Summary
Bu protokol, küçük ölçekli AAV üretimi, intravitreal enjeksiyon, retina görüntüleme ve retina genomik DNA izolasyonu ile birlikte dijital damlacık PCR (dd-PCR) kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyon verimliliğinin nasıl ölçüleceğini sunar.
Abstract
Birçok retina hücre biyolojisi laboratuvarı artık gen düzenleme ve düzenleyici uygulamalar için rutin olarak Adeno ile ilişkili virüsler (AAV' ler) kullanmaktadır. AAV transdüksiyonunun verimliliği genellikle kritiktir ve bu da genel deneysel sonuçları etkiler. Transdüksiyon verimliliği için ana belirleyicilerden biri AAV vektörün serotipi veya varyantıdır. Şu anda, hücre yüzey reseptörlerini barındırmak için farklı benzeşimlere sahip çeşitli yapay AAV serotipleri ve varyantları mevcuttur. Retina gen tedavisi için bu, farklı retina hücre tipleri için çeşitli derecelerde transdüksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Ayrıca enjeksiyon yolu ve AAV üretiminin kalitesi retina AAV transdüksiyon verimliliklerini de etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantların, partilerin ve metodolojilerin verimliliğini karşılaştırmak önemlidir. Dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemi, nükleik asitleri yüksek hassasiyetle ölçerek belirli bir hedefin herhangi bir standart veya referans olmadan mutlak nicelleştirilmesini sağlar. DD-PCR kullanılarak, enjekte edilen bir retinadaki AAV genom kopya numaralarının mutlak nicelleştirilmesiyle AAV'lerin transdüksiyon verimliliklerini değerlendirmek de mümkündür. Burada, dd-PCR kullanarak retina hücrelerindeki AAV'lerin transdüksiyon oranını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Küçük değişikliklerle, bu metodoloji, mitokondriyal DNA'nın kopya sayısı nicelliğinin yanı sıra, birkaç retina hastalığı ve gen tedavisi uygulaması için kritik olan baz düzenlemenin verimliliğini değerlendirmenin de temelini oluşturabilir.
Introduction
Adeno ilişkili virüsler (AAV'ler) artık çeşitli retina gen tedavisi çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. AAV'ler, daha az immünojeniklik ve daha az genom entegrasyonu ile güvenli ve verimli bir gen iletim yolu sağlar. Hedef hücreye AAV girişi, hücre yüzeyindeki reseptörlerin ve yardımcı reseptörlerin bağlanmasını gerektiren endositoz yoluylagerçekleşir 1,2. Bu nedenle, farklı hücre tipleri için AAV'lerin transdüksiyon verimliliği esas olarak kapsid ve konak hücre reseptörleri ile etkileşimlerine bağlıdır. AAV'lerin serotipleri vardır ve her serotip farklı hücresel/doku trompilerine ve transdüksiyon verimliliklerine sahip olabilir. Ayrıca virüs kapsid kimyasal modifikasyonu, hibrid kapsid üretimi, peptit ekleme, kapsid karıştırma, yönlendirilmiş evrim ve rasyonel mutajensis3tarafından oluşturulan yapay AAV serotipleri ve varyantları vardır. Amino asit dizisindeki veya kapsid yapısındaki küçük değişiklikler bile konak hücre faktörleri ile etkileşimler üzerinde bir etkiye sahip olabilir ve farklı tromizmlere neden olabilir4. Kapsid varyantlarına ek olarak, enjeksiyon rotası ve AAV üretiminin toplu olarak parçalanması gibi diğer faktörler, AAV'lerin nöronal retinadaki transdüksiyon verimliliğini etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantlar için transdüksiyon oranlarının karşılaştırılması için güvenilir yöntemler gereklidir.
AAV transdüksiyon verimliliğini belirleme yöntemlerinin çoğu muhabir gen ekspresyonine dayanır. Bunlar floresan görüntüleme, immünohistokimya, batı lekesi veya muhabir gen ürününün histokimyasal analizi5,6,7içerir. Bununla birlikte, AAV'lerin boyut kısıtlaması nedeniyle, transdüksiyon verimliliğini izlemek için muhabir genlerini dahil etmek her zaman mümkün değildir. Hibrid CMV enhancer / tavuk beta-actin veya Woodchuck hepatit transkripsiyonel düzenleyici eleman (WPRE) gibi güçlü promotörleri bir mRNA stabilizatör dizisi olarak kullanmak boyut problemini daha da karmaşık hale gelir8. Bu nedenle, enjekte edilen AAV'lerin transdüksiyon oranını daha doğrudan bir metodoloji ile tanımlamak da faydalı olacaktır.
Dijital damlacık PCR (dd-PCR), hedef DNA'yı dakika miktarda numuneden ölçmek için güçlü bir tekniktir. dd-PCR teknolojisi, hedef DNA ve PCR reaksiyon karışımının yağ damlacıkları ile kapsüllenmesine bağlıdır. Her dd-PCR reaksiyonı binlerce damlacık içerir. Her damlacık bağımsız bir PCR reaksiyon9olarak işlenir ve analiz edilir. Damlacıkların analizi, sadece Poisson algoritmasını kullanarak herhangi bir örnekteki hedef DNA moleküllerinin mutlak kopya sayısının hesaplanmasına olanak tanır. AAV'lerin transdüksiyon verimliliği nöronal retinadaki AAV genomlarının kopya sayısı ile ilişkili olduğundan, AAV genomlarını ölçmek için dd-PCR yöntemini kullandık.
Burada, retinal genomik DNA6,10'danAAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için bir dd-PCR metodolojisini açıklıyoruz. İlk olarak, tdTomato muhabirini ifade eden AAV'ler küçük ölçekli protokol kullanılarak oluşturulmuş ve dd-PCR yöntemi11ile titrilmiştir. İkincisi, AAV'ler intravitreal olarak nöronal retinaya enjekte edildi. Transdüksiyon verimliliğini göstermek için ilk olarak floresan mikroskopi ve ImageJ yazılımı kullanarak tdTomato ekspresyonını ölçtük. Bunu, DD-PCR kullanılarak enjekte edilen retinalarda AAV genomlarının nicelleştirilmesi için genomik DNA'nın izolasyonu izledi. tdTomato ekspresyon seviyelerinin dd-PCR ile ölçülen transdüklenmiş AAV genomları ile karşılaştırılması, dd-PCR yönteminin AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini doğru bir şekilde ölçtüğü göstermiştir. Protokollerimiz, AAV transdüksiyon verimliliklerini ölçmek için dd-PCR tabanlı bir metodolojinin ayrıntılı bir açıklamasını göstermiştir. Bu protokolde ayrıca intravitreal enjeksiyonlardan sonra sadece genomik DNA izolasyonu ve dd-PCR sonuçlarından sonra seyreltme faktörü kullanılarak transdüklenen mutlak AAV genom sayısını gösteriyoruz. Genel olarak, bu protokol retinadaki AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini ölçmek için muhabir ifadesine alternatif olacak güçlü bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller Sabancı Üniversitesi etik kurulu tarafından kabul edilmiş ve hayvanların araştırmada kullanımı için 'Vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Derneği' açıklamasına uygun deneyler yapılmıştır.
1. Küçük ölçekli AAV üretimi12
- Kültür HEK293T hücreleri kullanarak 15 cm plakalar tam 10 mL DMEM/%10 FBS%70-80 izdiah kadar.
- Transfeksiyon karışımını 5 mL DMEM'de 20 μg yardımcı plazmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg kapsid plazmid ve 7 μg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE vektörü ve 136 μL PEI çözeltisi (1 mg/mL) ile hazırlayın.
- 5 mL hazırlanan transfeksiyon karışımını 10 mL kültür ortamı içeren bir hücre kültürü kabına ekleyin ve transfected hücreleri 37 °C'de 48-60 saat kuluçkaya yatırın.
- Transfeksiyon sonrası 48-60 saat boyunca medyayı toplayın ve 37 °C'de 30 dakika boyunca 250 U/mL'lik son konsantrasyonda DNase I ile sindirin.
- Sindirilen ortamı 4000 x g, 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin ve ardından 0,22 μm şırıng filtresiyle önceden ıslanmış rejenezyon selüloz membranına 100 kDa filtre edin.
- Yenilenmiş selüloz membranı 4000 x g, 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin ve ortamı atın.
- Rejenerasyona uğramış selüloz membranı PBS ile yıkayın ve santrifüjleyin% 0.001 Pluronic F-68 4000 x g,4 °C'de 30 dakika boyunca üç kez. Her adımda PBS'yi atın.
- Daha fazla kullanım için rejenere selüloz zarının ve aliquot'un üst kısmından konsantre AAV'leri toplayın.
- Titerleme için 37 °C'de 15 dakika boyunca DNase I (0.2U/μl) ile 5 μL taze yapılmış AAV'yi sindirin. Bunu, hem DNase I'i inaktive etmek hem de viral kapsidleri bozmak için 95 °C'de 10 dakika inkübasyon izler.
- %0,05 Pluronic F-68 kullanarak sindirilmiş AAV'lerden 10 kat seri seyreltme hazırlayın. Titrasyon için AAV2-ITR ve WPRE astarlarını kullanın (Tablo 1). Titrler, dd-PCR sonuçlarının seyreltme faktörleri ile çarpılmasıyla hesaplandı. Sonuçlar genom kopyası/mL'ye (GC/mL) dönüştürüldü.
NOT: Küçük ölçekli AAV üretimi için AAV konsantrasyonlarının 1 x 1012 GC/mL civarında olması beklenmektedir. Bu protokol, AAV'leri AAV213gibi medyaya verimli bir şekilde serbest bırakmayan AAV suşları için geçerli değildir.
2. AAV'nin intravitreal enjeksiyonu
-
Ekipmanın hazırlanması
- Başlamadan önce, 36 G künt iğne ile 10 μL mikrosiiringe hazırlayın. %70 EtOH ile beş kez, ddH2O'da beş kez ve son olarak PBS ile beş kez durulayın.
- Her enjeksiyon için uygun miktarda AAV'yi mikrosyringe yükleyin.
- Cerrahi iğneyi (dikiş, ipek, 6/0), bant, asa ve makası hazırlayın.
-
intravitreal enjeksiyon
- Göz bebeklerini genişletmek için anesteziden önce göz damlası içeren %0,5 tropitimad ve %2,5 fenilefrin hidroklorür (örneğin Mydfrin) 1 damla uygulayın.
- İsoflurane ile fareleri% 5 (1 L / dk) uyuşturun ve işlem sırasında% 1.5 izofluran (1 L / dk) ile devam edin. İlk indüksiyon için küçük bir izofluran odası kullanılır.
- Sağ refleks, geri çekilme refleksi ve kuyruk kıstırma yanıtını kaybederek anestezinin derinliğini doğrulayın.
- Enjeksiyon işleminden önce her göze %0,3 tobramisin ve %0,1 deksametazon steril oftalmik çözelti uygulayın. Göz damlası uygulaması kuruluğu önler ve antienflamatuar ve anti-bakteriyel etkiler uygular.
- Üst göz kapağını stabilize etmek için cerrahi kancayı kullanın. Gözün sırt kısmını açığa çıkarmak için hafifçe geri çekin. Kancayı yerinde tutmak için yedek kulübesine bantla.
- Diseksiyon mikroskobu altında gözün sklerasını ortaya çıkarmak için kavisli iris makası ile konjonktivayı(1mm 2'den az) çıkarın. Sklerayı delmek için taze ve steril bir insülin şırınnası (30 G) kullanın.
- Mikrosilapsilatörü kullanarak mikrosyringe iğnesini aynı delinme yoluyla yerleştirin. İğnenin ucunu lensin arkasına göz kapağının ortasına yerleştirin.
- 1 μL AAV2/BP2 ve AAV2/PHP enjekte edin. 1.63 x 1012 GC/mL ve 1.7 x 1012 GC/mL konsantrasyonlarına sahip S vektörleri yavaşça gözün vitreusuna girer. Enjeksiyon ses kontrolü manuel olarak yapılır. İğneyi 1 dakika yerinde bırakın ve iğneyi yavaşça çekin.
- Göz kapağını serbest bırakın ve göz kapağına% 0.3 tobramycin ve% 0.1 deksametazon içeren anti-enflamatuar ve anti-bakteriyel topikal jel tedavisi uygulayın. Fareleri sonraki günlerde görünüm (parlak gözler, bakımlı palto, kamburluk), davranış (aktivite, hareketsizleştirme, kendi kendine sakatlama) ve vücut ağırlığı açısından 0 ila 3 arasında bir ölçekte puan tablosuna göre izleyin ve değerlendirin. Her koşulun puanı 0-3'tür ve toplam puanı 3 veya üzeri bir fesih kriteridir.
- Hayvanları iyileştikten sonra kafese yerleştirin.
3. Floresan ve fundus görüntüleme
- Fareyi süzün ve her göze% 0.5 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin hidroklorür damlaları yerleştirerek göz bebeğini genişletin.
- Yukarıdaki prosedürle hayvanı izofluran ile uyuşturun. Pençeleri kıstırarak anestezinin derinliğini dikkatlice değerlendirin.
- Fareyi görüntüleme aşamasına yerleştirin ve fundus kamerayı kontrol ederek uygun genişlemeyi doğrulayın. Gözleri anestezi altında susuzluktan korumak ve görüntüleme için kavrama jeli olarak kullanmak için gözlerin yüzeyine topikal jel (%0,2 karbomer 980) uygulayın.
- Hedefin burun parçasına hizalamak için görüntüleme aşamasını manipüle edin. Fare gözünü ortalamak için sahneyi gerektiği gibi ayarlayın. Göz ortalandıktan sonra, gözle temas edene kadar hedefi yavaşça hareket ettirün.
- İntravitreal enjeksiyondan 1 hafta ve 2 hafta sonra tdTomato ekspresyonünü takip etmek için her iki gözde fundus ve floresan görüntüleme gerçekleştirin (Şekil 3B)14. Muhabir ifadesini karşılaştırmak için fundus ve floresan görüntülerini aynı ayarlarda alın.
4. Retina izolasyonu
- 2 haftalık zaman noktasında retina koleksiyonu için CO2 inhalasyonu ile fundus ve floresan görüntülemeden sonra hayvanları ötenazi.
- 13,5 cm ayırıcı forseps yardımıyla göz küresini öne doğru kaydırın.
- Lensi,ps ile hafif basınç uygulayarak arta kalan vitreus ile birlikte çıkarın.
- Göz küresinin optik sinire olan bağlantısını hassas kavisli tokalarla kesin ve retinayı aynı kavisli tokalarla hafifçe sıkın.
- Parçalanmış retinaları mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Tüpleri sıvı nitrojene yerleştirerek retinayı dondurun.
5. Doku genomik DNA izolasyonu
- Genomik DNA'yı ticarileştirilmiş Proteinaz K sindirime dayalı doku genomik DNA kiti ile izole edin.
- Retinayı 55 °C'de, 200 x g'da 30 dakika boyunca, kit içinde zaten tedarik edilen Proteinase K ile sindirin.
- RNase inkübasyon adımı gerçekleştirin, adımları yıkama tamponu I ve II ile yıkayın ve son olarak üreticinin protokolüne göre elution adımı uygulayın.
- Kalan etanol kaldırmak için son yıkamadan sonra ekstra bir spin adımı ekleyin.
- Genomik DNA konsantrasyonu ölçün ve örnekleri -20 °C'de saklayın.
6. Viral genomların nicelleştirilmesi için fare retina örneklerinin damlacık dijital PCR analizi
- Enjekte edilen retinalardan genomik DNA'ları %0,05 Pluronic F-68 çözeltisinde seyrelterek her örnek için 1 ng/μL'lik son konsantrasyona ulaşın.
- Her astar için 125 nM son konsantrasyona sahip hedefe özgü astarları kullanarak WPRE ve 18S için ayrı reaksiyonlar gerçekleştirin.
- 1 ng genomik DNA, 125 nM primer ve 2x evagreen supermix dahil olmak üzere 20 μL PCR reaksiyon karışımında damlacık üretimi gerçekleştirin.
- Damlacık üretimi için numune karışımını kartuşun orta kısmına yükleyin.
- Kartuşa numune yüklemesi yapıldıktan sonra, kartuşun alt sırasına damlacık üretim yağının 70 μL'lik kısmını ekleyin.
- Contayı kartuşun üzerine koyun ve damlacık jeneratörüne yerleştirin. Conta ile kartuş arasında boşluk olmadığından emin olun.
- Üst kuyuda üretilen yaklaşık 40 μL damlacıkları hafifçe alın. Damlacık solüsyonını yarı etekli 96 kuyulu PCR reaksiyon plakasına ekleyin.
- Alüminyum sızdırmazlık folyosu kullanarak PCR plakasını PCR plaka sızdırmazlıklayıcı ile kapatın.
- PCR plakayı 96 kuyulu ısı sızdırmaz termal çevrime yerleştirin. PCR protokolünü kullanın; 5 dakika için 95 °C, 30 s için 95 °C 40 döngü, 1 dakika için 60 °C, 5 dakika için 4 °C, 5 dakika için 90 °C ve 4 °C sonsuz tutma. Damlacıkların bisiklet turu sırasında her adım için doğru sıcaklığa ulaştığından emin olmak için her döngüde 2 °C/s rampa hızı uygulayın
- DD-PCR yazılımını kullanarak damlacıkları ölçmek için PCR plakasını damlacık okuyucuya yerleştirin. Bir şablon, evagreen için belirli ayarlar kullanılarak ayarlanır.
- Floresan yoğunluğu ve damlacık numarası için her örnekle birlikte 1-B çizim grafiği kullanarak verileri analiz edin. Eşik değeri, eşiğin üzerindeki damlacıklar pozitif ve aşağıdakiler negatif olarak atanacak şekilde düzenlenir. Bunu, hedef DNA'nın kopya/μL birimlerindeki başlangıç konsantrasyonunun belirlenmesi için Poisson algoritmasının uygulanması izler. WPRE'nin 18S'ye karşı oranı, AAV transdüksiyon verimliliğini ölçmek için hesaplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Küçük ölçekli AAV üretimi intravitreal enjeksiyonlar için vektör sağlayan hızlı ve verimli bir yöntemdir (Şekil 1). Küçük ölçekli AAV üretimi genellikle retinadaki muhabir ifadesini tespit etmek için yeterli olan 1 x10 12 GC/ml aralığında titre verir (Şekil 2). DD-PCR kullanılarak AAV'nin titerlenerek tutarlı sonuçlar verir. ITR2 ve WPRE'ye özgü astarlar rutin olarak kullanılır ve her hedef molekülün başlangıç konsantrasyonu Poisson dağılımı olarak modellenerek dd-PCR yazılımı ile hesaplanmıştır. Hesaplamalar seyreltme faktörlerinin çarpımı ile son halini alarak mL başına genom kopyasına dönüştürüldü. Bu protokol için üretilen AAV'ler sırasıyla 1.63 x 1012 GC/mL ve AAV2/BP2 ve AAV2/PHP.S 7,15 için1.7x10 12GC/ml titerlere sahipti. Karşılaştırma için, her iki suş için de aynı tdTomato ifade yapıları kullanılmıştır. AAV transdüksiyon verimliliğinin nicelleştirilmesi için yaklaşık eşit AAV titreleri enjekte ettik. Yukarıda belirtilen AAV konsantrasyonlarından 1 μL enjekte edildikten sonra, hayvanlar 1 hafta ve 2 haftalık zaman noktalarında görüntülendi. Hem AAV2/BP2 hem de AAV2/PHP için fundus ve floresan görüntüleme sistemi kullanılmıştır. Retina #1 dışında benzer muhabir ifade profilleri üreten s enjekte retinalar (Şekil 3A,B). TdTomato ifadesi, transdüksiyon verimliliğini ve muhabir ifadesini karşılaştırmak için ortalama gri değer (ortalama floresan yoğunluğu) için ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü (Şekil 3A, B). Bu temelde, seçimdeki tüm piksellerin gri değerlerinin piksel sayısına bölünentoplamıdır 16. Retina #1'in floresan görüntüleri, büyük olasılıkla intravitreal enjeksiyonlardan sonra geri akış veya sızıntı nedeniyle sadece küçük bir tdTomato ifadesi alanı gösterdi. Bu bulgu ile tutarlı olarak, retina #1'in floresan yoğunluğu 0.9 idi ve intravitreal olarak enjekte edilen ve görüntülenen tüm retinalara kıyasla en düşüktü. Ortalama floresan yoğunluğu 4 - 11 arasındaydu. Bu, tdTomato ifadesinin floresan görüntülerinin niceliğinin başarılı olduğunu ve gösterilen görüntülerle ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 3A,B).
Retinaların görüntülenmesinden sonra genomik DNA 2 haftalık zaman noktasında enjekte edilen retinalardan izole edildi. dd-PCR, AAV genom nicelleştirmesi için WPRE primerleri kullanılarak gerçekleştirildi. Fare 18S, AAV genomlarının fare genomuna normalleştirilmesi için kullanılmıştır (Şekil 3C)17. Ortalama floresan yoğunluğu ve görüntülerle tutarlı olarak, retina #1, 18S'ye göre çok düşük bir AAV genom kopya numarasına sahipti, retina #2'ye kıyasla 0.011 kat daha düşüktü. Ayrıca, retinalar #2, 3, 4 ve 5 benzer kat seviyesi farklılıkları verir. Retinalar için retina #2 ile karşılaştırıldığında kat farkları #3, 4 ve 5 sırasıyla 1.75, 0.55 ve 0.99'dur. Bunlar arasında retina #3 hem en yüksek floresan yoğunluğunu hem de AAV genom kopya numarasını verdi. Bu, transdüklenmiş AAV genomlarının dd-PCR ile ölçülmesinin floresan yoğunluğu ve dolayısıyla gözlenen tdTomato ekspresyoyu ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Dd-PCR yöntemi ayrıca transdüklenmiş AAV'lerin mutlak nicelliğini yapmamıza izin verdi. Retina başına toplam AAV genomunun mutlak nicelemesi, dd-PCR'den tanımlanan toplam sayının ve genomik DNA için seyreltme faktörünün çarpılmasıyla hesaplandı. Bu, 18S normalleştirilmiş AAV genom transdüksiyon verimliliğine kıyasla benzer sonuçlar verdi (Şekil 3D).
Şekil 1: Deneysel prosedürlerin akış şeması. Küçük ölçekli AAV üretimini dd-PCR tabanlı AAV titerleme takip eder. AAV'ler intravitreal olarak erişkin retinaya enjekte edilir. Muhabir ifadesini analiz etmek amacıyla fundus ve floresan görüntüleme sistemi kullanılarak hayvanların takibi yapıldı. Fundus ve floresan görüntüler 1 hafta ve 2 haftalık zaman noktalarında çekildi. Genomik DNA, enjekte edilen retinalarda bulunan toplam AAV genomun ölçülmesi için dd-PCR ile analiz için enjekte edilen retinalardan izole edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dd-PCR yöntemi kullanılarak AAV titerleme. (A) Dd-PCR yöntemi, bir damlacık içindeki kapsüllenmiş PCR reaksiyonlarından yararlanır. Evagreen kimyası kullanılarak pcr reaksiyonunun ardından, bir çözelti içindeki mutlak hedef DNA sayısını belirlemek için hedef gen için pozitif ve negatif damlacıklar analiz edildi. (yeşil damlacıklı kırmızı kutular). (B) AAV titering için temsili dd-PCR verileri. ITR2 astarları kullanılarak çeşitli AAV'ler titrildi. Pozitif ve negatif damlacıklar eşiğin (mor çizgi) üstünde ve altında ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Retinadaki transdüklenmiş AAV genomlarının dd-PCR ile nicelleştirilmesi. 16 haftalık yabani tip hayvanlara intravitreal olarak AAV2/BP2 ve AAV2/PHP enjekte edildi. Sırasıyla 1,63 x 1012 GC/mL ve 1,7x 1012 GC/mL konsantrasyonlarına sahip S vektörleri. Her iki AAV'de de aynı tdTomato ekspresyon yapısı ve enjeksiyon hacmi 1 μL idi. Enjekte edilen retinalar (1-7) fundus ve floresan görüntüleme ile takip edildi. Çekilen görüntüler Image J yazılımı kullanılarak ölçülmüş. Kapsid farkına rağmen, tüm hayvanların en düşük yoğunlukta, 0.9 ve zayıf tdTomato ifadesine sahip retina #1 dışında 4 ila 11 arasında değişen bir floresan ortalama yoğunluk değeri (ortalama gri değer)vardı. Kırmızı ve gri sütunlar AAV2/BP2 ve AAV2/PHP'dir. Sırasıyla S enjekte retinalar (A-B). dd-PCR, AAV genom için WPRE primer ve 2 haftalık zaman noktasında normalleşme için 18S astar kullanılarak gerçekleştirildi. Retina # 1 ayrıca 18S kopya başına belirgin şekilde daha düşük AAV kopya numaraları gösterdi (C). Retina başına toplam AAV genomları da genomik DNA izolasyonu(D)için WPRE kopya numarası ve seyreltme faktörü kullanılarak hesaplanmıştır. Kırmızı ve gri kareler AAV2/BP2 ve AAV2/PHP'dir. Sırasıyla retina enjekte edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| ddPCR Astarlar | |
| ITR2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
Tablo 1: dd-PCR astar dizileri. WPRE, ITR2 ve fare 18S için ileri ve geri astar dizileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde farklı kapsid proteinleri olan iki AAV vektörü oluşturduk ve daha sonra bunları buna göre titrettirdik. Bu protokolün en önemli adımlarından biri, transdüksiyon12,13'densonra algılanabilir muhabir ifadesi verecek yeterli miktarda AAV üretmektir.
AAV'lerin titeringi de intravitreal enjeksiyonlar için AAV dozajlarını ayarlamak için önemli bir faktördür. Bu önemli kriterlere ulaşıldıktan sonra, AAV'lerin transdüksiyon verimliliğinin dd-PCR metodolojisi ile ölçülmesi mümkündür.
Birçok laboratuvar AAV titerleme için nicel PCR (qPCR) yöntemini kullanmaktadır. qPCR tabanlı mutlak niceleme yöntemi, bilinen miktarda hedef DNA18seyreltmeleri olan standart bir eğri gerektirir. Bununla birlikte, dd-PCR, hedef DNA'nın en az bir kopyasına sahip pozitif damlacıkları tespit ederek belirli bir örnekteki toplam hedef molekül sayısını doğrudan ölçtğü için standart bir eğri gerektirmez. DD-PCR bir uç nokta analizi olduğundan ve standart eğri gerekmediğinden, qPCR reaksiyon sırasında meydana gelen verimlilik sorunları, düşük verimli PCR'ler veya standart eğrilerin kalitesi gibi dd-PCR için daha az endişe vericidir 9. Dd-PCR metodolojisi, qPCR için önceden hazırlanmış örneklere uygulanabilir. AAV titering için Yöntemler bölümünde daha önce de belirtildiği gibi, dd-PCR seyreltilmiş numuneler gerektirir. Bu kritik bir adımdır, çünkü numune konsantrasyonu Poisson algoritmasını gerçekleştirmek için yeterli negatif damlacık olacak şekilde ayarlanmalıdır. Yani negatif damlacık vermeyen hedef DNA konsantrasyonları çok yüksek olan örneklerle dd-PCR reaksiyonunun gerçekleştirilmesi mümkün değildir.
Hem AAV titerleme hem de transdüksiyon verimliliği ölçümleri için farklı hedef setlerinin kullanılması mümkündür. AAV titerleme için, yapılarımızdaki AAV2 omurgası nedeniyle esas olarak AAV2 ITR'ye özgü astarlar kullanıyoruz. Analiz edilen AAV yapısına bağlı olarak WPRE ve gene özgü diğer hedeflerin kullanılması da mümkündür.
AAV'lerin nöronal retinadaki transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için retina başına toplam AAV genom miktarını ölçmek için tüm retina örneklerini kullanarak dd-PCR yöntemini uyguladık. TdTomato muhabirini ifade eden bir AAV vektörü kullanarak metodolojinin doğruluğunu değerlendirdik. Dd-PCR sonuçlarının tdTomato ifade düzeyleriyle karşılaştırılması, iki aykırılık dışında ilişkilidir. Retinalar #6 ve #7, retinalara kıyasla benzer floresan yoğunlukları göstermesine rağmen fazla AAV genom kopyaları verdi #2,3 4 veya 5. Bunun nedeni, bu retinaların sınırlı ifade seviyelerine sahip daha yüksek transdüksiyon oranlarına sahip olması veya kısmen vitreus veya nöronal retina19,20içindeki kalıcı AAV parçacıkları veya vektör DNA'sı ile ilgili olması olabilir. Genel olarak, bu yöntemimiz için tek sınırlayıcı faktördü ve diğer örnekler arasında kolayca tanımlanabilir. Ayrıca retina başına toplam AAV genom sayısını ölçtük ve bu metodolojinin güçlü yönlerinden biriydi. Bu, farklı laboratuvarlar ve hayvan partileri arasında verilerin karşılaştırılmasını sağlar. Bu nedenle, bu yöntem, muhabir ifadesi olmayan ve verileri farklı ayarlarda karşılaştırmamıza yardımcı olan AAV vektörleri için yeni bir serotip, varyant veya toplu işlemin toplu değişime transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için kolayca uygulanabilir. Bu, boyut kısıtlamaları nedeniyle bir muhabirin ifadesine izin vermeyen AAV vektörleri için kritik öneme sahiptir.
Bu yöntem aynı zamanda hedef DNA kullanan diğer hassas tahlil türlerine de temel oluşturur. Aynı protokolleri kullanarak mitokondriyal genom kopya numaralarını uygun astarlarla ölçebiliriz. Tek hücrelerde veya hücre partilerinde hedef DNA'yı ölçmek için retina ve akış sitometrisi sıralama adımlarının ayrıştırması da dahil olmak üzere daha fazla iyileştirme mümkündür. Ayrıca, baz düzenlemenin düzeltme verimliliğini değerlendirmek de mümkündür bu yöntemkullanılarak 21,22, bu da birkaç retina hastalığı ve gen tedavileri için kritik öneme sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Oezkan Keles, Josephine Jüttner ve Prof. Botond Roska'ya, Moleküler ve Klinik Oftalmoloji Enstitüsü Basel, Karmaşık Virüsler Platformu'na AAV üretimine verdikleri yardım ve destek için teşekkür ederiz. Ayrıca AAV8/BP2 suşu için Pennsylvania Üniversitesi Perelman Tıp Fakültesi'nden Prof. Jean Bennett'e teşekkür ederiz. Gebze Teknik Üniversitesi hayvan tesisinde hayvan çalışması yapılmaktadır. Bunun için Leyla Dikmetaş ve Prof. Dr. Uygar Halis Tazebay'a hayvancılığa yönelik teknik yardım ve destekleri için teşekkür ediyoruz. Dr. Fatma Özdemir'e de el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma TübİtAK, 118C226 ve 121N275 hibe numaraları ve Sabancı Üniversitesi Entegrasyon hibesi ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al.
