Summary
Detta protokoll presenterar hur man kvantifieraR AAV-transduktion effektivitet i mus näthinnan med hjälp av digital dropp PCR (dd-PCR) tillsammans med småskaligA AAV produktion, intravitreal injektion, retinal imaging och retinal genomisk DNA isolering.
Abstract
Många retinal cellbiologiska laboratorier använder nu rutinmässigt Adeno-associerade virus (AAV) för genredigering och regulatoriska applikationer. Effektiviteten av AAV-transduktion är vanligtvis kritisk, vilket påverkar de övergripande experimentella resultaten. En av de viktigaste bestämningsfaktorerna för transduktionseffektivitet är serotypen eller varianten av AAV-vektorn. För närvarande finns olika konstgjorda AAV-serotyper och varianter med olika affiniteter för att vara värd för cellytans receptorer. För retinal genterapi resulterar detta i varierande grad av transduktion effektivitet för olika retinal celltyper. Dessutom kan injektionsvägen och kvaliteten på AAV-produktionen också påverka retinal AAV-transduktionseffektiviteten. Därför är det viktigt att jämföra effektiviteten hos olika varianter, partier och metoder. Metoden digital dropp PCR (dd-PCR) kvantifierar nukleinsyrorna med hög precision och gör det möjligt att utföra absolut kvantifiering av ett givet mål utan någon standard eller referens. Med hjälp av dd-PCR är det också möjligt att bedöma flyttningseffektiviteten hos AAV genom absolut kvantifiering av AAV-genomkopieringsnummer i en injicerad näthinna. Här tillhandahåller vi en enkel metod för att kvantifiera flyttningshastigheten för AAV i retinala celler med dd-PCR. Med mindre modifieringar kan denna metod också ligga till grund för kvantifiering av mitokondriellt DNA och bedöma effektiviteten av basredigering, kritisk för flera näthinnesjukdomar och genterapiapplikationer.
Introduction
Adeno associerade virus (AAV) används nu ofta för en mängd olika retinal genterapi studier. AAV ger ett säkert och effektivt sätt att leverera gener med mindre immunogenicitet och färre genomintegrationer. AAV-inträde i målcellen sker genom endocytos, vilket kräver bindning av receptorer och co-receptorer på cellytan1,2. Därför beror flyttningseffektiviteten hos AAV för olika celltyper främst på kapsiden och dess interaktioner med värdcellreceptorerna. AAV har serotyper och varje serotyp kan ha distinkta cellulära/vävnad tropismer och transduktion effektivitet. Det finns också konstgjorda AAV serotyper och varianter som genereras av kemisk modifiering av viruskapsiden, produktion av hybridkapslar, peptidinsättning, capsidblandning, riktad evolution och rationell mutagenes3. Även mindre förändringar i aminosyrasekvensen eller kapsidstrukturen kan påverka interaktioner med värdcellsfaktorer och resultera i olika trombismer4. Förutom kapsidvarianter kan andra faktorer som injektionsväg och variation från parti till parti av AAV-produktion påverka flyttningseffektiviteten hos AAV i den neuronala näthinnan. Därför är det nödvändigt med tillförlitliga metoder för jämförelse av transduktionshastigheter för olika varianter.
Majoriteten av metoderna för att bestämma AAV-transduktion effektivitet förlitar sig på reporter gen uttryck. Dessa inkluderar fluorescerande avbildning, immunohistokemi, western blot eller histokemisk analys av reportergenprodukten5,6,7. På grund av storleksbegränsningen för AAV är det dock inte alltid möjligt att inkludera reportergener för att övervaka flyttningseffektiviteten. Att använda starka promotorer som hybrid CMV-förstärkare / kyckling beta-aktin eller Woodchuck hepatit post-transcriptional regulatoriska element (WPRE) som en mRNA stabilisatorsekvens komplicerar ytterligare storleksproblemet8. Därför kommer det också att vara fördelaktigt att definiera flyttningsfrekvensen för injicerade AAV med en mer direkt metod.
Digital droplet PCR (dd-PCR) är en kraftfull teknik för att kvantifiera mål-DNA från minimala mängder prover. dd-PCR-tekniken är beroende av inkapsling av mål-DNA- och PCR-reaktionsblandningen med oljedroppar. Varje dd-PCR-reaktion innehåller tusentals droppar. Varje droppe bearbetas och analyseras som en oberoende PCR-reaktion9. Analys av droppar gör det möjligt att beräkna det absoluta kopieringsnumret av mål-DNA-molekyler i något prov genom att helt enkelt använda Poisson-algoritmen. Eftersom flyttningseffektiviteten hos AAV är korrelerad med kopieringsnumret av AAV-genom i den neuronala näthinnan, använde vi dd-PCR-metoden för att kvantifiera AAV-genom.
Här beskriver vi en dd-PCR-metodik för att beräkna flyttningseffektiviteten hos AAV-vektorer från retinal genomiskt DNA6,10. Först genererades AAV som uttrycker tdTomato reporter med hjälp av det småskaliga protokollet och titered av dd-PCR-metoden11. För det andra injicerades AAV intravitreally i den neuronala näthinnan. För att demonstrera transduktionseffektiviteten kvantifierade vi först tdTomato-uttrycket med hjälp av fluorescerande mikroskopi och ImageJ-programvara. Detta följdes av isolering av genomiskt DNA för kvantifiering av AAV genom i injicerade näthinnor med dd-PCR. Jämförelse av tdTomato uttrycksnivåer med de transduced AAV genom kvantifieras av dd-PCR visade att dd-PCR metoden exakt kvantifierade givaren effektivitet av AAV vektorer. Våra protokoll visade en detaljerad beskrivning av en dd-PCR-baserad metodik för att kvantifiera AAV-transduktionseffektivitet. I detta protokoll visar vi också det absoluta antalet AAV-genom som transduced efter intravitreal injektioner genom att helt enkelt använda utspädningsfaktorn efter genomisk DNA-isolering och dd-PCR resultat. Sammantaget ger detta protokoll en kraftfull metod, vilket skulle vara ett alternativ till reporteruttryck för att kvantifiera transduktionseffektiviteten hos AAV-vektorer i näthinnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll accepterades av Sabanci-universitetets etiska kommitté och experiment utfördes i enlighet med uttalandet "The Association for Research in Vision and Ophthalmology" för användning av djur i forskning
1. Småskalig AAV-produktion12
- Odla HEK293T-celler med 15 cm plattor i komplett 10 ml DMEM/10% FBS tills 70-80% sammanflöde.
- Förbered transfektblandningen med 20 μg hjälpplasmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg kapsidplasmid och 7 μg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE-vektor och 136 μL PEI-lösning (1 mg/ml) i 5 ml DMEM.
- Tillsätt den 5 ml beredda transfektblandningen i en cellodlingsskål som innehåller 10 ml odlingsmedier och inkubera de transfekterade cellerna i 48-60 timmar vid 37 °C.
- Samla media vid 48-60 h efter transfektion och smält det med DNase I vid en slutlig koncentration av 250 U/ml i 30 min vid 37 °C.
- Centrifugera det smälta mediet vid 4000 x g, 4 °C i 30 minuter och filtrera det sedan med ett 0,22 μm sprutafilter i det förvätade regenererade cellulosamembranet för 100 kDa.
- Centrifugera det regenererade cellulosamembranet vid 4000 x g, 4 °C i 30 minuter och kassera mediet.
- Tvätta och centrifugera det regenererade cellulosamembranet med PBS som innehåller 0,001% Pluronic F-68 tre gånger vid 4000 x g, 4 °C i 30 min. Kassera PBS vid varje steg.
- Samla koncentrerade AAV från den övre delen av det regenererade cellulosamembranet och alikvot för vidare användning.
- Smält 5 μL nytillverkad AAV med DNase I (0,2U/μl) i 15 min vid 37 °C för titering. Detta följs av 10 min vid 95 °C inkubation för både inaktivering av DNase I och nedbrytning av viruskapslar.
- Förbered en 10-faldig seriell utspädning från smälta AAV med 0,05% Pluronic F-68. Använd AAV2-ITR- och WPRE-primers för titrering(tabell 1). Titers beräknades genom att multiplicera dd-PCR-resultaten med utspädningsfaktorerna. Resultaten konverterades till genomkopia/mL (GC/mL).
ANM.: AAV-koncentrationerna för småskalig AAV-produktion förväntas vara cirka 1 x 1012 GC/mL. Detta protokoll är inte tillämpligt för AAV-stammar som inte effektivt släpper AAV i media som AAV213.
2. Intravitreal injektion av AAV
-
Förberedelse av utrustning
- Förbered 10 μL microsyringe med en 36 G trubbig nål innan du börjar. Skölj fem gånger med 70% EtOH, fem gånger i ddH2O och slutligen fem gånger med PBS.
- Ladda lämplig mängd AAV i mikrosyring för varje injektion.
- Förbered den kirurgiska nålen (sutur, silke, 6/0), tejp, tång och sax.
-
Intravitreal injektion
- Applicera 1 droppe 0,5% tropikamid och 2,5% fenylefrinhydroklorid (t.ex. Mydfrin) som innehåller ögondroppar före anestesi för att vidga pupillerna.
- Bedöva möss med isofluran 5% (1 L/min) och fortsätt med 1,5% isofluran (1 L/min) under proceduren. En liten isoflurankammare används för den första induktion.
- Kontrollera djupet av anestesi genom förlust av ingreflex, abstinensreflexen och svansnypningsresponsen.
- Applicera 0, 3% tobramycin och 0, 1% dexametasonsteril oftalmisk lösning på varje öga före injektionsproceduren. Applicering av ögondroppar förhindrar torrhet och utövar antiinflammatoriska och antibakteriella effekter.
- Använd den kirurgiska kroken för att stabilisera det övre ögonlocket. Dra tillbaka något för att exponera den dorsala delen av ögat. Tejpa fast kroken på bänken för att hålla den på plats.
- Ta bort bindhinnan (mindre än 1 mm2) med den böjda irissaxen för att exponera ögats sclera under det dissekerande mikroskopet. Använd en färsk och steril insulinspruta (30 G) för att punktera sclera.
- För in mikrosyringens nål genom samma punktering med hjälp av en mikromanipulator. Placera nålens spets bakom linsen i mitten av ögonkåpan.
- Injicera 1 μL AAV2/BP2 och AAV2/PHP. S vektorer med 1,63 x 1012 GC/mL och 1,7 x 1012 GC/mL koncentrationer långsamt in i glaskroppen i ögat. Insprutning av volymkontrollen görs manuellt. Låt nålen vara på plats i 1 min och dra långsamt ut nålen.
- Släpp ögonlocket och applicera antiinflammatorisk och antibakteriell topikal gelbehandling som innehåller 0, 3% tobramycin och 0, 1% dexametason på ögonkåpor. Övervaka och utvärdera mössen under de följande dagarna enligt poängbladet när det gäller utseende (ljusa ögon, groomed coat, hunching), beteende (aktivitet, immobilisering, självstympning) och kroppsvikt på en skala från 0 till 3. Varje villkor har en poäng från 0-3 och en totalpoäng på 3 eller högre är ett uppsägningskriterium.
- Placera djuren i buret efter återhämtning.
3. Fluorescens och fundus imaging
- Sila musen och vidga pupillen genom att placera droppar på 0,5% tropikamid och 2,5% fenylefrinhydroklorid i varje öga.
- Bedöva djuret med ovanstående förfarande med isofluran. Utvärdera anestesidjupet noggrant genom att klämma tassarna.
- Placera musen på bildscenen och verifiera rätt utvidgning genom att kontrollera genom funduskameran. Applicera topikal gel (0,2% karbomer 980) på ögonytan för att skydda ögonen från uttorkning under anestesi och för att använda den som kopplingsgel för avbildning.
- Manipulera bildsteget för att ställa sig i linje med objektivets nosstycke. Justera scenen efter behov för att centrera musögat. När ögat är centrerat, flytta långsamt målet tills det kommer i kontakt med ögat.
- Utför fundus- och fluorescensavbildning på båda ögonen för att följa upp tdTomato-uttrycket 1 vecka och 2 veckor efter intravitreal injektion (figur 3B)14. Ta fundus- och fluorescensbilder i identiska inställningar för jämförelse av reporteruttryck.
4. Näthinneisolering
- Avliva djur efter fundus och fluorescens imaging genom CO2 inandning för näthinnan insamling vid 2 veckor tidpunkt.
- Flytta ögongloben framåt med hjälp av en 13,5 cm splitter tång.
- Ta bort linsen tillsammans med den överblivna glaskroppen genom att trycka försiktigt med tångarna.
- Skär anslutningen av ögongloben till synnerven med precisionsböjda tångar och pressa försiktigt näthinnan med samma böjda tång.
- Överför dissekerade näthinnor till ett mikrocentrifugerör.
- Snäpp frys näthinnan genom att placera rören i det flytande kvävet.
5. Vävnadsgenomisk DNA-isolering
- Isolera genomiskt DNA med ett kommersialiserat Proteinase K matsmältningsbaserat vävnadsgenomiskt DNA-kit.
- Smält näthinnan vid 55 °C, 200 x g i 30 min med Proteinase K, som redan levereras i satsen.
- Utför RNase inkubationssteg, tvätta steg med tvättbuffert I och II och slutligen elutionssteg enligt tillverkarens protokoll.
- Tillsätt ett extra spinnsteg efter den sista tvätten för att ta bort restetanol.
- Mät koncentrationen av genomiskt DNA och lagra prover vid -20 °C.
6. Droplet digital PCR-analys av mushinneprover för kvantifiering av virusgenom
- Späd genomiska DDA från injicerade näthinnor i 0,05% Pluronic F-68 lösning för att nå en slutlig koncentration på 1 ng/μL för varje prov.
- Utför separata reaktioner för WPRE och 18S med målspecifika primers med en slutlig koncentration på 125 nM för varje primer.
- Utför droppgenerering i en 20 μL PCR-reaktionsblandning inklusive 1 ng genomiskt DNA, 125 nM primers och 2x evagreen supermix.
- Ladda provblandningen i mitten av patronen för droppgenerering.
- Efter att provladdningen på patronen har gjorts, tillsätt 70 μL av droppgenereringsoljan i patronens nedre rad.
- Lägg packningen ovanpå patronen och placera den i droppgeneratorn. Se till att det inte finns något mellanrum mellan packningen och patronen.
- Ta försiktigt cirka 40 μL droppar som genereras i den övre brunnen. Tillsätt dropplösningen till den halvkjoliga 96-brunns PCR-reaktionsplattan.
- Försegla PCR-plattan med PCR-plattförsegling med hjälp av aluminiumtätningsfolie.
- Placera PCR-plattan i 96-väl värmetätad termisk cykelcyklist. Använd PCR-protokollet; 95 °C i 5 min, 40 cykler på 95 °C för 30 s, 60 °C i 1 min, 4 °C i 5 min, 90 °C för 5 min och 4 °C oändligt grepp. Applicera 2 °C/s ramphastighet vid varje cykel för att säkerställa att dropparna når rätt temperatur för varje steg under cyklingen
- Placera PCR-plattan i droppläsaren för att kvantifiera droppar med dd-PCR-programvara. En mall ställs in med hjälp av specifika inställningar för evagreen.
- Analysera data med hjälp av ett 1D-diagramdiagram med varje prov för fluorescensintensitet kontra droppnummer. Tröskelvärdet är ordnat så att dropparna över tröskelvärdet tilldelas som positiva och de nedanstående som negativa. Detta följs av tillämpningen av Poisson-algoritmen för att bestämma startkoncentrationen av mål-DNA i enheter av kopior/μL. Förhållandet mellan WPRE och 18S beräknas för att mäta AAV-transduktionseffektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Småskalig AAV-produktion är en snabb och effektiv metod som ger vektorer för intravitreala injektioner (figur 1). Småskalig AAV-produktion ger vanligtvis titrar inom intervallet 1 x 1012 GC/ml vilket är tillräckligt för att upptäcka reporteruttryck i näthinnan (figur 2). Titering av AAV med dd-PCR ger konsekventa resultat. ITR2- och WPRE-specifika primers används rutinmässigt och startkoncentrationen för varje målmolekyl beräknades med dd-PCR-programvara genom modellering som en Poisson-distribution. Beräkningarna slutfördes genom multiplikation av utspädningsfaktorer och omvandlades till genomkopia per ml. AAV som tillverkas för detta protokoll hade titers på 1,63 x 1012 GC/mL respektive 1,7x 1012 GC/ml för AAV2/BP2 respektive AAV2/PHP.S7,15. Som jämförelse användes identiska tdTomato uttryck konstruktioner för båda stammarna. Vi injicerade ungefär lika titers av AAV för kvantifiering av AAV transduktion effektivitet. Efter injektion av 1 μL från ovannämnda koncentrationer av AAV avbildades djuren vid 1 vecka och 2 veckors tidpunkter. Ett fundus- och fluorescenssystem användes för både AAV2/BP2 och AAV2/PHP. S injicerade näthinnor som genererade liknande reporteruttrycksprofiler förutom näthinnan #1 (figur 3A, B). TdTomato-uttrycket kvantifierades med hjälp av ImageJ-programvara för genomsnittligt grått värde (genomsnittlig fluorescensintensitet) för att jämföra transduktionseffektivitet och reporteruttryck (figur 3A, B). Detta är i princip summan av de grå värdena för alla pixlar i markeringen dividerat med antalet pixlar16. Fluorescerande bilder av Retina #1 visade endast ett litet område av tdTomato uttryck, troligen på grund av återflöde eller läckage efter intravitreal injektioner. I enlighet med detta konstaterande var fluorescensintensiteten i näthinnan #1 0,9 vilket var den lägsta jämfört med alla näthinnor som injicerades intravitreally och avbildades. Genomsnittlig fluorescensintensitet var mellan 4 - 11. Detta visade att kvantifieringen av fluorescerande bilder av tdTomato-uttryck var framgångsrik och korrelerad med de bilder som visades (figur 3A, B).
Efter avbildning av näthinnor isolerades genomisk DNA från injicerade näthinnor vid 2-veckors tidpunkt. dd-PCR utfördes med WPRE primers för AAV genom kvantifiering. Mus 18S användes för normalisering av AAV-genom till musgenomet (figur 3C)17. I överensstämmelse med den genomsnittliga fluorescensintensiteten och bilderna hade näthinnan #1 ett mycket lågt AAV-genomkopieringsnummer i förhållande till 18S, 0,011 gånger lägre jämfört med näthinnan #2. Dessutom ger näthinnan #2, 3, 4 och 5 liknande viknivåskillnader. Fold skillnader jämfört med näthinnan #2 för näthinnor #3, 4 och 5 var 1,75, 0,55 respektive 0,99. Bland dessa gav näthinnan #3 båda den högsta fluorescerande intensiteten och AAV-genomkopieringsnumret. Detta visade redan att kvantifiering av transduced AAV genom med dd-PCR korrelerar med fluorescensintensiteten och därmed till tdTomato uttryck som observeras. Dd-PCR-metoden gjorde det också möjligt för oss att göra absolut kvantifiering av transduced AAV. Absolut kvantifiering av det totala AAV-genomet per näthinna beräknades helt enkelt genom att multiplicera det totala antalet identifierade från dd-PCR och utspädningsfaktorn för genomiskt DNA. Detta gav liknande resultat jämfört med 18S normaliserad AAV-genomtransduktionseffektivitet (figur 3D).
Bild 1: Flödesschema över försöken. Småskalig AAV-produktion följs av dd-PCR-baserad AAV titering. AAV injiceras intravitreally i den vuxna näthinnan. Uppföljning av djur utfördes med hjälp av ett fundus och fluorescerande bildsystem för att analysera reporteruttrycket. Fundus och fluorescerande bilder togs vid 1 vecka och 2-veckors tidpunkter. Genomiskt DNA isoleras från injicerade näthinnor för analys med dd-PCR för att kvantifiera det totala AAV-genomet som finns i de injicerade näthinnan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: AAV-titering med dd-PCR-metoden. (A) Dd-PCR-metoden drar nytta av inkapslade PCR-reaktioner i en droppe. Efter PCR reaktion med evagreen kemi, positiva och negativa droppar för mål genen analyserades för att bestämma det absoluta antalet mål DNAs inom en lösning. (röda lådor i gröna droppar). b)Representativa dd-PCR-data för AAV titering. Flera partier av AAV:er titereds med ITR2 primers. Positiva och negativa droppar separeras över och under tröskeln (lila linje). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Kvantifiering av transduced AAV genom i näthinnan av dd-PCR. 16 veckor gamla vilda typ djur injicerades intravitreally med AAV2/BP2 och AAV2/PHP. S vektorer med 1,63 x 1012 GC/mL respektive 1,7x 1012 GC/mL koncentrationer. Båda AAV hade identiska tdTomato uttryck konstruktion och injektion volym för alla AAV var 1 μL. Injicerade näthinnor (1-7) följdes upp med fundus och fluorescence imaging. Bilder som tas kvantifierades med hjälp av Image J-programvaran. Trots den kapsid skillnaden hade alla djur en fluorescens medelvärdesvärde (genomsnittligt grått värde) som sträcker sig mellan 4 och 11 utom näthinnan # 1 som hade den lägsta intensiteten, 0,9, och svagt tdTomato uttryck. Röda och grå kolumner är AAV2/BP2 och AAV2/PHP. S injicerade näthinnor (A-B). dd-PCR utfördes med WPRE primers för AAV genom och 18S primer för normalisering vid 2-veckors tidpunkt. Näthinnan # 1 visade också distinkt lägre AAV-kopieringsnummer per 18S-kopior (C). Totala AAV-genom per näthinna beräknades också med hjälp av WPRE-kopieringsnummer och utspädningsfaktor för genomisk DNA-isolering (D). Röda och grå rutor är AAV2/BP2 och AAV2/PHP. S injicerade näthinnor, respektive. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| ddPCR Primers | |
| ITR2 F | GGAACCTAGTGATGGAGTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
Tabell 1: dd-PCR-primersekvenser. Sekvenser av framåt- och bakåt primers för WPRE, ITR2 och mus 18S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll genererade vi två AAV-vektorer som har olika kapsidproteiner och sedan titered dem i enlighet därmed. Ett av de viktigaste stegen i detta protokoll är att producera tillräckliga mängder AAV som ger detekterbart reporteruttryck efter12,13.
Titering av AAV är också en viktig faktor för att justera doser av AAV för intravitreala injektioner. När dessa viktiga kriterier har uppnåtts är det möjligt att kvantifiera flyttningseffektiviteten hos AAV med dd-PCR-metod.
Många laboratorier använder den kvantitativa PCR-metoden (qPCR) för AAV titering. qPCR-baserad absolut kvantifieringsmetod kräver en standardkurva som har utspädningar av kända mängder mål-DNA18. dd-PCR kräver dock inte en standardkurva eftersom den direkt kvantifierar det totala antalet målmolekyler i ett givet prov genom att detektera de positiva dropparna som har minst en kopia av mål-DNA. Eftersom dd-PCR är en slutpunktsanalys och ingen standardkurva krävs, är effektivitetsproblemen som uppstod under qPCR-reaktionen mindre oroande för dd-PCR som lågeffektiva PCR eller kvaliteten på standardkurvorna 9. DD-PCR-metoden kan tillämpas på prover som redan är förberedda för qPCR. Eftersom det redan nämndes i avsnittet Metoder för AAV titering, kräver dd-PCR utspädda prover. Detta är ett kritiskt steg eftersom provkoncentrationen bör justeras på ett sätt som gör att det finns tillräckligt med negativa droppar för att utföra Poisson-algoritmen. Med andra ord är det inte möjligt att utföra dd-PCR-reaktionen med prover med för höga koncentrationer av mål-DNA som inte ger negativa droppar.
För mätningar av både AAV-titerings- och transduktionseffektivitet är olika måluppsättningar möjliga att använda. För AAV titering använder vi främst AAV2 ITR-specifika primers på grund av AAV2-ryggraden i våra konstruktioner. Det är också möjligt att använda WPRE och andra genspecifika mål beroende på AAV-konstruktionen som har analyserats.
För att utvärdera flyttningseffektiviteten hos AAV i den neuronala näthinnan tillämpade vi dd-PCR-metoden med hela näthinnan prover för att kvantifiera den totala mängden AAV genom per näthinnan. Vi bedömde metodens noggrannhet med hjälp av en AAV vektor som uttrycker tdTomato reporter. Jämförelse av dd-PCR-resultat med tdTomato uttrycksnivåer korrelerade utom de två avvikande. Näthinnorna #6 och #7 gav överskott av AAV-genomkopior trots att de visade liknande fluorescensintensiteter jämfört med näthinnan #2,3 4 eller 5. Detta kan bero på att dessa näthinnor har högre transduktionshastigheter med begränsade uttrycksnivåer eller delvis kan vara relaterade till bestående AAV-partiklar eller vektor-DNA i glaskroppen eller neuronal näthinnan19,20. Sammantaget var detta den enda begränsande faktorn för vår metod och kan enkelt identifieras bland andra prover. Vi kvantifierade också det totala antalet AAV genom per näthinna som var en av styrkorna i denna metodik. Detta gör det möjligt att jämföra data mellan olika laboratorier och partier av djur. Därför kan denna metod enkelt tillämpas för att bedöma transduktionseffektiviteten hos en ny serotyp, variant eller batch till batchvariation för AAV-vektorer som inte har något reporteruttryck och hjälper oss att jämföra data i olika inställningar. Detta är viktigt för AAV-vektorer som inte tillåter uttryck för en reporter på grund av storleksbegränsningar.
Denna metod ger också en grund för andra typer av känsliga analyser som använder mål-DNA. Med hjälp av identiska protokoll kan vi kvantifiera mitokondriella genomkopieringsnummer med lämpliga primers. Ytterligare förbättringar är också möjliga, inklusive dissociation av näthinnan och flöde cytometri sortering steg för att kvantifiera mål DNA i antingen enstaka celler eller partier av celler. Dessutom är det också möjligt att bedöma korrigeringseffektiviteten av basredigering med denna metod21,22, som också är kritisk för flera näthinnesjukdomar och genterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Oezkan Keles, Josephine Jüttner och prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform för deras hjälp och stöd för AAV-produktion. Vi vill också tacka prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania för AAV8 / BP2-stammen. Djurarbete utförs på Gebze Technical University djuranläggning. För detta tackar vi Leyla Dikmetas och prof. Uygar Halis Tazebay för tekniskt stöd och stöd till djurhållning. Vi vill också tacka Dr. Fatma Ozdemir för hennes kommentarer om manuskriptet. Detta arbete stöds av TUBITAK, bidragsnummer 118C226 och 121N275 och Sabanci University Integration grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al.
