Summary
В этом протоколе представлены экспериментальные процедуры для выполнения анализа адгезионного следа для изображения событий адгезии во время быстрой клеточной скользящей адгезии.
Abstract
Скользящая адгезия, облегчаемая селектин-опосредованными взаимодействиями, представляет собой высокодинамичную, пассивную подвижность при наборе лейкоцитов к месту воспаления. Это явление происходит в посткапиллярных венулах, где кровоток толкает лейкоциты в скользящем движении по эндотелиальным клеткам. Стабильная прокатка требует тонкого баланса между образованием адгезионных связей и их механически управляемой диссоциацией, что позволяет ячейке оставаться прикрепленной к поверхности во время прокатки в направлении потока. В отличие от других процессов адгезии, происходящих в относительно статических средах, адгезия качения очень динамична, поскольку клетки качения перемещаются на тысячи микрон со скоростью десятки микрон в секунду. Следовательно, обычные методы механобиологии, такие как микроскопия силы тяги, непригодны для измерения отдельных событий адгезии и связанных с ними молекулярных сил из-за короткой временной шкалы и требуемой высокой чувствительности. Здесь мы описываем нашу последнюю реализацию анализа адгезионного следа для изображения P-селектина: взаимодействия PSGL-1 в адгезии качения на молекулярном уровне. Этот метод использует необратимые тросы натяжения на основе ДНК для получения постоянной истории событий молекулярной адгезии в виде флуоресцентных дорожек. Эти дорожки могут быть изображены двумя способами: (1) сшивание тысяч изображений с дифракционным ограничением для создания большого поля зрения, что позволяет извлекать адгезионный след каждой скользящей клетки длиной более тысяч микрон, (2) выполнение DNA-PAINT для реконструкции изображений со сверхвысоким разрешением флуоресцентных дорожек в небольшом поле зрения. В этом исследовании анализ адгезионного следа использовался для изучения клеток HL-60, катящихся при различных напряжениях сдвига. При этом мы смогли изобразить пространственное распределение взаимодействия P-селектина: PSGL-1 и получить представление об их молекулярных силах через интенсивность флуоресценции. Таким образом, этот метод обеспечивает основу для количественного исследования различных взаимодействий между клеткой и поверхностью, участвующих в адгезии качения на молекулярном уровне.
Introduction
Каскад скользящей адгезии описывает, как циркулирующие клетки привязываются к стенке кровеносного сосуда и катятся вдоль нее1. Пассивная прокатка в основном опосредована селектинами, основным классом молекул клеточной адгезии (CAMs)1. Под сдвиговым потоком крови лейкоциты, экспрессирующие Р-селектин гликопротеин лиганд-1 (PSGL-1), образуют высокопреходящие связи с Р-селектином, которые могут экспрессироваться на поверхности воспаленных эндотелиальных клеток. Этот процесс имеет решающее значение для того, чтобы лейкоциты мигрировали в место воспаления2. Кроме того, PSGL-1 также является механочувствительным рецептором, способным запускать последующую стадию твердой адгезии каскада скользящей адгезии при его взаимодействии с P-селектином3.
Генетические мутации, влияющие на функцию CAM, могут серьезно повлиять на иммунную систему, например, при редком заболевании дефицита адгезии лейкоцитов (LAD), где нарушение адгезии молекул, опосредующих прокатку, приводит к сильному ослаблению иммунитета лиц4,5,6. Кроме того, было показано, что циркулирующие опухолевые клетки мигрируют после аналогичного процесса прокатки, что приводит к метастазированию7,8. Однако, поскольку клеточная прокатка является быстрой и динамичной, обычные экспериментальные методы механобиологии непригодны для изучения молекулярных взаимодействий во время клеточной прокатки. В то время как одноклеточные и одномолекулярные методы манипулирования, такие как атомно-силовая микроскопия и оптический пинцет, смогли изучить молекулярные взаимодействия, такие как силово-зависимое взаимодействие P-селектина с PSGL-1 на уровне одной молекулы9, они непригодны для исследования событий живой адгезии во время клеточного качения. Кроме того, взаимодействие, характеризуемое in vitro, не может напрямую ответить на вопрос о молекулярной адгезии in vivo. Например, какой диапазон молекулярного напряжения является биологически значимым, когда клетки функционируют в своей родной среде? Вычислительные методы, такие как моделирование адгезионной динамики10 или простая стационарная модель11, охватывают определенные молекулярные детали и то, как они влияют на поведение качения, но сильно зависят от точности параметров моделирования и предположений. Другие методы, такие как микроскопия силы тяги, могут обнаруживать силы во время миграции клеток, но не обеспечивают достаточного пространственного разрешения или количественной информации о молекулярном напряжении. Ни один из этих методов не может обеспечить прямые экспериментальные наблюдения за временной динамикой, пространственным распределением и неоднородностью величин молекулярных сил, которые напрямую связаны с функцией и поведением клеток в их родной среде.
Поэтому внедрение датчика молекулярной силы, способного точно измерять селектин-опосредованные взаимодействия, имеет решающее значение для улучшения нашего понимания адгезии при качении. Здесь мы описываем протокол анализа адгезионного следа12, где шарики с покрытием PSGL-1 катаются на поверхности, представляющей п-селектин функционализированные тросы датчика напряжения (TGTs)13. Эти ТГТ являются необратимыми датчиками силы на основе ДНК, которые приводят к постоянной истории событий разрыва в виде считывания флуоресценции. Это достигается путем разрыва TGT (dsDNA) и последующей маркировки разорванной TGT (ssDNA) флуоресцентно меченой дополнительной нитью. Одним из основных преимуществ этой системы является ее совместимость как с дифракционными ограничениями, так и с изображениями со сверхвысоким разрешением. Флуоресцентно меченая комплементарная нить может быть либо постоянно связанной (>12 bp) для дифракционно-ограниченной визуализации, либо временно связанной (7-9 bp) для визуализации сверхвысокого разрешения через DNA PAINT. Это идеальная система для изучения адгезии при качении, поскольку ТГТ разрываются во время активной прокатки, но показания флуоресценции анализируются после прокатки. Два метода визуализации также предоставляют пользователю больше свободы для исследования адгезии при качении. Как правило, дифракционно-ограниченная визуализация полезна для извлечения силы молекулярного разрыва через интенсивность флуоресценции13, тогда как визуализация со сверхвысоким разрешением позволяет проводить количественный анализ плотности рецепторов. Благодаря возможности исследования этих свойств адгезии качения этот подход обеспечивает перспективную платформу для понимания механизма силовой регуляции молекулярной адгезии клеток качения при сдвиговом потоке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Маркировка и гибридизация олигонуклеотидов
- Восстановление дисульфидных связей белка G
- Растворите 10 мг белка G (ProtG) в 1 мл сверхчистой воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белок G здесь модифицирован одним остатком цистеина на С-конце и N-концевой полигистидовой меткой. - Буферный обмен ≥20 мкл ProtG (10 мг/мл) на 1x PBS (pH 7,2) со колонкой P6.
- Измерьте концентрацию белка после буферного обмена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация 7-8 мг/мл. - Готовят 120 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), растворяя 3 мг TCEP в 90 мкл 1x PBS (рН 7,2) с последующим 10 мкл 0,5 M ЭДТА.
ПРИМЕЧАНИЕ: TCEP должен быть свежеприготовленным. - Добавьте 4 мкл 120 мМ TCEP (480 нмоль) к 20 мкл ProtG (4-5 нмоль).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к молярному соотношению ~100:1 TCEP к белку. - Дайте реакции продолжаться в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
- Удалите избыток TCEP из восстановленного ProtG с помощью колонки P6 (буфер, обмениваемый в 1x PBS, pH 7,2).
- Измерьте концентрацию восстановленного ProtG с помощью спектрофотометра UV/Vis и сохраните спектры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация 3,5-4,5 мг/мл.
- Растворите 10 мг белка G (ProtG) в 1 мл сверхчистой воды.
- Амино-меченая реакция сдНК с сульфо-SMCC
- Растворяют меченую амином ssDNA (amine-ssDNA) в воде, свободной от нуклеаз, до концентрации 1 мМ. Проверьте концентрацию пряди с помощью спектрофотометра UV/Vis.
- Готовят 11,5 мМ сульфо-SMCC (гетеро-бифункциональный сшивающий ликер с сульфо-NHS эфиром и малеимидом) раствор в свежем виде, растворяя 2 мг сульфо-SMCC в 400 мкл сверхчистой воды и вихре для смешивания.
- Добавьте 6 мкл 1 мМ амина-ссДНК (6 нмоль) к 5,2 мкл 11,5 мМ сульфо-SMCC (60 нмоль) и 88,8 мкл 1x PBS (рН 7,2). Вихрь в течение 5 с с последующим центрифугированием при 8600 х г в течение 3 мин.
- Дайте реакции продолжаться в течение 30 мин при РТ.
- Удалить избыток сульфо-SMCC из конъюгированной амино-ssDNA (mal-ssDNA) со колонкой P6 (буфер, обмениваемый в 1x PBS, pH 7,2).
- Измерьте концентрацию mal-ssDNA с помощью спектрофотометра UV/Vis и сохраните спектры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация 35-45 мкМ.
- Конъюгация ПротГ-ссДНК
- Добавьте 21 мкл 4,5 мг/мл восстановленного ПротГ (3 нмоль) к mal-ssDNA (~4-5 нмоль).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы и концентрации здесь являются типичными значениями. Регулировка в соответствии с индивидуальными экспериментальными измерениями. Всегда обеспечивайте избыточное количество mal-ssDNA над ProtG в соотношении ~ 1,5: 1. - Вихрь в течение 5 с и дайте реакции продолжаться в течение 3 ч при RT.
- Добавьте 21 мкл 4,5 мг/мл восстановленного ПротГ (3 нмоль) к mal-ssDNA (~4-5 нмоль).
- Очистка и характеристика ПротГ-ссДНК
- Очищают конъюгированную ProtG-ssDNA с помощью изоляции его метки магнитными шариками никель-нитрилотриаценовой кислоты (Ni-NTA).
- Удалите избыток имидазола (буфер элюирования Ni-NTA) из продукта с помощью колонки P6 (буфер, обмениваемый в 1x PBS, pH 7,2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для количественной оценки конъюгации, так как имидазол обладает значительным поглощением при 280 нм. - Используйте спектрофотометр UV/Vis для записи спектров продукта ProtG-ssDNA, а также буфер элюирования Ni-NTA (1x).
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная абсорбция ProtG-ssDNA при 260 нм и 280 нм составляет 0,8 и 0,6 соответственно. - Чтобы определить эффективность сопряжения и отношение ProtG к ssDNA, используйте специально написанный скрипт MATLAB (Supplemental Coding File 1) для разложения спектра конечного продукта на основе трех спектров, собранных ранее (ProtG, SMCC-thread, Ni-NTA бусинный элюционный буфер).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкратце, код работает так, как описано в шагах 1.4.5-1.4.8. Типичная концентрация составляет 4 мкМ ПротГ-ссДНК с ПротГ и сдНК при молярном соотношении ~1:1 (Рисунок 2А). - Вход ProtG, SMCC-цепи, буфер элюирования шариков Ni-NTA и спектры ProtG-ssDNA UV/Vis в скрипт MATLAB
- Выполнение многомерной неограниченной нелинейной минимизации для реконструкции спектров ProtG-ssDNA из спектров источника (спектры буфера элюирования ProtG, SMCC и Ni-NTA бусин)
ПРИМЕЧАНИЕ: Функция минимизации выводит три коэффициента преобразования, по одному для каждого исходного спектра. - Реконструируйте спектры ProtG-ssDNA, умножив спектры на соответствующий им множитель и объединив преобразованные спектры источника.
- Умножьте начальную концентрацию ProtG и SMCC-цепи на соответствующие коэффициенты трансформации, чтобы определить концентрации SMCC-цепи и ProtG в продукте ProtG-ssDNA.
- (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Запустите собственную страницу PAGE в соответствии с рисунком 2B , чтобы убедиться, что каждый компонент и шаг работают должным образом.
- Гибридизация TGT
- Гибридизация ProtG-ssDNA (верхняя нить) с биотинилированной нижней нитью в молярном соотношении 1,2:1 с концентрациями 240 нМ и 200 нМ соответственно в буфере T50M5 (10 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2) для гибридизации полной конструкции TGT. Дайте гибридизации при RT ≥1 ч.
2. Поверхностное пегилирование
- Очистка поверхностей
- Очистите одну колбу Erlenmeyer и две банки для окрашивания на каждые 8 обложек. Наполните каждый контейнер 1 М РАСТВОРОМ КОН и ультразвуком в течение 1 ч на RT. Тщательно вымойте каждый контейнер сверхчистой водой и высушите N2 или в духовке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните KOH сверху, чтобы коснуться крышки, чтобы они также были очищены. - Тщательно промойте каждую крышку сверхчистой водой и поместите их в одну из очищенных банок для окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что они не прилипли друг к другу или к стенке окрашивающих банок. - В вытяжке свежеприготовите раствор пираньи, добавив 30 мл перекиси водорода (30%) до 90 мл концентрированной (95%-98%) серной кислоты в стакан объемом 250 мл.
ВНИМАНИЕ: Концентрированная серная кислота обладает высокой коррозионной активностью. Добавьте перекись водорода очень медленно в серную кислоту и осторожно закрутите, чтобы перемешать. - Полностью опустите крышки в банку для окрашивания раствором пираньи. Оставьте крышки у пираньи на 30 мин в вытяжке.
ВНИМАНИЕ: Охладите раствор пираньи до температуры не более 80 °C перед заливкой, чтобы предотвратить растрескивание банки для окрашивания. - Выбросьте раствор пираньи в стакан емкостью 1000 мл и нейтрализуйте 1 М КОН от очистки стекла.
- (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Повторите очистку пираньи (этапы 2.1.3-2.1.5) свежим раствором пираньи.
- Промойте крышки обильным количеством сверхчистой воды, чтобы удалить весь остаточный раствор пираньи. Осторожно встряхивайте банку для окрашивания во время каждого подъема, чтобы облегчить удаление (рекомендуется 10 полосканий).
- Промойте крышки метанолом 3 раза, чтобы удалить воду с поверхности крышки и сохранить крышки погруженными в метанол.
- Очистите одну колбу Erlenmeyer и две банки для окрашивания на каждые 8 обложек. Наполните каждый контейнер 1 М РАСТВОРОМ КОН и ультразвуком в течение 1 ч на RT. Тщательно вымойте каждый контейнер сверхчистой водой и высушите N2 или в духовке.
- Силанизация поверхности
- Приготовьте 1% раствор аминосилана, тщательно смешивая 94 мл метанола, 1 мл аминосилана и 5 мл ледниковой уксусной кислоты в очищенной и высушенной колбе Эрленмейера. Перелейте во вторую очищенную и высушенную банку для окрашивания14.
- Переложите крышки, погруженные под раствор метанола, в банку для окрашивания, содержащую 1% раствор аминосилана, и держите банку закрытой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания покровов при переходе на аминосилан, чтобы ограничить воздействие воздуха на поверхность стекла. - Инкубировать в духовке15 кувшин для окрашивания, содержащую крышки в аминосилане, в течение 1 ч при 70 °С.
- Осторожно выбросьте раствор аминосилана в отдельную емкость для отходов и промойте крышки в банке для окрашивания метанолом 5 раз, чтобы удалить раствор аминосилана.
- Промойте крышки в банке для окрашивания сверхчистой водой 5 раз и высушите их N2.
- Выпекать высушенные крышки в банке для окрашивания в духовке при 110 °C в течение 20 мин. Дайте крышкам остыть до RT, затем поместите их на стойку PEGylation.
ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте банку для окрашивания крышкой во время выпечки, чтобы свести к минимуму особое и химическое осаждение на поверхности15.
- Приготовление раствора ПЭГ
- Оттаивание ПЭГ (полиэтиленгликоля) и ПЭГ-биотина до РТ в течение примерно 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг сводит к минимуму конденсацию влаги, которая может ухудшить эфир NHS на ПЭГ. - Сделайте буфер ПЭГ, добавив 84 мг бикарбоната натрия в 10 мл сверхчистой воды. Этот состав должен обеспечивать буфер при рН 8,4.
- Для 8 обложек, каждый с одной ПЭГилированной стороной с 20:1 ПЭГ:ПЭГ-биотином: измерьте 100 мг ПЭГ и 5 мг ПЭГ-биотина, чтобы добавить к 400 мкл буфера ПЭГ. Вихрь раствора в течение 30 с и центрифуга в течение 1 мин на максимальной скорости (≥18000 х г).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап чувствителен ко времени, так как гидролиз эфира SVA NHS начинается немедленно и имеет период полураспада 34 мин при рН 8,0 с более коротким периодом полураспада при рН 8,4.
- Оттаивание ПЭГ (полиэтиленгликоля) и ПЭГ-биотина до РТ в течение примерно 30 мин.
- Инкубация ПЭГ и хранение крышек
- Установите камеру влажности и поместите крышки внутрь.
- Добавьте 90 мкл раствора ПЭГ в крышку в камере влажности и поместите второй крышку поверх раствора ПЭГ, используя пинцет, удерживающий крышку, чтобы равномерно распределить раствор ПЭГ.
- Убедитесь, что в растворе нет пузырьков, опущенных на крышку. Опустите один конец второго обтекателя на первый обтекатель и медленно опустите другой конец, чтобы между чехлами не было пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки приведут к тому, что некоторые области будут плохо обработаны PEGylat. - Повторяйте до тех пор, пока все крышки не будут иметь PEG (т.е. 8 обложек = 4 сэндвича PEG). Инкубируйте растворы ПЭГ в течение ночи (~12 ч) при РТ в камере влажности в темное время суток16.
- Отделите пары крышек и поместите их в банку для окрашивания. Обратите внимание на PEGylated стороны.
- Тщательно промойте крышки сверхчистой водой и высушите N2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживайте крышки пинцетом и продувайте N2 по поверхности по направлению к пинцуту, чтобы предотвратить высыхание загрязняющих веществ на поверхности. - Пометьте не-PEGylated сторону точкой в углу с помощью перманентного маркера или алмазной ручки.
- Поместите 2 ПЭГилированных крышки в почтовые трубки с ПЭГилированными сторонами, обращенными друг к другу, чтобы помочь идентифицировать ПЭГилированную сторону перед использованием.
- Пропылесосьте трубку в течение 5 мин и засыпьте обратно N2. Запечатайте трубку парапленкой.
- Храните полиэтиленовые крышки при температуре -20 °C в герметичных почтовых трубках до 6 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прогрейте трубки хранения до RT перед сборкой чипа. Конденсация на крышках во время уплотнения приведет к утечке.
3. Подготовка проточной камеры
- Сборка стружки
- Тонко распределите небольшое количество эпоксидной смолы по обеим сторонам двухсторонней лентой с лезвием бритвы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много эпоксидной смолы может распространиться в канал во время сборки. - Лазерная резка ленты с эпоксидным покрытием для создания 4 каналов. Создайте проточную стружку, зажав эпоксидную ленту между 4-отверстием слайда и крышкой PEG (рисунок 1A).
- Используя наконечник пипетки, приложите мягкое давление по всей длине каналов, чтобы создать хорошее уплотнение. Отверждение эпоксидной смолы в течение ≥1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не сдвигайте стекло, чтобы избежать скольжения по эпоксидной смоле.
- Тонко распределите небольшое количество эпоксидной смолы по обеим сторонам двухсторонней лентой с лезвием бритвы.
- Сборка камер
- Выровняйте чип так, чтобы открытие каждого канала располагалось в центрах адаптера (рисунок 1А). Поместите две прозрачные акриловые прокладки поверх чипа, приложите сильное давление в середине блока и вкрутите два винта по 4-40 на концах каждой распорки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте на винт и не надавливайте слишком сильно на распорки, иначе стружка может треснуть. - С другой стороны кронштейна вкрутите входные отверстия в резьбовые отверстия. Следите за состоянием уплотнения через прозрачный акриловый блок.
- Когда трубка вступает в контакт с отверстием стружки, запечатайте соединение, осторожно повернув трубку по часовой стрелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерно затянутые входные отверстия могут привести к блокировке потока, в то время как свободные контакты вызовут утечку.
- Выровняйте чип так, чтобы открытие каждого канала располагалось в центрах адаптера (рисунок 1А). Поместите две прозрачные акриловые прокладки поверх чипа, приложите сильное давление в середине блока и вкрутите два винта по 4-40 на концах каждой распорки.
4. Подготовка поверхности
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к рисунку 1B для общего рабочего процесса.
- Блокирующие агенты для предотвращения неспецифического связывания
- Используйте пипетку для подачи 200 мкл промывочного буфера (10 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2 и 2 мМ CaCl2, 0,05% Tween 20) в камеру для проверки утечки. Если пузырьки образуются в канале, агрессивно протолкните дополнительные 200 мкл, чтобы удалить пузырьки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большие пузырьки воздуха, не удаленные на этом этапе, могут вытеснить и разрушить функционализацию поверхности позже. - Добавьте 40 мкл BSA (1% мас./об.) в проточную камеру для предотвращения неспецифического связывания и инкубируйте в течение 10 мин.
- Убедитесь, что в течение каждого инкубационного периода добавляется достаточно объема для заполнения проточных камер и образования капель на входах и выходах. Отрегулируйте объемы инкубации соответствующим образом и выполните все инкубации в камере влажности.
- Добавьте 40 мкл Tween 20 (5% v/v) в проточную камеру. Инкубировать в течение 10 мин для дальнейшего уменьшения неспецифического связывания.
- (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Проверьте поверхность на наличие адекватной пассивации путем протекания полистирольных шариков через канал. Добавьте 40 мкл полистирольных шариков с покрытием ProtG (0,01% мас./об.) и нанесите изображение с помощью микроскопа темного поля с 10-кратным объективом. Если бусины не прилипают к поверхности, переходите к следующему шагу.
- Промывайте канал 200 мкл буфера для промывки, чтобы удалить все пассиваторы.
- Используйте пипетку для подачи 200 мкл промывочного буфера (10 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2 и 2 мМ CaCl2, 0,05% Tween 20) в камеру для проверки утечки. Если пузырьки образуются в канале, агрессивно протолкните дополнительные 200 мкл, чтобы удалить пузырьки.
- Функционализация поверхности камеры
- Добавьте 40 мкл стрептавидина (100 мкг/мл) в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 мин. Затем промыть 200 мкл промывочного буфера.
- Добавьте 40 мкл гибридизированного ProtG-TGT (100 нМ) в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 мин. Затем промыть с помощью промывочного буфера объемом 200 мкл.
- Добавьте 40 мкл верхней пряди ProtG-TGT (100 нМ) в течение 20 минут, чтобы завершить любую негибридизированную нижнюю прядь TGT на поверхности. Промывайте 200 мкл буфера для стирки.
- Добавьте 40 мкл P-селектина-Fc (10 мкг/мл) в проточную камеру и инкубируйте в течение 60 мин. Затем промыть 200 мкл промывочного буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инкубации имеет решающее значение.
5. Эксперимент и визуализация
- Настройка проточной системы
- Наполните стеклянный шприц 5 мл прокатным буфером (HBSS с 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 0,1% BSA). Убедитесь, что в шприце нет пузырьков воздуха, постукивая по сторонам шприца, чтобы выбить пузырьки и выталкивая их, когда они плывут к кончику.
- Вставьте стерильную иглу (26 г, длина 5/8 дюйма) в полиэтиленовую трубку диаметром ~200 мм (I.D: 0,38 мм; O.D: 1,09 мм) и подключите иглу к стеклянному шприцу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что воздух не задерживается где-либо в разъеме иглы. - Закрепите шприц на шприцевом насосе и наклоните шприцевой насос так, чтобы сторона плунжера была приподнята, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в канал. Вставьте конец трубки во входное отверстие проточной камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте контакт жидкости с жидкостью при соединении, положив капли на входные отверстия и имея капли в конце шприцевой трубки. Убедитесь, что пузырьки воздуха не попадают в канал, позволив небольшому падению образоваться на конце трубки шприца перед введением его во входное отверстие. - Вставьте один конец другой 200 мм полиэтиленовой трубки в выпускное отверстие, а другой конец погружают в стакан для отходов.
- Настройка на прокатку ячеек
- Выращивайте клетки HL-60 в вентилируемых культуральных колбах объемом 25 см2 в средах IMDM, дополненных 20% фетальной бычьей сывороткой и 1% антибиотиками при 37 °C с 5% CO2. Поддерживайте плотность клеток от 1 x 105-2 × 106 клеток/мл.
- (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Дифференцировать клетки HL-60 в полной среде IMDM, содержащей 1,25% DMSO при начальной плотности 2 x 105 клеток/мл. Инкубировать клетки, чтобы они были наиболее активными в течение 5-6 дней.
- Возьмите образец (1-2 мл) из клеточной суспензии и центрифуги (200 х г, 3 мин) для гранулирования клеток.
- Извлеките среду и аккуратно повторно суспендируйте ячейки в 500 мкл качающегося буфера. Повторите этап стирки дважды, чтобы удалить клеточный мусор.
- Измерьте плотность клеток с помощью гемоцитометра. Повторное суспендирование гранул ячейки с буфером качения до плотности 2 х 105 клеток/мл.
- Осторожно отсоедините трубку от входных/выходных отверстий и пипетки 40 мкл клеточной суспензии в проточной камере. Повторно подключите трубку, как описано ранее, убедитесь, что пузырьки не введены в канал потока.
- Начните эксперимент с клеточной прокаткой, запустив шприцевой насос с желаемой скоростью потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность флуоресцентных дорожек зависит от напряжения сдвига, и более низкая скорость сдвига ячейки напряжение / скорость ячейки обычно создают более тусклые дорожки (рисунок 4A). Избегайте высокой плотности ячеек на поверхности или чрезмерной продолжительности качения, чтобы обеспечить разделимость одноэлементных дорожек (рисунок 4B, C). - Используйте микроскоп темного поля с 10-кратным объективом, чтобы обеспечить наблюдение за катком клеток.
- Как только эксперимент будет завершен, удалите клетки из канала, вливая буфер качения со скоростью 100 мл / ч до тех пор, пока поверхность не станет бесклеточной.
- Визуализация локальных треков с помощью «Накопления точек на основе ДНК для визуализации в наноразмерной топографии» (DNA-PAINT)
- Добавьте в канал 40 мкл цепи тепловизора DNA-PAINT (500 пМ) в буфер ДНК-PAINT (0,05% Tween-20, 5 мМ Tris, 75 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА).
- Выполните флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения (TIRF) с использованием 100-кратной масляной объективной линзы TIRF. Получите более 40000 кадров со временем экспозиции 25 мс на кадр при коэффициенте усиления электрон-умножения (EM) 300 с помощью камеры электронно-умножающего зарядовую связь (EMCCD).
- Используйте программный пакет Picasso17 для локализации и рендеринга изображений со сверхвысоким разрешением (рисунок 4D), следуя шагам 5.3.4-5.3.5.
- Загрузите фильм DNA-PAINT в программу Localize, чтобы определить локализацию каждого флуорофора в каждом кадре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте длину стороны коробки и параметры минимального чистого градиента до тех пор, пока не будут точно отслеживаться только флуорофоры. Минимальный параметр net Gradient часто может превышать 100000 для достижения оптимального отслеживания. Настройка посадки: MLE, интегрированный метод Гаусса дает наилучший результат. Наконец, если фильм слишком длинный, разделите его на стопки по 10000 кадров, чтобы отслеживание предварительного просмотра в Localize работало должным образом, прежде чем перекомбинировать их в окончательный файл hdf5. - Затем загрузите полученный файл hdf5 в программу Render для выполнения коррекции дрейфа и рендеринга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните множественную коррекцию дрейфа с помощью Undrift by RCC для улучшения конечного результата.
- Визуализация длинных дорожек с помощью постоянной маркировки
- Добавьте постоянную прядь тепловизора и инкубируйте в течение 120 с в буфере T50M5. Промыть канал, влив 200 мкл промывочного буфера.
- Запишите изображение с выключенным лазером возбуждения, чтобы получить фоновый шум камеры. Изображение большой площади в виде сетки с помощью микроскопии TIRF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего сшивания рекомендуется перекрытие рамы на раму ≥10%. - Запрограммируйте микроскоп на сканирование на площади 400 х 50 изображений (всего 20000 изображений). Используя программу FIJI, разделите необработанные данные на отдельные файлы tiff, каждый из которых содержит максимум 10000 изображений.
- Сгладьте все изображения с помощью профиля освещения (рисунок 3A-C) следуя шагам 5.4.5-5.4.7.
- Вычтите фоновый шум камеры из каждого кадра. Получите проекцию среднего стека (профиль освещения) каждого кадра, вычитаемого из фона.
- Нормализуйте профиль освещения по его максимальному значению. Разделите каждый вычитаемый фоном кадр на нормализованный профиль освещения.
- Перемасштабируйте скорректированные кадры до соответствующего диапазона для соответствующей битовой глубины.
- Используйте MIST18 для сшивания изображений (рисунок 3D, E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В приведенном выше протоколе описывается экспериментальная процедура анализа адгезионного следа. Общий рабочий процесс эксперимента проиллюстрирован на рисунке 1, от сборки проточной камеры (рисунок 1A) до функционализации поверхности (рисунок 1B) и этапов эксперимента и визуализации (рисунок 1C).
Рисунок 2 является репрезентативным результатом для характеристики биоконъюгации ProtG-ssDNA. Спектры UV/Vis трех компонентов в конечном продукте, а именно ProtG, mal-ssDNA и буфер элюирования имидазола, собирали до окончательного сопряжения (фиг.2A), каждый из которых соответствовал известной концентрации. Эти спектры образуют ортогональную основу для подгонки к спектру продуктов биоконъюгации, где три неизвестных параметра являются их концентрациями. Для определения концентраций использовалась пользовательская функция в MATLAB. Результаты показывают почти 1:1 отношение ProtG к ssDNA (рисунок 2A). Это, как и ожидалось, потому что ssDNA имеет только одну модификацию амина, а ProtG имеет один цистеин, спроектированный на его C-конце. Этот подход более выгоден для ранее сообщенного подхода19 с использованием одной тиол-модифицированной ДНК для нацеливания на множество первичных аминов на ProtG, где соотношение конъюгации не может быть легко поддержано.
Кроме того, для подтверждения биоконъюгации использовался нативный PAGE (рисунок 2B). ДНК окрашивается GelGreen, а белки — синим Coomassie, соответственно. Поскольку GelGreen окрашивает дцДНК сильнее, чем ссДНК, ожидается, что любые полосы сдПГ будут тусклее, чем равная молярная концентрация полос дцДНК (полосы 3, 4). Поскольку запас ProtG содержит С-концевой остаток цистеина, часть белков образует димеры через дисульфидную связь, как показано на полосе 5 (рисунок 2B). Уменьшенный ProtG, с другой стороны, показывает одну полосу (полоса 6). При использовании запаса ProtG в конъюгации ДНК напрямую, дисульфидный димеризованный ProtG не реагирует на ДНК и проявляется в виде полосы без какого-либо окрашивания GelGreen (полосы 7, 8). Димерная полоса ProtG исчезает в продукте сопряжения при использовании восстановленного ProtG (полосы 9, 10). Поскольку во время сопряжения используется избыток mal-ssDNA к ProtG (1,5:1), в конечном продукте сопряжения видны только полосы TGT (полосы 8, 10). Яркие полосы GelGreen, совпадающие с мономерной полосой ProtG, указывают на успешное сопряжение и хороший выход.
На рисунке 3 показаны репрезентативные необработанные микроскопические изображения и рабочий процесс их исправления для последующего сшивания и анализа изображений. Профиль освещения TIRF, введенный из одномодового волокна, как правило, ярче в середине поля зрения и тусклее по краям (рисунок 3A, B). Чтобы компенсировать неравномерное освещение и сгладить изображения для количественного анализа, профиль освещения определяли путем усреднения тысяч отдельных кадров (рисунок 3B). Сглаженные изображения производились путем вычитания шума камеры как из необработанных профилей, так и из профилей освещения, а затем нормализации по профилю освещения (рисунок 3C). Эффект сглаживания изображения хорошо иллюстрируется, когда изображения сшиваются для формирования большого изображения. Интенсивность изображения в фоновых областях без каких-либо клеточных дорожек показывает четкие периодические узоры, соответствующие неисправленным изображениям (рисунок 3D). То же поле зрения, сшитое из сглаженных изображений, создает плоский фон (рисунок 3E). Наличие плоского фона имеет решающее значение для интерпретации колебаний интенсивности вдоль клеточного трека. В качестве первого эксперимента для определения диапазона напряжения сдвига, подходящего для эксперимента, используется профиль нарастающего потока, аналогичный показанному на рисунке 3F , обеспечивающий как стабильную прокачку ячеек, так и четкие флуоресцентные дорожки ячеек. Типичный одноэлементный адгезионный след под этим профилем потока показан на рисунке 3G, где интенсивность увеличивается по мере увеличения напряжения сдвига до тех пор, пока ячейка больше не сможет выдерживать качение при высоком напряжении сдвига и отсоединиться от поверхности, отмечая конец одного пути.
На рисунке 4 показаны потенциальные результаты от неоптимальных до оптимальных репрезентативных экспериментальных результатов. Рисунок 4А иллюстрирует неоптимальный результат, когда флуоресцентные треки имеют низкое отношение сигнал/шум. Это, вероятно, вызвано либо низкой поверхностной плотностью полностью сопряженных зондов, либо низкой скоростью потока. Рисунок 4B иллюстрирует еще один неоптимальный результат, когда флуоресцентные треки слишком плотно упакованы, чтобы разрешить и изолировать отдельные треки для последующего анализа. Рисунок 4C является примером хорошего результата, когда отдельные треки разрешаемы на большом расстоянии и ясны на фоне. Рисунок 4D является примером дифракционно-ограниченного изображения TIRF (левая половина) по сравнению с тем же треком, изображенным DNA-PAINT (правая половина). DNA-PAINT в этой установке производит NeNA (анализ на основе ближайшего соседа) с точностью 28,8 нм.
Рисунок 1: Рабочий процесс эксперимента по анализу адгезионного следа. (A) Сборка проточной ячейки и проточной камеры. (B) Пассивация и функционализация поверхности. Каждая стадия инкубации отмечена продолжительностью, за которой следует этап промывки. (C) Эксперимент по прокатке клеток и визуализация. Клетки, катящиеся по поверхности, будут распаковывать ДНК, где формируются адгезионные взаимодействия, оставляя ssDNA на поверхности, которая отмечает местоположение каждого события адгезии. Поверхность маркируется перманентным тепловизором ssDNA для визуализации обширной области, требующей окрашивания в течение 2 минут перед смыванием. Для визуализации ДНК-PAINT сверхвысокого разрешения цепь тепловизора хранится в буфере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика биоконъюгации. (A) поглощение UV-VIS очищенного Ni-NTA продукта биоконъюгации (синий) и кривая соответствия (красный) для определения коэффициента сопряжения. Спектры поглощения ProtG (пурпурный), mal-ssDNA (зеленый) и имидазол (серый) были использованы в качестве компонентов для создания наилучшего соответствия (красный) спектру продукта (синий). Остаток посадки отображается в виде черной пунктирной линии. Это позволяет определить концентрацию ПротГ и сдНК в очищенном продукте биоконъюгации и их молярное соотношение. (B) Нативная СТРАНИЦА компонентов в процедуре биоконъюгации. Первая полоса показывает низкомолекулярную лестницу ДНК (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). Изображение геля ложного цвета, с окрашиванием ДНК GelGreen в зеленый цвет и синим белковым пятном Coomassie (обратным) в пурпурном цвете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Обработка изображений и репрезентативные результаты визуализации обширной области. (A) Тысячи необработанных изображений TIRF, облицовывающих обширную территорию. (B) Профиль освещения, полученный из необработанных изображений. (C) Исправленные изображения путем сглаживания профиля освещения. (D) Сшитое изображение из необработанных плиток изображений. Неравномерный профиль освещения можно увидеть как периодические узоры на изображении. Синие и красные поля обозначают участки изображения, на которые проецируются средние профили интенсивности (синие и красные следы). Средние значения интенсивности (произвольная единица) представляют собой значения 8-битных изображений (0-255). (E) Та же область, что и (D), но сшитая с использованием сглаженных изображений. Прогнозы не показывают каких-либо крупномасштабных периодических закономерностей. (F) Профиль напряжения сдвига для использования в экспериментах для определения диапазона напряжений сдвига, которые приводят к опрокидыванию клеток и получению флуоресцентных дорожек. G) образец флуоресцентной дорожки из одной ячейки под профилем потока, проиллюстрированным в пункте (F). Клетка перемещается слева направо, интенсивность флуоресценции увеличивается по мере того, как напряжение сдвига увеличивается до тех пор, пока клетка больше не сможет выдерживать качение и отделяется от поверхности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные неоптимальные и оптимальные результаты. (A) Пример флуоресцентных треков с недостаточной контрастностью. (B) Пример чрезмерной флуоресцентной плотности трека. (C) Пример оптимальной плотности и контрастности трека. Все три изображения были получены в одном и том же состоянии, сплющены и сшиты. Красные поля на каждом изображении представляют область, где были сделаны проекции интенсивности (справа). (D) Флуоресцентный трек, показанный в дифракционно-ограниченной (левая половина) и ДНК-PAINT (правая половина) визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Проблема | Возможная причина | Решение | |
| Эпоксидная лента не разрезается должным образом | Слишком толстый слой эпоксидной смолы | Максимально истончите слой эпоксидной смолы с помощью рейзерного лезвия | |
| Мощность и скорость лазерного гравера не оптимизированы | Оптимизация мощности и скорости лазерного гравера | ||
| Пузырьки, застрявшие по бокам проточной камеры | Неправильное первоначальное введение жидкости | Проталкивайте буферные растворы через канал с высокой скоростью потока, чтобы вымыть пузырьки | |
| Пузырьки проходят через проточную камеру | Неправильное введение жидкости через входное и выходное отверстия | Убедитесь, что капля жидкости находится на входной трубке, чтобы обеспечить контакт жидкости с жидкостью между наконечником пипетки и входным отверстием | |
| Пузырьки из шприца попали в линию потока | Наклоните шприцевой насос, чтобы убедиться, что пузырьки задерживаются на конце плунжера | ||
| Жидкость не может попасть в каналы | Впускные отверстия, привинченные слишком плотно | Отрегулируйте для оптимизации уплотнения. Впускная трубка должна просто касаться отверстия канала при правильном ввинчивании. | |
| Утечка канала | Эпоксидная смола не отверждается полностью | Переделайте каналы, обеспечьте использование 5 мин быстро отверждающейся эпоксидной смолы и дайте затвердеть не менее 1 ч | |
| Неправильное уплотнение впускных отверстий | Настройка для оптимизации уплотнения | ||
| Клетки застряли | Плохое ПЕГилирование, приводящее к неспецифическому связыванию | В идеале, переделайте PEG. Кроме того, можно попытаться инкубировать дополнительные блокирующие агенты (BSA & Tween-20) и добавить блокирующие агенты в буфер промывки. | |
| Поверхностная пассивация, разрушенная крупными пузырьками воздуха, проходящими через канал | Убедитесь, что пузырьки не проходят через канал | ||
| Проблема с клетками | Используйте HL-60 через 2 недели после перезапуска клеточной культуры из замороженных. Подтвердите перемещение ячейки по поверхности управления только с помощью P-селектина. | ||
| Клетки не имеют или имеют разреженные взаимодействия с поверхностью | Слишком низкая плотность P-селектина в результате плохой функционализации поверхности и/или плохой биоконъюгации | Во-первых, используйте ProtG-биотин вместо ProtG-TGT в качестве контроля, чтобы определить, связана ли проблема с биоконъюгацией или плотностью поверхностного биотина. После обеспечения качества биоконъюгации и поверхностной плотности биотина увеличивают концентрацию TGT-ProtG и P-селектин-Fc и время инкубации. | |
| Клетки катятся, но не производят флуоресцентных дорожек | Адгезионные взаимодействия слишком слабы, чтобы разорвать TGT | Увеличьте расход во время эксперимента по прокатке, чтобы увеличить силу взаимодействия. Мы рекомендуем начальный профиль нарастания потока (рисунок 3F), чтобы найти оптимальную скорость потока, которая обеспечивает как стабильную качку, так и флуоресцентные дорожки (рисунок 3G) | |
| Плохое качество поверхности приводит к высокой фоновой флуоресценции и недостаточному контрасту, чтобы увидеть следы | Проверка пассивации поверхности | ||
Таблица 1: Устранение неполадок. В таблице перечислены возможные причины и решения проблем, возникающих при выполнении этого анализа.
Дополнительный кодирующий файл 1: Специально написанный скрипт MATLAB для разложения спектра конечного продукта на основе трех спектров, собранных ранее (ProtG, SMCC-thread, Ni-NTA бусинный буфер элюирования) для определения эффективности сопряжения и отношения ProtG к ssDNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ адгезионного следа позволяет визуализировать события молекулярной адгезии между PSGL-1 и P-селектином во время клеточной скользящей адгезии. Этот процесс инициируется P-селектин-опосредованным захватом с последующей прокаткой под текучим напряжением сдвига. Потенциальные проблемы во время эксперимента обычно связаны с плохим прокатом клеток или отсутствием флуоресцентных дорожек, даже если клетки хорошо катятся. Эти проблемы часто возникают в результате контроля качества на критических этапах протокола, как указано в таблице устранения неполадок (таблица 1).
Биомолекулы и буферы необходимо фильтровать и хранить при температуре 4 °C для предотвращения загрязнения, поскольку подготовка поверхности включает в себя несколько этапов. Высококачественная пассивация поверхности является требованием для достижения соответствующей плотности функционализации поверхности и уменьшения неспецифического связывания биомолекул. Неспецифическое связывание биомолекул с поверхностью может создавать фон высокой флуоресценции, мешая одномолекулярной флуоресцентной визуализации и статистическому анализу данных. Несколько факторов могут влиять на пассивацию поверхности. Гидролиз аминосилана и ПЭГ-NHS дают значительно меньшую эффективность ПЭГилирования. Достаточная промывка KOH и очистка пираньей повышают гидрофильность за счет образования свободных гидроксильных групп на поверхности стекла, увеличивая плотность химически реакционноспособной группы. Клетки будут застревать на плохо пассивированных поверхностях. Качество пассивации поверхности проверяют путем измерения интенсивности фоновой флуоресценции до и после ПЭГилирования с использованием флуоресцентных биомолекул.
Поверхностная плотность лигандов является критическим фактором для клеточной прокатки, которая контролируется ПЭГ: соотношением ПЭГ-биотин, гибридизацией TGT и связыванием Р-селектина. В этой системе соотношение ПЭГ:ПЭГ-биотин 20:1 является достаточным для функционализации поверхности с достаточным P-селектином для клеточного качения. Эффективная гибридизация TGT также улучшает поверхностную плотность и отношение сигнал/шум флуоресцентных треков. Этот протокол включает в себя этап пополнения верхней нити TGT-ProtG, чтобы гарантировать, что любая негибридированная нижняя нить TGT будет дополнена перед экспериментами. Конъюгация ДНК с ProtG также влияет на поверхностную плотность. Линкер Sulfo-SMCC добавляли к ДНК при 10-кратном моляровом избытке, так что вся ДНК реагировала с линкером. ProtG с одним остатком цистеина (ProtG-Cys) на С-конце использовался для достижения соотношения конъюгации 1:1 ДНК: ProtG. Поскольку ProtG-Cys может образовывать димеры через дисульфидные связи, обработка TCEP необходима для снижения дисульфидной связи перед сульфгидрил-реакционными сшивающими реакциями. Белково-конъюгированная ДНК и гибридизация TGT могут быть подтверждены с помощью нативного анализа PAGE, в котором конъюгированная ДНК и дуплекс ДНК покажут замедленную подвижность из-за увеличения молекулярной массы. Эффективность сборки также может быть оценена с помощью гелевой денситометрии (рисунок 2B). Тщательные процессы ПЕГилирования и биоконъюгации имеют решающее значение для получения однородной поверхности. Иногда состояние клетки может влиять на качение клеток и формирование следов. Хотя экспрессия PSGL-1 по плотности клеток не была зарегистрирована, плотность клеток является мощным регулятором клеточного цикла и экспрессии белка во время фазы роста.
Учитывая, что PSGL-1 также функционирует как сигнальный рецептор трансдукции и регулирует пролиферацию клеток20,21, условия культивирования, такие как плотность клеток, поддерживаются для поддержания постоянного уровня экспрессии и связывающей способности PSGL-1. Прикрепление P-селектина-Fc, опосредованного ProtG, к поверхности имеет решающее значение для адгезии и прокатки клеток. Кинетика связывания Р-селектина с ПротГ зависит от концентрации. Более низкие концентрации Р-селектина приводят к увеличению времени достижения равновесия. Для связывания насыщения для концентраций ниже 100 нМ22 требуется не менее 30 мин. 10 нМ Р-селектина использовали для уменьшения неспецифического связывания с поверхностью и увеличения времени инкубации для достаточного взаимодействия с ProtG. Инкубации 1 ч достаточно, чтобы вызвать адгезию клеток и прокатку в этой системе.
TGT и соответствующий силезависимый срок службы является важным фактором в результатах этого анализа. Во время сцепления качения усилие на тросе передается как через TGT, так и через P-селектин: взаимодействие PSGL-1. Каждый из этих отдельных компонентов имеет уникальный зависящий от силы срок службы, и в зависимости от приложенной силы вероятность разрыва будет предпочтительнее одного над другим. Например, было показано, что при использовании TGT, описанного в этой статье, при силах ниже 13,6 pN, P-selectin: PSGL-1 в основном диссоциирует, тогда как выше 13,6 pN TGT в основном диссоциирует13. Это важно понимать при выполнении этого анализа, потому что, если напряжение сдвига слишком низкое или бусины катятся слишком медленно, событиями разрыва будут в первую очередь взаимодействие P-селектин: PSGL-1, и будет минимальный или вообще не будет измеримого флуоресцентного сигнала от TGT. Порог напряжения TGT также будет влиять на результаты. Если TGT разрывается при слишком высокой силе, событиями разрыва в первую очередь будет P-селектин: PSGL-1, и будет минимальный флуоресцентный сигнал.
Метод, описанный здесь, позволяет анализировать силы молекулярного разрыва, а также местоположения событий молекулярной адгезии, участвующих в адгезии качения. Вместо обнаружения адгезии в режиме реального времени наиболее существенным преимуществом этого метода является то, что он позволяет проводить поэкспериментальную визуализацию и анализ. После того, как адгезионный след был оставлен на поверхности в виде ssDNA, следы все еще могут быть отображены через 12 ч, если каналы потока поддерживаются в холодильнике с температурой 4 °C в темной камере влажности с закрытыми входами и выходами для предотвращения высыхания. Интерпретация показаний флуоресценции для этого анализа зависит от выбранного метода визуализации. Благодаря визуализации со сверхвысоким разрешением этот анализ достигает высокого пространственного разрешения (<50 нм), что позволяет проводить количественный анализ плотности разорванных TGTs13. Анализ плотности рецепторов или плотности разрыва TGT был бы полезен при исследовании адгезионного поведения при качении в различных условиях. Напротив, дифракционно-ограниченная визуализация не обеспечивает высокого пространственного разрешения; тем не менее, он позволяет получить большую площадь поверхности для анализа флуоресцентных следов нескольких бусин в сотнях полей зрения. Это выгодно, так как интенсивность флуоресценции трека может быть проанализирована для одной бусины на большом расстоянии, предоставляя информацию об изменениях в поведении качения с течением времени. Таким примером является изменение напряжения сдвига с течением времени и наблюдение за соответствующими изменениями интенсивности флуоресценции. Недавно было показано, что с помощью простой модели интенсивность флуоресценции треков может быть использована для оценки распределения молекулярной силы13. Существует также потенциальное применение ратиометрических методов для достижения количественной оценки силы с помощью этого анализа23.
Поскольку перемещение клеток происходит быстро (10 мкм / с) и на большом расстоянии (1000 мкм), изучение их молекулярного напряжения было сложной задачей с помощью традиционных датчиков молекулярного напряжения в реальном времени. Анализ адгезионного следа преодолевает это сложное ограничение, позволяя получать изображения после события. Хотя событие разрыва TGT напрямую не сообщает о величине напряжения, испытываемого до разрыва, были сделаны многообещающие разработки в анализе флуоресцентных путей, позволяющих провести количественное исследование молекулярных сил, участвующих в сцеплении при качении13,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Канадским фондом инноваций (CFI 35492), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), Фондом новых рубежей в исследованиях (NFRFE-2018-00969), Фондом Майкла Смита для исследований в области здравоохранения (SCH-2020-0559) и Фондом возвышения Университета Британской Колумбии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
