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Biology

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Published: September 24, 2021 doi: 10.3791/63045
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Abstract

Im stationären Zustand bleiben hämatopoetische Stammzellen (HSCs) weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie überwiegend auf Glykolyse angewiesen sind, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Unter Stressbedingungen wie Infektionen oder Blutverlust werden HSCs jedoch proliferativ und produzieren schnell nachgeschaltete Vorläuferzellen, die sich wiederum weiter differenzieren und schließlich reife Blutzellen produzieren. Während dieses Übergangs- und Differenzierungsprozesses verlassen HSCs die Ruhephase und durchlaufen schnell einen metabolischen Wechsel von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung (OxPHOS). Verschiedene Stresszustände wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit können sich negativ auf die mitochondriale Funktion auswirken und somit die metabolische Reprogrammierung und Differenzierung von HSCs und Vorläufern während der Hämatopoese verändern. Wertvolle Einblicke in die glykolytischen und mitochondrialen Funktionen von HSCs und Vorläufern unter Normal- und Stressbedingungen können durch die Beurteilung ihrer extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) und Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind.

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in Mausknochenmark-abgeleiteten liniennegativen Zellpopulationen bereitgestellt, die sowohl hämatopoetische Stamm- als auch primitive Vorläuferzellen (HSPCs) umfassen, mit dem extrazellulären Flussanalysator. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von liniennegativen Zellen aus dem Knochenmark der Maus, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen von 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG, ein Glukoseanalogon, das die Glykolyse hemmt) und verschiedener OxPHOS-zielgerichteter Medikamente (Oligomycin, FCCP, Rotenon und Antimycin A), die in diesen Assays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien. Schlüsselparameter des glykolytischen Flusses, wie Glykolyse, glykolytische Kapazität und glykolytische Reserve, und OxPHOS-Parameter wie Basalatmung, maximale Atmung, Protonenleck, ATP-Produktion, freie Atemkapazität und Kopplungseffizienz können in diesen Assays gemessen werden. Dieses Protokoll ermöglicht ECAR- und OCR-Messungen an nicht adhärenten HSPCs und kann verallgemeinert werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren.

Introduction

Hämatopoese ist der Prozess, bei dem verschiedene Arten von reifen Blutzellen mit hochspezialisierten Funktionen aus HSCs1 gebildet werden. HSCs sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und in verschiedene multipotente und linienspezifische Vorläuferpopulationen zu differenzieren. Diese Vorläufer produzieren letztendlich Zellen von lymphatischen, myeloischen, erythroiden und Megakaryozytenlinien. Um ihre Selbsterneuerungskapazität aufrechtzuerhalten, bleiben HSCs weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie, wie andere Gewebestammzellen, auf Glykolyse und nicht auf mitochondriales OxPHOS für die ATP-Produktion angewiesen sind 2,3. Der Eintritt in den Zellzyklus führt zu einer verbesserten Atmung und OxPHOS, was zu erhöhten Werten an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt, die sich nachteilig auf die HSC-Aufrechterhaltung und -Funktionauswirken 3. Eine wiederholte Zellteilung kann daher zu einer verminderten Selbsterneuerungskapazität von HSCs und letztlich zu deren Erschöpfung führen.

Bei der adulten Hämatopoese durchlaufen HSCs hauptsächlich eine asymmetrische Zellteilung, bei der eine der Tochterzellen das HSC-Potenzial behält und weiterhin auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen ist. Die andere Tochterzelle wird zu einer primitiven Vorläuferzelle, die die Selbsterneuerungsfähigkeit verliert, sich aber vermehrt und schließlich zu differenzierten funktionellen hämatopoetischen Zellen führt4. Wenn HSCs differenzieren, um nachgeschaltete Vorläufer zu produzieren, wird angenommen, dass ein Wechsel von der Glykolyse zum mitochondrialen Stoffwechsel erfolgt, um die Energie und die Bausteine zu liefern, die zur Unterstützung dieses schnellen Übergangs benötigt werden5, wie die Beobachtungen nahelegen, dass HSCs inaktive mitochondriale Massebesitzen 6,7,8,9 . Im Gegensatz dazu ist die mitochondriale Aktivität (angezeigt durch verknüpfte ROS-Spiegel) bei der Abstammung gebundenen Vorläufer viel höher als bei HSCs 9,10,11. Metabolische Veränderungen, die während des frühesten Schritts der Hämatopoese auftreten, deuten daher auf eine direkte und entscheidende Rolle der Mitochondrien bei der Regulierung des HSC-Schicksals hin.

Dysfunktionale Mitochondrien, die unter verschiedenen Stressbedingungen wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit auftreten 12, können die HSC-Selbsterneuerungskapazität beeinträchtigen und ein Ungleichgewicht in der HSC / Vorläuferdifferenzierung induzieren, indem sie übermäßige Mengen an ROS produzieren, die ATP-Produktion beeinträchtigen und / oder andere Stoffwechselprozesse verändern9,12,13 . Störungen in der metabolischen Homöostase bei der HSC/Vorläufer-Differenzierung könnten die Hämatopoese signifikant beeinflussen und möglicherweise zur Entwicklung hämatogischer Anomalien beitragen13. Angesichts der kritischen Einflüsse von Glykolyse und mitochondrialem OxPHOS auf die HSC-Stammheit und -Differenzierung ist es von Interesse, sowohl metabolische Parameter unter normalen als auch unter Stressbedingungen zu untersuchen. Wertvolle Einblicke in die glykolytische und mitochondriale Funktion von HSCs und Vorläuferzellen können durch die Bewertung ihrer ECAR und OCR gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind.

Der extrazelluläre Flussanalysator von Seahorse ist ein leistungsstarkes Gerät, das mit zwei Sonden pro Bohrung ausgestattet ist, um ECAR und OCR in lebenden Zellen gleichzeitig zu messen und somit zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in Echtzeit als Reaktion auf verschiedene Substrate oder Inhibitoren verwendet werden kann. Die mit dem Analysator verwendete Assay-Kartusche enthält Injektionsanschlüsse, um bis zu vier Medikamente für die automatisierte Injektion während des Assays aufzunehmen. Ein Schema eines typischen Glykolyse-Stresstests ist in Abbildung 1A dargestellt. Der Assay beginnt mit der Messung von ECAR von Zellen, die in Glykolyse-Stresstestmedium inkubiert werden, das Glutamin, aber nicht Glucose oder Pyruvat enthält. Dies stellt eine Versauerung dar, die aufgrund nicht-glykolytischer Aktivitäten der Zellen auftritt, und wird als nicht-glykolytische Versauerung berichtet. Es folgt die Injektion von Glukose in einer gesättigten Konzentration. Über die Glykolyse wird Glukose in der Zelle in Pyruvat umgewandelt, das im Zytoplasma weiter metabolisiert wird, um Laktat zu produzieren, oder in Mitochondrien, um CO 2 und Wasser zu produzieren.

Die Umwandlung von Glukose in Laktat verursacht eine Nettoproduktion und anschließende Freisetzung von Protonen in das extrazelluläre Medium, was zu einem raschen Anstieg des ECAR14,15,16 führt. Diese glukosestimulierte Veränderung der ECAR wird als Glykolyse unter basalen Bedingungen berichtet. Die zweite Injektion besteht aus Oligomycin (einem Inhibitor der ATP-Synthase, auch bekannt als Komplex V17), das die mitochondriale ATP-Produktion hemmt. Während der Oligomycin-vermittelten OxPHOS-Hemmung regulieren die Zellen die Glykolyse maximal, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Dies führt zu einem weiteren Anstieg der ECAR, der die maximale glykolytische Kapazität der Zellen offenbart. Die Differenz zwischen der maximalen glykolytischen Kapazität und der basalen Glykolyse wird als glykolytische Reserve bezeichnet. Schließlich wird 2-DG injiziert, was zu einem signifikanten Rückgang der ECAR führt, in der Regel in der Nähe von nicht-glykolytischen Säuerungsgraden. 2-DG ist ein Glukoseanalogon, das kompetitiv an die Hexokinase bindet, was zu einer Hemmung der Glykolyse18 führt. Somit bestätigt die 2-DG-induzierte Abnahme der ECAR weiter, dass die Glykolyse tatsächlich die Quelle von ECAR ist, die nach Glukose- und Oligomycin-Injektionen beobachtet wurde.

Abbildung 1B zeigt den Schaltplan für einen typischen mitochondrialen Stresstest. Der Assay beginnt mit der OCR-Basismessung der Zellen, die in mitochondrialem Stresstestmedium, das Glukose, Glutamin und Pyruvat enthält, inkubiert werden. Nach basalen OCR-Messungen wird Oligomycin in diesen Assay injiziert, das den Komplex V hemmt und dadurch den Elektronenfluss durch die Elektronentransportkette (ETC) reduziert17. Folglich wird die OCR als Reaktion auf die Oligomycin-Injektion reduziert, und diese Abnahme der OCR ist mit der mitochondrialen ATP-Produktion verbunden. Die zweite Injektion besteht aus Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)-phenylhydrazon (FCCP), einem Protonophor und einem Entkoppler des mitochondrialen OxPHOS17. FCCP kollabiert den mitochondrialen Protonengradienten, indem es den Fluss von Protonen durch die mitochondriale innere Membran ermöglicht. Aufgrund der FCCP-Injektion wird der Elektronenfluss durch das ETC unterdrückt, und Komplex IV verbraucht Sauerstoff auf dem maximalen Niveau. Der Unterschied zwischen maximaler OCR und basaler OCR wird als freie Atemkapazität bezeichnet, die ein Maß für die Fähigkeit der Zelle ist, auf einen erhöhten Energiebedarf unter Stressbedingungen zu reagieren. Schließlich wird eine Mischung aus zwei ETC-Inhibitoren (Rotenon, ein Komplex-I-Inhibitor, und Antimycin A, ein Komplex-III-Inhibitor17) injiziert, wodurch der Elektronenfluss vollständig abgeschaltet wird, und die OCR sinkt auf ein niedriges Niveau. OCR, gemessen nach Rotenon und Antimycin A-Injektion entspricht einer nicht-mitochondrialen OCR, die durch andere Prozesse in den Zellen angetrieben wird. Die nicht-mitochondriale OCR ermöglicht die Berechnung der Basalatmung, des Protonenlecks und der maximalen Atmung.

Die Basalatmung stellt den Unterschied zwischen der Baseline-OCR und der nicht-mitochondrialen OCR dar. Protonenleck bezieht sich auf den Unterschied zwischen OCR nach Oligomycin-Injektion und nicht-mitochondrialer OCR. Die maximale Atmung stellt den Unterschied zwischen OCR nach FCCP-Injektion und nicht-mitochondrialer OCR dar. Die Kopplungseffizienz wird als Prozentsatz der ATP-Produktionsrate zur Basalatmungsrate berechnet. Dieses Methodenpapier enthält ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in liniennegativen HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse XFe96. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von Mauslinien-negativen HSPCs, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen verschiedener Medikamente, die in extrazellulären Flussassays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien.

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Protocol

Alle Tierversuche mit Wirbeltieren wurden von den Vorschriften des Ausschusses für die Verwendung und Pflege von Tieren der University of Michigan genehmigt und in Übereinstimmung mit diesen durchgeführt.

1. Tag vor dem Assay (Gesamtzeit: ~10 min)

  1. Hydratation der Sensorkartusche (Schrittzeit: ~10 min)
    1. Öffnen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit, und entfernen Sie die Sensorkassette und die Utility-Plate-Baugruppe. Speichern Sie Ladehilfswohnungen für die Verwendung am nächsten Tag.
    2. Trennen Sie die Sensorkassette (den oberen grünen Teil mit Deckel) manuell von der Utility-Platte (untere 96-Well-Mikroplatte) und legen Sie sie kopfüber neben die Utility-Platte.
    3. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jede Vertiefung der Gebrauchsplatte mit 200 μL Kalibrant, das im Lieferumfang des Flow-Assay-Kits enthalten ist.
    4. Setzen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Gebrauchsplatte und stellen Sie sicher, dass die Sensoren vollständig in das Kaliber eingetaucht sind.
    5. Legen Sie die montierte Sensorpatrone und die Gebrauchsplatte mit Kalibrant über Nacht in einen Nicht-CO2 37 °C Inkubator. Um eine Verdunstung des Kalibers zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Inkubator ordnungsgemäß befeuchtet ist. Wenn Sie einen normalen Ofeninkubator für Nicht-CO2 37 °C-Inkubationen verwenden, stellen Sie ein offenes Becherglas mit Wasser in den Inkubator, um ihn zu befeuchten. Falls verfügbar, verwenden Sie eine XF-Vorbereitungsstation für alle Nicht-CO2 37 °C-Inkubationen.
      HINWEIS: Alternativ kann die Sensorkartusche über Nacht mit 200 μL sterilem Reinstwasser pro Bohrung in einem Nicht-CO2 37 °C Inkubator hydratisiert werden. Ersetzen Sie Wasser durch 200 μL pro Bohrung von 37 °C vorgewärmtem Kalibrant, mindestens 45-60 Minuten, bevor Sie die Injektionsöffnungen am Tag des Assays laden.

2. Tag des Assays (Gesamtzeit: ~9 h 30 min)

HINWEIS: Die oben angegebene Gesamtzeit beinhaltet die kumulative Dauer der Schritte 2.1-2.4 zusätzlich zu Schritt 2.5 oder Schritt 2.6.

  1. Herstellung von zellklebebeschichteten Mikrotiterplatten (Schrittzeit: ~1 h 30 min)
    HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitskabine durch.
    1. Pro 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte werden 2,5 ml der Zellklebelösung (22,4 μg/ml, siehe Materialtabelle) hergestellt, indem 56 μg des Zellklebers in einem geeigneten Volumen filtersterilisiertes 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,0) gelöst und sofort 1 N Natriumhydroxid bei halbem Volumen des verwendeten Zellklebstoffs zugegeben werden. Vortex oder Pipette auf und ab pipettieren, um zu mischen.
    2. Öffnen Sie die 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte (im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten) und dosieren Sie 25 μL der vorbereiteten Zellklebelösung am Boden jeder Vertiefung. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie 30 min bei Raumtemperatur in der Haube.
    3. Entfernen und verwerfen Sie nach der Inkubation überschüssige Zellklebelösung mit einer Mehrkanalpipette oder einem Aspirator und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 μL sterilem Reinstwasser. Trocknen Sie die Platte an der Luft, wobei der Deckel entfernt wurde, in der Kapuze für 30-45 min.
      HINWEIS: Zellkleberbeschichtete Zellkultur-Mikrotiterplatten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. Vorbeschichtete Mikrotiterplatten, die bei 4 °C gelagert werden, müssen vor dem Aussäen der Zellen auf Raumtemperatur in der Haube erwärmt werden.
  2. Aufbereitung von Assay-Medien (Schrittzeit: ~30 min)
    1. Erstellung von Glykolyse-Stresstest-Assay-Medium
      1. Ergänzen Sie 100 mL Basismedium (siehe Materialtabelle) mit 1 ml 200 mM L-Glutamin.
        HINWEIS: Die endgültige L-Glutaminkonzentration im Assay-Medium beträgt 2 mM.
      2. Das mit L-Glutamin versetzte Medium im Wasserbad auf 37 °C erwärmen.
      3. Stellen Sie den pH-Wert des warmen Mediums mit 1 N NaOH auf 7,4 ein.
      4. Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter und halten Sie es bei 37 °C, bis es gebrauchsfertig ist.
    2. Erstellung von mitochondrialem Stresstest-Assay-Medium
      1. Ergänzen Sie 100 ml des Basismediums mit 0,45 g Glukose, 1 ml 200 mM L-Glutamin und 1 ml 100 mM Natriumpyruvat.
        HINWEIS: Das endgültige Assay-Medium enthält 25 mM Glukose, 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat.
      2. Erwärmen Sie Glukose, L-Glutamin und das mit Natriumpyruvat versetzte Medium bis 37 °C in einem Wasserbad.
      3. Stellen Sie den pH-Wert des warmen Mediums mit 1 N NaOH auf 7,4 ein.
      4. Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter und lagern Sie es bei 37 °C, bis es gebrauchsfertig ist.
  3. Ernte von Maus-Linien-negativen HSPCs (Schrittzeit: ~3 h)
    1. Bereiten Sie den Assay-Puffer vor, indem Sie Hank's ausgewogene Salzlösung mit 4% fetalem Rinderserum ergänzen. Bereiten Sie den 1x-Anreicherungspuffer vor, indem Sie den 5x-Bestand mit sterilem destilliertem Wasser verdünnen. Halten Sie beide Puffer bis zum Gebrauch auf Eis.
    2. Euthanasieren Sie Mäuse auf humane Weise mit CO2, gefolgt von zervikaler Dislokation und entfernen Sie die Hinterbeine mit einer Schere. Entfernen Sie vorsichtig alle Gewebe von den Knochen und schneiden Sie die Enden von beiden Seiten des Femurs und der Tibia mit einer Schere. Spülen Sie Knochenmarkzellen aus dem Femur und der Tibia mit dem Assay-Puffer aus. Führen Sie die gespülten Zellen durch einen sterilen 70-μm-Filter, zentrifugieren Sie das Filtrat bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C und entsorgen Sie den Überstand.
    3. Die roten Blutkörperchen werden lysiert, indem das Zellpellet in 500 μL ACK-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2)resuspendiert wird. Nach der Lyse für 1 min auf Eis waschen Sie die Proben mit 1 ml Assay-Puffer und zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
    4. Nach dem Waschen inkubieren Sie die Proben mit einem Cocktail aus biotinylierten Antikörpern, die gegen CD2 (1:200-Verdünnung), CD3 (1:200-Verdünnung), CD5 (1:200-Verdünnung), CD8 (1:200-Verdünnung), Ter-119 (1:200-Verdünnung), B220 (1:200-Verdünnung) und Gr-1 (1:800-Verdünnung) gerichtet sind, für 45 min auf Eis in einem Gesamtvolumen von 500 μL Assay-Puffer.
    5. Waschen Sie die Proben mit 1 ml Assay-Puffer mit Zentrifugation wie oben.
    6. Waschen Sie die Proben mit 1 ml 1x Anreicherungspuffer mit Zentrifugation wie oben.
    7. Inkubieren Sie die Proben mit 20 μL Streptavidin-Nanokügelchen und 100 μL 1x Anreicherungspuffer auf Eis für 15 min.
    8. Waschen Sie die Proben mit 1 ml 1x Anreicherungspuffer mit Zentrifugation wie oben.
    9. Resuspendieren Sie die Proben in 2,5 ml 1x Anreicherungspuffer. Legen Sie sie für 5 min auf einen Trennmagneten. Sammeln Sie die Überstände separat in 15 ml konischen Röhrchen.
    10. Magnetgetrennte Proben in einem zusätzlichen 1-fachen Anreicherungspuffer von 2,5 ml suspendieren und für 5 min wieder auf den Trennmagneten legen. Überstände sammeln und kombinieren Sie die vorherigen Sammlungen in 15 ml konischen Röhrchen aus Schritt 2.3.9.
      HINWEIS: Die Überstände enthalten die liniennegativen Zellanteile.
    11. Zentrifugieren Sie die 15 ml konischen Röhrchen mit den negativ ausgewählten Zellen für 5 min bei 200 × g bei 4 °C.
    12. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 1 ml Assay-Puffer und zählen Sie die Zellzahl mit trypan blue manuell oder über einen automatisierten Zellzähler wie eine Countess 3.
      HINWEIS: Nach dem oben beschriebenen Ansatz sollten ~ 6 ×10 6 liniennegative HSPCs leicht von den Hinterbeinen einer einzelnen Maus gereinigt werden. Wenn Reagenzien wie Assay-Puffer, 1x-Anreicherungspuffer und Lineage-spezifischer Antikörpercocktail am Tag vor dem Experiment hergestellt werden, dauert es ungefähr 2,5-3 Stunden, um HSPCs von 4 Mäusen anzureichern. Es würde zusätzliche 10 Minuten für jede Maus über diese Zahl hinaus dauern.
  4. Seeding-Zellen in zellklebebeschichteten Mikrotiterplatten (Schrittzeit: ~1 h)
    1. Zentrifugenzellen aus Schritt 2.3.12 bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet im entsprechenden Assay-Medium (Glykolyse-Stresstestmedium oder mitochondriales Stresstestmedium). Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im entsprechenden erwärmten Assay-Medium bis zur Konzentration von 2,5 × 10 5 Zellen pro 50 μL oder5 × 106 pro ml.
    4. Pipette 50 μL der Zellsuspension entlang der Seite jeder Vertiefung der mit Zellkleber beschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur. Pipette 50 μL des Assay-Mediums in die Eck-Hintergrundmesstöpfe. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette für die Zellbeschichtung, um Konsistenz zu gewährleisten.
    5. Erstellen Sie eine Zentrifugenbilanzplatte, indem Sie 50 μL Wasser pro Bohrloch einer unbeschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte hinzufügen.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellen in der Platte bei 200 × g für 1 min bei Raumtemperatur. Bremsen Sie nicht. Überführen Sie die Platte für 25-30 min in einen Nicht-CO2 37 °C Inkubator, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig angeschlossen sind. Bestätigen Sie visuell unter dem Mikroskop, dass die Zellen stabil auf der Mikrotiterplattenoberfläche haften.
      HINWEIS: Da ~ 6 × 106 lineage-negative HSPCs aus den Hinterbeinen einer einzelnen Maus geerntet werden können, werden HSPCs, die von 4 Mäusen (~ 2,4 × 107 Zellen) isoliert wurden, benötigt, um eine ganze 96-Well-Platte zu füllen, wenn das Ziel darin besteht, mehrere Interventionen ex vivo parallel zu screenen. Wenn es jedoch darum geht, die Auswirkungen einer genetischen Veränderung oder eines Eingriffs auf die metabolischen Parameter von HSPCs in vivo zu untersuchen, können HSPCs, die aus mehreren Paaren von Kontroll- und Testmäusen isoliert wurden, in mehreren technischen Replikaten parallel mit einer einzigen Platte analysiert werden.
  5. Durchführung eines Glykolyse-Stresstests mit dem extrazellulären Flussanalysator (Schrittzeit: ~3 h 30 min)
    1. Beschickungssensorpatrone mit Injektionsmassen
      1. Es werden 100 mM Glukose, 20 μM Oligomycin und 500 mM 2-DG-Lösungen in vorgewärmtem Glykolyse-Stresstest-Assay-Medium (pH 7,4) hergestellt.
        HINWEIS: Alle injizierenden Verbindungslösungen werden in 10-facher Konzentration hergestellt. Die Endkonzentrationen der Vertiefung betragen 10 mM für Glukose, 2 μM für Oligomycin und 50 mM für 2-DG (siehe Tabelle 1).
      2. Entfernen Sie die hydratisierte Sensorkartusche aus dem Nicht-CO2 37 °C-Inkubator aus Schritt 1.1.5. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Kalibrant in der Gebrauchsplatte, indem Sie die Sensorpatrone aus dem Kalibrant herausheben und auf derselben Gebrauchsplatte mit dem Kalibrant ersetzen.
      3. Platzieren Sie die A/D-Ladeführung flach (im extrazellulären Flux-Assay-Kit enthalten) auf der Oberseite der Sensorkassette und richten Sie sie so aus, dass sich der Buchstabe "A" in der oberen linken Ecke befindet, um sicherzustellen, dass nur Anschlüsse A zum Laden zur Verfügung stehen. Mit einer Mehrkanalpipette 20 μL 100 mM Glucoselösung in Port A dosieren.
      4. Ersetzen Sie die A/D-Ladeführung flach durch die B/C-Ladeführung flach und orientieren Sie sich so, dass sich der Buchstabe "B" in der oberen linken Ecke befindet, um sicherzustellen, dass nur Anschlüsse B zum Laden verfügbar sind. Mit einer Mehrkanalpipette 22 μL 20 μM Oligomycinlösung in Port B dosieren.
      5. Richten Sie die B/C-Ladeführung flach aus, um den Buchstaben "C" in der oberen linken Ecke für Ladeanschlüsse C zu finden. Dosieren Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 μL 500 mM 2-DG-Lösung in Ports C.
      6. Entfernen und entsorgen Sie die Ladeführungsflats.
        HINWEIS: Es ist wichtig, dass jede Portreihe aller 96 Wells, einschließlich derjenigen der Hintergrundwellen, vollständig mit dem gleichen Volumen der injizierenden Verbindung geladen wird.
    2. Vorlagenerstellung, Kalibrierung und Messungen
      1. Erstellen oder laden Sie die Vorlage für den Glykolyse-Stresstest auf dem Controller. Geben Sie Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu. Weisen Sie die 4 Eckvertiefungen für Hintergrundmessungen zu.
      2. Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden.
      3. Stellen Sie für die Basismessung und die Messungen nach jeder Injektion (Glukose, Oligomycin und 2-DG) die Anzahl der Messzyklen auf 3 und Mischen - Warten - Messzeiten auf 3 min - 0 min - 3 min ein (siehe Tabelle 2).
      4. Entfernen Sie den Deckel von der mit Compounds beladenen und hydratisierten Sensorpatrone, die in Kalibrant in die Utility-Platte eingetaucht ist. Legen Sie es auf das Arbeitsfach des extrazellulären Flussanalysators und beginnen Sie den Lauf.
        HINWEIS: Der erste Schritt ist die Kalibrierung, die normalerweise ~ 20 Minuten dauert.
      5. Nehmen Sie die Mikrotiterplatte mit den Zellen aus dem Nicht-CO 2 37 °C Inkubator aus Schritt 2.4.6 heraus, nachdem 25-30 min Inkubation vorbei ist. Ohne die Zellen zu stören, fügen Sie langsam 130 μL des vorerwärmten Glykolyse-Stresstestmediums (pH 7,4) pro Vertiefung hinzu, um das Mediumsvolumen in jeder Vertiefung auf 180 μL zu erhöhen, und bringen Sie die Platte für weitere 15-20 min in den Nicht-CO2 37 °C-Inkubator zurück.
        HINWEIS: Eine Gesamtinkubationszeit von 45-60 min nach der Zentrifugation wird bevorzugt.
      6. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, ersetzen Sie die Utility-Platte durch die Assay-Mikroplatte (ohne Deckel), die die Zellen enthält. Drücken Sie die Wägezellenplatte, um die Messungen zu starten, die ~ 1,5 Stunden für den Abschluss des Assays benötigen.
      7. Nachdem die Messungen abgeschlossen sind, sammeln Sie die Assay-Mikroplatte, die die Zellen enthält, und entfernen Sie das Assay-Medium, ohne die Zellen zu stören. Einmal vorsichtig mit 250 μL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen, ohne die Zellen zu verdrängen.
      8. 10 μL RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na-Desoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), ergänzt mit 1x Proteaseinhibitor-Cocktail, zu jeder Vertiefung geben und die Platte auf einem Shaker für 10 min rühren. Den ganzen Teller bei -80 °C einfrieren.
      9. Tauen Sie die Platte auf und führen Sie einen Proteinmesstest zur Datennormalisierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      10. Abrufen und Analysieren der Daten. Öffnen Sie die Datendatei mit der Wave Desktop Software. Klicken Sie auf Normalisieren und fügen Sie die Normalisierungswerte für jedes Bohrloch ein. Klicken Sie auf Übernehmen , um die Daten zu normalisieren. Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Glykolyse-Stresstest-Berichtsgenerator, um die analysierten Daten in einen Berichtsgenerator zu exportieren. Alternativ können Sie die Daten in eine externe Anwendung exportieren.
        HINWEIS: Alternativ kann der gesamte Kern-DNA-Gehalt in jedem Bohrloch verwendet werden, um die Daten zu normalisieren. Ein fluoreszierender Farbstoff wie CyQuant, der an Nukleinsäure bindet, kann verwendet werden, um den gesamten Kern-DNA-Gehalt pro Bohrloch zu beurteilen.
  6. Durchführung eines mitochondrialen Stresstests mit dem extrazellulären Flussanalysator (Schrittzeit: ~3 h 30 min)
    1. Beschickungssensorpatrone mit Injektionsmassen
      1. Es werden 20 μM Oligomycin, 20 μM FCCP und 5 μM Rotenon + 5 μM Antimycin A-Lösungen in vorgewärmtem mitochondrialem Stresstest-Assay-Medium (pH 7,4) hergestellt.
        HINWEIS: Alle injizierenden Verbindungslösungen werden in 10-facher Konzentration hergestellt. Die Endkonzentrationen der Vertiefung betragen 2 μM für Oligomycin, 2 μM für FCCP und jeweils 0,5 μM für Rotenon und Antimycin A (siehe Tabelle 3).
      2. Entfernen Sie die hydratisierte Sensorpatrone aus dem 37 °C Inkubator aus Schritt 1.1.5 und entfernen Sie Luftblasen, wie zuvor in Schritt 2.5.1.2 beschrieben.
      3. Durch Ausführen der Schritte 2.5.1.3 bis 2.5.1.6 werden 20 μL 20 μM Oligomycin in Port A, 22 μL 20 μM FCCP in Port B und 25 μL einer Mischung aus 5 μM Rotenon und 5 μM Antimycin A in Port C abgegeben.
        HINWEIS: Es ist wichtig, dass jede Portreihe aller 96 Wells, einschließlich derjenigen der Hintergrundwellen, vollständig mit dem gleichen Volumen der injizierenden Verbindung geladen wird.
    2. Vorlagenerstellung, Kalibrierung und Messungen
      1. Erstellen oder laden Sie die Vorlage für den mitochondrialen Stresstest auf dem Controller. Geben Sie Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu. Weisen Sie die 4 Eckvertiefungen für Hintergrundmessungen zu.
      2. Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden.
      3. Für die Baseline-Messung und die Messungen nach jeder Injektion (Oligomycin, FCCP und Rotenon + Antimycin A) legen Sie die Anzahl der Messzyklen auf 3 fest und Mischen - Warten - Messzeiten auf 3 min - 0 min - 3 min (siehe Tabelle 4).
      4. Starten Sie den Lauf, um die Kalibrierung wie in Schritt 2.5.2.4 durchzuführen.
      5. 130 μL des vorgewärmten mitochondrialen Stresstestmediums (pH-Wert 7,4) werden wie in Schritt 2.5.2.5 zugegeben.
      6. Starten Sie die Messungen; Abrufen und Analysieren der Daten wie in den Schritten 2.5.2.6 bis 2.5.2.10. Exportieren Sie die analysierten Daten in den mitochondrialen Stresstestberichtsgenerator oder eine externe Anwendung.

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Representative Results

Mit diesem Protokoll wurden die Zellzahl und die Konzentrationen verschiedener OxPHOS-Targeting-Medikamente (die in den extrazellulären Flussassays verwendet werden) optimiert, um ECAR und OCR von HSPCs zu messen, die aus 24 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert wurden. Zunächst wurde der Glykolyse-Stresstest durchgeführt, um die Zellzahl und die Oligomycinkonzentration zu optimieren. In diesem Assay wurde eine unterschiedliche Anzahl von HSPCs pro Bohrloch im Bereich von 5 × 104 bis 2,5 × 105 verwendet. Wie in Abbildung 2A und Abbildung 2C gezeigt, steigt die nicht-glykolytische Säuerungsrate mit erhöhter Zellzahl von 5 ×10 4 auf 2,5 × 10 5 an, steigt aber nur minimal zwischen 2 × 10 5 bis 2,5 × 10 5 Zellen an. Wie erwartet, stimuliert die Injektion von 10 mM Glucose die Glykolyse bei allen Zellzahlen, wobei ein maximaler Anstieg der ECAR bei 2,5 × 105 Zellen pro Well beobachtet wird. Die Injektion von 2 μM Oligomycin erhöht ECAR jedoch nicht weiter, wie sonst erwartet. Die Anwendung von 1 μM Oligomycin ergab ähnliche Ergebnisse (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse könnten so interpretiert werden, dass diese Oligomycinkonzentrationen in diesen Assays nicht optimal waren.

OCR-Daten, die in den gleichen Glykolyse-Stresstests erhalten wurden, zeigen jedoch, dass beide getesteten Oligomycin-Konzentrationen (1 μM und 2 μM) tatsächlich wirksam waren, wie der signifikante Abfall der OCR nach Oligomycin-Injektion aufgrund einer komplexen V-Hemmung nahelegt (siehe Abbildung 2B für 2 μM Oligomycin; nicht gezeigt für 1 μM Oligomycin). Bei beiden getesteten Oligomycin-Konzentrationen wurde eine maximale Abnahme der OCR bei 2,5 × 105 Zellen pro Bohrloch beobachtet. Schließlich führte die Injektion von 50 mM 2-DG zu einer signifikanten Reduktion von ECAR, was bedeutet, dass die Glykolyse die Quelle von ECAR ist, die in diesen Experimenten beobachtet wurde. Zusammengenommen kann der Schluss gezogen werden, dass HSPCs nach der Glukoseinjektion in diesen Assays eine maximale Glykolyse erreichen und wenig bis gar keine glykolytische Reserve besitzen. Dies deutet darauf hin, dass wie gereinigte HSCs auch lineage-negative HSPCs, zu denen die in diesem Assay verwendete HSC-Fraktion gehört, für ihre ATP-Produktion überwiegend auf Glykolyse angewiesen sind. In Zellen mit einer hohen glykolytischen Rate kann es bei einer Oligomycin-vermittelten Hemmung der mitochondrialen ATP-Produktion zu keinem signifikanten Anstieg des ATP-Bedarfs kommen. Zellen könnten den Verlust von mitochondrialem ATP leicht bewältigen, ohne die Glykolyse weiter zu regulieren19. Die Glykolyse-Stresstestparameter - nicht-glykolytische Versauerung, Glykolyse, Glykolytkapazität und Glykolytreserve wie in Abbildung 2C gezeigt - wurden wie zuvor in den Einführungs- und Protokollabschnitten beschrieben berechnet. Basierend auf diesen Daten wurden 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung und 2 μM Oligomycin für weitere Studien ausgewählt.

Der mitochondriale Stresstest wurde zur Optimierung der FCCP-Konzentration eingesetzt. In diesem Assay wurden 2,5 × 10 5 HSPCs pro Well verwendet, wie zuvor über den Glykolyse-Stresstest optimiert. Wie in Abbildung 3A gezeigt, beginnt der Assay mit der Messung der Baseline-OCR, gefolgt von einer 2-μM-Oligomycin-Injektion, was zu einer signifikanten Reduktion der OCR durch die Hemmung des Komplexes V führt. Nach OCR-Messungen nach der Oligomycin-Injektion wurde FCCP in unterschiedlichen Konzentrationen injiziert: 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM und 2 μM. Wie bereits erwähnt, kehrt FCCP die Oligomycin-induzierte Unterdrückung des Elektronenflusses durch ETC um, indem es den Protonentransport von OxPHOS entkoppelt und den Komplex IV zwingt, Sauerstoff maximal zu verbrauchen. Wie in Abbildung 3A gezeigt, stimuliert FCCP die OCR in HSPCs in dosisabhängiger Weise mit einem maximalen Anstieg der OCR, der bei 2 μM FCCP beobachtet wird. Schließlich wurde eine Mischung aus 0,5 μM Rotenon und 0,5 μM Antimycin A injiziert, die den Elektronenfluss durch das ETC vollständig abschaltet und die OCR auf ihr minimales Niveau abnimmt. OCR, gemessen nach Rotenon und Antimycin A-Injektion entspricht dem nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch. Andere mitochondriale Stresstestparameter - Basalatmung, maximale Atmung, Protonenleck, ATP-Produktion, freie Atemkapazität und Kopplungseffizienz, wie in Abbildung 3B gezeigt - wurden wie zuvor in den Einführungs- und Protokollabschnitten beschrieben berechnet. Schließlich wurden 2 μM FCCP für weitere Studien ausgewählt.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Beurteilung der glykolytischen Funktion und der mitochondrialen Atmung mit dem extrazellulären Flussanalysator. Es werden Sequenzen und Injektionszeiten verschiedener Effektorverbindungen gezeigt, die im glykolytischen Stresstest (A) und im mitochondrialen Stresstest (B) verwendet wurden. (A) Glykolytische Parameter, Glykolyse, glykolytische Kapazität, glykolytische Reserve und nicht-glykolytische Versauerung sowie (B) mitochondriale Funktionsparameter, Basalatmung, ATP-gebundene Atmung, maximale Atmung, nicht-mitochondrialer Sauerstoffverbrauch, Protonenleck und freie Atemkapazität werden beschrieben. Abkürzungen: ECAR = extrazelluläre Versauerungsrate; 2-DG = 2-Desoxy-D-Glukose; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; FCCP = Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)-phenylhydrazon; Verfaulen. = Rotenon; Anti. A = Antimycin A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Beurteilung der glykolytischen Funktion in Maus-HSPCs. Der Glykolyse-Stresstest wurde durchgeführt, um (A) die extrazellulären Versauerungsraten (ECAR, mpH/min) und (B) die Sauerstoffverbrauchsraten (OCR, pmol/min) von HSPCs, die von 24 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert wurden, zu messen. Zu den angegebenen Zeiten wurden Glucose (10 mM), Oligomycin (2 μM) und 2-DG (50 mM) injiziert. (C) ECAR wird berechnet als nicht-glykolytische Ansäuerung, Glykolyse, Glykolysekapazität und glykolytische Reserve pro 5 × 104, 1 × 10 5, 1,5 × 10 5, 2 ×10 5 und 2,5 × 10 5 HSPCs/Well. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 4 dargestellt. Abkürzungen: HSPCs = hämatopoetische Stamm- und primitive Vorläuferzellen; ECAR = extrazelluläre Versauerungsrate; 2-DG = 2-Desoxy-D-Glukose; OCR = Sauerstoffverbrauch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Beurteilung der mitochondrialen Atmung bei Maus-HSPCs. Ein mitochondrialer Stresstest wurde durchgeführt, um (A) die Sauerstoffverbrauchsraten (pmol/min) von HSPCs zu messen, die von 24 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert wurden. Zu den angegebenen Zeiten wurden Oligomycin (2 μM), FCCP (0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM, 2 μM) sowie Rotenon und Antimycin A (Rot./AA, je 0,5 μM) injiziert. (B) OCR wird berechnet als nicht-mitochondrialer Sauerstoffverbrauch, Basalatmung, Protonenleck, maximale Atmung (pro 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM und 2 μM FCCP), ATP-Produktion, freie Atemkapazität (pro 0,5 μM, 1 μM, 1,5 μM und 2 μM FCCP) und Kopplungseffizienz pro 2,5 × 105 HSPCs/Well. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 4 dargestellt. Abkürzungen: HSPCs = hämatopoetische Stamm- und primitive Vorläuferzellen; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; FCCP = Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)-phenylhydrazon; Verfaulen. = Rotenon; AA = Antimycin A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Einspritzanschluss Port-Volume Injizierende Verbindung (10x konzentriert) Endzusammengesetzte Konzentration im Bohrloch
Ein 20 μL Glukose (100 mM) 10 mM
B 22 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
C 25 μL 2-DG (500 mM) 50 mM

Tabelle 1: Injektionsstrategie für den Glykolyse-Stresstest. Abkürzung: 2-DG = 2-Desoxy-D-Glucose.

1 Kalibrierung
2 Gleichgewicht
3 Injektionen und Messungen
Zyklen Mischen Warte Messen
Ausgangswert (Nichtglykolytische Säuerung) 3 mal 3 Minuten 0 min 3 Minuten
Injizieren Sie Port A: Glukose 3 mal 3 Minuten 0 min 3 Minuten
Inject Port B: Oligomycin 3 mal 3 Minuten 0 min 3 Minuten
Einspritzanschluss C: 2-DG 3 mal 3 Minuten 0 min 3 Minuten

Tabelle 2: Extrazelluläres Flussanalyseprogramm für den Glykolyse-Stresstest. Abkürzung: 2-DG = 2-Desoxy-D-Glucose.

Einspritzanschluss Port-Volume Injizierende Verbindung (10x konzentriert) Endzusammengesetzte Konzentration im Bohrloch
Ein 20 μL Oligomycin (20 μM) 2 μM
B 22 μL FCCP (20 μM) 2 μM
C 25 μL Rotenon (5 μM) + Antimycin A (5 μM) je 0,5 μM

Tabelle 3: Injektionsstrategie für den mitochondrialen Stresstest. Abkürzung: FCCP = Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy) phenylhydrazon.

1 Kalibrierung
2 Gleichgewicht
3 Injektionen und Messungen
Zyklen Mischen Warte Messen
Baseline-Messungen 3 mal 3 Minuten 0 min 3 Minuten
Injektion Port A: Oligomycin 3 mal 3 Minuten 0 min 3 Minuten
Inject Port B: FCCP 3 mal 3 Minuten 0 min 3 Minuten
Inject Port C: Rotenon & Antimycin A 3 mal 3 Minuten 0 min 3 Minuten

Tabelle 4: Extrazelluläres Flussanalysatorprogramm für den mitochondrialen Stresstest. Abkürzung: FCCP = Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy) phenylhydrazon.

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Discussion

Diese Methodenarbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik (Glykolyse und OxPHOS) in Maus-HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse. Dieses Gerät ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das gleichzeitig die ECAR und OCR lebender Zellen misst, bei denen es sich um Metriken der Glykolyse bzw. der mitochondrialen Atmung handelt. So kann es verwendet werden, um die zelluläre Bioenergetik in Echtzeit zu beurteilen. Darüber hinaus bietet die 96-Well-Microplate-basierte Plattform eine Hochdurchsatzquantifizierung mit hoher Empfindlichkeit, die die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben mit einer einzigen Platte ermöglicht, verglichen mit einem anderen hochauflösenden Respirometer, dem Oroboros O2k, das nur 2 Proben gleichzeitig analysieren kann, oder der klassischen Clark-Elektrode20.

Der extrazelluläre Flussanalysator wurde hauptsächlich für die Analyse adhärenter Zelltypen verwendet, da er erfordert, dass Zellen in einer Monoschicht vorhanden sind, was es schwieriger macht, Zellen zu analysieren, die in Suspension gezüchtet wurden. Darüber hinaus treten nach der Injektion von Medikamenten aus dem Port Turbulenzen während des Arzneimittel-Medien-Mischzyklus in den Vertiefungen vor den Messungen auf, die die Zellen verdrängen können. Daher müssen die Zellen fest mit dem Boden des Brunnens verbunden sein. Die hier beschriebenen Protokolle haben eine zelladhäsive Formulierung von nicht-immunogenen polyphenolischen Proteinen verwendet, die aus der Meeresmuschel, Mytilus edulis, extrahiert wurden, um eine adhärente Monoschicht aus murinen HSPCs herzustellen.

Eine weitere Einschränkung dieser Technologie sind die Kosten pro Assay, die im Vergleich zur Clark-Elektrode und dem Oroboros O2k sehr hoch sind. Die Kartuschen sind relativ teuer und können nicht wiederverwendet werden. Es wird geschätzt, dass die Kosten für den extrazellulären Flussanalysator selbst ~ 4-mal höher sind als für den Oroboros O2k20. Angesichts der Semi-Automatisierung und der Hochdurchsatzfähigkeit des extrazellulären Flussanalysators kann jedoch eine viel größere Datenmenge pro Lauf gesammelt werden als mit dem O2k.

Die hier erzielten Ergebnisse zeigen, dass 2,5 × 105 HSPCs pro Bohrloch erforderlich sind, um zuverlässige Daten mit einem 96-Well-basierten extrazellulären Flussanalysator zu erhalten. Dies stellt eine weitere Herausforderung bei der Durchführung von Flussassays mit HSPCs dar, die in großen Mengen von einer Maus schwer zu erhalten sind und eine durchflusszytometrische Sortierung erfordern, um eine reine Population zu erhalten. Darüber hinaus fügt die Flusssortierung dem Experiment viel Zeit hinzu und könnte den metabolischen Phänotyp der Vorläuferzellen verändern. Um die Einschränkungen zu überwinden, die mit der auf Durchflusszytometrie basierenden Reinigung verbunden sind, verwendete die hier diskutierte Strategie linienspezifische Antikörper, die an magnetische Perlen gebunden sind, um Abstammungsgebundene Vorläufer zu erschöpfen und so die liniennegativen HSPCs anzureichern. Um sich für primitivere HSPCs weiter anzureichern, kann ein zusätzlicher cKit-Anreicherungsschritt hinzugefügt werden. Dies ist jedoch mit Kosten für zusätzliche Ex-vivo-Zeit (~ 1,5 h) und eine Verringerung der Zellzahl verbunden. Die Verwendung eines solchen Protokolls würde eine Optimierung außerhalb des Anwendungsbereichs dieses Protokolls erfordern.

Um ihre Pluripotenz aufrechtzuerhalten, müssen HSCs ruhig bleiben und sich bevorzugt in der hypoxischen Umgebung im Knochenmark 9,21 befinden. Es wird angenommen, dass ruhende HSCs überwiegend auf Glykolyse angewiesen sind, um ihren bescheidenen Energiebedarf zu decken, da hohe ROS-Werte, ein Nebenprodukt der mitochondrialen Atmung, für ihre Stammheit schädlich sind 2,3. HSCs besitzen eine relativ hohe, aber weitgehend inaktive mitochondriale Masse, wodurch das zelluläre ROS auf niedrigem Niveau gehalten wird, um die Aufrechterhaltung der HSC-Pluripotenz9 zu ermöglichen. Während des Engagements und der Differenzierung werden die Mitochondrien jedoch zur Hauptquelle der ATP-Produktion in HSCs 5,9. Daher spielen Mitochondrien eine Schlüsselfunktion beim Übergang von HSCs von der Ruhephase in den metabolisch aktiven Zustand, der für ihre Abstammungsverpflichtung und Differenzierung erforderlich ist. Neben der Produktion von ATP über OxPHOS spielen Mitochondrien viele andere wichtige Rollen in der hämatopoetischen Zellhomöostase, einschließlich ROS-Regulation, Apoptose, Calciumsignalisierung und der Synthese von Häm und vielen anderen kritischen Metabolitenzwischenprodukten9. Veränderungen der mitochondrialen Funktionen können die HSC/Vorläufer-Differenzierungswege signifikant beeinflussen und zu verschiedenen hämatologischen Störungen wie hämatopoetischen Malignomen, angeborener Dyserythropoese und sideroblastischer Anämie sowie myelodysplastischen Syndromen beitragen13. In bösartigen hämatopoetischen Zellen spielen dysfunktionale Mitochondrien eine entscheidende Rolle bei der Resistenz gegen Apoptose, die durch verschiedene Zytostatika induziert wird13.

Aufgrund der zentralen Rolle der Mitochondrien bei der Aufrechterhaltung der HSC/Vorläuferhomöostase können durch die Beurteilung ihres mitochondrialen OxPHOS unter Normal- und Stressbedingungen wertvolle Erkenntnisse über den physiologischen Zustand dieser Zellen gewonnen werden. Die Identifizierung neuartiger Modulatoren mitochondrialer Aktivitäten könnte neue therapeutische Ziele für die Behandlung hämatologischer Anomalien identifizieren. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Auswirkungen chemischer Verbindungen oder metabolischer CRISPR-Bibliotheken auf die OCR und ECAR von HSCs unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen , z. B . HSCs, die aus gentechnisch veränderten Mausmodellen hämatologischen Störungen gewonnen wurden. Ein solches Screening könnte auch nützlich sein, um Stoffwechselwege aufzuklären, die die HSC-Potenz in ihrer hypoxischen Nische aufrechterhalten, was bei der Entwicklung von Strategien für die In-vitro-Expansion von HSCs unter Beibehaltung ihrer Pluripotenz für therapeutische Zwecke nützlich wäre. Angesichts des Hochdurchsatzcharakters dieser Analyse könnte das hier beschriebene Protokoll leicht angepasst werden, um eine große Anzahl bioenergetischer Modulatoren in HSCs, hämatopoetischen Vorläufern und bösartigen hämatopoetischen Zellen zu screenen.

Zusammenfassend beschreiben die hier vorgestellten Methoden optimierte Protokolle zur Messung von ECAR und OCR in primären Maus-HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator. Die Ergebnisse des Glykolyse-Stresstests haben gezeigt, dass 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung und 2 μM Oligomycin für weitere Analysen optimal sind. Unter Verwendung von 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung und 2 μM Oligomycin wurde der mitochondriale Stresstest durchgeführt, um die FCCP-Konzentration zu optimieren, und es wurde festgestellt, dass 2 μM FCCP eine maximale OCR induzieren. Obwohl sich die aktuelle Studie hauptsächlich auf Maus-HSPCs konzentriert, könnten das Protokoll und dieser Ansatz leicht angepasst werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.

Acknowledgments

Die Arbeit im lombardischen Labor wird vom NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 und ME200030) und der Glenn Foundation for Medical Research unterstützt. Die Arbeit im Li-Labor wird vom NIH (NHLBI 5R01HL150707) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Corning 430626 Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate Life Technologies 11360-070 Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes Corning 352096 Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine Life Technologies 25030-081 Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375 3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort) Biolegend 480017 Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Scientific A661-3 Component of ACK lysis buffer
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit Bio-Rad 500-0112 Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific For cell counting
EDTA Fisher Scientific O2793-500 Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter Fisher Scientific 08-771-2 Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS) Fisher Scientific 26400044 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS Fisher Scientific 14175095 Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS Life Technologies 10010-049 Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3) Fisher Scientific P235-500 Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC) Roche 11836170001 Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 Biolegend 103203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 Biolegend 100103 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 Biolegend 100243 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 Biolegend 100603 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 Biolegend 100703 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 Biolegend 108403 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 Biolegend 116203 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer Seahorse Biosciences now Agilent For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl) Fisher BP358 Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF) Sigma-Aldrich S7920 Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045 Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort) Biolegend 480015 Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl Fisher BP153 Component of RIPA lysis buffer
XF base medium Agilent 102353-100 base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station Seahorse Biosciences Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak Agilent 102416-100 or 102601-100 Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

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Kumar, S., Jones, M., Li, Q., Lombard, D. B. Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (175), e63045, doi:10.3791/63045 (2021).

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