Summary
Este protocolo apresenta como quantificar a eficiência de transdução AAV na retina do mouse usando PCR de gotícula digital (dd-PCR) juntamente com produção de AAV de pequena escala, injeção intravitreal, imagem da retina e isolamento do DNA genômico da retina.
Abstract
Muitos laboratórios de biologia de células da retina agora usam rotineiramente vírus associados ao Adeno (AAVs) para edição de genes e aplicações regulatórias. A eficiência da transdução AAV é geralmente crítica, o que afeta os resultados experimentais globais. Um dos principais determinantes para a eficiência da transdução é o sorotipo ou variante do vetor AAV. Atualmente, vários sorotipos e variantes artificiais de AAV estão disponíveis com diferentes afinidades para hospedar receptores de superfície celular. Para a terapia genética da retina, isso resulta em diferentes graus de eficiência de transdução para diferentes tipos de células da retina. Além disso, a rota de injeção e a qualidade da produção de AAV também podem afetar a eficiência de transdução AAV da retina. Portanto, é essencial comparar a eficiência de diferentes variantes, lotes e metodologias. O método digital gotlet PCR (dd-PCR) quantifica os ácidos nucleicos com alta precisão e permite realizar a quantificação absoluta de um determinado alvo sem qualquer padrão ou referência. Usando dd-PCR, também é viável avaliar a eficiência de transdução de AAVs por quantificação absoluta dos números de cópia do genoma AAV dentro de uma retina injetada. Aqui, fornecemos um método simples para quantificar a taxa de transdução de AAVs em células de retina usando dd-PCR. Com pequenas modificações, essa metodologia também pode ser a base para a quantificação do número de cópia do DNA mitocondrial, bem como avaliar a eficiência da edição de base, fundamental para várias doenças da retina e aplicações de terapia genética.
Introduction
Os vírus associados ao Adeno (AAVs) são agora comumente usados para uma variedade de estudos de terapia genética da retina. Os AAVs fornecem uma maneira segura e eficiente de entrega de genes com menos imunogenicidade e menos integrações de genomas. A entrada de AAV na célula alvo ocorre através da endocitose, que requer a ligação de receptores e co-receptores na superfície celular1,2. Portanto, a eficiência de transdução de AAVs para diferentes tipos de células depende principalmente do capsídeo e suas interações com os receptores de células hospedeiras. Os AAVs possuem sorotipos e cada sorotipo pode ter tropismos celulares/tecidos distintos e eficiências de transdução. Há também sorotipos artificiais de AAV e variantes geradas pela modificação química do vírus capsid, produção de capsídeos híbridos, inserção de peptídeos, embaralhamento capsídeo, evolução direcionada e mutagênese racional3. Mesmo pequenas alterações na sequência de aminoácidos ou estrutura capsíide podem influenciar as interações com fatores celulares hospedeiros e resultar em diferentes tropismos4. Além das variantes capsid, outros fatores como a rota de injeção e a variação em lote da produção de AAV podem afetar a eficiência de transdução de AAVs na retina neuronal. Portanto, são necessários métodos confiáveis para a comparação das taxas de transdução para diferentes variantes.
A maioria dos métodos para determinar a eficiência da transdução AAV depende da expressão genética dos repórteres. Estes incluem imagens fluorescentes, imunohistoquímica, mancha ocidental ou análise histoquímica do produto genético repórter5,6,7. No entanto, devido à restrição de tamanho dos AAVs, nem sempre é viável incluir genes de repórteres para monitorar a eficiência de transdução. O uso de promotores fortes como o melhorador de CMV híbrido/frango beta-actin ou woodchuck hepatite pós-transcrição elemento regulatório (WPRE) como uma sequência estabilizadora mRNA complica ainda mais o problema de tamanho8. Portanto, também será benéfico definir a taxa de transdução de AAVs injetados com uma metodologia mais direta.
O PCR de gotícula digital (dd-PCR) é uma técnica poderosa para quantificar o DNA alvo a partir de quantidades minúsculas de amostras. A tecnologia dd-PCR depende do encapsulamento da mistura de dna alvo e reação PCR por gotículas de óleo. Cada reação dd-PCR contém milhares de gotículas. Cada gotícula é processada e analisada como uma reação independente do PCR9. A análise das gotículas permite calcular o número absoluto de cópias de moléculas de DNA alvo em qualquer amostra simplesmente usando o algoritmo Poisson. Como a eficiência de transdução dos AAVs está correlacionada com o número de cópia de genomas AAV na retina neuronal, usamos o método dd-PCR para quantificar genomas AAV.
Aqui, descrevemos uma metodologia dd-PCR para calcular a eficiência de transdução dos vetores AAV a partir do DNA genômico da retina6,10. Primeiro, os AAVs que expressam o repórter tdTomato foram gerados usando o protocolo de pequena escala, e titered pelo método dd-PCR11. Em segundo lugar, os AAVs foram injetados intravitrealmente na retina neuronal. Para demonstrar a eficiência da transdução, primeiro quantificamos a expressão tdTomato usando microscopia fluorescente e software ImageJ. Isso foi seguido pelo isolamento do DNA genômico para a quantificação de genomas AAV em retinas injetadas usando dd-PCR. A comparação dos níveis de expressão tdTomato com os genomas AAV transduzidos quantificados pelo dd-PCR mostrou que o método dd-PCR quantificou com precisão a eficiência de transdução dos vetores AAV. Nossos protocolos demonstraram uma descrição detalhada de uma metodologia baseada em dd-PCR para quantificar a eficiência de transdução AAV. Neste protocolo, também mostramos o número absoluto de genomas AAV que são transduzidos após injeções intravitais simplesmente usando o fator de diluição após o isolamento genômico do DNA e os resultados do DD-PCR. No geral, este protocolo fornece um método poderoso, que seria uma alternativa à expressão dos repórteres para quantificar a eficiência de transdução dos vetores AAV na retina.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais foram aceitos pelo comitê de ética da Universidade de Sabanci e os experimentos foram realizados de acordo com a declaração da "Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia" para o uso de animais em pesquisas
1. Produção de AAV em pequena escala12
- Cultura CÉLULAS HEK293T utilizando placas de 15 cm em 10 mL completo de DMEM/10% FBS até 70-80% de confluência.
- Prepare a mistura de transfecção com 20 μg de plasmídeo auxiliar (pHGT1-Adeno1), 7 μg de plasmídeo capsídeo e 7 μg de vetor AAV2-CBA-tdTomato-WPRE e 136 μL de solução PEI (1 mg/mL) em 5 mL de DMEM.
- Adicione a mistura de transfecção preparada de 5 mL em um prato de cultura celular contendo 10 mL de mídia cultural e incubar as células transfecidas por 48-60 h a 37 °C.
- Colete a mídia em 48-60 h após a transfecção e digerir-a com DNase I em uma concentração final de 250 U/mL por 30 min a 37 °C.
- Centrifugar a mídia digerida a 4000 x g,4 °C por 30 min e depois filtre-a com um filtro de seringa de 0,22 μm na membrana de celulose regenerada pré-molhada por 100 kDa.
- Centrifugar a membrana de celulose regenerada a 4000 x g,4 °C por 30 min e descartar a mídia.
- Lave e centrifule a membrana de celulose regenerada com PBS contendo F-68 plurônico de 0,001% três vezes a 4000 x g,4 °C por 30 min. Descarte o PBS em cada etapa.
- Colete AAVs concentrados da parte superior da membrana de celulose regenerada e alíquota para usos posteriores.
- Digerir 5 μL de AAV recém-feito com DNase I (0,2U/μl) por 15 min a 37 °C para titering. Isso é seguido por 10 min a incubação de 95 °C para tanto inativar o DNase I quanto degradar os capsídeos virais.
- Prepare uma diluição serial de 10 vezes a partir de AAVs digeridas usando F-68 plurônicos de 0,05%. Use primers AAV2-ITR e WPRE para titulação(Tabela 1). Os títulos foram calculados multiplicando-se os resultados dd-PCR com os fatores de diluição. Os resultados foram convertidos em cópia do genoma/mL (GC/mL).
NOTA: As concentrações de AAV para produção de AAV em pequena escala devem ser em torno de 1 x 1012 GC/mL. Este protocolo não é aplicável para cepas AAV que não liberam AAVs eficientemente em mídias como a AAV213.
2. Injeção intravitreal de AAV
-
Preparação de equipamentos
- Antes de começar, prepare 10 μL de microsiringe com uma agulha cega de 36 G. Enxágüe cinco vezes com 70% de EtOH, cinco vezes em ddH2O, e finalmente cinco vezes com PBS.
- Carregue a quantidade apropriada de AAV no microsinge para cada injeção.
- Prepare a agulha cirúrgica (sutura, seda, 6/0), fita, fórceps e tesoura.
-
Injeção intravitreal
- Aplique 1 queda de 0,5% de tropicamida e 2,5% de cloridrato de fenilefrina (por exemplo, Mydfrin) contendo colírio antes da anestesia para dilatar pupilas.
- Anestesize camundongos com isoflurane 5% (1 L/min) e continue com 1,5% de isoflurane (1 L/min) durante o procedimento. Uma pequena câmara isoflurano é usada para a primeira indução.
- Verifique a profundidade da anestesia pela perda do reflexo de direito, o reflexo de abstinência e a resposta de pinça da cauda.
- Aplique 0,3% de tobramicina e 0,1% de solução oftalmómica estéril de dexametasona a cada olho antes do procedimento de injeção. A aplicação do olípero previne o ressecamento e exerce efeitos anti-inflamatórios e antibacterianos.
- Use o gancho cirúrgico para estabilizar a pálpebra superior. Puxe ligeiramente para trás para expor a parte dorsal do olho. Grave o gancho no banco para mantê-lo em posição.
- Remova a conjuntiva (menos de 1 mm2) com a tesoura de íris curvada para expor a esclera do olho sob o microscópio dissecando. Use uma seringa de insulina fresca e estéril (30 G) para perfurar a esclera.
- Insira a agulha da microsinga através da mesma punção usando um micromanipulador. Coloque a ponta da agulha atrás da lente no meio da xícara de olho.
- Injete 1 μL de AAV2/BP2 e AAV2/PHP. S vetores com concentrações de 1,63 x 1012 GC/mL e 1,7 x 1012 GC/mL lentamente no vítreo do olho. O controle de volume de injeção é feito manualmente. Deixe a agulha no lugar por 1 minuto e retire lentamente a agulha.
- Libere a pálpebra e aplique tratamento de gel tópico anti-inflamatório e antibacteriano contendo 0,3% de tofilicina e 0,1% dexametasona na púbis. Monitore e avalie os camundongos nos dias seguintes de acordo com a folha de pontuação em termos de aparência (olhos brilhantes, casaco arrumado, curvamento), comportamento (atividade, imobilização, automutilação) e peso corporal em uma escala de 0 a 3. Cada condição tem um placar de 0-3 e uma pontuação total de 3 ou mais é um critério de rescisão.
- Coloque os animais na gaiola após a recuperação.
3. Fluorescência e imagem de fundus
- Coe o camundongo e dilatar a pupila colocando gotas de 0,5% de tropamida e 2,5% de cloridrato de fenilefrina em cada olho.
- Anestesiar o animal com o procedimento acima com isoflurano. Avalie cuidadosamente a profundidade da anestesia beliscando as patas.
- Coloque o mouse no estágio de imagem e verifique a dilatação adequada verificando através da câmera do fundus. Aplique gel tópico (0,2% carbomer 980) na superfície dos olhos para proteger os olhos de desidratação sob anestesia e usá-lo como um gel de acoplamento para imagem.
- Manipule o estágio de imagem para alinhar com a peça do nariz do objetivo. Ajuste o estágio conforme necessário para centralizar o olho do rato. Uma vez que o olho esteja centrado, mova lentamente o objetivo até fazer contato com o olho.
- Realize imagens de fundus e fluorescência em ambos os olhos para acompanhar a expressão tdTomato em 1 semana e 2 semanas após a injeção intravitarreal(Figura 3B)14. Pegue imagens de fundus e fluorescência em configurações idênticas para comparação da expressão do repórter.
4. Isolamento da retina
- Eutanize os animais após a imagem de fundus e fluorescência por inalação de CO2 para coleta de retina em 2 semanas de ponto.
- Mude o globo ocular para a frente com a ajuda de um fórceps divisor de 13,5 cm.
- Remova a lente junto com a sobra vítrea aplicando pressão suave com os fórceps.
- Corte a conexão do globo ocular com o nervo óptico com fórceps curvos de precisão e aperte suavemente a retina com os mesmos fórceps curvos.
- Transfira retinas dissecadas em um tubo de microcentrífuga.
- Encaixe a retina congelante colocando os tubos no nitrogênio líquido.
5. Isolamento genômico do dna do tecido
- Isole o DNA genômico com um kit de DNA genômico de tecido baseado em digestão Proteinase K comercializado.
- Digeste retina a 55 °C, 200 x g por 30 min com Proteinase K, que já é fornecida no kit.
- Execute a etapa de incubação RNase, lave os passos com tampão de lavagem I e II e, finalmente, a etapa de elução de acordo com o protocolo do fabricante.
- Adicione um passo extra de giro após a última lavagem para remover o etanol residual.
- Meça a concentração de DNA genômico e armazene amostras a -20 °C.
6. Análise de PCR digital gotícula de amostras de retina de camundongos para quantificação de genomas virais
- Diluir DNAs genômicas de retinas injetadas em solução Plurônica F-68 de 0,05% para atingir uma concentração final de 1 ng/μL para cada amostra.
- Realize reações separadas para WPRE e 18S usando primers específicos de destino com uma concentração final de 125 nM para cada primer.
- Realize a geração de gotículas em uma mistura de reação PCR de 20 μL, incluindo 1 ng de DNA genômico, primers de 125 nM e supermix evagreen 2x.
- Carregue a mistura de amostras na parte média do cartucho para geração de gotículas.
- Após o carregamento da amostra para o cartucho, adicione 70 μL do óleo de geração de gotículas na linha inferior do cartucho.
- Coloque a junta em cima do cartucho e coloque-a no gerador de gotículas. Certifique-se de que não há diferença entre a junta e o cartucho.
- Leve suavemente aproximadamente 40 μL de gotículas que são geradas no topo bem. Adicione a solução de gotícula à placa de reação PCR de 96 poços semi-contornada.
- Sele a placa PCR com selador de placa PCR usando papel alumínio.
- Coloque a placa PCR em um ciclo térmico selado a calor de 96 poços. Use o protocolo PCR; 95 °C para 5 min, 40 ciclos de 95 °C para 30 s, 60 °C para 1 min, 4 °C para 5 min, 90 °C para 5 min e 4 °C de espera infinita. Aplique a taxa de rampa de 2 °C/s em cada ciclo para garantir que as gotículas atinjam a temperatura correta para cada etapa durante o ciclismo
- Coloque a placa PCR no leitor de gotículas para quantificar gotículas usando o software dd-PCR. Um modelo é configurado usando configurações específicas para evagreen.
- Analise os dados usando um gráfico de gráfico de gráfico 1D com cada amostra para intensidade de fluorescência versus número de gotícula. O valor limiar é organizado para que as gotículas acima do limiar sejam atribuídas como positivas e as abaixo como negativas. Isso é seguido pela aplicação do algoritmo Poisson para determinar a concentração inicial do DNA alvo em unidades de cópias/μL. A razão entre WPRE versus 18S é calculada para medir a eficiência da transdução AAV.
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Representative Results
A produção de AAV em pequena escala é um método rápido e eficiente que fornece vetores para injeções intravitais(Figura 1). A produção de AAV em pequena escala geralmente dá titers dentro da faixa de 1 x 1012 GC/ml que é suficiente para detectar a expressão do repórter na retina (Figura 2). Titering de AAV usando dd-PCR dá resultados consistentes. Primers específicos ITR2 e WPRE são usados rotineiramente e a concentração inicial de cada molécula alvo foi calculada com software dd-PCR por modelagem como distribuição Poisson. Os cálculos foram finalizados pela multiplicação de fatores de diluição e convertidos em cópia de genoma por mL. Os AAVs produzidos para este protocolo apresentaram títulos de 1,63 x 1012 GC/mL e 1,7x 1012 GC/ml para AAV2/BP2 e AAV2/PHP.S7,15, respectivamente. Para comparação, foram utilizadas construções de expressão tdTomato idênticas para ambas as cepas. Injetamos aproximadamente títulos iguais de AAV para a quantificação da eficiência de transdução AAV. Após a injeção de 1 μL das concentrações acima mencionadas de AAVs, os animais foram retratados em 1 semana e 2 pontos de tempo da semana. Utilizou-se um sistema de imagem de fundus e fluorescência tanto para AAV2/BP2 quanto para AAV2/PHP. Retinas injetadas s gerando perfis de expressão de repórter semelhantes, exceto para retina #1 (Figura 3A, B). A expressão TdTomato foi quantificada usando o software ImageJ para valor cinza médio (intensidade média de fluorescência) a fim de comparar a eficiência de transdução e a expressão do repórter(Figura 3A, B). Esta é basicamente a soma dos valores cinzentos de todos os pixels na seleção dividida pelo número de pixels16. Imagens fluorescentes da Retina #1 mostraram apenas uma pequena área de expressão tdTomato, provavelmente devido ao backflow ou vazamento após injeções intravitreal. Consistente com este achado, a intensidade de fluorescência da retina #1 foi 0,9, que foi a mais baixa em comparação com todas as retinas que foram injetadas e imagens intravitrealmente. A intensidade média da fluorescência foi entre 4 a 11. Isso mostrou que a quantificação de imagens fluorescentes da expressão tdTomato foi bem sucedida e correlacionada com as imagens que foram mostradas (Figura 3A, B).
Após a imagem das retinas, o DNA genômico foi isolado das retinas injetadas em 2 semanas. dd-PCR foi realizado utilizando primers WPRE para quantificação do genoma AAV. Mouse 18S foi usado para a normalização dos genomas AAV para o genoma do camundongo(Figura 3C)17. Consistente com a intensidade média de fluorescência e imagens, a retina #1 tinha um número de cópia de genoma AAV muito baixo em relação a 18S, 0,011 dobra menor em comparação com a retina #2. Além disso, as retinas #2, 3, 4 e 5 dão diferenças semelhantes no nível da dobra. As diferenças de dobra em relação à retina #2 para as retinas #3, 4 e 5 foram de 1,75, 0,55 e 0,99, respectivamente. Entre eles, a retina #3 deu a maior intensidade fluorescente e o número de cópia do genoma AAV. Isso já mostrou que a quantificação de genomas AAV transduzidos com dd-PCR se correlaciona com a intensidade da fluorescência e, portanto, à expressão tdTomato que é observada. O método dd-PCR também nos permitiu fazer quantificação absoluta de AAVs transduzidas. A quantificação absoluta do genoma AAV total por retina foi calculada simplesmente multiplicando o número total identificado a partir de dd-PCR e o fator de diluição para DNA genômico. Isso produziu resultados semelhantes em comparação com a eficiência de transdução de genoma AAV normalizada 18S (Figura 3D).
Figura 1: Fluxograma dos procedimentos experimentais. A produção de AAV em pequena escala é seguida por titering AAV baseado em dd-PCR. Os AAVs são injetados intravitrealmente na retina adulta. O acompanhamento dos animais foi realizado utilizando-se um sistema de imagem fundus e fluorescente para analisar a expressão do repórter. As imagens de Fundus e fluorescentes foram tiradas em pontos de tempo de 1 semana e 2 semanas. O DNA genômico é isolado de retinas injetadas para análise com dd-PCR para quantificar o genoma AAV total que está presente nas retinas injetadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: AAV titering usando o método dd-PCR. (A) Método Dd-PCR beneficia-se de reações pcr encapsuladas dentro de uma gotícula. Após a reação do PCR usando química evagreen, gotículas positivas e negativas para o gene alvo foram analisadas para determinar o número absoluto de DNAs alvo dentro de uma solução. (caixas vermelhas em gotículas verdes). (B) Dados de dd-PCR representativos para a AAV titering. Vários lotes de AAVs foram titered usando primers ITR2. Gotículas positivas e negativas são separadas acima e abaixo do limiar (linha roxa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de genomas AAV transduzidos na retina por animais do tipo selvagem dd-PCR. 16 semanas de idade foram injetados intravitrealmente com AAV2/BP2 e AAV2/PHP. S vetores com concentrações de 1,63 x 1012 GC/mL e 1,7x 1012 GC/mL, respectivamente. Ambos os AAVs tinham o mesmo tdTomato expression construct e volume de injeção para todos os AAVs foi de 1 μL. Retinas injetadas (1-7) foram acompanhadas com imagem de fundus e fluorescência. As imagens que foram tiradas foram quantificadas usando o software Image J. Apesar da diferença capsid, todos os animais apresentaram um valor médio de intensidade de fluorescência(valor médio cinza) variando entre 4 a 11, exceto a retina #1 que teve a menor intensidade, 0,9, e expressão tdTomato fraca. As colunas vermelha e cinza são AAV2/BP2 e AAV2/PHP. Retinas injetadas, respectivamente (A-B). dd-PCR foi realizado utilizando primers WPRE para genoma AAV e primer 18S para normalização em 2 semanas. Retina # 1 também mostrou números de cópias AAV distintamente mais baixos por cópias 18S(C). Os genomas totais de AAV por retina também foram calculados utilizando-se o número de cópia do WPRE e o fator de diluição para isolamento genômico de DNA(D). Os quadrados vermelhos e cinzas são AAV2/BP2 e AAV2/PHP. Retinas injetadas, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| primers ddPCR | |
| ITR2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
Tabela 1: sequências de primer dd-PCR. Sequências de primers dianteiros e invertidos para WPRE, ITR2 e mouse 18S.
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Discussion
Neste protocolo, geramos dois vetores AAV que têm diferentes proteínas capsidas e, em seguida, titered-los em conformidade. Uma das etapas mais cruciais deste protocolo é produzir quantidades suficientes de AAVs que produzirão expressão detectável de repórteres após a transdução12,13.
A titering de AAVs também é um fator importante para ajustar as doses de AAV para injeções intravitais. Uma vez alcançados esses critérios importantes, é viável quantificar a eficiência de transdução dos AAVs pela metodologia dd-PCR.
Muitos laboratórios estão usando o método quantitativo pcr (qPCR) para a AAV titering. o método de quantificação absoluta baseado em qPCR requer uma curva padrão que tenha diluições de quantidades conhecidas de DNA alvo18. No entanto, o DD-PCR não requer uma curva padrão, pois quantifica diretamente o número total de moléculas-alvo dentro de uma determinada amostra, detectando as gotículas positivas que têm pelo menos uma cópia do DNA alvo. Uma vez que o DD-PCR é uma análise de ponto final e não é necessária uma curva padrão, os problemas de eficiência que ocorreram durante a reação qPCR são menos preocupantes para dd-PCR como PCRs de baixa eficiência ou a qualidade das curvas padrão 9. A metodologia dd-PCR pode ser aplicada a amostras que já estão preparadas para qPCR. Como já foi mencionado na seção Métodos para titering AAV, dd-PCR requerem amostras diluídas. Este é um passo crítico, uma vez que a concentração amostral deve ser ajustada de uma forma que haja gotículas negativas suficientes para executar o algoritmo Poisson. Em outras palavras, não é possível realizar a reação dd-PCR com amostras com concentrações muito altas de DNA alvo que não produzem gotículas negativas.
Tanto para as medições de eficiência de aav quanto para a eficiência de transdução, diferentes conjuntos de metas são possíveis de usar. Para a AAV titering, usamos principalmente primers específicos AAV2 ITR devido à espinha dorsal AAV2 em nossas construções. Também é possível usar WPRE e outros alvos específicos de genes, dependendo do construto AAV que foi analisado.
Para avaliar a eficiência de transdução de AAVs na retina neuronal, aplicamos o método dd-PCR utilizando amostras inteiras de retina para quantificar a quantidade total de genomas AAV por retina. Avaliamos a precisão da metodologia usando um vetor AAV que expressa o repórter tdTomato. Comparação dos resultados dd-PCR com os níveis de expressão tdTomato correlacionados, exceto os dois outliers. Retinas #6 e #7 renderam cópias do genoma AAV em excesso, apesar de mostrarem intensidades de fluorescência semelhantes em comparação com as retinas #2,3 4 ou 5. Isso pode ser porque essas retinas têm taxas de transdução mais altas com níveis de expressão limitados ou podem, em parte, estar relacionadas com partículas AAV duradouras ou DNA vetorial dentro da retina vítrea ou neuronal19,20. No geral, este foi o único fator limitante para o nosso método e pode ser facilmente identificado entre outras amostras. Também quantificamos o número total de genomas AAV por retina, que foi um dos pontos fortes dessa metodologia. Isso permite a comparação de dados entre diferentes laboratórios e lotes de animais. Portanto, este método pode ser facilmente aplicado para avaliar a eficiência de transdução de um novo sorotipo, variante ou variação de lote a lote para vetores AAV que não têm expressão de repórter e nos ajudam a cruzar dados em diferentes configurações. Isso é fundamental para vetores AAV que não permitem a expressão de um repórter devido a restrições de tamanho.
Este método também fornece uma base para outros tipos de ensaios sensíveis que utilizam DNA alvo. Usando os protocolos idênticos, podemos quantificar números de cópias de genoma mitocondrial com primers apropriados. Outras melhorias também são possíveis, incluindo a dissociação da retina e etapas de triagem de citometria de fluxo para quantificar o DNA alvo em células únicas ou em lotes de células. Além disso, também é viável avaliar a eficiência de correção da edição base utilizando este método21,22, que também é fundamental para diversas doenças da retina e terapias genéticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Oezkan Keles, Josephine Jüttner e prof. Botond Roska, Instituto de Oftalmologia Molecular e Clínica Basel, Plataforma de Vírus Complexos por sua ajuda e apoio à produção de AAV. Também gostaríamos de agradecer ao Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, da Universidade da Pensilvânia pela cepa AAV8/BP2. O trabalho com animais é realizado na unidade de animais da Universidade Técnica gebze. Por isso, agradecemos a Leyla Dikmetas e ao Prof. Uygar Halis Tazebay por assistência técnica e apoio à pecuária. Também gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho é apoiado pela TUBITAK, números de subvenção 118C226 e 121N275, e bolsa de Integração da Universidade sabanci.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
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