Summary
Detta protokoll presenterar de experimentella förfarandena för att utföra vidhäftning fotavtryck analys för att avbilda vidhäftning händelser under snabb cell rullande vidhäftning.
Abstract
Rullande vidhäftning, underlättad av selectin-medierade interaktioner, är en mycket dynamisk, passiv motilitet i rekrytering av leukocyter till inflammationsplatsen. Detta fenomen förekommer i postkapillär venule, där blodflödet skjuter leukocyter i en rullande rörelse på endotelcellerna. Stabil rullning kräver en delikat balans mellan vidhäftningsbindningsbildning och deras mekaniskt drivna dissociation, vilket gör att cellen kan förbli fastsatt på ytan medan den rullar i flödesriktningen. Till skillnad från andra vidhäftningsprocesser som förekommer i relativt statiska miljöer är rullande vidhäftning mycket dynamiskt eftersom de rullande cellerna färdas över tusentals mikron med tiotals mikron per sekund. Följaktligen är konventionella mekanobiologi metoder såsom dragkraft mikroskopi olämpliga för att mäta de enskilda vidhäftningshändelserna och de associerade molekylära krafterna på grund av den korta tidsskala och hög känslighet som krävs. Här beskriver vi vår senaste implementering av vidhäftningsavtrycksanalysen för att avbilda P-selectin: PSGL-1 interaktioner i rullande vidhäftning på molekylär nivå. Denna metod använder irreversibla DNA-baserade spänningsmätare tjudrar för att producera en permanent historia av molekylära vidhäftningshändelser i form av fluorescensspår. Dessa spår kan avbildas på två sätt: (1) sy ihop tusentals diffraktionsbegränsade bilder för att producera ett stort synfält, vilket möjliggör extraktion av vidhäftningsavtryck för varje rullande cell över tusentals mikron i längd, (2) utför DNA-PAINT för att rekonstruera superupplösningsbilder av fluorescensspåren inom ett litet synfält. I denna studie användes vidhäftningsavtrycksanalysen för att studera HL-60 celler som rullar vid olika skjuvspänningar. På så sätt kunde vi avbilda den rumsliga fördelningen av P-selectin: PSGL-1 interaktion och få insikt i deras molekylära krafter genom fluorescensintensitet. Således ger denna metod grunden för den kvantitativa undersökningen av de olika cell-ytan interaktioner som är involverade i rullande vidhäftning på molekylär nivå.
Introduction
Den rullande vidhäftningskaskaden beskriver hur cirkulerande celler tjudrar till och rullar längs blodkärlsväggen1. Passiv rullning förmedlas främst av selectins, en stor klass av cellulära vidhäftning molekyler (CAMs)1. Under skjuvningsflödet av blod bildar leukocyter som uttrycker P-selectin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1) mycket övergående bindningar med P-selectin, som kan uttryckas på ytan av inflammerade endotelceller. Denna process är avgörande för att leukocyter migrerar till en inflammationsplats2. Dessutom är PSGL-1 också en mekanosensitiv receptor som kan utlösa det efterföljande fasta vidhäftningsstadiet i den rullande vidhäftningskaskaden vid dess engagemang med P-selectin3.
Genetiska mutationer som påverkar CAM-funktionen kan allvarligt påverka immunsystemet, såsom i den sällsynta sjukdomen av leukocyt vidhäftning brist (LAD), där fel på vidhäftning molekyler som medlar rullande leder till allvarligt immunkomprometterade individer4,5,6. Dessutom har cirkulerande tumörceller visat sig migrera efter en liknande rullande process, vilket leder till metastasering7,8. Men eftersom cellrullning är snabb och dynamisk, är konventionella experimentella mekanobiologimetoder olämpliga för att studera molekylära interaktioner under cellrullning. Medan encelliga och enmolekyliga manipuleringsmetoder som atomkraftmikroskopi och optisk pincett kunde studera molekylära interaktioner som P-selectins kraftberoende interaktion med PSGL-1 på enmolekylsnivå9, är de olämpliga för att undersöka levande vidhäftningshändelser under cellrullning. Dessutom kan interaktionen som kännetecknas in vitro inte direkt svara på frågan om molekylär vidhäftning in vivo. Till exempel, vilket molekylärt spänningsområde är biologiskt relevant när celler fungerar i sin ursprungliga miljö? Beräkningsmetoder som limdynamiksimulering10 eller enkel steady-state model11 har fångat vissa molekylära detaljer och hur de påverkar det rullande beteendet men är mycket beroende av noggrannheten hos modelleringsparametrarna och antagandena. Andra tekniker som dragkraftmikroskopi kan detektera krafter under cellmigration men ger inte tillräcklig rumslig upplösning eller kvantitativ information om molekylär spänning. Ingen av dessa tekniker kan ge direkta experimentella observationer av temporal dynamik, rumslig fördelning och magnitud heterogenitet av molekylära krafter, som direkt relaterar till cell funktion och beteende i deras ursprungliga miljö.
Därför är implementering av en molekylär kraftsensor som exakt kan mäta utvalda interaktioner avgörande för att förbättra vår förståelse av rullande vidhäftning. Här beskriver vi protokollet för vidhäftningsavtrycksanalys12 där PSGL-1-belagda pärlor rullas på en yta som presenterar p-selectin funktionaliserade spänningsmätare tjudrar (TGTs)13. Dessa TGTs är irreversibla DNA-baserade kraftsensorer som resulterar i en permanent historia av sprängning händelser i form av fluorescens avläsning. Detta uppnås genom att TGT (dsDNA) sprack och sedan efterföljande märkning av den brusten TGT (ssDNA) med en fluorescerande märkt kompletterande sträng. En stor fördel med detta system är dess kompatibilitet med både diffraktionsbegränsad och superupplösningsavbildning. Den fluorescerande märkta kompletterande delen kan antingen vara permanent bunden (>12 bp) för diffraktionsbegränsad avbildning eller övergående bunden (7-9 bp) för superupplösningsavbildning genom DNA PAINT. Detta är ett idealiskt system för att studera rullande vidhäftning eftersom TGTs bryts under aktiv rullning, men fluorescens avläsningen analyseras efter rullning. De två bildbehandlingsmetoderna ger också användaren större frihet att undersöka rullande vidhäftning. Vanligtvis är diffraktionsbegränsad avbildning användbar för att extrahera molekylär sprängkraft genom fluorescensintensitet13, medan superupplösningsavbildning möjliggör kvantitativ analys av receptordensitet. Med förmågan att undersöka dessa egenskaper hos rullande vidhäftning ger detta tillvägagångssätt en lovande plattform för att förstå kraftregleringsmekanismen för molekylär vidhäftning av rullande celler under skjuvflöde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oligonukleotidmärkning och hybridisering
- Minskning av protein G disulfidbindningar
- Lös upp 10 mg protein G (ProtG) i 1 ml ultrapurvatten.
OBS: Protein G här modifieras med en enda cysteinrester vid C-ändstationen och en N-terminus poly-histidine tagg. - Buffertutbyte ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) till 1x PBS (pH 7.2) med en P6-kolumn.
- Mät proteinkoncentrationen efter buffertutbyte.
OBS: Typisk koncentration på 7-8 mg/ml. - Förbered 120 mM Tris(2-karboxyletyl)fosfin (TCEP) genom att lösa upp 3 mg TCEP till 90 μL 1x PBS (pH 7,2) följt av 10 μL 0,5 M EDTA.
OBS: TCEP bör vara nyberedd. - Tillsätt 4 μL 120 mM TCEP (480 nmol) till 20 μL ProtG (4-5 nmol).
OBS: Sikta på ett molarförhållande på ~100:1 TCEP till protein. - Låt reaktionen fortsätta i 30 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort överflödig TCEP från den reducerade ProtG med en P6-kolumn (buffert utbytt i 1x PBS, pH 7.2).
- Mät koncentrationen av den reducerade ProtG med en UV/Vis spektrofotometer och spara spektrat.
OBS: Typisk koncentration på 3,5-4,5 mg/ml.
- Lös upp 10 mg protein G (ProtG) i 1 ml ultrapurvatten.
- Amine-märkt ssDNA reaktion med Sulfo-SMCC
- Lös upp aminmärkt ssDNA (amine-ssDNA) i nukleasfritt vatten till en koncentration av 1 mM. Kontrollera strängkoncentrationen med en UV/Vis spektrofotometer.
- Förbered 11,5 mM sulfo-SMCC (en hetero-bifunctional tvärlänk med sulfo-NHS ester och maleimide) lösning färsk genom att lösa upp 2 mg sulfo-SMCC i 400 μL ultrapure vatten och virvel att blanda.
- Tillsätt 6 μL av 1 mM amine-ssDNA (6 nmol) till 5,2 μL av 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) och 88,8 μL 1x PBS (pH 7,2). Virvel i 5 s följt av centrifugering vid 8600 x g i 3 min.
- Låt reaktionen fortsätta i 30 min på RT.
- Ta bort överskott av sulfo-SMCC från SMCC konjugerad amine-ssDNA (mal-ssDNA) med en P6-kolumn (buffert utbytt i 1x PBS, pH 7.2).
- Mät koncentrationen av mal-ssDNA med en UV/Vis spektrofotometer och spara spektra.
OBS: Typisk koncentration på 35-45 μM.
- ProtG-ssDNA konjugation
- Tillsätt 21 μL 4,5 mg/ml reducerad ProtG (3 nmol) till mal-ssDNA (~4-5 nmol).
OBS: Volymer och koncentrationer här är typiska värden. Justera enligt individuell experimentell mätning. Se alltid till att en överskjutande mängd mal-ssDNA över ProtG i ett förhållande av ~ 1.5:1. - Vortex i 5 s och låt reaktionen fortsätta i 3 h på RT.
- Tillsätt 21 μL 4,5 mg/ml reducerad ProtG (3 nmol) till mal-ssDNA (~4-5 nmol).
- ProtG-ssDNA rening och karakterisering
- Rena den konjugerade ProtG-ssDNA genom hans-tagg isolering med magnetisk nickel-nitrilotriacetic syra (Ni-NTA) pärlor.
- Ta bort överskott av imidazol (Ni-NTA elutionbuffert) från produkten med en P6-kolumn (buffert utbytt i 1x PBS, pH 7.2).
OBS: Detta steg är viktigt för att kvantifiera konjugationen, eftersom imidazol har betydande absorption vid 280 nm. - Använd en UV/Vis-spektrofotometer för att registrera spektrat för produkten ProtG-ssDNA samt Ni-NTA elutionbuffert (1x).
OBS: Typisk ProtG-ssDNA absorbans vid 260 nm och 280 nm är 0,8 respektive 0,6. - För att bestämma konjugationseffektiviteten och förhållandet mellan ProtG och ssDNA, använd det specialskrivna MATLAB-skriptet (Supplemental Coding File 1) för att sönderdela slutproduktspektrumet baserat på de tre spektra som samlats in tidigare (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA pärla elution buffert).
Obs: Kortfattat fungerar koden enligt beskrivningen i steg 1.4.5-1.4.8. Den typiska koncentrationen är 4 μM ProtG-ssDNA med ProtG och ssDNA vid ett molarförhållande ~1:1 (figur 2A). - Input ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA pärla elution buffert och ProtG-ssDNA UV/Vis spektra i MATLAB-skriptet
- Utför en flerdimensionell obehindrad ickelinjär minimering för att rekonstruera ProtG-ssDNA-spektrat från källspektra (ProtG, SMCC-strand och Ni-NTA bead elution buffer spectra)
OBS: Minimeringsfunktionen utdata tre omvandlingsfaktorer, en för varje källspektra. - Rekonstruera ProtG-ssDNA-spektrat genom att multiplicera spektrat med motsvarande faktor och kombinera det omvandlade källspektrat.
- Multiplicera den ursprungliga koncentrationen av ProtG- och SMCC-strängen med motsvarande omvandlingsfaktorer för att bestämma koncentrationerna av SMCC-strand och ProtG i ProtG-ssDNA-produkten.
- (VALFRITT) Kör inbyggd SIDA enligt figur 2B för att se till att varje komponent och steg fungerar som förväntat.
- TGT-hybridisering
- Hybridisera ProtG-ssDNA (toppsträng) med biotinylerad bottensträng vid ett molarförhållande på 1,2:1 med koncentrationer på 240 nM respektive 200 nM i T50M5-buffert (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) för att hybridisera hela TGT-konstruktionen. Låt hybridisera på RT ≥1 h.
2. Pegylation på ytan
- Ytrengöring
- Rengör en Erlenmeyerkolv och två färgburkar för varje 8 täcken. Fyll varje behållare med 1 M KOH-lösning och sonkat i 1 h vid RT. Tvätta varje behållare noggrant med extremt vatten och torka med N2 eller i en ugn.
OBS: Fyll KOH högst upp för att röra vid locket, så att de också rengörs. - Skölj noggrant varje täcksläck med ultrapure vatten och placera dem i en av de rengjorda färgburkarna.
OBS: Se till att de inte sitter fast på varandra eller på väggen i färgburkarna. - I en rökhuv, nyberöm en pirayalösning genom att tillsätta 30 ml väteperoxid (30%) till 90 ml koncentrerad (95%-98%) svavelsyra i en 250 ml bägare.
VARNING: Koncentrerad svavelsyra är mycket frätande. Tillsätt väteperoxiden mycket långsamt till svavelsyran och virvla försiktigt runt för att blanda. - Doppa täcket helt i färgburken med piranhalösningen. Lämna täcken i piranha i 30 min i rökhuven.
VARNING: Kyl ner piranhalösningen till högst 80 °C innan du häller för att förhindra sprickbildning av färgburken. - Kassera piranhalösningen i en 1000 ml bägare och neutralisera med 1 M KOH från glasrengöring.
- (VALFRITT) Upprepa piranharengöring (steg 2.1.3-2.1.5) med en färsk piranhalösning.
- Skölj täcksläcket med rikliga mängder ultrapurvatten för att avlägsna all rest piranhalösning. Skaka försiktigt färgburken under varje höjning för att underlätta borttagningen (10 sköljningar rekommenderas).
- Skölj täcksänken med metanol 3 gånger för att avlägsna vatten från täckytan och håll täcksliparna nedsänkta i metanol.
- Rengör en Erlenmeyerkolv och två färgburkar för varje 8 täcken. Fyll varje behållare med 1 M KOH-lösning och sonkat i 1 h vid RT. Tvätta varje behållare noggrant med extremt vatten och torka med N2 eller i en ugn.
- Ytsensilanisering
- Förbered en 1% aminosilanelösning genom att noggrant blanda 94 ml metanol, 1 ml aminosilane och 5 ml glaciär ättiksyra i den rengjorda och torkade Erlenmeyerkolven. Häll i den andra rengjorda och torkade färgburken14.
- Överför täcksliparna nedsänkta under metanollösningen till färgburken som innehåller 1% aminosilanelösning och håll burken täckt.
OBS: Låt inte täcksläparna torka under överföring till aminosilane för att begränsa exponeringen för glasytan för luft. - Inkubera färgburken som innehåller täckglas i aminosilane i 1 h vid 70 °C i en ugn15.
- Kassera försiktigt aminosilanelösningen i en separat avfallsbehållare och skölj täckbladen i färgningsburken med metanol 5 gånger för att ta bort aminosilanelösningen.
- Skölj täckena i färgburken med ultrapurvatten 5 gånger och torka dem med N2.
- Grädda de torkade täckglasen i färgburken i en ugn vid 110 °C i 20 minuter. Låt täckslipen svalna till RT och placera dem sedan på PEGylationsstället.
OBS: Täck färgburken med lock under bakningen för att minimera särskild och kemisk deponering på ytan15.
- PEG lösning förberedelse
- Tina PEG (Polyetylenglykol) och PEG-biotin till RT i ca 30 min.
OBS: Detta steg minimerar fuktkondensation som kan bryta ner NHS-ester på PEG. - Gör PEG buffert genom att tillsätta 84 mg natriumbikarbonat till 10 ml ultrapurvatten. Denna formulering bör ge en buffert vid pH 8,4.
- För 8 täcken, var och en med en PEGylated sida med 20:1 PEG:PEG-biotin: mät 100 mg PEG och 5 mg PEG-biotin för att lägga till 400 μL PEG-buffert. Virvel lösningen för 30 s och centrifugera i 1 min vid maxhastighet (≥18000 x g).
OBS: Detta steg är tidskänsligt, eftersom SVA NHS-ester hydrolys börjar omedelbart och har en halveringstid på 34 min vid pH 8,0, med en kortare halveringstid vid pH 8,4.
- Tina PEG (Polyetylenglykol) och PEG-biotin till RT i ca 30 min.
- PEG inkubation och täckslip lagring
- Ställ in fuktkammaren och placera täckbladen inuti.
- Tillsätt 90 μL PEG-lösning till ett täckslip i fuktkammaren och placera ett andra täckglas ovanpå PEG-lösningen med täckglass för att fördela PEG-lösningen jämnt.
- Se till att det inte finns några bubblor i lösningen som tappas på täcket. Sänk ena änden av det andra täckslipet på det första täcket och släpp långsamt den andra änden så att det inte finns några bubblor inklämda mellan täcksliparna.
OBS: Bubblor kommer att orsaka att vissa områden är dåligt PEGylated. - Upprepa tills alla täcken har PEG (dvs. 8 täcken = 4 PEG-smörgåsar). Inkubera PEG-lösningarna över natten (~12 h) vid RT i en fuktighetskammare i mörkret16.
- Separera täckslipsparen och placera dem i en färgburk. Notera pegylaterade sidor.
- Skölj täcksläcket noggrant med ultrapurvatten och torka med N2.
OBS: Håll täcksläparna med pincett och blås N2 över ytan mot pincetten för att förhindra att föroreningar torkar på ytan. - Markera den icke-PEGylated sidan med en punkt i ett hörn med en permanent markör eller en diamantpenna.
- Placera 2 PEGylated täcken i brevrör med PEGylated sidor vända mot varandra för att hjälpa till att identifiera PEGylated sidan före användning.
- Dammsug röret i 5 min och fyll igen med N2. Försegla röret med parafilm.
- Förvara PEGylated-täckglasen vid -20 °C i de förseglade brevrören i upp till 6 månader.
OBS: Värm förvaringsrören till RT innan spånenheten monteras. Kondens på täcksläckorna under tätningen kommer att orsaka läckage.
3. Förberedelse av flödeskammare
- Chipmontering
- Sprid tunt ut en liten mängd epoxi på båda sidor av dubbelsidig tejp med ett rakblad.
OBS: För mycket epoxi kan spridas i kanalen under monteringen. - Laserskuren epoxibelagd tejp för att skapa 4 kanaler. Skapa flödeschipet genom att smöra epoxitejpen mellan en 4-håls rutschkana och PEG-täckslip (bild 1A).
- Använd en pipettspets och tryck försiktigt längs kanalernas längd för att skapa en bra tätning. Bota epoxiet i ≥1 h.
OBS: Klipp inte glaset för att undvika att glida mot epoxi.
- Sprid tunt ut en liten mängd epoxi på båda sidor av dubbelsidig tejp med ett rakblad.
- Kammarsammankomst
- Justera chipet så att öppningen på varje kanal placeras i adapterns mittpunkter (bild 1A). Placera två genomskinliga akryldistanser ovanpå chipet, applicera fast tryck i mitten av blocket och skruva i två 4-40 skruvar i ändarna på varje distans.
OBS: Tvinga inte skruven eller tryck för hårt på distanserna, för annars kan chippet spricka. - Skruva inloppen i de gängade hålen på andra sidan av fästet. Övervaka tätningsförhållandet genom det genomskinliga akrylblocket.
- När slangen kommer i kontakt med spånans öppning, försegla anslutningen genom att försiktigt vrida slangen medurs.
OBS: Övertätna inlopp kan orsaka flödesblockering, medan lösa kontakter orsakar läckage.
- Justera chipet så att öppningen på varje kanal placeras i adapterns mittpunkter (bild 1A). Placera två genomskinliga akryldistanser ovanpå chipet, applicera fast tryck i mitten av blocket och skruva i två 4-40 skruvar i ändarna på varje distans.
4. Ytberedning
Se bild 1B för det övergripande arbetsflödet.
- Blockerande medel för att förhindra ospecificerad bindning
- Använd en pipett för att flöda 200 μL tvättbuffert (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 och 2 mM CaCl2, 0,05% Interpol 20) in i kammaren för att kontrollera läckage. Om bubblor bildas i kanalen, tryck aggressivt ytterligare 200 μL för att ta bort bubblorna.
OBS: Stora luftbubblor som inte tas bort i detta steg kan lossna och förstöra ytfunktionalisering senare. - Tillsätt 40 μL BSA (1% w/v) i flödeskammaren för att förhindra ospecificerad bindning och inkubera i 10 min.
- Se till att tillsätta tillräckligt med volym under varje inkubationsperiod för att fylla flödeskamrarna och bilda droppar vid inloppen och utloppen. Justera inkubationsvolymerna i enlighet därmed och utför alla inkubationer i en fuktighetskammare.
- Tillsätt 40 μL interpolering 20 (5% v/v) i flödeskammaren. Inkubera i 10 minuter för att ytterligare minska ospecificerad bindning.
- (VALFRITT) Kontrollera ytan för adekvat passivering genom att flöda polystyrenpärlor genom kanalen. Tillsätt 40 μL ProtG-belagda polystyrenpärlor (0,01% w/v) och bild med ett darkfieldmikroskop med 10x objektivt. Om pärlor inte klibbar på ytan, fortsätt till nästa steg.
- Tvätta kanalen med 200 μL tvättbuffert för att avlägsna alla passiviseringsmedel.
- Använd en pipett för att flöda 200 μL tvättbuffert (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 och 2 mM CaCl2, 0,05% Interpol 20) in i kammaren för att kontrollera läckage. Om bubblor bildas i kanalen, tryck aggressivt ytterligare 200 μL för att ta bort bubblorna.
- Funktionalisering av kammarens yta
- Tillsätt 40 μL streptavidin (100 μg/ml) i flödeskammaren och inkubera i 20 minuter. Tvätta sedan med 200 μL tvättbuffert.
- Tillsätt 40 μL hybridiserad ProtG-TGT (100 nM) i flödeskammaren och inkubera i 20 min. Tvätta sedan med 200 μL tvättbuffert.
- Tillsätt 40 μL ProtG-TGT toppsträng (100 nM) i 20 minuter för att slutföra eventuella ohybridiserade TGT-bottensträngar på ytan. Tvätta med 200 μL tvättbuffert.
- Tillsätt 40 μL P-selectin-Fc (10 μg/ml) i flödeskammaren och inkubera i 60 min. Tvätta sedan med 200 μL tvättbuffert.
OBS: Inkubationstiden är avgörande.
5. Experiment och avbildning
- Installation av flödessystem
- Fyll en 5 ml glasspruta med rullbufferten (HBSS med 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Se till att det inte finns några luftbubblor i sprutan genom att knacka på sidorna av sprutan för att lossa bubblorna och trycka ut dem när de flyter mot spetsen.
- Sätt in en steril nål (26 G, 5/8 Tum Längd) i en ~200 mm polyetenrör (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) och anslut nålen till glasspruten.
OBS: Se till att ingen luft fastnar någonstans i nålkontakten. - Fäst sprutan på sprutpumpen och luta sprutpumpen så att kolvens sida är förhöjd för att förhindra att luftbubblor kommer in i kanalen. För in rörets ände i flödeskammarens inlopp.
OBS: Säkerställ vätskekontakt vid anslutning genom att deponera droppar på inloppen och ha droppar i slutet av sprutslangen. Se till att inga luftbubblor kommer in i kanalen genom att låta en liten droppe bildas i änden av sprutslangen innan du för in den i inloppet. - Sätt in ena änden av ytterligare 200 mm av polyetenslangen i utloppet och den andra änden nedsänkt i en avfalls bägare.
- Konfigurera för cellrullning
- Odla HL-60 celler i 25 cm2 ventilerade odlingskolvar i IMDM-medier kompletterade med 20% fetalt bovinserum och 1% antibiotika vid 37 °C med 5% CO2. Bibehåll celltätheter mellan 1 x 105-2 × 106 celler/ml.
- (VALFRITT) Differentiera HL-60-cellerna i ett komplett IMDM-medium som innehåller 1,25% DMSO vid en initial densitet på 2 x 105 celler/ml. Inkubera celler för att vara mest aktiva i 5-6 dagar.
- Ta ett prov (1-2 ml) från cellfjädringen och centrifugen (200 x g, 3 min) för att pelletera cellerna.
- Ta bort mediet och återanvänd cellerna försiktigt i 500 μL av den rullande bufferten. Upprepa tvättsteget två gånger för att ta bort cellulärt skräp.
- Mät celltätheten med en hemocytometer. Återanvänd cellpelletsen med rullande buffert till en densitet av 2 x 105 celler/ml.
- Koppla försiktigt bort slangen från inloppen/utloppet och pipetten 40 μL av cellupphängningen i flödeskammaren. Återanslut slangen som beskrivits tidigare, se till att inga bubblor förs in i flödeskanalen.
- Påbörja cellrullningsexperimentet genom att starta sprutpumpen vid önskade flödeshastigheter.
OBS: Intensiteten hos fluorescerande spår beror på skjuvstressen, och lägre cellhastighet skjuvningsstress /cellhastighet ger i allmänhet dimmerspår (figur 4A). Undvik hög celltäthet på ytan eller överdriven rullande varaktighet för att säkerställa särskiljbara encellsspår (figur 4B,C). - Använd ett darkfieldmikroskop med ett 10x-mål för att säkerställa att cellrullning observeras.
- När experimentet är klart tar du bort cellerna från kanalen genom att ingjuta den rullande bufferten vid 100 ml/h tills ytan är cellfri.
- Avbildning av lokala spår av "DNA-baserad punktackumulering för avbildning i nanoskala topografi" (DNA-PAINT)
- Tillsätt 40 μL DNA-PAINT-bildtråd (500 pM) i DNA-PAINT-buffert (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) till kanalen.
- Utför tirf-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence) med hjälp av en 100x oljesänkning TIRF objektiv. Skaffa 40000+ ramar med 25 ms exponeringstid per ram vid en elektronförökande (EM) förstärkning på 300 med en elektronförökande laddningskopplad enhet (EMCCD) kamera.
- Använd Picassos programvarupaket17 för att lokalisera och återge superupplösningsbilderna (bild 4D) enligt steg 5.3.4-5.3.5.
- Ladda DNA-PAINT-filmen i Localize-programmet för att bestämma lokaliseringen av varje fluorofor i varje bildruta.
OBS: Optimera boxsidans längd och Parametrarna Min. Net Gradient tills endast fluoroforer spåras korrekt. Net Gradient parameter kan ofta gå över 100000 för att uppnå optimal spårning. Passformsinställning: MLE, integrerad Gaussian-metod ger bästa resultat. Slutligen, om filmen är för lång, dela upp den i staplar med 10000 bildrutor för att förhandsgranskningsspårningen i Localize ska fungera korrekt innan du kombinerar dem i en slutlig hdf5-fil. - Ladda sedan den resulterande hdf5-filen i Rendering-programmet för att utföra driftkorrigering och rendering.
OBS: Utför flera driftkorrigeringar via Undrift by RCC för att förbättra slutresultatet.
- Avbildning av långa spår genom permanent märkning
- Tillsätt den permanenta bildrean och inkubera i 120 s i T50M5-buffert. Tvätta kanalen genom att ingjuta 200 μL tvättbuffert.
- Spela in en bild med excitationslasern avstängd för att få bakgrundskamerabrus. Föreställ dig ett stort område i ett rutnätsmönster av TIRF-mikroskopi.
OBS: Frame-over-frame överlappning av ≥10% rekommenderas för efterföljande sömmar. - Programmera mikroskopet för att skanna över området med 400 x 50 bilder (totalt 20000 bilder). Använd FIJI-programmet och dela upp rådata i enskilda tifffiler, var och en innehåller högst 10000 bilder.
- Platta till alla bilder med hjälp av belysningsprofilen (bild 3A-C) enligt steg 5.4.5-5.4.7.
- Subtrahera bakgrundskameraljudet från varje bildruta. Få medelvärdet av stackprojektionen (belysningsprofilen) för varje bakgrunds subtrakterad ram.
- Normalisera belysningsprofilen med dess maxvärde. Dividera varje bakgrunds subtraherad ram med den normaliserade belysningsprofilen.
- Skala om de korrigerade bildrutorna till lämpligt intervall för motsvarande bitdjup.
- Använd MIST18 för att sy ihop bilderna (bild 3D, E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet ovan beskriver det experimentella förfarandet för vidhäftning fotavtrycksanalysen. Det allmänna experimentarbetsflödet illustreras i figur 1, från flödeskammarens sammansättning (figur 1A) till ytfunktionalisering (figur 1B) och experiment- och bildsteg (figur 1C).
Figur 2 är ett representativt resultat för biokonjugationskarakteriseringen ProtG-ssDNA. UV/Vis-spektrat av tre komponenter i slutprodukten, nämligen ProtG, mal-ssDNA och imidazol elution buffert, samlades in före den slutliga konjugationen (figur 2A), var och en motsvarar en känd koncentration. Dessa spektra utgör ortogonal grund för anpassning till biokonjugationsproduktspektrumet, där de tre okända parametrarna är deras koncentrationer. En anpassad funktion i MATLAB användes för att bestämma koncentrationerna. Resultaten visar ett nästan 1:1-förhållande mellan ProtG och ssDNA (figur 2A). Detta är som förväntat eftersom ssDNA har endast en aminmodifiering, och ProtG har en enda cystein konstruerad vid sin C-ändstation. Detta tillvägagångssätt är mer fördelaktigt för den tidigare rapporterade metoden19 med hjälp av en enda tiol modifierad DNA för att rikta in sig på mängden primära aminer på ProtG, där konjugation förhållandet inte lätt kan upprätthållas.
Dessutom användes native PAGE för att bekräfta biokonjugationen (figur 2B). DNA färgas av GelGreen respektive proteiner av Coomassie blue. Eftersom GelGreen fläckar dsDNA starkare än ssDNA, förväntas det att alla ssDNA band är dimmer än den lika molar koncentrationen av dsDNA band (körfält 3, 4). Eftersom beståndet ProtG innehåller en C-terminal cysteinrester bildar en bråkdel av proteinerna dimers genom en disulfidbindning, som ses i körfält 5 (figur 2B). Den reducerade ProtG, å andra sidan, visar ett enda band (bana 6). Vid användning av beståndet ProtG i DNA-konjugationen direkt reagerar disulfid dimerized ProtG inte på DNA och visas som ett band utan någon GelGreen färgning (körfält 7, 8). ProtG dimer-bandet försvinner i konjugationsprodukten med reducerad ProtG (körfält 9, 10). Eftersom ett överskott av mal-ssDNA till ProtG (1.5:1) används under konjugationen, är TGT endast band synliga i den slutliga konjugationsprodukten (körfält 8, 10). De ljusa GelGreen-banden som sammanfaller med det monomeriska ProtG-bandet indikerar framgångsrik konjugation och bra utbyte.
Figur 3 illustrerar representativa råmikroskopibilder och arbetsflödet för att korrigera dem för efterföljande bildstygn och analys. TIRF-belysningsprofilen som introduceras från en enlägesfiber är i allmänhet ljusare i mitten av synfältet och dimmer runt kanterna (figur 3A, B). För att kompensera för den ojämna belysningen och platta till bilderna för kvantitativ analys bestämdes belysningsprofilen genom i genomsnitt tusentals enskilda ramar (figur 3B). Tillplattade bilder producerades genom att dra av kamerabruset från både råa profiler och belysningsprofiler och sedan normaliseras av belysningsprofilen (bild 3C). Effekten av bildens förenkling illustreras tydligt när bilderna sys för att bilda en stor bild. Bildintensiteten i bakgrundsområdena utan cellspår visar tydliga periodiska mönster som motsvarar de okorrigerade bilderna (bild 3D). Samma synfält som sys av tillplattade bilder ger en platt bakgrund (figur 3E). Att ha en platt bakgrund är avgörande för att tolka intensitetsfluktuationerna längs ett cellspår. Som ett första experiment används en upprampningsflödesprofil som liknar den som illustreras i figur 3F för att bestämma det intervall av skjuvspänning som är lämplig för experimentet och säkerställer både stabila cellrullnings- och tydliga fluorescerande cellspår. Ett typiskt encellig vidhäftningsavtryck under denna flödesprofil visas i figur 3G, där intensiteten ökar när skjuvningsstressen ökar tills cellen inte längre kan upprätthålla att rulla vid hög skjuvningsstress och lossna från ytan, vilket markerar slutet på ett enda spår.
Figur 4 illustrerar potentiella resultat från suboptimala till optimala representativa experimentella resultat. Figur 4A illustrerar ett suboptimalt utfall där fluorescerande spår har ett lågt signal-till-brus-förhållande. Detta orsakas sannolikt av antingen en låg yttäthet hos de helt konjugerade sonderna eller en låg flödeshastighet. Figur 4B illustrerar ett annat suboptimalt utfall där fluorescerande spår är för tätt packade för att lösa och isolera enskilda spår för efterföljande analys. Figur 4C är ett exempel på ett bra resultat där enskilda spår kan lösas över lång sträcka och är tydliga mot bakgrunden. Figur 4D är ett exempel på den diffraktionsbegränsade TIRF-bilden (vänsterhalva) jämfört med samma spår som avbildas av DNA-PAINT (högerhalva). DNA-PAINT i den här inställningen ger en NeNA-precision (nearest-neighbor-based-based analysis) på 28,8 nm.
Bild 1: Experimentera arbetsflödet för vidhäftningsavtrycksanalysen. A) Montering av flödescellen och flödeskammaren. (B) Yt passivering och funktionalisering. Varje inkubationssteg markeras av varaktigheten, följt av ett tvättsteg. C) Cellrullande experiment och avbildning. Celler som rullar på ytan kommer att packa upp DNA där vidhäftningsinteraktioner bildas och lämna ssDNA på ytan som markerar platsen för varje vidhäftningshändelse. Ytan är märkt med den permanenta bildspelaren ssDNA för omfattande områdesavbildning, vilket kräver 2 minuters färgning innan du tvättar av. För superupplösnings-DNA-PAINT-avbildning hålls bildåtergivningssträngen i bufferten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Biokonjugationskarakterisering. A) UV-VIS-absorbansen av Ni-NTA-produkten för renad biokonjugation (blå) och kurvpassningen (röd) för att bestämma konjugationsförhållandet. Absorptionsspektrat av ProtG (magenta), mal-ssDNA (grön) och imidazol (grå) användes som komponenter för att skapa den bästa passformen (röd) till produktspektrumet (blå). Resterna av passformen visas som den svarta streckade linjen. Detta gör det möjligt för oss att bestämma koncentrationen av ProtG och ssDNA i den renade biokonjugationsprodukten och deras molarförhållande. B) Inbyggd sida av komponenter i biokonjugationsförfarandet. Det första körfältet visar en DNA-stege med låg molekylvikt (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). Gelbilden är falskt färgad, med DNA-färgande GelGreen i grönt och Coomassie blå proteinfläck (inversed) i magenta. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Bildbehandling och representativa resultat från omfattande områdesavbildning. A) Tusentals obearbetade TIRF-bilder som lägger till ett omfattande område. (B) Belysningsprofil som härrör från de råa bilderna. (C) Korrigerade bilder genom att platta till belysningsprofilen. (D) Sydd bild från råa bildplattor. Den ojämna belysningsprofilen kan ses som periodiska mönster i bilden. De blå och röda rutorna anger de bildavsnitt där medelintensitetsprofilerna projiceras (blå och röda spår). Medelvärdesvärdena (godtycklig enhet) representerar värdena för 8-bitars bilder (0-255). (E) Samma område som (D) men sytt med tillplattade bilder. Prognoserna visar inga storskaliga periodiska mönster. F) Skjuvningsstressprofilen som ska användas i experimenten för att bestämma det intervall av skjuvningsspänningar som resulterar i cellrullning och ger fluorescensspår. G) Ett provexemplarspår från en enda cell under flödesprofilen som illustreras i F. Cellen färdas från vänster till höger, fluorescensintensiteten ökar när skjuvningsstressen ökar tills cellen inte längre kan upprätthålla rullning och lossnar från ytan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa suboptimala och optimala resultat. A) Ett exempel på fluorescerande spår med otillräcklig kontrast. B) Ett exempel på överdriven fluorescerande spårtäthet. C) Ett exempel på optimal spårtäthet och kontrast. Alla tre bilderna förvärvades under samma skick, platta och sydda. De röda rutorna i varje bild representerar det område där intensitetsprojektionerna (höger) togs. (D) Ett fluorescerande spår som visas vid diffraktionsbegränsad (vänsterhalva) och DNA-PAINT (högerhalva) bildbehandling. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Problem | Möjlig orsak | Lösning | |
| Epoxitejp klipps inte ordentligt | Epoxiskiktet för tjockt | Tunna epoxiskiktet så mycket som möjligt med razerbladet | |
| Lasergravereffekt och hastighet inte optimerad | Optimera lasergravereffekt och hastighet | ||
| Bubblor fastnade på sidorna av flödeskammaren | Felaktig inledande vätskeintroduktion | Tryck buffertlösningar genom kanalen med hög flödeshastighet för att tvätta ut bubblorna | |
| Bubblor passerar genom flödeskammaren | Felaktig vätskeinledning genom inlopp och utlopp | Se till att en vätskedroppe finns på inloppsslangen för att säkerställa vätske-till-vätskekontakt mellan pipetterspetsen och inloppet | |
| Bubblor från sprutan kom in i flödeslinjen | Luta sprutpumpen för att säkerställa att bubblor fastnar i kolvens ände | ||
| Vätska kan inte komma in i kanaler | Inloppen skruvade på för hårt | Justera för att optimera tätningen. Inloppsslangen ska bara vidröra kanalöppningen när den skruvas in ordentligt. | |
| Kanalläckage | Epoxy har inte botat helt | Gör kanaler, se till att du använder 5 min snabbhärdande epoxi och låt härda i minst 1 h | |
| Inlopp som inte förseglar ordentligt | Justera för att optimera tätningen | ||
| Celler har fastnat | Dålig PEGylation leder till icke-specifik bindning | Helst remake PEG. Dessutom kan försöka inkubera ytterligare blockeringsmedel (BSA & Tween-20) och lägga till blockerande medel för att tvätta bufferten. | |
| Yt passivering förstörd av stora luftbubblor som passerar genom kanalen | Se till att inga bubblor går genom kanalen | ||
| Problem med cellerna | Använd HL-60 2 veckor efter omstart av cellkulturen från fryst. Bekräfta cellrullning på kontrollytan med endast P-selectin. | ||
| Celler har inte eller har glesa interaktioner med ytan | P-selectin densiteten för låg, till följd av dålig ytfunktionalisering och/eller dålig biokonjugation | Använd först ProtG-biotin istället för ProtG-TGT som en kontroll för att avgöra om problemet beror på biokonjugation eller ytbiotintäthet. Efter att ha säkerställt biokonjugationskvalitet och ytbiotintäthet, öka TGT-ProtG och P-selectin-Fc koncentration och inkubationstid. | |
| Celler rullar men producerar inte fluorescerande spår | Vidhäftningsinteraktioner för svaga för att brista TGT | Öka flödeshastigheten under rullande experiment för att öka interaktionskraften. Vi rekommenderar en första upptrappningsflödesprofil (figur 3F) för att hitta den optimala flödeshastigheten som ger både stabila rull- och fluorescensspår (figur 3G) | |
| Dålig kvalitet yta leder till hög bakgrund fluorescens och otillräcklig kontrast för att se spår | Kontrollera passivation av ytan | ||
Tabell 1: Felsökning. Tabellen innehåller en förteckning över möjliga orsaker och lösningar på problem som uppstår vid denna analys
Kompletterande kodningsfil 1: Det specialskrivna MATLAB-skriptet för att sönderdela slutproduktspektrumet baserat på de tre spektra som samlats in tidigare (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA pärla elution buffert) för att bestämma konjugation effektivitet och förhållandet mellan ProtG och ssDNA. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vidhäftningsavtrycksanalysen möjliggör visualisering av de molekylära vidhäftningshändelserna mellan PSGL-1 och P-selectin under cellvals vidhäftning. Denna process initieras av P-selectin-medierad fångst följt av rullande under fluidic skjuvning stress. Potentiella problem under experimentet innebär vanligtvis dålig cellrullning eller saknade fluorescerande spår även när celler rullar bra. Dessa problem beror ofta på kvalitetskontroller i de kritiska stegen i protokollet, enligt listan i felsökningstabellen (tabell 1).
Biomolekyler och buffertar måste filtreras och lagras vid 4 °C för att förhindra förorening eftersom ytberedning innebär flera steg. Högkvalitativ yt passivering är ett krav för att uppnå lämplig ytfunktionaliseringstäthet och minska den ospecificerade bindningen av biomolekyler. Ospecificerad bindning av biomolekyler till ytan kan skapa en hög fluorescensbakgrund, vilket stör enmolekylens fluorescensavbildning och statistisk dataanalys. Flera faktorer kan påverka yt passivering. Hydrolys av aminosilane och PEG-NHS ger mycket lägre effektivitet av PEGylation. Tillräcklig KOH-tvätt och piranharengöring förbättrar hydrofiliciteten genom att generera fria hydroxylgrupper på glasytan, vilket ökar densiteten hos den kemiskt reaktiva gruppen. Celler skulle fastna på dåligt passiverade ytor. Kvaliteten på yt passivering kontrolleras genom mätning av bakgrund fluorescensintensitet före och efter PEGylation med fluorescerande biomolekyler.
Ligadernas yttäthet är en kritisk faktor för cellrullning, som styrs av PEG: PEG-biotinförhållande, TGT-hybridisering och P-selectinbindning. I detta system är ett PEG: PEG-biotinförhållande på 20:1 tillräckligt för ytfunktionalisering med tillräckligt P-selectin för cellrullning. Effektiv TGT-hybridisering förbättrar också yttätheten och signal-till-brus-förhållandet för fluorescerande spår. Detta protokoll innehåller ett påfyllningssteg av top-strand-TGT-ProtG för att säkerställa att eventuella ohybridiserade TGT-bottensträngar kompletteras före experiment. Konjugation av DNA till ProtG påverkar också yttätheten. Sulfo-SMCC linker lades till DNA vid 10-faldig molar överskott så att allt DNA reagerade med länkaren. ProtG med en enda cystein rester (ProtG-Cys) vid C-terminus användes för att uppnå en 1:1 DNA: ProtG konjugation förhållandet. Eftersom ProtG-Cys kan bilda dimers genom disulfidbindningar, behövs behandling av TCEP för att minska disulfidbindningen före sulfhydrylreaktiva korslänkande reaktioner. Proteinkonjugerat DNA och TGT-hybridisering kan valideras med inbyggd PAGE-analys, där konjugat DNA och DNA-duplex kommer att visa den fördröjda rörligheten på grund av ökningen av molekylvikten. Monteringseffektiviteten kan också uppskattas med gel densitometri (figur 2B). De noggranna PEGylations- och biokonjugationsprocesserna är avgörande för att producera en konsekvent yta. Ibland kan celltillstånd påverka cellrullningen och spårbildningen. Även om PSGL-1 uttryck över cell densitet inte har rapporterats, cell densitet är en potent regulator av cell cykeln och protein uttryck under tillväxtfasen.
Med tanke på att PSGL-1 också fungerar som en signaltransduktionsreceptor och reglerar cellproliferation20,21 upprätthålls odlingsförhållanden som celltäthet för konsekvent uttrycksnivå och bindningsförmåga hos PSGL-1. Fastsättning av P-selectin-Fc medierad av ProtG på ytan är avgörande för vidhäftning och rullning av celler. Bindningskinetiken hos P-selectin till ProtG är beroende av koncentrationen. Lägre koncentrationer av P-selectin leder till en ökning av tiden för att nå jämvikt. Minst 30 min krävs för mättnadsbindning för koncentrationer under 100 nM22. 10 nM P-selectin användes för att minska den ospecificerade bindningen till ytan och ökad inkubationstid för tillräcklig interaktion med ProtG. En inkubation på 1 h är tillräckligt med tid för att inducera cell vidhäftning och rullning i detta system.
TGT och dess motsvarande kraftberoende livslängd är en viktig faktor i resultaten av denna analys. Under rullande vidhäftning överförs kraften på tjudern genom både TGT och P-selectin: PSGL-1 interaktion. Var och en av dessa enskilda komponenter har en unik kraftberoende livslängd, och beroende på den applicerade kraften kommer sannolikheten för bristning att gynna den ena över den andra. Det har till exempel visat sig att när man använder den TGT som beskrivs i den här artikeln, vid krafter under 13,6 pN, P-selectin: PSGL-1 dissocierar främst, medan TGT över 13,6 pN i första hand separerar13. Detta är viktigt att förstå när du utför denna analys eftersom om skjuvspänningen är för låg eller pärlorna rullar för långsamt, kommer sprängningshändelserna främst att vara P-selectin: PSGL-1 interaktion, och det kommer att finnas minimal eller ingen mätbar fluorescenssignal från TGTs. TGT:s spänningströskel kommer också att påverka resultaten. Om TGT brister vid för hög kraft, kommer sprängningshändelserna främst att vara P-selectin: PSGL-1, och det kommer att finnas minimal fluorescenssignal.
Metoden som beskrivs här möjliggör analys av de molekylära sprängkrafterna, liksom platserna för molekylära vidhäftningshändelser som är involverade i rullande vidhäftning. I stället för realtidsdetektering av vidhäftning är den största fördelen med denna metod att den möjliggör avbildning och analys efter experimentet. När vidhäftningsavtrycket har lämnats på ytan i form av ssDNA kan spåren fortfarande avbildas efter 12 timmar om flödeskanalerna hålls i ett 4 °C kylskåp i en mörk fuktighetskammare med både inlopp och uttag blockerade för att förhindra torkning. Tolkningen av fluorescensavläsningen för denna analys är beroende av den valda avbildningsmetoden. Genom superupplösningsavbildning uppnår denna analys hög rumslig upplösning (<50 nm) som möjliggör kvantitativ analys av densiteten hos brusten TGTs13. Analysen av receptor densitet eller brusten TGT densitet skulle vara användbart för att undersöka rullande vidhäftning beteende under olika förhållanden. Tvärtom ger diffraktionsbegränsad avbildning inte en hög rumslig upplösning. Det gör det dock möjligt att avbilda en stor yta för att analysera fluorescensspåren hos flera pärlor över hundratals synfält. Detta är fördelaktigt eftersom fluorescensintensiteten hos ett spår kan analyseras för en enda pärla över ett stort avstånd som ger information om förändringar i rullande beteende över tid. Ett sådant exempel förändrar skjuvstressen över tid och observerar motsvarande förändringar i fluorescensintensitet. Nyligen har det visat sig att genom en enkel modell kan spårens fluorescensintensitet användas för att uppskatta den molekylära kraftfördelningen13. Det finns också en potentiell tillämpning av ratiometriska metoder för att uppnå kraftkvantifiering med denna analys23.
Eftersom cellrullning sker snabbt (10s μm/s) och över ett längre avstånd (1000-tals μm), har det varit utmanande att studera deras molekylära spänning med traditionella molekylära spänningssensorer i realtid. Analysen av vidhäftningsavtrycket bryter denna krävande begränsning för att möjliggöra avbildning efter händelsen. Även om TGT sprängning händelse inte direkt rapportera omfattningen av spänningar upplevs före bristning, lovande utveckling har gjorts i analysen av fluorescens spår för att möjliggöra kvantitativ undersökning av de molekylära krafter som är involverade i rullande vidhäftning13,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) och University of British Columbia Eminence Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
