksperimentet ved å starte sprøytepumpen ved ønsket strømningshastighet.
MERK: Intensiteten til fluorescerende spor avhenger av skjærspenningen, og lavere cellehastighet skjærspenning/cellehastighet vil vanligvis produsere dimmerspor (figur 4A). Unngå høy celletetthet på overflaten eller overdreven rullende varighet for å sikre separerbare encellede spor (figur 4B,C). - Bruk et darkfield mikroskop med et 10x mål for å sikre at cellerulling blir observert.
- Når eksperimentet er fullført, fjerner du cellene fra kanalen ved å infundere rullebufferen ved 100 ml/t til overflaten er cellefri.
- Avbildning av lokale spor ved "DNA-basert punktakkumulering for avbildning i nanoskala topografi" (DNA-PAINT)
- Tilsett 40 μL DNA-PAINT imager strand (500 pM) i DNA-PAINT buffer (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) til kanalen.
- Utfør total innvendig refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi ved hjelp av en 100x olje-nedsenking TIRF objektiv linse. Skaff deg 40000+ bilder med 25 ms eksponeringstid per ramme ved en elektron-multipliserende (EM) gevinst på 300 ved hjelp av et Elektron-multipliserende ladekoblingskamera (EMCCD).
- Bruk Picasso-programvarepakken17 til å lokalisere og gjengi bilder med superoppløsning (figur 4D) ved å følge trinn 5.3.4-5.3.5.
- Last DNA-PAINT-filmen inn i Localize-programmet for å bestemme lokaliseringen av hver fluorofor i hver ramme.
MERK: Optimaliser boksens sidelengde og Min. Net Gradient-parametere til bare fluoroforer spores nøyaktig. Min. Net Gradient parameter kan ofte gå over 100000 for å oppnå optimal sporing. Passforminnstilling: MLE, integrert gaussisk metode gir det beste resultatet. Til slutt, hvis filmen er for lang, del den i stabler på 10000 bilder for at forhåndsvisningssporingen i Localize skal fungere ordentlig før du kombinerer dem på nytt i en endelig HDF5-fil. - Last deretter den resulterende HDF5-filen inn i Render-programmet for å utføre driftkorrigering og gjengivelse.
MERK: Utfør multippel driftkorrigering via Undrift fra RCC for å forbedre sluttresultatet.
- Bilde av lange spor ved permanent merking
- Legg til den permanente imager-tråden og inkuber for 120 s i T50M5-bufferen. Vask kanalen ved å infundere 200 μL vaskebuffer.
- Ta opp et bilde med eksitasjonslaseren av for å få bakgrunnskamerastøy. Bilde et stort område i et rutenett mønster av TIRF mikroskopi.
MERK: Ramme-over-ramme overlapping av ≥10% anbefales for etterfølgende søm. - Programmer mikroskopet til å skanne over området på 400 x 50 bilder (totalt 20000 bilder). Ved hjelp av FIJI-programmet deler du rådata i individuelle TIFF-filer, som hver inneholder maksimalt 10 000 bilder.
- Slå sammen alle bilder ved hjelp av belysningsprofilen (figur 3A-C) ved å følge trinn 5.4.5-5.4.7.
- Trekk bakgrunnskamerastøyen fra hvert bilde. Få mean stack projeksjon (belysningsprofil) av hver bakgrunn-trukket ramme.
- Normaliser belysningsprofilen med maksimal verdi. Del hver bakgrunnsdelte ramme med den normaliserte belysningsprofilen.
- Skaler de korrigerte delbildene på nytt til riktig område for den tilsvarende bitdybden.
- Bruk MIST18 til å sy sammen bildene (figur 3D,E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen ovenfor beskriver den eksperimentelle prosedyren for adhesjonsfotavtrykkanalysen. Den generelle eksperimentarbeidsflyten er illustrert i figur 1, fra strømningskammerenheten (figur 1A) til overflatefunksjonaliseringen (figur 1B) og eksperiment- og bildetrinn (figur 1C).
Figur 2 er et representativt resultat for protG-ssDNA biokonjugeringskarakterisering. UV/Vis-spektraet av tre komponenter i sluttproduktet, nemlig ProtG, mal-ssDNA og imidazol elutionbuffer, ble samlet inn før den endelige konjugeringen (figur 2A), som hver tilsvarer en kjent konsentrasjon. Disse spektra danner ortogonalt grunnlag for montering til biokonjugeringsproduktspekteret, hvor de tre ukjente parametrene er deres konsentrasjoner. En tilpasset funksjon i MATLAB ble brukt til å bestemme konsentrasjonene. Resultatene viser et forhold på nesten 1:1 av ProtG til ssDNA (figur 2A). Dette er som forventet fordi ssDNA bare har en amin modifikasjon, og ProtG har en enkelt cystein konstruert på sin C-terminus. Denne tilnærmingen er mer fordelaktig for den tidligere rapporterte tilnærmingen19 ved hjelp av et enkelt tiolmodifisert DNA for å målrette mot mangfoldet av primære aminer på ProtG, hvor konjugeringsforholdet ikke lett kan opprettholdes.
I tillegg ble opprinnelig PAGE brukt til å bekrefte biokonjugeringen (figur 2B). DNA er farget av GelGreen og proteiner av Coomassie blå, henholdsvis. Ettersom GelGreen flekker dsDNA sterkere enn ssDNA, forventes det at eventuelle ssDNA-bånd er dimmere enn den like molarkonsentrasjonen av dsDNA-bånd (baner 3, 4). Fordi bestanden ProtG inneholder en C-terminal cysteinrester, danner en brøkdel av proteinene dimmere gjennom en disulfidbinding, som vist i bane 5 (figur 2B). Den reduserte ProtG, derimot, viser et enkelt bånd (lane 6). Når du bruker bestanden ProtG i DNA-konjugeringen direkte, reagerer ikke den disulfid dimeriserte ProtG på DNA-et og viser som et bånd uten gelgreenfarging (baner 7, 8). ProtG-dimerbåndet forsvinner i konjugeringsproduktet ved hjelp av redusert ProtG (bane 9, 10). Fordi et overskudd av mal-ssDNA til ProtG (1,5:1) brukes under konjugeringen, er bare TGT-bånd synlige i det endelige konjugeringsproduktet (bane 8, 10). De lyse GelGreen-båndene som sammenfaller med det monomeriske ProtG-båndet indikerer vellykket konjugering og godt utbytte.
Figur 3 illustrerer representative raw-mikroskopibilder og arbeidsflyten for å korrigere dem for senere bildesting og analyse. TIRF-belysningsprofilen introdusert fra en enkeltmodusfiber er generelt lysere midt i synsfeltet og dimmeren rundt kantene (figur 3A,B). For å kompensere for ujevn belysning og slå sammen bildene for kvantitativ analyse, ble belysningsprofilen bestemt ved å beregne gjennomsnittet av tusenvis av individuelle rammer (figur 3B). Sammenslåtte bilder ble produsert ved å trekke kamerastøyen fra både rå- og belysningsprofiler og deretter normalisere med belysningsprofilen (figur 3C). Effekten av sammenslåingen av bildet er tydelig illustrert når bildene er sydd sammen for å danne et stort bilde. Bildeintensiteten i bakgrunnsområdene uten cellespor viser klare periodiske mønstre som tilsvarer de ukorrigerte bildene (figur 3D). Det samme synsfeltet som er sydd sammen av sammenslåtte bilder, gir en flat bakgrunn (figur 3E). Å ha en flat bakgrunn er avgjørende for å tolke intensitetssvingningene langs et cellespor. Som et første eksperiment brukes en opptrappingsflytprofil som ligner den som er illustrert i figur 3F, til å bestemme omfanget av skjærspenning som passer for eksperimentet, noe som sikrer både stabil cellerulling og klare fluorescerende cellespor. Et typisk encellet vedheftsfotavtrykk under denne strømningsprofilen vises i figur 3G, der intensiteten øker etter hvert som skjærspenningen øker til cellen ikke lenger kan opprettholde rulling ved høy skjærspenning og løsne fra overflaten, og markere slutten på et enkelt spor.
Figur 4 illustrerer potensielle resultater fra suboptimale til optimale representative eksperimentelle resultater. Figur 4A illustrerer et suboptimalt utfall der fluorescerende spor har et lavt signal-til-støy-forhold. Dette skyldes sannsynligvis enten en lav overflatetetthet på de fullt konjugede sondene eller en lav strømningshastighet. Figur 4B illustrerer et annet suboptimalt utfall der fluorescerende spor er for tettpakket til å løse og isolere individuelle spor for senere analyse. Figur 4C er et eksempel på et godt resultat der individuelle spor kan løses over lang avstand og tydelige mot bakgrunnen. Figur 4D er et eksempel på det diffraksjonsbegrensede TIRF-bildet (venstre halvdel) sammenlignet med det samme sporet som er avbildet av DNA-PAINT (høyre halvdel). DNA-PAINT i dette oppsettet gir en NeNA (nærmeste nabobaserte analyse) presisjon på 28,8 nm.
Figur 1: Eksperimenter arbeidsflyt for analysen av adhesjonsfotavtrykk. (A) Montering av strømningscellen og strømningskammeret. (B) Overflate passivisering og funksjonalisering. Hvert inkubasjonstrinn er preget av varigheten, etterfulgt av et vasketrinn. (C) Cellerullingseksperiment og bildebehandling. Celler som ruller på overflaten vil pakke ut DNA-et der vedheftsinteraksjoner dannes, og etterlater ssDNA på overflaten som markerer plasseringen av hver vedheftshendelse. Overflaten er merket med den permanente imager ssDNA for omfattende arealavbildning, som krever 2 min farging før vasking. For DNA-PAINT-bildebehandling med superoppløsning oppbevarer imagerstrengen i bufferen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av biokonjugering. (A) UV-VIS-absorbans av Ni-NTA renset biokonjugeringsprodukt (blå) og kurvetilpasningen (rød) for å bestemme konjugeringsforholdet. Absorpsjonsspektraet til ProtG (magenta), mal-ssDNA (grønn) og imidazol (grå) ble brukt som komponenter for å skape den beste passformen (rød) til produktspekteret (blå). Restene av passformen vises som den svarte stiplede linjen. Dette gjør at vi kan bestemme konsentrasjonen av ProtG og ssDNA i det rensede biokonjugeringsproduktet og deres molarforhold. (B) Innfødt SIDE av komponenter i biokonjugeringsprosedyren. Det første kjørefeltet viser en DNA-stige med lav molekylvekt (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). Gelbildet er falskt farget, med DNA-farging GelGreen i grønt og Coomassie blå protein flekk (omvendt) i magenta. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bildebehandling og representative resultater fra omfattende områdeavbildning. (A) Tusenvis av rå TIRF-bilder som fliser til et omfattende område. (B) Belysningsprofil avledet fra RAW-bildene. (C) Korrigerte bilder ved å slå sammen belysningsprofilen. (D) Sydd bilde fra rå bildefliser. Den ujevne belysningsprofilen kan ses på som periodiske mønstre i bildet. De blå og røde boksene angir bildedelene der gjennomsnittsintensitetsprofilene projiseres (blå og røde spor). Gjennomsnittsintensitetsverdiene (vilkårlig enhet) representerer verdiene for 8-biters bilder (0-255). (E) Samme område som (D), men sydd sammen med sammenslåtte bilder. Framskrivingene viser ingen store periodiske mønstre. (F) Skjærspenningsprofilen som skal brukes i forsøkene for å bestemme omfanget av skjærspenninger som resulterer i cellerulling og gir fluorescensspor. (G) En prøve fluorescerende spor fra en enkelt celle under strømningsprofilen illustrert i (F). Cellen beveger seg fra venstre til høyre, fluorescensintensiteten øker etter hvert som skjærspenningen ramper opp til cellen ikke lenger kan opprettholde rullende og løsner fra overflaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative suboptimale og optimale resultater. (A) Et eksempel på fluorescerende spor med utilstrekkelig kontrast. (B) Et eksempel på overdreven fluorescerende sportetthet. (C) Et eksempel på optimal sportetthet og kontrast. Alle tre bildene ble anskaffet under samme tilstand, flatt og sydd. De røde boksene i hvert bilde representerer området der intensitetsprojeksjonene (til høyre) ble tatt. (D) Et fluorescerende spor vist i diffraksjonsbegrenset (venstre halvdel) og DNA-PAINT (høyre halvdel) avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Problem | Mulig årsak | Løsning | |
| Epoksybånd kuttes ikke ordentlig | Epoksylaget er for tykt | Tynn epoksylaget så mye som mulig med razerbladet | |
| Lasergraveringskraft og -hastighet er ikke optimalisert | Optimaliser lasergraverkraft og -hastighet | ||
| Bobler sitter fast på sidene av strømningskammeret | Feil innledende væskeintroduksjon | Skyv bufferløsninger gjennom kanalen med høy strømningshastighet for å vaske boblene ut | |
| Bobler passerer gjennom strømningskammeret | Feil væskeintroduksjon gjennom innløp og utløp | Sørg for at det er væskedråpe på innløpsslangen for å sikre væske-til-væske-kontakt mellom pipettespissen og innløpet | |
| Bobler fra sprøyten kom inn i strømningslinjen | Vipp sprøytepumpen for å sikre at boblene sitter fast i stempelenden | ||
| Væske kan ikke komme inn i kanaler | Innløp skrudd på for stramt | Juster for å optimalisere forseglingen. Innløpsslangen skal bare berøre kanalåpningen når den er skrudd ordentlig inn. | |
| Kanallekkasje | Epoksy har ikke kurert helt | Re-make kanaler, sørg for å bruke 5 min rask herding epoksy og la kurere i minst 1 time | |
| Innløpene forsegles ikke riktig | Juster for å optimalisere forseglingen | ||
| Celler som sitter fast | Dårlig PEGylering som fører til ikke-spesifikk binding | Ideelt sett, remake PEG. I tillegg kan prøve å inkubere flere blokkeringsmidler (BSA &Tween-20) og legge til blokkeringsmidler i vaskebufferen. | |
| Overflate passivisering ødelagt av store luftbobler som passerer gjennom kanalen | Sørg for at ingen bobler går gjennom kanalen | ||
| Problem med cellene | Bruk HL-60 2 uker etter omstart av cellekultur fra frossen. Bekreft cellerulling på kontrolloverflaten med bare P-selectin. | ||
| Celler har ikke eller har sparsomme interaksjoner med overflaten | P-selectin tetthet for lav, som følge av dårlig overflatefunksjonalisering og / eller dårlig biokonjugering | Bruk først ProtG-biotin i stedet for ProtG-TGT som en kontroll for å avgjøre om problemet skyldes biokonjugering eller overflatebiotintetthet. Etter å ha sikret biokonjugeringskvalitet og overflatebiotintetthet, øk TGT-ProtG og P-selectin-Fc konsentrasjons- og inkubasjonstid. | |
| Celler ruller, men produserer ikke fluorescerende spor | Adhesjonsinteraksjoner for svake til å sprekke TGT | Øk strømningshastigheten under rullende eksperiment for å øke samhandlingskraften. Vi anbefaler en innledende opptrappingsflytprofil (figur 3F) for å finne den optimale strømningshastigheten som produserer både stabile rulle- og fluorescensspor (figur 3G) | |
| Dårlig kvalitetsoverflate fører til høy bakgrunnsfluorescens og utilstrekkelig kontrast for å se spor | Kontroller overflate passivisering | ||
Tabell 1: Feilsøking. Tabellen viser mulige årsaker og løsninger på problemer som oppstår når du utfører denne analysen
Tilleggskodingsfil 1: Det spesialskrevne MATLAB-skriptet for å dekomponere det endelige produktspekteret basert på de tre spektraene som er samlet tidligere (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer) for å bestemme konjugeringseffektiviteten og forholdet mellom ProtG og ssDNA. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adhesjonsfotavtrykksanalysen muliggjør visualisering av molekylære vedheftshendelser mellom PSGL-1 og P-selectin under cellerulling. Denne prosessen er initiert av P-selectin-mediert fangst etterfulgt av rullende under fluidisk skjær stress. Potensielle problemer under eksperimentet innebærer vanligvis dårlig cellerulling eller manglende fluorescerende spor selv når cellene ruller godt. Disse problemene skyldes ofte kvalitetskontroller ved de kritiske trinnene i protokollen, som oppført i feilsøkingstabellen (tabell 1).
Biomolekyler og buffere må filtreres og lagres ved 4 °C for å forhindre forurensning fordi overflateforberedelse innebærer flere trinn. Høy kvalitet overflate passivisering er et krav for å oppnå passende overflatefunksjonalitet tetthet og redusere den ikke-spesifikke bindingen av biomolekyler. Ikke-spesifikk binding av biomolekyler til overflaten kan skape en høy fluorescensbakgrunn, som forstyrrer enkeltmolekylet fluorescensavbildning og statistisk dataanalyse. Flere faktorer kan påvirke overflate passivisering. Hydrolyse av aminosilane og PEG-NHS gir mye lavere effektivitet i PEGylering. Tilstrekkelig KOH-vask og piranha-rengjøring forbedrer hydrofilisiteten ved å generere frie hydroksylgrupper på glassoverflaten, noe som øker tettheten til den kjemisk reaktive gruppen. Celler ville bli sittende fast på dårlig passiverte overflater. Kvaliteten på overflate passivisering kontrolleres ved å måle bakgrunnsfluorescensintensitet før og etter PEGylering ved hjelp av fluorescerende biomolekyler.
Overflatetettheten til ligander er en kritisk faktor for cellerulling, som styres av PEG: PEG-biotin ratio, TGT hybridisering og P-selectin binding. I dette systemet er et PEG: PEG-biotinforhold på 20: 1 tilstrekkelig for overflatefunksjonalisering med tilstrekkelig P-selectin for cellerulling. Effektiv TGT-hybridisering forbedrer også overflatetettheten og signal-til-støy-forholdet til de fluorescerende sporene. Denne protokollen inkluderer et etterfyllingstrinn av topp-strand-TGT-ProtG for å sikre at enhver ukybridisert TGT bunnstreng kompletteres før eksperimenter. Konjugering av DNA til ProtG påvirker også overflatetettheten. Sulfo-SMCC linker ble lagt til DNA ved 10 ganger molar overskudd slik at alt DNA reagerte med linker. ProtG med en enkelt cysteinrester (ProtG-Cys) ved C-terminus ble brukt til å oppnå et 1:1 DNA: ProtG-konjugeringsforhold. Fordi ProtG-Cys kan danne dimmere gjennom disulfidbindinger, er behandling av TCEP nødvendig for å redusere disulfidbindingen før sulhydrylreaktive krysskoblingsreaksjoner. Proteinkonjugert DNA og TGT hybridisering kan valideres med innfødt PAGE-analyse, der konjugerer DNA og DNA-dupleks vil vise tilbakestående mobilitet på grunn av økningen av molekylvekt. Monteringseffektivitet kan også estimeres ved gel densitometri (figur 2B). De forsiktige PEGylerings- og biokonjugeringsprosessene er avgjørende for å produsere en konsistent overflate. Av og til kan celletilstanden påvirke cellerullingen og sporformasjonen. Selv om PSGL-1-uttrykk over celletetthet ikke er rapportert, er celletetthet en potent regulator av cellesyklusen og proteinuttrykket i vekstfasen.
Gitt at PSGL-1 også fungerer som en signaltransduksjonsreseptor og regulerer celleproliferasjon20,21, opprettholdes kulturforhold som celletetthet for konsistent uttrykksnivå og bindende evne til PSGL-1. Vedlegg av P-selectin-Fc mediert av ProtG på overflaten er avgjørende for vedheft og rulling av celler. Bindingskinetikken til P-selectin til ProtG er avhengig av konsentrasjonen. Lavere konsentrasjoner av P-selectin fører til en økning av tid til å nå likevekt. Minst 30 min kreves for metningsbinding for konsentrasjoner lavere enn 100 nM22. 10 nM P-selectin ble brukt til å redusere den ikke-spesifikke bindingen til overflaten og økt inkubasjonstid for tilstrekkelig interaksjon med ProtG. En 1 h inkubasjon er nok tid til å indusere celleadhesjon og rulle i dette systemet.
TGT og den tilsvarende kraftavhengige levetiden er en viktig faktor i resultatene av denne analysen. Under rullende vedheft overføres kraften på tetheren gjennom både TGT- og P-selectin: PSGL-1-interaksjonen. Hver av disse individuelle komponentene har en unik kraftavhengig levetid, og avhengig av den påførte kraften, vil bruddsannsynligheten favorisere den ene over den andre. For eksempel har det vist seg at når du bruker TGT beskrevet i denne artikkelen, ved krefter under 13,6 pN, P-selectin: PSGL-1 først og fremst dissosierer, mens over 13,6 pN, TGT primært dissosierer13. Dette er viktig å forstå når du utfører denne analysen fordi hvis skjærspenningen er for lav eller perlene ruller for sakte, vil bruddhendelsene først og fremst være P-selectin: PSGL-1-interaksjon, og det vil være minimal eller ingen målbart fluorescenssignal fra TGTene. Spenningsterskelen til TGT vil også påvirke resultatene. Hvis TGT brister ved for høy kraft, vil bruddhendelsene primært være P-selectin: PSGL-1, og det vil være minimalt fluorescenssignal.
Metoden beskrevet her tillater analyse av molekylære bruddkrefter, samt plasseringen av molekylære vedheftshendelser involvert i rullende vedheft. I stedet for sanntidsdeteksjon av vedheft, er den viktigste fordelen med denne metoden at den tillater avbildning og analyse etter eksperimentet. Når vedheftsfotavtrykket er igjen på overflaten i form av ssDNA, kan sporene fortsatt avbildes etter 12 timer hvis strømningskanalene opprettholdes i et 4 °C kjøleskap i et mørkt fuktighetskammer med både innløp og uttak blokkert for å forhindre tørking. Tolkningen av fluorescensavlesningen for denne analysen er avhengig av den valgte avbildningsmetoden. Gjennom avbildning med superoppløsning oppnår denne analysen høy romlig oppløsning (<50 nm) som muliggjør kvantitativ analyse av tettheten av ruptured TGTs13. Analysen av reseptortetthet eller ruptured TGT tetthet ville være nyttig for å undersøke rullende vedheft oppførsel under forskjellige forhold. Tvert imot gir diffraksjonsbegrenset avbildning ikke høy romlig oppløsning; Det gjør det imidlertid mulig å avbilde et stort overflateareal for å analysere fluorescenssporene til flere perler over hundrevis av synsfelt. Dette er fordelaktig ettersom fluorescensintensiteten til et spor kan analyseres for en enkelt perle over stor avstand som gir informasjon om endringer i rullende oppførsel over tid. Et slikt eksempel er å endre skjærspenningen over tid og observere de tilsvarende endringene i fluorescensintensiteten. Nylig har det vist seg at gjennom en enkel modell kan fluorescensintensiteten til sporene brukes til å estimere molekylkraftfordelingen13. Det er også mulig anvendelse av ratiometric metoder for å oppnå kraft kvantifisering med denne analysen23.
Fordi cellerulling skjer raskt (10-tallet av μm/s) og over en lengre avstand (1000-tallet av μm), har det vært utfordrende å studere deres molekylære spenning med tradisjonelle molekylære spenningssensorer i sanntid. Vedheftsfotavtrykksanalysen bryter denne krevende begrensningen for å muliggjøre bildebehandling etter hendelsen. Selv om TGT-bruddhendelsen ikke direkte rapporterer omfanget av spenning opplevd før brudd, er det gjort lovende utviklinger i analysen av fluorescenssporene for å muliggjøre kvantitativ undersøkelse av molekylære krefter involvert i rullende vedheft13,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) og University of British Columbia Eminence Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
