Summary
Este protocolo presenta los procedimientos experimentales para realizar el ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de los eventos de adhesión durante la adhesión rápida de rodadura celular.
Abstract
La adhesión rodante, facilitada por interacciones mediadas por selectina, es una motilidad pasiva altamente dinámica en el reclutamiento de leucocitos en el sitio de la inflamación. Este fenómeno ocurre en las vénulas postcapilares, donde el flujo sanguíneo empuja a los leucocitos en un movimiento rodante sobre las células endoteliales. El laminado estable requiere un delicado equilibrio entre la formación de enlaces de adhesión y su disociación impulsada mecánicamente, lo que permite que la celda permanezca unida a la superficie mientras rueda en la dirección del flujo. A diferencia de otros procesos de adhesión que ocurren en entornos relativamente estáticos, la adhesión de rodadura es altamente dinámica ya que las células de rodadura viajan a través de miles de micras a decenas de micras por segundo. En consecuencia, los métodos de mecanobiología convencionales, como la microscopía de fuerza de tracción, no son adecuados para medir los eventos de adhesión individuales y las fuerzas moleculares asociadas debido a la corta escala de tiempo y la alta sensibilidad requerida. Aquí, describimos nuestra última implementación del ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de las interacciones P-selectina: PSGL-1 en la adhesión rodante a nivel molecular. Este método utiliza amarres de medición de tensión irreversibles basados en ADN para producir una historia permanente de eventos de adhesión molecular en forma de pistas de fluorescencia. Estas pistas se pueden visualizar de dos maneras: (1) uniendo miles de imágenes limitadas por difracción para producir un gran campo de visión, lo que permite la extracción de la huella de adhesión de cada célula rodante sobre miles de micras de longitud, (2) realizando DNA-PAINT para reconstruir imágenes de superresolución de las pistas de fluorescencia dentro de un pequeño campo de visión. En este estudio, el ensayo de huella de adhesión se utilizó para estudiar las células HL-60 rodando a diferentes tensiones de cizallamiento. Al hacerlo, pudimos obtener imágenes de la distribución espacial de la interacción P-selectina: PSGL-1 y obtener información sobre sus fuerzas moleculares a través de la intensidad de la fluorescencia. Por lo tanto, este método proporciona la base para la investigación cuantitativa de las diversas interacciones célula-superficie involucradas en la adhesión rodante a nivel molecular.
Introduction
La cascada de adhesión rodante describe cómo las células circulantes se atan y ruedan a lo largo de la pared de los vasos sanguíneos1. El laminado pasivo está mediado principalmente por selectinas, una clase importante de moléculas de adhesión celular (CAM)1. Bajo el flujo de cizallamiento de la sangre, los leucocitos que expresan el ligando de glicoproteína P-selectina-1 (PSGL-1) forman enlaces altamente transitorios con P-selectina, que pueden expresarse en la superficie de las células endoteliales inflamadas. Este proceso es crítico para que los leucocitos migren a un sitio de inflamación2. Además, PSGL-1 es también un receptor mecanosensible capaz de desencadenar la etapa de adhesión firme posterior de la cascada de adhesión rodante tras su compromiso con P-selectina3.
Las mutaciones genéticas que afectan a la función CAM pueden afectar gravemente al sistema inmunitario, como en la rara enfermedad de deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD), donde el mal funcionamiento de las moléculas de adhesión que median el rodar conduce a individuos gravemente inmunocomprometidos4,5,6. Además, se ha demostrado que las células tumorales circulantes migran siguiendo un proceso de rodadura similar, lo que lleva a metástasis7,8. Sin embargo, debido a que el laminado celular es rápido y dinámico, los métodos experimentales convencionales de mecanobiología no son adecuados para estudiar las interacciones moleculares durante el laminado celular. Si bien los métodos de manipulación de una sola célula y una sola molécula, como la microscopía de fuerza atómica y la pinza óptica, pudieron estudiar interacciones moleculares como la interacción dependiente de la fuerza de P-selectina con PSGL-1 a nivel de molécula única9, no son adecuados para investigar eventos de adhesión en vivo durante el rodaje celular. Además, la interacción caracterizada in vitro no puede responder directamente a la pregunta sobre la adhesión molecular in vivo. Por ejemplo, ¿qué rango de tensión molecular es biológicamente relevante cuando las células funcionan en su entorno nativo? Los métodos computacionales como la simulación de dinámica adhesiva10 o el modelo simple de estado estacionario11 han capturado ciertos detalles moleculares y cómo influyen en el comportamiento de rodadura, pero dependen en gran medida de la precisión de los parámetros y suposiciones de modelado. Otras técnicas como la microscopía de fuerza de tracción pueden detectar fuerzas durante la migración celular, pero no proporcionan suficiente resolución espacial o información cuantitativa sobre la tensión molecular. Ninguna de estas técnicas puede proporcionar observaciones experimentales directas de la dinámica temporal, la distribución espacial y la heterogeneidad de magnitud de las fuerzas moleculares, que se relacionan directamente con la función y el comportamiento celular en su entorno nativo.
Por lo tanto, la implementación de un sensor de fuerza molecular capaz de medir con precisión las interacciones mediadas por selectina es crucial para mejorar nuestra comprensión de la adhesión rodante. Aquí, describimos el protocolo para el ensayo de huella de adhesión12 donde las perlas recubiertas de PSGL-1 se enrollan sobre una superficie presentando ataduras de medidor de tensión funcionalizadas con p-selectina (TGT)13. Estos TGT son sensores de fuerza irreversibles basados en ADN que dan como resultado una historia permanente de eventos de ruptura en forma de lectura de fluorescencia. Esto se logra a través de la ruptura del TGT (dsDNA) y luego el posterior etiquetado del TGT roto (ssDNA) con una hebra complementaria marcada fluorescentemente. Una de las principales ventajas de este sistema es su compatibilidad con imágenes de difracción limitada y de superresolución. La hebra complementaria marcada fluorescentemente puede estar unida permanentemente (>12 pb) para imágenes limitadas por difracción o enlazada transitoriamente (7-9 pb) para imágenes de superresolución a través de DNA PAINT. Este es un sistema ideal para estudiar la adherencia a la rodadura ya que los TGT se rompen durante el laminado activo, pero la lectura de fluorescencia se analiza después del laminado. Los dos métodos de imagen también proporcionan al usuario más libertad para investigar la adherencia rodante. Por lo general, las imágenes limitadas por difracción son útiles para extraer la fuerza de ruptura molecular a través de la intensidad de la fluorescencia13, mientras que las imágenes de superresolución permiten el análisis cuantitativo de la densidad del receptor. Con la capacidad de investigar estas propiedades de la adhesión rodante, este enfoque proporciona una plataforma prometedora para comprender el mecanismo de regulación de la fuerza en la adhesión molecular de las células rodantes bajo flujo de cizallamiento.
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Protocol
1. Etiquetado e hibridación de oligonucleótidos
- Reducción de los enlaces disulfuro de proteína G
- Disolver 10 mg de Proteína G (ProtG) en 1 ml de agua ultrapura.
NOTA: La proteína G aquí se modifica con un solo residuo de cisteína en el extremo C y una etiqueta de polihistidina N-terminal. - Intercambio de búfer ≥20 μL de ProtG (10 mg/mL) en 1x PBS (pH 7.2) con una columna P6.
- Mida la concentración de proteína después del intercambio tampón.
NOTA: Concentración típica de 7-8 mg/ml. - Preparar 120 mM Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) disolviendo 3 mg de TCEP en 90 μL de 1x PBS (pH 7.2) seguido de 10 μL de 0.5 M EDTA.
NOTA: El TCEP debe estar recién preparado. - Añadir 4 μL de TCEP de 120 mM (480 nmol) a 20 μL de ProtG (4-5 nmol).
NOTA: Apunte a una relación molar de ~ 100: 1 TCEP a proteína. - Deje que la reacción continúe durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Elimine el exceso de TCEP del ProtG reducido con una columna P6 (búfer intercambiado en 1x PBS, pH 7.2).
- Mida la concentración del ProtG reducido con un espectrofotómetro UV/Vis y guarde los espectros.
NOTA: Concentración típica de 3.5-4.5 mg/mL.
- Disolver 10 mg de Proteína G (ProtG) en 1 ml de agua ultrapura.
- Reacción de ssDNA marcada con amina con Sulfo-SMCC
- Disolver el ssDNA marcado con aminas (amina-ssDNA) en agua libre de nucleasas a una concentración de 1 mM. Verifique la concentración de la hebra con un espectrofotómetro UV/Vis.
- Preparar 11,5 mM de solución de sulfo-SMCC (un reticulador hetero-bifuncional con éster de sulfo-NHS y maleimida) fresca disolviendo 2 mg de sulfo-SMCC en 400 μL de agua ultrapura y vórtice para mezclar.
- Añadir 6 μL del 1 mM de amina-ssDNA (6 nmol) a 5,2 μL de 11,5 mM de sulfo-SMCC (60 nmol) y 88,8 μL de 1x PBS (pH 7,2). Vórtice durante 5 s seguido de centrifugación a 8600 x g durante 3 min.
- Permita que la reacción continúe durante 30 minutos en RT.
- Eliminar el exceso de sulfo-SMCC del SMCC conjugado amina-ssDNA (mal-ssDNA) con una columna P6 (tampón intercambiado en 1x PBS, pH 7.2).
- Mida la concentración del mal-ssDNA con un espectrofotómetro UV/Vis y guarde los espectros.
NOTA: Concentración típica de 35-45 μM.
- Conjugación ProtG-ssDNA
- Añadir 21 μL de 4,5 mg/ml de ProtG reducido (3 nmol) al mal-ssDNA (~4-5 nmol).
NOTA: Los volúmenes y las concentraciones aquí son valores típicos. Ajuste de acuerdo con la medición experimental individual. Siempre asegure una cantidad excesiva de mal-ssDNA sobre ProtG en una proporción de ~ 1.5: 1. - Vórtice durante 5 s y permita que la reacción continúe durante 3 h en RT.
- Añadir 21 μL de 4,5 mg/ml de ProtG reducido (3 nmol) al mal-ssDNA (~4-5 nmol).
- Purificación y caracterización de ProtG-ssDNA
- Purifique el ProtG-ssDNA conjugado a través de su aislamiento de etiqueta con perlas magnéticas de ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA).
- Elimine el exceso de imidazol (tampón de elución de Ni-NTA) del producto con una columna P6 (tampón intercambiado en 1x PBS, pH 7.2).
NOTA: Este paso es esencial para cuantificar la conjugación, ya que el imidazol tiene una absorción significativa a 280 nm. - Utilice un espectrofotómetro UV/Vis para registrar los espectros del producto ProtG-ssDNA, así como el tampón de elución Ni-NTA (1x).
NOTA: La absorbancia típica de ProtG-ssDNA a 260 nm y 280 nm es de 0,8 y 0,6, respectivamente. - Para determinar la eficiencia de conjugación y la relación entre ProtG y ssDNA, utilice el script MATLAB escrito a medida (Supplemental Coding File 1) para descomponer el espectro del producto final en función de los tres espectros recopilados previamente (ProtG, SMCC-strand, búfer de elución de cuentas de Ni-NTA).
Nota : brevemente, el código funciona como se describe en los pasos 1.4.5-1.4.8. La concentración típica es de 4 μM de ProtG-ssDNA con ProtG y ssDNA en una relación molar de ~1:1 (Figura 2A). - Introduzca ProtG, SMCC-strand, búfer de elución de perlas Ni-NTA y los espectros ProtG-ssDNA UV/Vis en el script matlab
- Realizar una minimización no lineal multidimensional sin restricciones para reconstruir los espectros ProtG-ssDNA a partir de los espectros de origen (espectros de búfer de elución de cuentas ProtG, SMCC-strand y Ni-NTA)
NOTA: La función de minimización produce tres factores de transformación, uno para cada espectro de fuente. - Reconstruir los espectros ProtG-ssDNA multiplicando los espectros por su factor correspondiente y combinando los espectros de fuente transformados.
- Multiplique la concentración inicial de la cadena ProtG y SMCC por los factores de transformación correspondientes para determinar las concentraciones de la cadena SMCC y ProtG en el producto ProtG-ssDNA.
- (OPCIONAL) Ejecute PAGE nativo de acuerdo con la Figura 2B para ayudar a garantizar que cada componente y paso funcione como se esperaba.
- Hibridación TGT
- Hibridar ProtG-ssDNA (hebra superior) con hebra inferior biotinilada a una relación molar de 1.2:1 con concentraciones de 240 nM y 200 nM respectivamente en tampón T50M5 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) para hibridar la construcción completa de TGT. Deja hibridar en RT ≥1 h.
2. PEGilación superficial
- Limpieza de superficies
- Limpie un matraz Erlenmeyer y dos frascos de tinción por cada 8 fundas. Llene cada recipiente con una solución de KOH de 1 M y sonice durante 1 h en RT. Lave bien cada recipiente con agua ultrapura y séquelo con N2 o en un horno.
NOTA: Llene el KOH hasta la parte superior para tocar la tapa, de modo que también se limpien. - Enjuague bien cada funda con agua ultrapura y colóquelas en uno de los frascos de manchas limpias.
NOTA: Asegúrese de que no estén pegados entre sí o a la pared de los frascos de tinción. - En una campana extractora de humos, prepare recién una solución de piraña agregando 30 ml de peróxido de hidrógeno (30%) a 90 ml de ácido sulfúrico concentrado (95% -98%) en un vaso de precipitados de 250 ml.
PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico concentrado es altamente corrosivo. Agregue el peróxido de hidrógeno muy lentamente al ácido sulfúrico y revuelva cuidadosamente para mezclar. - Sumerja completamente las cubiertas en el frasco de tinción con la solución de piraña. Deje las fundas en piraña durante 30 minutos en la campana de humos.
PRECAUCIÓN: Enfríe la solución de piraña a no más de 80 ° C antes de verterla para evitar que se agriete el frasco de manchas. - Deseche la solución de piraña en un vaso de precipitados de 1000 ml y neutralice con el 1 M KOH de la limpieza de vidrios.
- (OPCIONAL) Repita la limpieza de pirañas (pasos 2.1.3-2.1.5) con una solución de piraña fresca.
- Enjuague las fundas con abundantes cantidades de agua ultrapura para eliminar toda la solución residual de piraña. Agite suavemente el frasco de tinción durante cada subida para facilitar la eliminación (se recomiendan 10 enjuagues).
- Enjuague las fundas con metanol 3 veces para eliminar el agua de la superficie de la funda y mantener las fundas sumergidas en metanol.
- Limpie un matraz Erlenmeyer y dos frascos de tinción por cada 8 fundas. Llene cada recipiente con una solución de KOH de 1 M y sonice durante 1 h en RT. Lave bien cada recipiente con agua ultrapura y séquelo con N2 o en un horno.
- Silanización de superficies
- Prepare una solución de aminosilano al 1% mezclando a fondo 94 ml de metanol, 1 ml de aminosilano y 5 ml de ácido acético glacial en el matraz Erlenmeyer limpio y seco. Vierta en el segundo frasco de tinción limpia y seco14.
- Transfiera los cubrehojas sumergidos debajo de la solución de metanol al frasco de tinción que contiene una solución de aminosilano al 1% y mantenga el frasco cubierto.
NOTA: No permita que las fundas se sequen mientras se transfieren a aminosilano para limitar la exposición de la superficie del vidrio al aire. - Incubar el frasco de tinción que contiene fundas en aminosilano durante 1 h a 70 °C en un horno15.
- Deseche cuidadosamente la solución de aminosilano en un recipiente de desecho separado y enjuague las hojas de cubierta en el frasco de tinción con metanol 5 veces para eliminar la solución de aminosilano.
- Enjuague las hojas de cubierta en el frasco de tinción con agua ultrapura 5 veces y séquelas con N2.
- Hornea las fundas secas en el frasco de tinción en un horno a 110 °C durante 20 min. Deje que las cubiertas se enfríen a RT, luego colóquelas en el bastidor PEGylation.
NOTA: Cubra el frasco de tinción con una tapa durante el horneado para minimizar la deposición particular y química en la superficie15.
- Preparación de la solución PEG
- Descongele PEG (polietilenglicol) y PEG-biotina a RT durante unos 30 min.
NOTA: Este paso minimiza la condensación de humedad que puede degradar el éster del NHS en PEG. - Haga tampón PEG agregando 84 mg de bicarbonato de sodio a 10 ml de agua ultrapura. Esta formulación debe proporcionar un tampón a pH 8.4.
- Para 8 cápsulas, cada una con un lado PEGilado con 20:1 PEG:PEG-biotina: mida 100 mg de PEG y 5 mg de PEG-biotina para agregar a 400 μL de tampón PEG. Vórtice la solución durante 30 s y centrífuga durante 1 min a la velocidad máxima (≥18000 x g).
NOTA: Este paso es sensible al tiempo, ya que la hidrólisis de éster SVA NHS comienza inmediatamente y tiene una vida media de 34 min a pH 8.0, con una vida media más corta a pH 8.4.
- Descongele PEG (polietilenglicol) y PEG-biotina a RT durante unos 30 min.
- Incubación de PEG y almacenamiento de coverslip
- Configure la cámara de humedad y coloque los cobertores en el interior.
- Agregue 90 μL de solución de PEG a una cubierta en la cámara de humedad y coloque una segunda cubierta sobre la solución de PEG utilizando pinzas de sujeción de la cubierta para extender uniformemente la solución de PEG.
- Asegúrese de que no haya burbujas en la solución que caigan sobre la cubierta. Baje un extremo de la segunda cubierta en la primera cubierta y deje caer lentamente el otro extremo para que no haya burbujas intercaladas entre las cubiertas.
NOTA: Las burbujas harán que ciertas áreas estén mal PEGiladas. - Repita hasta que todas las fundas tengan PEG (es decir, 8 fundas = 4 sándwiches de PEG). Incubar las soluciones peg durante la noche (~12 h) en RT en una cámara de humedad en la oscuridad16.
- Separe los pares de fundas y colóquelos en un frasco de tinción. Tenga en cuenta los lados PEGilados.
- Enjuague bien las fundas con agua ultrapura y séquelas con N2.
NOTA: Sostenga las cubiertas con pinzas y sople N2 a través de la superficie hacia la pinza para evitar que los contaminantes se sequen en la superficie. - Marque el lado no PEGylated con un punto en una esquina usando un marcador permanente o un bolígrafo de diamante.
- Coloque 2 hojas de cubierta PEGylated en tubos de correo con los lados PEGylated uno frente al otro para ayudar a identificar el lado PEGylated antes de su uso.
- Aspire el tubo durante 5 minutos y rellene con N2. Selle el tubo con parafilm.
- Guarde las cubiertas PEGylated a -20 °C en los tubos de correo sellados durante un máximo de 6 meses.
NOTA: Caliente los tubos de almacenamiento a RT antes del ensamblaje del chip. La condensación en las cubiertas durante el sellado causará fugas.
3. Preparación de la cámara de flujo
- Montaje de chips
- Extienda finamente una pequeña cantidad de epoxi en ambos lados de cinta de doble cara con una cuchilla de afeitar.
NOTA: Demasiado epoxi puede propagarse en el canal durante el montaje. - Corte con láser la cinta recubierta de epoxi para crear 4 canales. Cree el chip de flujo intercalando la cinta epoxi entre una corredera de 4 orificios y una cubierta PEG (Figura 1A).
- Usando una punta de pipeta, aplique una presión suave a lo largo de los canales para crear un buen sello. Curar el epoxi durante ≥1 h.
NOTA: No corte el vidrio para evitar deslizarse contra el epoxi.
- Extienda finamente una pequeña cantidad de epoxi en ambos lados de cinta de doble cara con una cuchilla de afeitar.
- Asamblea de cámara
- Alinee el chip de modo que la abertura de cada canal se coloque en los centros del adaptador (Figura 1A). Coloque dos espaciadores acrílicos transparentes en la parte superior del chip, aplique una presión firme en el medio del bloque y atornille dos tornillos de 4-40 en los extremos de cada espaciador.
NOTA: No fuerce el tornillo ni presione demasiado fuerte sobre los espaciadores, o el chip puede agrietarse. - En el otro lado del soporte, atornille las entradas en los orificios roscados. Controle la condición de sellado a través del bloque de acrílico transparente.
- A medida que el tubo hace contacto con la abertura del chip, selle la conexión girando suavemente el tubo en el sentido de las agujas del reloj.
NOTA: Las entradas demasiado apretadas pueden causar obstrucción del flujo, mientras que los contactos sueltos causarán fugas.
- Alinee el chip de modo que la abertura de cada canal se coloque en los centros del adaptador (Figura 1A). Coloque dos espaciadores acrílicos transparentes en la parte superior del chip, aplique una presión firme en el medio del bloque y atornille dos tornillos de 4-40 en los extremos de cada espaciador.
4. Preparación de la superficie
NOTA: Consulte la Figura 1B para ver el flujo de trabajo general.
- Agentes de bloqueo para evitar la unión inespecífica
- Utilice una pipeta para hacer fluir 200 μL de tampón de lavado (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 y 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) en la cámara para comprobar si hay fugas. Si se forman burbujas en el canal, empuje agresivamente 200 μL adicionales para eliminar las burbujas.
NOTA: Las burbujas de aire grandes que no se eliminan en este paso pueden desalojar y destruir la funcionalización de la superficie más adelante. - Añadir 40 μL de BSA (1% p/v) a la cámara de flujo para evitar la unión inespecífica e incubar durante 10 min.
- Asegúrese de agregar suficiente volumen durante cada período de incubación para llenar las cámaras de flujo y formar gotas en las entradas y salidas. Ajuste los volúmenes de incubación en consecuencia y realice todas las incubaciones en una cámara de humedad.
- Añadir 40 μL de Tween 20 (5% v/v) a la cámara de flujo. Incubar durante 10 min para reducir aún más la unión inespecífica.
- (OPCIONAL) Compruebe la superficie para una pasivación adecuada haciendo fluir las perlas de poliestireno a través del canal. Añadir 40 μL de perlas de poliestireno recubiertas de ProtG (0,01% p/v) e imagen con un microscopio de campo oscuro con un objetivo 10x. Si las cuentas no se adhieren a la superficie, continúe con el siguiente paso.
- Lave el canal con 200 μL de tampón de lavado para eliminar todos los agentes de pasivación.
- Utilice una pipeta para hacer fluir 200 μL de tampón de lavado (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 y 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) en la cámara para comprobar si hay fugas. Si se forman burbujas en el canal, empuje agresivamente 200 μL adicionales para eliminar las burbujas.
- Funcionalización de la superficie de la cámara
- Añadir 40 μL de estreptavidina (100 μg/ml) a la cámara de flujo e incubar durante 20 min. Luego, lavar con 200 μL de tampón de lavado.
- Añadir 40 μL de ProtG-TGT hibridado (100 nM) a la cámara de flujo e incubar durante 20 min. Luego, lavar con un tampón de lavado de 200 μL.
- Agregue 40 μL de hebra superior ProtG-TGT (100 nM) durante 20 minutos para completar cualquier hebra inferior TGT no hibridada en la superficie. Lavar con 200 μL de tampón de lavado.
- Añadir 40 μL de P-selectina-Fc (10 μg/mL) a la cámara de flujo e incubar durante 60 min. Luego, lavar con 200 μL de tampón de lavado.
NOTA: La duración de la incubación es crítica.
5. Experimento e imágenes
- Configuración del sistema de flujo
- Llene una jeringa de vidrio de 5 ml con el tampón de laminación (HBSS con 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa golpeando los lados de la jeringa para desalojar las burbujas y empujándolas hacia afuera a medida que flotan hacia la punta.
- Inserte una aguja estéril (26 G, 5/8 pulgadas de longitud) en un tubo de polietileno de ~200 mm (I.D: 0.38 mm; O.D: 1,09 mm) y conecte la aguja a la jeringa de vidrio.
NOTA: Asegúrese de que no quepa aire en ninguna parte del conector de la aguja. - Fije la jeringa en la bomba de la jeringa e incline la bomba de la jeringa de tal manera que el lado del émbolo esté elevado para evitar que las burbujas de aire entren en el canal. Inserte el extremo del tubo en la entrada de la cámara de flujo.
NOTA: Asegúrese de que el contacto de líquido a líquido al realizar la conexión deposite gotas en las entradas y tenga gotas al final del tubo de la jeringa. Asegúrese de que no entren burbujas de aire en el canal permitiendo que se forme una pequeña gota en el extremo del tubo de la jeringa antes de insertarlo en la entrada. - Inserte un extremo de otros 200 mm de la tubería de polietileno en la salida, y el otro extremo sumergido en un vaso de precipitados de desecho.
- Configuración para el laminado de celdas
- Cultivar células HL-60 en matraces de cultivo ventilados de 25 cm2 en medios IMDM suplementados con suero fetal bovino al 20% y antibióticos al 1% a 37 °C con 5% de CO2. Mantenga densidades celulares entre 1 x 105-2 × 106 células/ml.
- (OPCIONAL) Diferenciar las células HL-60 en un medio IMDM completo que contenga 1,25% de DMSO a una densidad inicial de 2 x 105 células/ml. Incubar las células para que estén más activas durante 5-6 días.
- Tome una muestra (1-2 ml) de la suspensión celular y la centrífuga (200 x g, 3 min) para granular las células.
- Retire el medio y vuelva a suspender suavemente las células en 500 μL del tampón rodante. Repita el paso de lavado dos veces para eliminar los desechos celulares.
- Mide la densidad celular con un hemocitómetro. Resuspendir los gránulos celulares con tampón rodante a una densidad de 2 x 105 celdas/ml.
- Desconecte cuidadosamente el tubo de las entradas/salidas y pipete 40 μL de la suspensión celular en la cámara de flujo. Vuelva a conectar el tubo como se describió anteriormente, asegúrese de que no se introduzcan burbujas en el canal de flujo.
- Comience el experimento de rodadura de celdas iniciando la bomba de jeringa a los caudales deseados.
NOTA: La intensidad de las pistas fluorescentes depende de la tensión de cizallamiento, y la menor tensión de cizallamiento de velocidad celular / velocidad celular generalmente producirá pistas más tenues (Figura 4A). Evite la alta densidad de celdas en la superficie o la duración excesiva del laminado para garantizar pistas separables de una sola celda (Figura 4B, C). - Use un microscopio de campo oscuro con un objetivo 10x para asegurarse de que se observe el balanceo celular.
- Una vez que se complete el experimento, retire las células del canal infundiendo el tampón rodante a 100 ml / h hasta que la superficie esté libre de células.
- Imágenes de pistas locales por "DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography" (DNA-PAINT)
- Añadir 40 μL de hebra de dna-PAINT imager (500 pM) en el tampón DNA-PAINT (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) al canal.
- Realice microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) utilizando una lente de objetivo TIRF de inmersión en aceite 100x. Adquiera más de 40000 fotogramas con un tiempo de exposición de 25 ms por fotograma a una ganancia de multiplicación de electrones (EM) de 300 utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD).
- Utilice el paquete de software Picasso17 para localizar y renderizar las imágenes de superresolución (Figura 4D) siguiendo los pasos 5.3.4-5.3.5.
- Cargue la película DNA-PAINT en el programa Localize para determinar la localización de cada fluoróforo en cada fotograma.
NOTA: Optimice la longitud del lado de la caja y los parámetros de gradiente neto mínimo hasta que solo se rastreen con precisión los fluoróforos. El parámetro De gradiente neto mínimo a menudo puede superar los 100000 para lograr un seguimiento óptimo. Ajuste: MLE, método gaussiano integrado produce el mejor resultado. Por último, si la película es demasiado larga, divídala en pilas de 10000 fotogramas para que el seguimiento de la vista previa en Localize funcione correctamente antes de recombinarlos en un archivo hdf5 final. - A continuación, cargue el archivo hdf5 resultante en el programa Render para realizar la corrección de deriva y la representación.
NOTA: Realice la corrección de deriva múltiple a través de Undrift by RCC para mejorar el resultado final.
- Obtención de imágenes de pistas largas mediante etiquetado permanente
- Agregue la hebra de generador de imágenes permanente e incube durante 120 s en el búfer T50M5. Lave el canal infundiendo 200 μL de tampón de lavado.
- Grabe una imagen con el láser de excitación desactivado para obtener el ruido de fondo de la cámara. Imagen de un área grande en un patrón de cuadrícula mediante microscopía TIRF.
NOTA: Se recomienda la superposición de marco sobre marco de ≥10% para costuras posteriores. - Programe el microscopio para escanear sobre el área de 400 x 50 imágenes (20000 imágenes en total). Usando el programa FIJI, divida los datos sin procesar en archivos tiff individuales, cada uno con un máximo de 10000 imágenes.
- Acople todas las imágenes utilizando el perfil de iluminación (Figura 3A-C) siguiendo los pasos 5.4.5-5.4.7.
- Reste el ruido de la cámara de fondo de cada fotograma. Obtenga la proyección media de la pila (perfil de iluminación) de cada fotograma restado de fondo.
- Normalice el perfil de iluminación por su valor máximo. Divida cada fotograma restado de fondo por el perfil de iluminación normalizado.
- Vuelva a escalar los fotogramas corregidos al rango apropiado para la profundidad de bits correspondiente.
- Utilice MIST18 para coser las imágenes (Figura 3D, E).
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Representative Results
El protocolo anterior describe el procedimiento experimental del ensayo de huella de adhesión. El flujo de trabajo general del experimento se ilustra en la Figura 1, desde el conjunto de la cámara de flujo (Figura 1A) hasta la funcionalización de la superficie (Figura 1B) y los pasos de experimento e imagen (Figura 1C).
La Figura 2 es un resultado representativo para la caracterización de la bioconjugación ProtG-ssDNA. Los espectros UV/Vis de tres componentes en el producto final, a saber, ProtG, mal-ssDNA y tampón de elución de imidazol, se recolectaron antes de la conjugación final (Figura 2A), cada uno correspondiente a una concentración conocida. Estos espectros forman la base ortogonal para ajustarse al espectro de productos de bioconjugación, donde los tres parámetros desconocidos son sus concentraciones. Se utilizó una función personalizada en MATLAB para determinar las concentraciones. Los resultados muestran una relación de casi 1:1 de ProtG a ssDNA (Figura 2A). Esto es como se esperaba porque el ssDNA tiene solo una modificación de amina, y el ProtG tiene una sola cisteína diseñada en su terminal C. Este enfoque es más ventajoso que el enfoque reportado anteriormente19 que utiliza un solo ADN modificado por tiol para apuntar a la multitud de aminas primarias en ProtG, donde la relación de conjugación no se puede mantener fácilmente.
Además, se utilizó PAGE nativo para confirmar la bioconjugación (Figura 2B). El ADN está teñido por GelGreen y las proteínas por Coomassie blue, respectivamente. Como GelGreen tiñe el dsDNA con más fuerza que el ssDNA, se espera que cualquier banda de ssDNA sea más tenue que la concentración molar igual de las bandas de dsDNA (carriles 3, 4). Debido a que el stock ProtG contiene un residuo de cisteína C-terminal, una fracción de las proteínas forman dímeros a través de un enlace disulfuro, como se ve en el carril 5 (Figura 2B). El ProtG reducido, por otro lado, muestra una sola banda (carril 6). Cuando se utiliza el stock ProtG en la conjugación de ADN directamente, el ProtG dimerizado por disulfuro no reacciona al ADN y se muestra como una banda sin ninguna tinción GelGreen (carriles 7, 8). La banda del dímero ProtG desaparece en el producto de conjugación utilizando ProtG reducido (carriles 9, 10). Debido a que se utiliza un exceso de mal-ssDNA a ProtG (1.5:1) durante la conjugación, solo las bandas TGT son visibles en el producto final de conjugación (carriles 8, 10). Las brillantes bandas GelGreen que coinciden con la banda monomérica ProtG indican una conjugación exitosa y un buen rendimiento.
La Figura 3 ilustra imágenes representativas de microscopía en bruto y el flujo de trabajo para corregirlas para su posterior costura y análisis de imágenes. El perfil de iluminación TIRF introducido a partir de una fibra monomodo es generalmente más brillante en el centro del campo de visión y más tenue alrededor de los bordes (Figura 3A, B). Para compensar la iluminación desigual y aplanar las imágenes para el análisis cuantitativo, el perfil de iluminación se determinó promediando miles de fotogramas individuales (Figura 3B). Las imágenes aplanadas se produjeron restando el ruido de la cámara de los perfiles raw y de iluminación y luego normalizándose por el perfil de iluminación (Figura 3C). El efecto de aplanamiento de la imagen se ilustra claramente cuando las imágenes se cosen para formar una imagen grande. La intensidad de la imagen en las regiones de fondo sin ninguna pista de celda muestra patrones periódicos claros correspondientes a las imágenes no corregidas (Figura 3D). El mismo campo de visión cosido a partir de imágenes aplanadas produce un fondo plano (Figura 3E). Tener un fondo plano es fundamental para interpretar las fluctuaciones de intensidades a lo largo de una pista celular. Como primer experimento, se utiliza un perfil de flujo de aceleración similar al ilustrado en la Figura 3F para determinar el rango de tensión de cizallamiento adecuado para el experimento, asegurando tanto el rodadura estable de las células como las pistas de células fluorescentes claras. Una huella de adhesión típica de una sola célula bajo este perfil de flujo se muestra en la Figura 3G, donde la intensidad aumenta a medida que aumenta la tensión de cizallamiento hasta que la celda ya no puede sostener el laminado a alta tensión de cizallamiento y separarse de la superficie, marcando el final de una sola pista.
La Figura 4 ilustra los resultados potenciales de los resultados experimentales representativos subóptimos a óptimos. La Figura 4A ilustra un resultado subóptimo en el que las pistas fluorescentes tienen una baja relación señal-ruido. Esto es probablemente causado por una baja densidad superficial de las sondas completamente conjugadas o un bajo caudal. La Figura 4B ilustra otro resultado subóptimo en el que las pistas fluorescentes están demasiado densamente empaquetadas para resolver y aislar pistas individuales para su posterior análisis. La Figura 4C es un ejemplo de un buen resultado en el que las pistas individuales se pueden resolver a larga distancia y son claras en el fondo. La Figura 4D es un ejemplo de la imagen TIRF limitada por difracción (mitad izquierda) en comparación con la misma pista fotografiada por DNA-PAINT (mitad derecha). El DNA-PAINT en esta configuración produce una precisión NeNA (análisis basado en el vecino más cercano) de 28,8 nm.
Figura 1: Flujo de trabajo del experimento del ensayo de huella de adhesión. (A) Montaje de la celda de flujo y la cámara de flujo. (B) Pasivación y funcionalización de la superficie. Cada paso de incubación está marcado por la duración, seguido de un paso de lavado. (C) Experimento de rodadura celular e imágenes. Las células que ruedan sobre la superficie descomprimirán el ADN donde se forman las interacciones de adhesión, dejando ssDNA en la superficie que marca la ubicación de cada evento de adhesión. La superficie está etiquetada con el generador de imágenes permanente ssDNA para imágenes de área extensa, lo que requiere una tinción de 2 minutos antes de lavarse. Para las imágenes DNA-PAINT de superresolución, la hebra del generador de imágenes se mantiene en el búfer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización de la bioconjugación. (A) Absorbancia UV-VIS del producto de bioconjugación purificada De-NTA (azul) y el ajuste de la curva (rojo) para determinar la relación de conjugación. Los espectros de absorción de ProtG (magenta), mal-ssDNA (verde) e imidazol (gris) se utilizaron como componentes para crear el mejor ajuste (rojo) al espectro del producto (azul). El residuo del ajuste se muestra como la línea discontinua negra. Esto nos permite determinar la concentración de ProtG y ssDNA en el producto de bioconjugación purificado y su relación molar. (B) PAGE nativo de componentes en el procedimiento de bioconjugación. El primer carril muestra una escalera de ADN de bajo peso molecular (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 pb). La imagen del gel es de color falso, con Tinción de ADN GelGreen en verde y Tinción de proteína azul Coomassie (invertida) en magenta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procesamiento de imágenes y resultados representativos de imágenes de área extensa. (A) Miles de imágenes TIRF sin procesar que embaldosan un área extensa. (B) Perfil de iluminación derivado de las imágenes en bruto. (C) Imágenes corregidas aplanando el perfil de iluminación. (D) Imagen cosida de mosaicos de imágenes sin procesar. El perfil de iluminación desigual se puede ver como patrones periódicos en la imagen. Los cuadros azul y rojo indican las secciones de imagen donde se proyectan los perfiles de intensidad media (trazas azules y rojas). Los valores de intensidad media (unidad arbitraria) representan los de las imágenes de 8 bits (0-255). (E) Misma área que (D) pero cosida usando imágenes aplanadas. Las proyecciones no muestran ningún patrón periódico a gran escala. (F) El perfil de tensión de cizallamiento que se utilizará en los experimentos para determinar el rango de tensiones de corte que resultan en el laminado celular y el rendimiento de las pistas de fluorescencia. (G) Una pista fluorescente de muestra de una sola celda bajo el perfil de flujo ilustrado en (F). La célula viaja de izquierda a derecha, la intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que aumenta la tensión de cizallamiento hasta que la célula ya no puede sostener el balanceo y se separa de la superficie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos subóptimos y óptimos. (A) Un ejemplo de pistas fluorescentes con contraste insuficiente. (B) Un ejemplo de densidad excesiva de vías fluorescentes. (C) Un ejemplo de densidad y contraste óptimos de la vía. Las tres imágenes fueron adquiridas en las mismas condiciones, aplanadas y cosidas. Los cuadros rojos en cada imagen representan el área donde se tomaron las proyecciones de intensidad (derecha). (D) Una pista fluorescente que se muestra en imágenes de difracción limitada (mitad izquierda) y DNA-PAINT (mitad derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Problema | Posible razón | Solución | |
| La cinta epoxi no se corta correctamente | Capa epoxi demasiado gruesa | Adelgaza la capa epoxi tanto como sea posible con la cuchilla de afeitar | |
| Potencia y velocidad del grabador láser no optimizadas | Optimice la potencia y la velocidad del grabador láser | ||
| Burbujas pegadas en los lados de la cámara de flujo | Introducción inicial inadecuada del líquido | Empuje las soluciones de búfer a través del canal a un alto caudal para lavar las burbujas | |
| Las burbujas pasan a través de la cámara de flujo | Introducción inadecuada de líquido a través de la entrada y salida | Asegúrese de que haya una gota de líquido en el tubo de entrada para garantizar el contacto de líquido a líquido entre la punta de la pipeta y la entrada | |
| Las burbujas de la jeringa entraron en la línea de flujo | Incline la bomba de la jeringa para asegurarse de que las burbujas queden atrapadas en el extremo del émbolo | ||
| El líquido no puede entrar en los canales | Entradas atornilladas demasiado apretadas | Ajuste para optimizar el sellado. El tubo de entrada solo debe tocar la abertura del canal cuando se atornille correctamente. | |
| Fuga del canal | El epoxi no se ha curado por completo | Vuelva a hacer los canales, asegúrese de usar epoxi de curado rápido de 5 minutos y deje curar durante al menos 1 h | |
| Entradas que no se sellan correctamente | Ajuste para optimizar el sellado | ||
| Células atascadas | PeGilación deficiente que conduce a una unión inespecífica | Idealmente, rehacer PEG. Además, puede intentar incubar agentes bloqueadores adicionales (BSA y Tween-20) y agregar agentes de bloqueo al tampón de lavado. | |
| Pasivación superficial destruida por grandes burbujas de aire que pasan a través del canal | Asegúrese de que ninguna burbuja pase por el canal | ||
| Problema con las células | Use HL-60 2 semanas después de reiniciar el cultivo celular de congelado. Confirme el laminado de la celda en la superficie de control con solo P-selectina. | ||
| Las células no tienen o tienen interacciones escasas con la superficie | Densidad de P-selectina demasiado baja, como resultado de una funcionalización superficial deficiente y / o una bioconjugación deficiente | Primero, use ProtG-biotina en lugar de ProtG-TGT como control para determinar si el problema se debe a la bioconjugación o a la densidad de biotina superficial. Después de garantizar la calidad de la bioconjugación y la densidad de biotina superficial, aumente la concentración de TGT-ProtG y P-selectina-Fc y el tiempo de incubación. | |
| Las células ruedan pero no producen pistas fluorescentes | Interacciones de adhesión demasiado débiles para romper TGT | Aumente el caudal durante el experimento de rodadura para aumentar la fuerza de interacción. Recomendamos un perfil de flujo de rampa inicial (Figura 3F) para encontrar el caudal óptimo que produzca pistas de rodadura y fluorescencia estables (Figura 3G) | |
| La superficie de mala calidad conduce a una alta fluorescencia de fondo y un contraste insuficiente para ver las pistas. | Comprobar la pasivación de la superficie | ||
Tabla 1: Solución de problemas. La tabla enumera las posibles razones y soluciones para los problemas que ocurren al realizar este ensayo
Archivo de codificación suplementario 1: El script matlab escrito a medida para descomponer el espectro del producto final en función de los tres espectros recopilados previamente (ProtG, SMCC-strand, ni-NTA bead elution buffer) para determinar la eficiencia de conjugación y la relación de ProtG a ssDNA. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El ensayo de huella de adhesión permite la visualización de los eventos de adhesión molecular entre PSGL-1 y P-selectina durante la adhesión de rodadura celular. Este proceso se inicia mediante la captura mediada por P-selectina seguida de laminación bajo tensión de cizallamiento fluídico. Los problemas potenciales durante el experimento generalmente involucran un rodado celular deficiente o pistas fluorescentes faltantes, incluso cuando las células ruedan bien. Estos problemas a menudo son el resultado de controles de calidad en los pasos críticos del protocolo, como se enumera en la tabla de solución de problemas (Tabla 1).
Se requiere que las biomoléculas y los tampones se filtren y almacenen a 4 ° C para evitar la contaminación porque la preparación de la superficie implica múltiples pasos. La pasivación superficial de alta calidad es un requisito para lograr una densidad de funcionalización superficial adecuada y reducir la unión inespecífica de biomoléculas. La unión inespecífica de biomoléculas a la superficie puede crear un fondo de alta fluorescencia, interfiriendo con las imágenes de fluorescencia de una sola molécula y el análisis de datos estadísticos. Múltiples factores pueden afectar la pasivación de la superficie. La hidrólisis de aminosilano y PEG-NHS produce una eficiencia mucho menor de PEGylation. El lavado suficiente de KOH y la limpieza de pirañas mejoran la hidrofilia al generar grupos hidroxilo libres en la superficie del vidrio, aumentando la densidad del grupo químicamente reactivo. Las células se pegarían en superficies mal pasivadas. La calidad de la pasivación superficial se comprueba midiendo la intensidad de la fluorescencia de fondo antes y después de la PEGilación utilizando biomoléculas fluorescentes.
La densidad superficial de los ligandos es un factor crítico para el laminado celular, que está controlado por la relación PEG: PEG-biotina, hibridación TGT y unión a P-selectina. En este sistema, una relación PEG:PEG-biotina de 20:1 es suficiente para la funcionalización de la superficie con suficiente P-selectina para el laminado celular. La hibridación eficiente de TGT también mejora la densidad de la superficie y la relación señal-ruido de las pistas fluorescentes. Este protocolo incluye un paso de reposición de TGT-ProtG de hilo superior para garantizar que cualquier hebra inferior de TGT no hibridada se complemente antes de los experimentos. La conjugación del ADN a ProtG también afecta la densidad de la superficie. El enlazador Sulfo-SMCC se agregó al ADN en un exceso molar de 10 veces para que todo el ADN reaccionara con el enlazador. Se utilizó ProtG con un solo residuo de cisteína (ProtG-Cys) en el extremo C para lograr una relación de conjugación 1:1 ADN:ProtG. Debido a que el ProtG-Cys puede formar dímeros a través de enlaces disulfuro, se necesita tratamiento de TCEP para reducir el enlace disulfuro antes de las reacciones de reticulación reactivas a sulfhidrilo. El ADN conjugado con proteínas y la hibridación TGT se pueden validar con análisis PAGE nativos, en el que el ADN conjugado y el ADN dúplex mostrarán la movilidad retardada debido al aumento del peso molecular. La eficiencia del ensamblaje también se puede estimar mediante densitometría en gel (Figura 2B). Los cuidadosos procesos de PEGilación y bioconjugación son cruciales para producir una superficie consistente. Ocasionalmente, el estado celular puede afectar el balanceo de la célula y la formación de la pista. Aunque no se ha reportado la expresión de PSGL-1 sobre la densidad celular, la densidad celular es un potente regulador del ciclo celular y la expresión de proteínas durante la fase de crecimiento.
Dado que PSGL-1 también funciona como un receptor de transducción de señales y regula la proliferación celular20,21, las condiciones de cultivo como la densidad celular se mantienen para un nivel de expresión consistente y la capacidad de unión de PSGL-1. La fijación de P-selectina-Fc mediada por ProtG en la superficie es crucial para la adhesión y el laminado de las células. La cinética de unión de P-selectina a ProtG depende de la concentración. Las concentraciones más bajas de P-selectina conducen a un aumento del tiempo para alcanzar el equilibrio. Se requieren al menos 30 min para la unión a la saturación para concentraciones inferiores a 100 nM22. Se utilizaron 10 nM de P-selectina para reducir la unión inespecífica a la superficie y aumentar el tiempo de incubación para una interacción suficiente con ProtG. Una incubación de 1 h es tiempo suficiente para inducir la adhesión celular y el laminado en este sistema.
El TGT y su correspondiente vida útil dependiente de la fuerza es un factor importante en los resultados de este ensayo. Durante la adhesión de rodadura, la fuerza sobre la correa se transmite a través de la interacción TGT y P-selectina: PSGL-1. Cada uno de estos componentes individuales tiene una vida útil única dependiente de la fuerza, y dependiendo de la fuerza aplicada, la probabilidad de ruptura favorecerá a uno sobre el otro. Por ejemplo, se ha demostrado que al utilizar el TGT descrito en este artículo, a fuerzas inferiores a 13,6 pN, P-selectina: PSGL-1 se disocia principalmente, mientras que por encima de 13,6 pN, el TGT se disocia principalmente13. Esto es importante de entender al realizar este ensayo porque si la tensión de cizallamiento es demasiado baja o las perlas están rodando demasiado lentamente, los eventos de ruptura serán principalmente la interacción P-selectina: PSGL-1, y habrá una señal de fluorescencia mínima o nula medible de los TGT. El umbral de tensión del TGT también influirá en los resultados. Si el TGT se rompe a una fuerza demasiado alta, los eventos de ruptura serán principalmente P-selectina: PSGL-1, y habrá una señal de fluorescencia mínima.
El método descrito aquí permite el análisis de las fuerzas de ruptura molecular, así como las ubicaciones de los eventos de adhesión molecular involucrados en la adhesión rodante. En lugar de la detección de adherencia en tiempo real, la ventaja más significativa de este método es que permite imágenes y análisis posteriores al experimento. Una vez que la huella de adhesión se ha dejado en la superficie en forma de ssDNA, las pistas aún se pueden visualizar después de 12 h si los canales de flujo se mantienen en un refrigerador de 4 ° C en una cámara de humedad oscura con entradas y salidas bloqueadas para evitar el secado. La interpretación de la lectura de fluorescencia para este ensayo depende del método de imagen elegido. A través de imágenes de superresolución, este ensayo logra una alta resolución espacial (<50 nm) que permite el análisis cuantitativo de la densidad de TGT rotos13. El análisis de la densidad del receptor o la densidad de TGT rota sería útil para investigar el comportamiento de adhesión rodante en diferentes condiciones. Por el contrario, las imágenes limitadas por difracción no proporcionan una alta resolución espacial; sin embargo, permite obtener imágenes de una gran área de superficie para analizar las pistas de fluorescencia de múltiples cuentas en cientos de campos de visión. Esto es ventajoso ya que la intensidad de fluorescencia de una pista se puede analizar para una sola cuenta a lo largo de una gran distancia, proporcionando información sobre los cambios en el comportamiento de rodadura a lo largo del tiempo. Tal ejemplo es cambiar el esfuerzo cortante con el tiempo y observar los cambios correspondientes en la intensidad de la fluorescencia. Recientemente, se ha demostrado que a través de un modelo simple, la intensidad de fluorescencia de las pistas se puede utilizar para estimar la distribución de la fuerza molecular13. También existe una posible aplicación de métodos ratiométricos para lograr la cuantificación de la fuerza con este ensayo23.
Debido a que el balanceo celular ocurre rápidamente (10 s de μm / s) y a una distancia extendida (1000 s de μm), el estudio de su tensión molecular ha sido un desafío con los sensores de tensión molecular tradicionales en tiempo real. El ensayo de huella de adhesión rompe esta exigente restricción para permitir la obtención de imágenes posteriores al evento. Aunque el evento de ruptura TGT no reporta directamente la magnitud de la tensión experimentada antes de la ruptura, se han realizado avances prometedores en el análisis de las pistas de fluorescencia para permitir la investigación cuantitativa de las fuerzas moleculares involucradas en la adhesión rodante13,23,24.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Canadiense de Innovación (CFI 35492), natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) y el University of British Columbia Eminence Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
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