क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन गहरी मात्रात्मक proteome विश्लेषण के लिए मुरीन मस्तिष्क में सबसे बड़े न्यूरोजेनिक आला की ताजा, जमे हुए तैयारी की अनुमति देता है। विधि सटीक, कुशल है, और न्यूनतम ऊतक गड़बड़ी का कारण बनती है। इसलिए, यह आदर्श रूप से इस आला के आणविक माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ-साथ अन्य अंगों, क्षेत्रों और प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।
Subependymal neurogenic आला पार्श्व वेंट्रिकल के पार्श्व वेंट्रिकुलर दीवार के एक पैरावेंट्रिकुलर रिबन के होते हैं। Subependymal क्षेत्र (SEZ) एक पतला और अलग क्षेत्र है जो निलय और मस्तिष्कमेरु द्रव के संपर्क में है। इस आला का अलगाव एक न्यूरोजेनिक स्टेम सेल माइक्रोएन्वायरमेंट के विश्लेषण की अनुमति देता है। हालांकि, proteome विश्लेषण के लिए छोटे ऊतकों का निष्कर्षण चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से काफी माप गहराई के रखरखाव और विश्वसनीय मजबूती की उपलब्धि के लिए। इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए न्यूनतम ऊतक गड़बड़ी के साथ उच्च परिशुद्धता का संयोजन करते हुए क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन (सीएसडी) नामक एक नई विधि विकसित की गई थी। यह विधि अत्याधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विधियों के साथ संगत है जो कम प्रचुर मात्रा में आला नियामकों का पता लगाने की अनुमति देती है। इस अध्ययन ने सीएसडी और इसके प्रोटिओम डेटा की तुलना लेजर-कैप्चर-माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) और एक मानक होलमाउंट विच्छेदन द्वारा प्राप्त विधि और डेटा से की। सीएसडी विधि के परिणामस्वरूप एलसीएम की तुलना में आधे से भी कम तैयारी के समय में दो बार परिमाणीकरण गहराई हुई और साथ ही साथ स्पष्ट रूप से पूरेमाउंट विच्छेदन के विच्छेदन परिशुद्धता को बेहतर बनाया गया। इसलिए, सीएसडी प्रोटिओम विश्लेषण के लिए एसईजेड एकत्र करने के लिए एक बेहतर तरीका है।
जैसा कि न्यूरोजेनेसिस वयस्क मस्तिष्क में प्रतिबंधित है, विभिन्न केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की मरम्मत रणनीतियों को वयस्क तंत्रिका प्रतिस्थापन के आधार की बढ़ती समझ से बहुत लाभ होगा। कृन्तकों ने हमें प्रसवोत्तर न्यूरोजेनेसिस के बुनियादी तंत्र को समझने में मदद की है, हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वयस्क न्यूरोजेनेसिस बहुत अधिक प्रजातियों पर निर्भर है। चूहों में, तीन वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) niches हैं। हाइपोथैलेमस न्यूरोजेनिक क्षमता 1,2 के साथ एक वयस्क एनएससी आला है, जबकि निरंतर वयस्क न्यूरोजेनेसिस मुख्य रूप से हिप्पोकैम्पस 3 और पार्श्व वेंट्रिकल्स 4,5,6 की पार्श्व दीवारों के एसईजेड तक सीमित है। SEZ सबसे बड़ा जर्मिनल क्षेत्र है जिसमें NSC (प्रकार बी कोशिकाएं) शामिल हैं जो पारगमन-प्रवर्धित पूर्वज कोशिकाओं (प्रकार सी कोशिकाओं) के माध्यम से न्यूरोब्लास्ट्स (प्रकार ए कोशिकाओं) में विकसित होते हैं। एसईजेड में टाइप बी कोशिकाओं का 20-35%, टाइप सी कोशिकाओं का 1-15%, टाइप ए कोशिकाओं का 1-30% और एपेंडिमल कोशिकाओं का 25-50% होता है। एसईजेड में एंडोथेलियल कोशिकाओं, माइक्रोग्लियल कोशिकाओं और एपिंडिमल कोशिकाओं के साथ एक जटिल माइक्रोआर्किटेक्चर होता है, जो स्टेम सेल niche8,9,10 में रहते हैं और प्रभावित करते हैं। यद्यपि सेज में न्यूरॉन्स दुर्लभ हैं, फिर भी दूर के स्रोतों से निकलने वाले अक्षतंतु जैसे स्ट्रिएटम, वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र, या हाइपोथैलेमस टाइप बी कोशिकाओं तक पहुंचते हैं और प्रभावित करते हैं। इस स्टेम सेल आला की एक अनूठी विशेषता प्रसार की साइट और भेदभाव की साइट के बीच अलगाव है। प्रसार के बाद, न्यूरोनल पूर्वज एसईजेड से घ्राण बल्ब में कई मिलीमीटर स्थानांतरित करते हैं, जहां वे न्यूरॉन्स में अंतर करते हैं और पहले से मौजूद तंत्रिका सर्किट में एकीकृत होते हैं। न्यूरोजेनेसिस से जुड़े सेल-आंतरिक कार्यक्रमों की जांच ने पहले से ही प्रयोगात्मक चिकित्सीय सेल रीप्रोग्रामिंग और प्रत्यारोपण रणनीतियों के लिए महत्वपूर्ण ज्ञान प्रदान किया है15,16,17,18,19,20। हालांकि, सेल-बाह्य संकेत न्यूरोजेनेसिस को भी विनियमित करते हैं, और ऊतक वातावरण स्टेम कोशिकाओं के न्यूरोजेनिक भाग्य को निर्धारित कर सकते हैं11,12,14,21,22,23। नतीजतन, न्यूरोजेनिक niches के माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच और स्टेम कोशिकाओं के साथ इसकी बातचीत महत्वपूर्ण महत्व की है।
बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) और अन्य स्रावित प्रोटीन माइक्रोएन्वायरमेंट का एक बड़ा हिस्सा हैं। सटीक पहचान और परिमाणीकरण के लिए, ईसीएम 24,25 के लिए ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटीन के स्तर के बीच कम सहसंबंध के कारण ईसीएम संरचना निर्धारित करने के लिए एक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण एक ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोण की तुलना में बेहतर अनुकूल है। इसके अलावा, इस बात के पर्याप्त सबूत हैं कि एसईजेड में आला नियामकों को विशेष रूप से आला को पॉप्युलेट करने वाली कोशिकाओं द्वारा उत्पादित नहीं किया जाता है। अधिक दूर के स्थान, जैसे कि कोरॉइड प्लेक्सस, मस्तिष्कमेरु द्रव 22,23 के माध्यम से स्टेम कोशिकाओं को प्रेषित मॉड्यूलेटरी संकेतों को स्रावित करते हैं। आला proteome की जांच करने से उनके उत्पादन स्थल से स्वतंत्र आला में मौजूद आला नियामकों की पहचान करने में मदद मिल सकती है, यह देखते हुए कि बाह्य कोशिकीय माइक्रोएन्वायरमेंट का एक बड़ा हिस्सा प्रोटीन द्वारा इकट्ठा किया जाता है।
निष्पक्ष प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए मुरीन वेंट्रिकुलर ज़ोन को इकट्ठा करने के लिए, उच्च परिशुद्धता के साथ एक विधि की आवश्यकता होती है, जो आसन्न स्ट्रिएटम के ऊतक को छोड़कर स्टेम कोशिकाओं वाले सीए 50 μm पतले पैरावेंट्रिकुलर रिबन को कैप्चर करती है। इसके अलावा, विच्छेदन के दौरान ऊतक की गड़बड़ी को बाह्य कोशिकीय माइक्रोएन्वायरमेंट का विश्लेषण करने के लिए न्यूनतम किया जाना चाहिए क्योंकि घुलनशील प्रोटीन, विकास कारकों या साइटोकिन्स सहित, आसानी से धोया जा सकता है। यद्यपि निश्चित ऊतक के द्रव्यमान स्पेक्ट्रा का विश्लेषण करना संभव है, आवश्यक एजेंट, जैसे कि पैराफॉर्मेल्डिहाइड, प्रोटीन पहचान की गहराई को कम कर देगा और पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों को पेश कर सकता है। एक आम wholemount SEZ विच्छेदन, उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के संग्रह के लिए, कैंची 26 के साथ पूरे एसईजेड को हटा देता है। यह मानक विच्छेदन न्यूनतम ऊतक गड़बड़ी के साथ तेजी से होता है। हालांकि, नमूनों के स्ट्रिएटल संदूषण से बचा नहीं जा सकता है। इसके विपरीत, एलसीएम में बेहतर विच्छेदन परिशुद्धता का उत्कृष्ट लाभ है। हालांकि, एलसीएम ऊतक की गड़बड़ी का परिचय दे सकता है, उदाहरण के लिए, पृष्ठभूमि धुंधला या लेजर के कारण प्रोटीन विकृतीकरण के कारण। होलमाउंट विच्छेदन और एलसीएम की ताकत को संयोजित करने के लिए, एक उपन्यास विधि जो एमएस के साथ संगत है, जिसे क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन (सीएसडी) कहा जाता है, विकसित किया गया था (चित्रा 1 ए-डी)। सीएसडी सेज के निष्कर्षण और पार्श्व वेंट्रिकल्स (एमईजेड) की औसत दर्जे की दीवारों के एसईजेड के विच्छेदन की अनुमति देता है, जो एसईजेड के लिए एक आदर्श, ज्यादातर गैर-न्यूरोजेनिक नियंत्रण क्षेत्र है (प्रोटोकॉल देखें)। सीएसडी और अत्याधुनिक एमएस विधियों के संयोजन से प्राप्त आला proteome इस वयस्क NSC niche25 में उपन्यास नियामकों के लक्षण वर्णन और पहचान के लिए उपयोगी साबित हुआ। इसलिए, यह विधि एसईजेड ऊतक प्रोटीन संरचना के निर्धारण के लिए उपयोगी होगी।
सीएसडी विधि ने एसईजेड ऊतक को ठीक से निकालना और एमएस का उपयोग करके महत्वपूर्ण गहराई के साथ एक विश्वसनीय प्रोटिओम उत्पन्न करना संभव बना दिया सीएसडी एसईजेड नमूनों और बाह्य कोशिकीय प्रोटीन संवर्धन के बहुत कम स्ट्रिएटल संदूषण के संदर्भ में होलमाउंट विच्छेदन की तुलना में एक स्पष्ट लाभ प्रदर्शित करता है। जैसा कि सीएसडी और होलमाउंट विच्छेदन के साथ व्यक्तिगत नमूनों (~ 6,500 प्रोटीन प्रति नमूना) में प्रोटीन की एक समान संख्या का पता लगाना भी संभव है, सीएसडी के लिए अतिरिक्त समय अच्छी तरह से प्रयास के लायक है। एलसीएम अधिक सटीक एसईजेड विच्छेदन प्रदान करता है, लेकिन सीएसडी (पुस्तकालय मिलान और लेबल-मुक्त परिमाणीकरण) के रूप में एक ही एमएस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के बावजूद प्रति नमूना केवल 3,500 प्रोटीन के साथ एक कम प्रोटिओम गहराई तक पहुंच गया। महत्वपूर्ण रूप से, परिवर्तनशीलता बहुत अधिक थी, शायद प्रति नमूना आठ गुना लंबे समय तक तैयारी के समय के कारण। एलसीएम और सीएसडी द्वारा प्राप्त नमूनों के पीसीए से तंग क्षेत्र-विशिष्ट समूहों के साथ दोनों तरीकों के स्पष्ट अलगाव का पता चलता है जो एक-दूसरे से मजबूती से अलग होते हैं। इसके विपरीत, एलसीएम नमूनों ने एक अधिक बिखरे हुए वितरण को प्रदर्शित किया, जो शायद तैयारी की लंबाई के कारण भाग में है। यह स्पष्ट नहीं है कि क्या लंबी अवधि में कहीं अधिक नमूने एकत्र करने से एलसीएम के साथ समान मजबूती और गहराई का एक प्रोटिओम प्राप्त होगा। एक अनुमान की गणना करते हुए, सीएसडी के लिए किए गए समान नमूना मात्रा को इकट्ठा करने में एलसीएम के साथ 5-8 गुना अधिक समय लगेगा, यहां तक कि 15 गुना अधिक समय तक अगर पेप्टाइड स्पेक्ट्रा पुस्तकालयों के लिए प्रदान किए गए नमूनों को शामिल किया गया था, और इसमें से अधिकांश पिघलने वाली स्थितियों के तहत। इसके अलावा, एलसीएम (पृष्ठभूमि धुंधला, लेजर विच्छेदन) के लिए आवश्यक ऊतक के अतिरिक्त व्यवधानों को ध्यान में रखते हुए, एलसीएम ने सीएसडी पर थोड़ा, यदि कोई हो, तो लाभ प्रदान किया। इसलिए, सीएसडी को एक्स्ट्रासेल्युलर प्रोटिओम अनुसंधान के लिए अधिक उपयुक्त माना जा सकता है, विशेष रूप से एसईजेड के लिए।
विशेष रूप से, यदि ब्याज का क्षेत्र एसईजेड की तुलना में छोटा है (उदाहरण के लिए, केवल एपेंडिमल सेल परत की जांच करना), तो एक फ्री-हैंड दृष्टिकोण एलसीएम की सटीकता के पीछे पड़ता है। उदाहरण के लिए, सीएसडी का उपयोग करके एपेंडिमल को सबपेंडीमल परत से अलग करना मुश्किल है क्योंकि एपेंडिमल परत केवल एक सेल व्यास चौड़ा है, और सबपेंडीमल परत की ओर सीमांकन ताजा जमे हुए ऊतक में नग्न आंखों के लिए दिखाई नहीं देता है। इसलिए, एलसीएम सीएसडी की तुलना में एक बेहतर विकल्प होगा यदि 50 μm से नीचे के पैमाने पर एक सटीक विच्छेदन अबाधित ऊतक की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है या विच्छेदन समय को कम रखता है। 50 μm और अधिक की चौड़ाई वाले क्षेत्रों के लिए, हालांकि, CSD की सटीकता ECM प्रोटीन विश्लेषण के लिए LCM की तुलना में तुलनीय है।
सीएसडी पहले से ही न्यूरोजेनिक niche25 में ईसीएम की कार्यात्मक भूमिका की जांच में योगदान देकर उपयोगी साबित हुआ है। इसलिए, विभिन्न प्रोटीन और proteome जांच (या यहां तक कि एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण) के लिए एसईजेड में सीएसडी के निरंतर अनुप्रयोग से आगे न्यूरोजेनेसिस नियामकों, स्टेम सेल सक्रियण मार्करों और एसईजेड स्टेम सेल आला फिजियोलॉजी की गहरी समझ का पता लगाया जा सकता है। उम्र बढ़ने SEZ37 में न्यूरोजेनेसिस की गिरावट को ध्यान में रखते हुए, वृद्ध बनाम युवा चूहों के एसईजेड के ईसीएम परिवर्तनों का एक संक्षिप्त विश्लेषण एनएससी विकास और रखरखाव को बढ़ावा देने वाले सटीक आला तंत्र की समझ को बढ़ावा दे सकता है38,39। इसके अलावा, सेज न्यूरोजेनेसिस पर सूजन और चोट का प्रभाव अच्छी तरह से स्थापित है40,41,42,43। कॉर्टिकल मस्तिष्क की चोट के बाद एसईजेड में रक्त-व्युत्पन्न फाइब्रिनोजेन का संवर्धन और एसईजेड एस्ट्रोग्लियोजेनेसिस और निशान गठन पर इसका प्रभाव 44 एसईजेड स्टेम सेल फिजियोलॉजी पर आघात-प्रेरित माइक्रोएन्वायरमेंट परिवर्तनों के संभावित प्रभाव पर प्रकाश डालता है। इसलिए, सीएसडी का उपयोग करके मस्तिष्क की चोट के सहयोग से एसईजेड-ईसीएम प्रोटिओम की जांच करने से उन तंत्रों को स्पष्ट करने में मदद मिल सकती है जिनके द्वारा चोट और सूजन न्यूरोजेनेसिस को प्रभावित करती है। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि स्वास्थ्य और बीमारी में मानव मस्तिष्क न्यूरोजेनिक niches पर भी लागू हो सकती है क्योंकि ताजा जमे हुए ऊतक अक्सर सर्जरी से प्राप्त किए जा सकते हैं। इसके अलावा, वयस्क न्यूरोजेनेसिस में प्रजातियों के अंतर को देखते हुए, सीएसडी विधि को अन्य प्रजातियों पर लागू करना भी आकर्षक होगा, उदाहरण के लिए, स्ट्रिएटल न्यूरोजेनेसिस के सहयोग से। इसके अलावा, अन्य प्रोटीन का पता लगाने के तरीकों के साथ, स्थानीय रूप से उत्पादित विकास कारकों में अंतर की जांच एसईजेड और एमईजेड (जैसे, एलिसा) के लिए सीएसडी का उपयोग करके सटीक और कुशलता से की जा सकती है।
अंत में, विच्छेदन प्रक्रिया को संभावित रूप से अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के सटीक निष्कर्षण के लिए संशोधित किया जा सकता है, न्यूरोजेनेसिस से संबंधित नहीं शोध प्रश्नों के लिए भी। उदाहरण के लिए, सीएसडी में एक संक्षिप्त अर्ध-पिघलने वाला चरण शामिल है, जिसके दौरान कॉम्पैक्ट माइलिन अधिक पारभासी अवशिष्ट मस्तिष्क ऊतक से अलग सफेद क्षेत्रों के रूप में दिखाई देता है। विधि के एक सरल संशोधन के साथ, यह सुविधा केवल कॉर्पस कैलोसम कॉम्पैक्ट माइलिन ऊतक के सटीक विच्छेदन की अनुमति देगी, जिसे चोट से संबंधित परिवर्तनों के प्रोटिओमिक विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। एक प्रोटोकॉल संशोधन का एक सुझाव जो कॉर्पस कठोर विच्छेदन की अनुमति देगा, प्रोटोकॉल के चरणों 1.5-1.9 को छोड़ना है और एसईजेड और एमईजेड को सुलभ बनाने के लिए वेंट्रिकल्स खोलने के बजाय कोरोनल वर्गों को तैयार करने के लिए सीधे आगे बढ़ना है। फिर, सूखी बर्फ पर वर्गों को रखें, संक्षेप में स्लाइस को उठाएं और अर्ध-पिघलाएं, और बस एक स्केलपेल के साथ कॉर्पस कॉलोसम को हटा दें। यह तैयारी अब किसी भी विश्लेषण के लिए तैयार होनी चाहिए, जिसमें देशी कॉर्पस कैलोसम ऊतक के कुशल विच्छेदन की आवश्यकता होती है।
संक्षेप में, यह अध्ययन एक सूक्ष्म-विच्छेदन विधि प्रस्तुत करता है जिसका उपयोग विश्वसनीय वेंट्रिकुलर न्यूरोजेनिक आला प्रोटिओम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। डेटा एसईजेड माइक्रोएन्वायरमेंट के एमएस-आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ-साथ सीएसडी विधि की संगतता और उपयोगिता को रेखांकित करता है। परिशुद्धता, दक्षता, और न्यूनतम ऊतक क्षोभ का संयोजन सीएसडी को मौजूदा तरीकों का एक मूल्यवान विस्तार प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम ईमानदारी से Mathias मान हमें अपनी प्रयोगशाला में प्रयोगों के बड़े हिस्से का प्रदर्शन करने की अनुमति देने के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं, LCM और proteome विश्लेषण के साथ मदद के लिए फैबियन Coscia, पूरेमाउंट विच्छेदन के लिए Tatiana साइमन-Ebert, और Korbinian Mayr और इगोर पारोन उनकी तकनीकी मदद के लिए। हम कृतज्ञतापूर्वक जर्मन रिसर्च काउंसिल से एमजी (SFB870, TFR274), यूरोपीय संघ (एरानेट S-700982-5008-001), ERC (aERC “NeuroCentro” से MG), स्वीडिश सोसाइटी फॉर मेडिकल रिसर्च (SSMF, JK) पोस्टडॉक्टरल अनुदान, और KI नींव और फंड (2020-01351, JK के लिए) के लिए धन स्वीकार करते हैं।
Cryostat CM3050S | Leica | ||
Dissecting microscope | Leica | ||
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
Antibodies | |||
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
Software | |||
GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
ZEN imaging software | Carl Zeiss |