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Bioengineering

विट्रो में बायोडिग्रेडेबल इम्प्लांट सामग्री का अध्ययन करने के लिए प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संस्कृति विधियां

Published: April 15, 2022 doi: 10.3791/63065
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3
1Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Stem Cell Center, University of California, Riverside
* These authors contributed equally

Summary

हम बायोडिग्रेडेबल इम्प्लांट सामग्री के इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्यक्ष संस्कृति, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति और एक्सपोजर संस्कृति के तीन तरीकों का परिचय देते हैं। ये इन विट्रो विधियां विवो सेल-इम्प्लांट इंटरैक्शन में अलग-अलग नकल करती हैं और विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों का अध्ययन करने के लिए लागू की जा सकती हैं।

Abstract

पिछले कई दशकों में, बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों को बड़े पैमाने पर बायोमेडिकल अनुप्रयोगों जैसे कि आर्थोपेडिक, दंत चिकित्सा और क्रैनियोमैक्सिलोफेशियल प्रत्यारोपण के लिए खोजा गया है। बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए बायोडिग्रेडेबल सामग्री को स्क्रीन करने के लिए, इन विट्रो सेल प्रतिक्रियाओं, साइटोकॉम्पैटिबिलिटी और साइटोटॉक्सिसिटी के संदर्भ में इन सामग्रियों का मूल्यांकन करना आवश्यक है। बायोमैटेरियल्स के मूल्यांकन में अंतर्राष्ट्रीय मानकीकरण संगठन (आईएसओ) मानकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। हालांकि, अधिकांश आईएसओ मानकों को मूल रूप से गैर-डिग्रेडेबल सामग्रियों की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए स्थापित किया गया था, इस प्रकार बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों की स्क्रीनिंग के लिए सीमित मूल्य प्रदान किया गया था।

यह लेख तीन अलग-अलग संस्कृति विधियों का परिचय देता है और चर्चा करता है, अर्थात्, प्रत्यक्ष संस्कृति विधि, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति विधि, और बायोडिग्रेडेबल प्रत्यारोपण सामग्री की इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक्सपोजर संस्कृति विधि, जिसमें बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, सिरेमिक, धातुएं और उनके कंपोजिट शामिल हैं, विभिन्न सेल प्रकारों के साथ। अनुसंधान से पता चला है कि संस्कृति के तरीके बायोडिग्रेडेबल सामग्री के लिए सेल प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं क्योंकि उनकी गतिशील गिरावट इंटरफ़ेस पर और स्थानीय वातावरण में स्पैटिओटेम्पोरल अंतर को प्रेरित करती है। विशेष रूप से, प्रत्यक्ष संस्कृति विधि प्रत्यारोपण पर सीधे बीज ति कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को प्रकट करती है; प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति विधि प्रत्यारोपण के संपर्क में आने वाली स्थापित मेजबान कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट करती है; और एक्सपोजर कल्चर विधि स्थापित मेजबान कोशिकाओं का मूल्यांकन करती है जो प्रत्यारोपण के साथ सीधे संपर्क में नहीं हैं, लेकिन प्रत्यारोपण गिरावट के कारण स्थानीय वातावरण में परिवर्तन से प्रभावित होते हैं।

यह लेख बायोडिग्रेडेबल इम्प्लांट सामग्री की इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी और अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (बीएमएससी) के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए इन तीन संस्कृति विधियों के उदाहरण प्रदान करता है। यह यह भी वर्णन करता है कि फसल, मार्ग, संस्कृति, बीज, ठीक, दाग, कोशिकाओं को चिह्नित करना, और पोस्टकल्चर मीडिया और सामग्रियों का विश्लेषण कैसे करना है। इस लेख में वर्णित इन विट्रो विधियां इन विवो वातावरण के विभिन्न परिदृश्यों की नकल करती हैं, विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए विभिन्न बायोमैटेरियल्स के इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी परीक्षण की प्रयोज्यता और प्रासंगिकता को विस्तृत करती हैं।

Introduction

दशकों से, बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और बायोमेडिकल अनुप्रयोगों जैसे ऑर्थोपेडिक 1,2, डेंटल 3,4 और क्रैनियोमैक्सिलोफेशियल 5 अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाता है। स्थायी प्रत्यारोपण और सामग्रियों के विपरीत, बायोडिग्रेडेबल धातुओं, सिरेमिक, पॉलिमर, और उनके कंपोजिट धीरे-धीरे शारीरिक वातावरण में विभिन्न रासायनिक प्रतिक्रियाओं के माध्यम से समय के साथ शरीर में खराब हो जाते हैं। उदाहरण के लिए, मैग्नीशियम (Mg) मिश्र धातु1,6,7 और जस्ता (Zn) मिश्र धातु8,9 जैसे बायोडिग्रेडेबल धातुएं हड्डी निर्धारण उपकरणों के लिए आशाजनक सामग्री हैं। उनकी biodegradability हड्डी उपचार के बाद प्रत्यारोपण को हटाने के लिए माध्यमिक सर्जरी के लिए आवश्यकता को समाप्त कर सकता है। कैल्शियम फॉस्फेट सीमेंट (CPCs) जैसे बायोडिग्रेडेबल सिरेमिक्स ने पर्क्यूटेनियस किफोप्लास्टी 10 में ऑस्टियोपोरोटिक कशेरुका संपीड़न फ्रैक्चर के उपचार के लिए रोमांचक क्षमता दिखाई है। सीपीसी फ्रैक्चर कशेरुक शरीर के लिए यांत्रिक समर्थन प्रदान करते हैं और फ्रैक्चर ठीक होने के बाद धीरे-धीरे नीचा दिखाते हैं।

बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, जैसे कि कुछ पॉलीसेकेराइड और पॉलिएस्टर, बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए भी व्यापक रूप से खोजा गया है। उदाहरण के लिए, एक बायोडिग्रेडेबल पॉलीसेकेराइड के रूप में चिटोसन हाइड्रोजेल ने संक्रमण को रोकने और त्वचा के ऊतकों को पुनर्जीवित करने के लिए अपनी क्षमताओं का प्रदर्शन किया है। पॉली-एल-लैक्टिक एसिड (पीएलएलए), पॉली (ग्लाइकोलिक एसिड) (पीजीए), और पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) (पीएलजीए) ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए 2 डी या 3 डी झरझरा मचानों को बनाने के लिए पॉलिएस्टर का व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है12,13,14। इसके अलावा, समग्र सामग्री धातुओं, सिरेमिक और पॉलिमर के दो या दो से अधिक चरणों को एकीकृत करने के लिए जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उन्नत कार्य प्रदान करने के लिए15,16,17। उदाहरण के लिए, पीएलजीए और कैल्शियम फॉस्फेट कंपोजिट का उपयोग खोपड़ी की हड्डी के दोषों की मरम्मत जैसे अनुप्रयोगों के लिए बायोडिग्रेडेबल मचान बनाने के लिए किया जा सकता है। ये बायोडिग्रेडेबल मचान और प्रत्यारोपण कोशिकाओं और ऊतकों के विकास का समर्थन और बढ़ावा दे सकते हैं और फिर समय के साथ धीरे-धीरे शरीर में नीचा दिखा सकते हैं।

जैसा कि पूरक तालिका 1 में दिखाया गया है, विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों में विभिन्न गिरावट तंत्र, उत्पाद और दरें हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, मैग्नीशियम मिश्र धातु, जैसे Mg-2 wt % Zn-0.5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19, और Mg-9 wt% Al-1 wt% Zinc (AZ91)20, पानी के साथ प्रतिक्रिया करके अवक्रमित होते हैं, और उनके गिरावट उत्पादों में मुख्य रूप से Mg2 + आयन, OH- आयन, H2 गैस और खनिज जमाव शामिल हैं। बायोडिग्रेडेबल धातुओं के लिए गिरावट की दर उनकी विभिन्न रचनाओं, ज्यामिति और गिरावट के वातावरण के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, Cipriano et al.19 ने बताया कि ZSr41 तारों (Ø1.1 × 15 मिमी) ने 85% द्रव्यमान खो दिया, जबकि एक ही ज्यामिति वाले शुद्ध एमजी तारों ने 47 दिनों के लिए चूहे के टिबिया में प्रत्यारोपित होने के बाद 40% द्रव्यमान खो दिया। बायोडिग्रेडेबल सिरेमिक सामग्री जैसे कि हाइड्रॉक्सीएपेटाइट (एचए) और β-ट्राइकैल्शियम फॉस्फेट (β-टीसीपी) समाधान-संचालित बाह्य कोशिकीय तरल विघटन के माध्यम से नीचा दिखा सकते हैं या छोटे कणों में टूट सकते हैं और फिर बाह्य कोशिकीय तरल विघटन और सेल-मध्यस्थता अवशोषण प्रक्रियाओं दोनों के माध्यम से नीचा दिखा सकते हैं। इन कैल्शियम फॉस्फेट-आधारित सिरेमिक के क्षरण उत्पादों में Ca2 + आयन, (PO4) 3- आयन, OH- आयन, और खनिज जमाव शामिल हो सकते हैं21। कैल्शियम फॉस्फेट सिरेमिक के लिए गिरावट की दर उनके क्रिस्टल संरचनाओं से काफी प्रभावित होती है। उदाहरण के लिए, वैन Blitterswijk et al.22 ने बताया कि 40 vol.% माइक्रोपोर के साथ एचए ने कोई द्रव्यमान नहीं खोया, जबकि 40 vol.% माइक्रोपोर के साथ β-TCP ने 3 महीने के लिए खरगोशों के टिबिया में प्रत्यारोपित होने के बाद 30 ± 4% द्रव्यमान खो दिया। PLGA14,23 जैसे पॉलिमर पानी की उपस्थिति में एस्टर लिंकेज के हाइड्रोलिसिस के कारण खराब हो सकते हैं, और गिरावट उत्पादों में मुख्य रूप से लैक्टिक और ग्लाइकोलिक एसिड शामिल हैं। पीएलजीए 50/50 के लिए एक महीने और पीएलजीए 95/5 को पूर्ण गिरावट प्राप्त करने में कई महीने लग सकते हैं।

सेल प्रतिक्रिया और cytocompatibility परीक्षण मूल्यांकन और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इन biodegradable प्रत्यारोपण सामग्री स्क्रीन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, मानकीकरण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन (आईएसओ) के वर्तमान मानक, जैसे कि आईएसओ 10993-5: 2009 "चिकित्सा उपकरणों का जैविक मूल्यांकन- इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी के लिए भाग 5 परीक्षण", शुरू में विट्रो 25 में टीआई मिश्र धातुओं और सीआर-को मिश्र धातुओं जैसे गैर-ग्रेडेबल बायोमैटेरियल्स की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। विशेष रूप से, आईएसओ 10993-5: 2009 केवल निकालने, प्रत्यक्ष संपर्क और अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षणों के इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षणों को कवर करता है। निकालने के परीक्षण में, अर्क को निष्कर्षण तरल पदार्थों में नमूने डुबोकर तैयार किया जाता है जैसे कि सीरम और शारीरिक खारा समाधानों के साथ संस्कृति मीडिया मानक समय और तापमान की स्थिति में से एक के तहत। एकत्र अर्क या कमजोर पड़ने को तब साइटोटॉक्सिसिटी का अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति में जोड़ा जाता है। प्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण के लिए, नमूना और कोशिकाओं के बीच सीधा संपर्क स्थापित (पालन) सेल परत पर परीक्षण नमूने को रखकर प्राप्त किया जाता है। अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण में, सीरम और पिघले हुए अगर वाले संस्कृति मीडिया को स्थापित कोशिकाओं को कवर करने के लिए पाइप किया जाता है। नमूना तो एक फिल्टर के साथ या बिना solidified आगर परत पर रखा जाता है.

आईएसओ मानकों ने विट्रो में बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों का मूल्यांकन करने के लिए लागू होने पर कुछ सीमाएं दिखाई हैं। गैर-विकासीय सामग्रियों के विपरीत, बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों के क्षरण व्यवहार गतिशील होते हैं और एक अलग समय पर या विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों (जैसे, तापमान, आर्द्रता, मीडिया संरचना और सेल प्रकार) में बदल सकते हैं। निकालने का परीक्षण केवल सामग्री के अवक्रमण उत्पादों की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करता है और नमूना गिरावट की गतिशील प्रक्रिया को प्रतिबिंबित नहीं करता है। आईएसओ मानक के प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण दोनों ही स्थापित कोशिकाओं और नमूनों के बीच बातचीत की विशेषता है। इसके अलावा, अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण में, सामग्री और कोशिकाएं विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंट में होती हैं जो विवो वातावरण में प्रतिबिंबित नहीं होती हैं और बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों के गतिशील क्षरण पर कब्जा नहीं करती हैं।

इस लेख का उद्देश्य वर्तमान आईएसओ मानकों में वर्णित विधियों की उपर्युक्त सीमाओं को संबोधित करने के लिए विभिन्न बायोडिग्रेडेबल प्रत्यारोपण सामग्रियों के लिए साइटोकंपैटिबिलिटी परीक्षण विधियों को पेश करना और चर्चा करना है। इस आलेख में प्रस्तुत विधियाँ प्रत्यारोपण सामग्री के गतिशील अवक्रमण व्यवहार और विवो में सेल-सामग्री इंटरैक्शन की विभिन्न परिस्थितियों पर विचार करती हैं। विशेष रूप से, यह लेख तीन साइटोकॉम्पैटिबिलिटी परीक्षण विधियां प्रदान करता है, अर्थात् प्रत्यक्ष संस्कृति, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति, और विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों के लिए एक्सपोजर संस्कृति, जिसमें बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, सिरेमिक, धातुएं और चिकित्सा प्रत्यारोपण अनुप्रयोगों के लिए उनके कंपोजिट शामिल हैं।

प्रत्यक्ष संस्कृति विधि में, संस्कृति मीडिया में निलंबित कोशिकाओं को सीधे नमूनों पर बीज दिया जाता है, इस प्रकार नई बीजित कोशिकाओं और प्रत्यारोपण के बीच बातचीत का मूल्यांकन किया जाता है। प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति में, नमूनों को शरीर में स्थापित मेजबान कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपण की बातचीत की नकल करने के लिए सीधे स्थापित सेल परत पर रखा जाता है। एक्सपोजर संस्कृति में, नमूनों को उनके संबंधित अच्छी तरह से आवेषण में रखा जाता है और फिर स्थापित कोशिकाओं के साथ संस्कृति कुओं में पेश किया जाता है, जो प्रत्यारोपण गिरावट से प्रेरित स्थानीय वातावरण में परिवर्तन के लिए स्थापित कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की विशेषता है जब उनका प्रत्यारोपण के साथ कोई सीधा संपर्क नहीं होता है। प्रत्यक्ष संस्कृति और प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति विधियां एक ही संस्कृति में प्रत्यारोपण सामग्री के संपर्क में प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से कोशिकाओं का मूल्यांकन करती हैं। एक्सपोजर संस्कृति अप्रत्यक्ष रूप से एक ही संस्कृति में एक निर्धारित दूरी के भीतर प्रत्यारोपण सामग्री के संपर्क में कोशिकाओं को अच्छी तरह से दर्शाती है।

यह लेख विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों और मॉडल कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत के लिए साइटोकंपैटिबिलिटी परीक्षण का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करता है, अर्थात, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल (बीएमएससी)। प्रोटोकॉल में कोशिकाओं की कटाई, खेती, सीडिंग, फिक्सिंग, धुंधला और इमेजिंग शामिल है, साथ ही पोस्टकल्चर सामग्री और मीडिया के विश्लेषण के साथ, जो विभिन्न प्रकार की बायोडिग्रेडेबल प्रत्यारोपण सामग्री और सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होते हैं। ये विधियां सेल प्रतिक्रियाओं और विट्रो में साइटोकंपैटिबिलिटी के संदर्भ में विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को सेल और ऊतक कटाई के लिए रिवरसाइड (यूसीआर) में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। वीडियो में एक 12 सप्ताह की मादा स्प्राग-डॉली (एसडी) चूहे को एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। युवा मादा और नर चूहों को पसंद किया जाता है।

1. सेल संस्कृति तैयारी

नोट:: इस आलेख में वर्णित तीन संस्कृति विधियाँ आमतौर पर अनुयायी हैं जो विभिन्न कक्ष प्रकारों के लिए लागू होते हैं। यहां, चूहे के वीनलिंग से काटे गए बीएमएससी को सेल संस्कृति की तैयारी के लिए एक उदाहरण के रूप में पेश किया जाएगा। विशिष्ट चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए उनकी प्रासंगिकता के आधार पर, विभिन्न सेल प्रकारों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें जानवरों या मानव दाताओं से काटी गई प्राथमिक कोशिकाएं और सेल / ऊतक बैंक से सेल लाइनें शामिल हैं।

  1. चूहे के वीनलिंग से बीएमएससी की कटाई
    नोट:: चित्र 1 में योजनाबद्ध आरेख चूहे weanlings से BMSCs फसल के लिए चरणों से पता चलता है।
    1. Co2 साँस लेने से स्प्राग डॉली (एसडी) चूहे को Euthanize करें।
    2. euthanized चूहे से बाहर फीमर विच्छेदन करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों और संयोजी ऊतकों को निकालें। ऊरु की हड्डियों को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (पॉलीप्रोपाइलीन) में रखें जिसमें सेल कल्चर माध्यम होता है। सेल निष्कर्षण करने के समय तक शंक्वाकार ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
      नोट: टिबिया का उपयोग बीएमएससी की कटाई के लिए भी किया जा सकता है। सेल संस्कृति माध्यम Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / streptomycin (पी / एस) के साथ पूरक है।
    3. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक पेट्री डिश के लिए हड्डियों को स्थानांतरित करें। एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके हड्डी के सिरों को काटें और 251/2 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके सेल कल्चर मीडिया के साथ अस्थि मज्जा गुहा को धोकर अस्थि मज्जा को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (पॉलीप्रोपाइलीन) में फ्लश करें।
      नोट: अस्थि मज्जा के साथ मीडिया में एक 18 जी सुई के साथ एक सिरिंज डालें। धीरे-धीरे और धीरे से, मीडिया को मज्जा के बड़े हिस्से को तोड़ने के लिए तब तक ले जाएं और वितरित करें जब तक कि कोई दृश्यमान सेल / ऊतक agglomerates मौजूद न हों।
    4. एक 70 μm फ़िल्टर का उपयोग करके सेल निलंबन को फ़िल्टर करें, इसके बाद सेल छर्रों को प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 126 × g (1,000 rpm) पर सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया।
    5. Supernatant मीडिया aspirate और ताजा मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ फिर से भरना. धीरे से पिपेट ऊपर और नीचे एक 10 mL सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए।
    6. एक टी -75 फ्लास्क के अंदर नीचे सीधे निलंबन pipette और 25 mL करने के लिए मात्रा लाने के लिए मीडिया जोड़ें। एक मानक बाँझ सेल संस्कृति वातावरण में एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति (यानी, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 95% हवा के साथ ह्यूमिडिफाइड वातावरण)।
    7. 3-7 दिनों के बाद, पुराने माध्यम को एस्पिरेट करके और ताजा माध्यम से फिर से भरकर गैर-एडहरेंट कोशिकाओं को दूर करें। कोशिकाओं को ताजा माध्यम के साथ खेती और खिलाना जारी रखें जब तक कि वे सेल मार्ग, ठंड, या प्रयोग में उपयोग के लिए तैयार न हों।
  2. सेल रखरखाव
    1. सेलुलर अपशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए सेल संस्कृति माध्यम को नियमित रूप से बदलें और लगभग हर दूसरे दिन पोषक तत्वों को फिर से भरें जब तक कि कोशिकाएं 90% -100% confluent न हों। 90% confluency पर, पारित होने, फ्रीज, या एक प्रयोग में कोशिकाओं का उपयोग करें।
    2. पासिंग कोशिकाएं
      नोट: Passaging, जिसे subculturing के रूप में भी जाना जाता है, एक ऐसा शब्द है जो तब लागू होता है जब कोशिकाओं को एक संस्कृति से दूसरे में स्थानांतरित किया जाता है। ताजा काटी गई कोशिकाएं मार्ग चरण 0 (पी 0) पर हैं। ट्रिप्सिन-एथिलीनेडियामिनटेट्राएसिटिक एसिड समाधान (ट्रिप्सिन-ईडीटीए) और इस लेख में वर्णित मीडिया की मात्रा टी -75 फ्लास्क के लिए है।
      1. यह पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाएं 90% confluent हैं, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें।
      2. सेल फ्लास्क से माध्यम को एस्पिरेट करें।
      3. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके फ्लास्क में फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) के 10 मिलीलीटर को वितरित करें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करने के लिए धीरे से फ्लास्क को रॉक करें; सभी पीबीएस aspirate.
        नोट: यह चरण यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त कुल्ला के रूप में कार्य करता है कि पासिंग के दौरान कोई मृत कोशिकाएं या सेलुलर अपशिष्ट स्थानांतरित नहीं किया जाएगा।
      4. कोशिकाओं की सतह पर सीधे सेल फ्लास्क में ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3 एमएल वितरित करें। धीरे से फ्लास्क रॉक यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं के साथ पूरी सतह ट्रिप्सिन-ईडीटीए द्वारा कवर की गई है।
      5. ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ सेल फ्लास्क को इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए रखें ताकि कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति मिल सके।
      6. इनक्यूबेटर में 5 मिनट के बाद, यह पुष्टि करने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें कि कोशिकाएं अलग हो गई हैं। यदि कुछ कोशिकाएं अलग नहीं हुई हैं, तो सेल फ्लास्क के किनारे को धीरे से टैप करें, और फ्लास्क को फिर से जांचें।
      7. ट्रिप्सिन-ईडीटीए को पतला करने के लिए सेल फ्लास्क में 9 एमएल ताजा माध्यम जोड़ें। यह ट्रिप्सिन-ईडीटीए के लिए कोशिकाओं को लाइसिंग करने के बजाय बांधने के लिए अधिक सुलभ प्रोटीन प्रदान करता है।
      8. मीडिया और ट्रिप्सिन-ईडीटीए में कोशिकाओं को पिपेट करें और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में वितरित करें। 5 मिनट के लिए 126 × जी (1,000 आरपीएम) पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
      9. सेल गोली को परेशान किए बिना, ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ माध्यम को एस्पिरेट करें।
      10. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5-10 मिलीलीटर ताजा मीडिया जोड़ें और धीरे से 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      11. पिपेट कोशिकाओं सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से बाहर माध्यम में निलंबित कर दिया और 2-3 ताजा संस्कृति फ्लास्क में मात्रा विभाजित. प्रत्येक फ्लास्क के लिए कुल मध्यम मात्रा को 25 मिलीलीटर तक लाने के लिए पर्याप्त माध्यम जोड़ें।
        नोट:: उपसंस्कृति के दौरान विभाजित अनुपात सेल प्रकार और विशिष्ट विकास विशेषताओं के आधार पर भिन्न हो सकता है।
      12. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें और उन्हें इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    3. ठंड कोशिकाओं
      1. यह पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाएं 90% confluent हैं, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें।
      2. चरण 1.2.2.2 से 1.2.2.9 तक दोहराएँ।
      3. एक 100-1000 μL माइक्रोपिपेट के साथ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए ताजा माध्यम के 900 μL जोड़ें। धीरे-धीरे और धीरे-धीरे एक ही माइक्रोपिपेट का उपयोग करके माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया।
      4. एक cryovial में 900 μL सेल निलंबन स्थानांतरण. डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 100 μL जोड़ें।
      5. जितनी जल्दी हो सके, क्रायोवियल को तापमान में कमी को विनियमित करने के लिए डिज़ाइन किए गए एक बेलनाकार फोम कंटेनर में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। फोम कंटेनर को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    4. Thawing कोशिकाओं
      1. पानी के स्नान में जमे हुए कोशिकाओं को पिघलाएं। ताजा माध्यम के 5 मिलीलीटर से भरे एक बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब लें, कोशिकाओं को शंक्वाकार ट्यूब में रखें, और 5 मिनट के लिए 126 × जी (1,000 आरपीएम) पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      2. DMSO युक्त माध्यम aspirate.
      3. कोशिकाओं की 15 मिली शंक्वाकार ट्यूब में ताजा माध्यम के 5-10 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे और धीरे-धीरे कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
      4. पिपेट कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से माध्यम में निलंबित कर दिया जाता है और एक नए टी -75 फ्लास्क में वितरित किया जाता है। कोशिकाओं को वितरित करते समय, सेल फ्लास्क के तल पर यथासंभव समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक व्यापक गति का उपयोग करें।
      5. प्रत्येक T-75 फ्लास्क के लिए कुल मध्यम मात्रा को 25 मिलीलीटर तक लाने के लिए पर्याप्त ताजा माध्यम जोड़ें।
      6. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें और सेल फ्लास्क को इनक्यूबेटर में वापस रखें।

2. नमूना तैयारी और नसबंदी

  1. नमूना तैयारी
    1. इस लेख में वर्णित सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए ऊतक-संस्कृति-उपचारित प्लेटों जैसे 6, 12, 24, 48, या 96-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करें। ऊतक-संस्कृति प्लेटों के प्रकार और नमूना आयाम जैसे विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइनों के आधार पर प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम की मात्रा का चयन करें।
  2. सेल संस्कृति से पहले सभी बायोडिग्रेडेबल नमूनों को निष्फल या कीटाणुरहित करें।
    नोट: कीटाणुशोधन के लिए स्वीकार्य है in vitro अध्ययन जब नमूने उच्च गर्मी, ऑक्सीकारक, और / या कणों को शामिल करने वाले कुछ नसबंदी स्थितियों के तहत रासायनिक और / या सतह परिवर्तन के लिए प्रवण होते हैं। विभिन्न नमूना प्रकारों के लिए नसबंदी या कीटाणुशोधन विधियां सामग्री के विभिन्न गुणों के आधार पर भिन्न होती हैं, जैसे कि पॉलिमर, धातु और सिरेमिक। नसबंदी या कीटाणुशोधन की प्रक्रिया में गर्मी, गैस, विकिरण, रसायन, उच्च दबाव, या इनमें से एक संयोजन शामिल हो सकता है।
    1. बायोडिग्रेडेबल धातुओं
      1. सामान्य तौर पर, इन विट्रो अध्ययनों के लिए बायोडिग्रेडेबल धातुओं को कीटाणुरहित करने के लिए पराबैंगनी (यूवी) विकिरण का उपयोग करें।
        नोट: उदाहरण के लिए, झांग एट अल ने बताया कि शुद्ध मैग्नीशियम (एमजी) और जेडसी 21 मिलीग्राम मिश्र धातु के नमूनों को सेल अध्ययन में उपयोग किए जाने से पहले 4 घंटे के लिए यूवी विकिरण के तहत कीटाणुरहित किया गया था। विवो अध्ययनों के लिए, नमूनों को आमतौर पर निष्फल करने की आवश्यकता होती है। मैग्नीशियम या मैग्नीशियम मिश्र धातुओं जैसे कई बायोडिग्रेडेबल धातुओं के लिए, भाप का उपयोग करके ऑटोक्लेविंग से बचा जाना चाहिए क्योंकि इन नमूनों को ऑक्सीकरण या पानी में खराब किया जा सकता है। यूवी कीटाणुशोधन के लिए एक क्वार्ट्ज डिश की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह अधिकांश चश्मे और प्लास्टिक की तुलना में बेहतर यूवी पारदर्शिता प्रदान करता है।
      2. 100-200 डिग्री सेल्सियस की तापमान सीमा पर एक ओवन या आटोक्लेव में सूखी गर्मी के तहत एमजी मिश्र धातु के नमूनों को निष्फल करें।
        नोट: जैसा कि कुछ धातु मिश्र धातु अभी भी हवा में उच्च तापमान पर सतह पर ऑक्सीकरण हो सकते हैं, उच्च तीव्रता वाले विकिरण का उपयोग कुछ मामलों में विकल्प के रूप में किया जा सकता है। हालांकि, उच्च तीव्रता वाले विकिरण जैसे अल्फा या गामा विकिरण से बचा जाना चाहिए जब पतली धातु की पन्नियों को निष्फल किया जाता है। यह सामग्री के भीतर परमाणु विस्थापन का कारण बन सकता है, जिससे सामग्री की सूक्ष्म संरचना बदल सकती है।
      3. एथिलीन ऑक्साइड (ईटीओ) गैस नसबंदी का उपयोग गर्मी और विकिरण के प्रति संवेदनशील बायोडिग्रेडेबल धातुओं के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में करें26।
    2. बायोडिग्रेडेबल सिरेमिक
      1. आम तौर पर, इन विट्रो अध्ययनों से पहले यूवी विकिरण या 70% इथेनॉल समाधान का उपयोग करके बायोडिग्रेडेबल सिरेमिक कीटाणुरहित करें।
        नोट: उदाहरण के लिए, लियू एट अल ने बताया कि कैल्शियम फॉस्फेट के नमूनों को 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जन के माध्यम से कीटाणुरहित किया गया था और इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी टेस्ट 27 में उपयोग किए जाने से पहले प्रत्येक पक्ष पर 12 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क में थे।
      2. बायोडिग्रेडेबल सिरेमिक को निष्फल करने के लिए आटोक्लेव का उपयोग करें यदि उच्च तापमान और जल वाष्प उनके कम्पोस्टियन और माइक्रोस्ट्रक्चर को नुकसान नहीं पहुंचाते हैं।
        नोट: कुछ सिरेमिक autoclaving से प्रभावित हो सकता है। उदाहरण के लिए, चरण परिवर्तन और सतह roughening पाया गया जब yttria-स्थिर zirconia सिरेमिक 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaved थे। इसके अतिरिक्त, सीपीसी को भाप के साथ ऑटोक्लेविंग के माध्यम से निष्फल नहीं किया जा सकता है क्योंकि नमूने पानी के साथ प्रतिक्रिया करेंगे।
      3. उपर्युक्त yttria-स्थिर zirconia सिरेमिक और CPC नमूने 28 के लिए कोबाल्ट -60 विकिरण जैसे वैकल्पिक नसबंदी विधियों का उपयोग करें।
    3. बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर
      1. सामान्य तौर पर, यूवी विकिरण या 70% इथेनॉल का उपयोग करके बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर को कीटाणुरहित करें, इससे पहले कि वे विट्रो में सेल अध्ययन में उनका उपयोग कर सकें।
        नोट: कुछ पॉलिमर यूवी विकिरण के तहत रासायनिक परिवर्तन से गुजर सकते हैं। नसबंदी के लिए, गामा-किरण उपचार जैसे कोबाल्ट -60 विकिरण का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, स्टार्च पाउडर को इन विट्रो सेल अध्ययन 29 में उपयोग किए जाने से पहले कोबाल्ट -60 विकिरण के तहत निष्फल किया गया था।
      2. आटोक्लेव बहुलक सामग्री जो उच्च तापमान और नमी का सामना कर सकती है।
        नोट: उदाहरण के लिए, पॉलीप्रोपाइलीन जैसे पॉलिमर को ऑटोक्लेव किया जा सकता है क्योंकि वे ऑटोक्लेविंग तापमान (यानी, 121-134 डिग्री सेल्सियस) को सहन कर सकते हैं। कुछ पॉलिमर जैसे पॉलीकैप्रोलैक्टोन (पीसीएल) को उनके अपेक्षाकृत कम पिघलने बिंदुओं (यानी, लगभग 60 डिग्री सेल्सियस) 30 के कारण ऑटोक्लेव नहीं किया जा सकता है।
      3. गर्मी या विकिरण नसबंदी के प्रति संवेदनशील बहुलक सामग्री को निष्फल करने के लिए ईटीओ गैस का उपयोग करें।

3. सेल संस्कृति विधियों

  1. प्रत्यक्ष संस्कृति के तरीके
    नोट:: चित्र 2A में योजनाबद्ध आरेख प्रत्यक्ष संस्कृति विधि के चरणों को दिखाता है। इस लेख में, बीएमएससी को एक एमजी-व्युत्पन्न प्लेट पर सुसंस्कृत किया गया था, जो संस्कृति विधि को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में 12-अच्छी तरह से ऊतक-संस्कृति-उपचारित प्लेट के कुओं के अंदर रखा गया था।
    1. कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए चरण 1.2.2.1-1.2.2.10 में वर्णित चरणों का पालन करें।
    2. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल निलंबन में सेल एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए 90% कॉन्फ्लुएंट फ्लास्क का उपयोग करें। विट्रो में सेल अध्ययन के लिए आवश्यक एक निर्धारित सेल एकाग्रता के लिए ताजा माध्यम का उपयोग करके सेल निलंबन को पतला करें।
      नोट: कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्धारित किया जाता है। उदाहरण के लिए, बायोडिग्रेडेबल सामग्री के साथ विभिन्न सेल अध्ययनों में 2,000-40,000 कोशिकाओं / सेमी 2 के सेल घनत्व का उपयोग किया गया है।
    3. नमूने (एमजी प्लेट) को 12-अच्छी तरह से इलाज किए गए ऊतक-संस्कृति प्लेटों के केंद्र में रखें। अनुक्रमिक रूप से, बाँझ परिस्थितियों में आसमाटिक दबाव को कैलिब्रेट करने के लिए पीबीएस के 2 एमएल और डीएमईएम के 2 एमएल के साथ संस्कृति प्लेटों को कुल्ला करें। ब्याज के नमूनों पर प्रत्येक अच्छी तरह से पतला सेल निलंबन के 3 एमएल जोड़ें।
    4. 24 घंटे के लिए मानक सेल संस्कृति शर्तों के तहत एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति दें।
      नोट:: संस्कृति का समय प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर 24 घंटे से अधिक या छोटा हो सकता है।
  2. प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृतियों
    नोट:: चित्र 2B में योजनाबद्ध आरेख प्रत्यक्ष एक्सपोज़र संस्कृति के चरणों को दिखाता है।
    1. जैसा कि चरण 3.1.1 और 3.1.2 में वर्णित है, विभिन्न सेल प्रकारों और इच्छित अनुप्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर कोशिकाओं की आवश्यक सांद्रता के साथ सेल निलंबन तैयार करें।
    2. बाँझ परिस्थितियों में आसमाटिक दबाव को कैलिब्रेट करने के लिए पीबीएस के 2 एमएल और डीएमईएम के 2 एमएल के साथ संस्कृति प्लेटों को क्रमिक रूप से कुल्ला करें। प्रत्येक अच्छी तरह से पतला सेल निलंबन के 3 मिलीलीटर जोड़ें। 24 घंटे के लिए मानक सेल संस्कृति की स्थिति के तहत या जब तक कोशिकाएं 50-80% संगम तक नहीं पहुंचती हैं, तब तक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति करें।
      नोट:: सेल संगम स्तर विभिन्न सेल प्रकार और प्रयोगात्मक डिज़ाइन के लिए भिन्न हो सकता है।
    3. 24 घंटे के बाद, फ्लोटिंग मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करके पीबीएस के साथ अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    4. कीटाणुरहित या निष्फल नमूनों को सीधे चिपके हुए कोशिकाओं पर रखें। प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. एक और 24 घंटे के लिए मानक सेल संस्कृति की स्थिति के तहत कोशिकाओं को संस्कृति दें।
      नोट:: संस्कृति का समय प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर 24 घंटे से अधिक या छोटा हो सकता है।
  3. एक्सपोजर संस्कृतियों
    नोट:: चित्र 2C में योजनाबद्ध आरेख एक्सपोज़र संस्कृति विधि के चरणों को दिखाता है।
    1. सेल की तैयारी के लिए प्रारंभिक चरण एक्सपोज़र संस्कृति के समान हैं। जैसा कि चरण 3.1.1 और 3.1.2 में वर्णित है, वांछित कक्षों के साथ सेल निलंबन तैयार करें। चरण 3.2.1 और 3.2.2 के समान, वांछित घनत्व पर अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं को बीज दें और उन्हें 24 घंटे के लिए मानक सेल संस्कृति स्थितियों के तहत इनक्यूबेटर में संस्कृति दें।
    2. 24 घंटे के बाद, फ्लोटिंग मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के साथ अनुयायी कोशिकाओं को कुल्ला करें, इसके बाद प्रत्येक कुएं में 3 एमएल ताजा माध्यम के अलावा।
    3. बाद में, 0.4 μm के झिल्ली छिद्र आकार के साथ अच्छी तरह से आवेषण में नमूनों को रखें और कोशिकाओं के साथ प्रत्येक कुएं में नमूनों के साथ अच्छी तरह से आवेषण रखें।
    4. एक और 24 घंटे के लिए मानक सेल संस्कृति की स्थिति के तहत कोशिकाओं को संस्कृति दें।
      नोट:: संस्कृति का समय प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर 24 घंटे से अधिक या छोटा हो सकता है।

4. कोशिकाओं के पोस्टकल्चर लक्षण वर्णन

नोट: प्रत्यक्ष संस्कृति और प्रत्यक्ष एक्सपोज़र संस्कृति के लिए, ठीक करें, दाग, छवि, और दोनों अच्छी तरह से प्लेटों और नमूनों पर अनुयायी कोशिकाओं का विश्लेषण करें। एक्सपोजर संस्कृति के लिए, अच्छी तरह से प्लेटों का पालन करने वाली कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

  1. सेल निर्धारण
    1. आगे के विश्लेषण के लिए एक इसी 15 मिली शंक्वाकार ट्यूब में प्रत्येक अच्छी तरह से पोस्टकल्चर माध्यम ले लीजिए। आगे के विश्लेषण के लिए संस्कृति के बाद सभी नमूनों को इकट्ठा करें।
    2. पीबीएस का उपयोग करके 3 बार दोनों नमूनों और अच्छी तरह से प्लेटों पर अनुयायी कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से प्लेट में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए, 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन) के 1 एमएल जोड़ें। अच्छी तरह से प्लेट पर ढक्कन वापस रखो और पीएफए को 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें।
    4. 20 मिनट के बाद, पीएफए को एस्पिरेट करें और इसे एक बेकार की बोतल में वितरित करें। पीएफए को हटाने के लिए पीबीएस का उपयोग करके अच्छी तरह से प्लेट को 3 बार कुल्ला करें, और अपशिष्ट को अपशिष्ट बोतल में स्थानांतरित करें।
  2. सेल धुंधला
    1. निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए धुंधला एजेंटों के काम स्टॉक तैयार करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, एलेक्सा फ्लोर 488 Phalloidin का उपयोग F-actin को दागने के लिए किया जाता है, और 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) का उपयोग सेल नाभिक को दागने के लिए किया जाता है। धुंधला समय कम हो सकता है यदि नमूने दाग समाधान में तेजी से नीचा दिखाते हैं।
    2. अच्छी तरह से प्लेट और नमूने पर कोशिकाओं को कवर करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पतला एलेक्सा फ्लोर 488 Phalloidin धुंधला एजेंट के 200-400 μL जोड़ें। प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में अच्छी तरह से प्लेट लपेटें, और एलेक्सा फ्लोर 488 Phalloidin को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें।
    3. एलेक्सा फ्लोर 488 Phalloidin धुंधला एजेंट ले लीजिए और इसी अपशिष्ट बोतल में यह वितरित. अतिरिक्त एलेक्सा फ्लोर 488 Phalloidin को हटाने के लिए पीबीएस का उपयोग करके अच्छी तरह से प्लेट को 3 बार कुल्ला करें, और इसी अपशिष्ट बोतल में इस्तेमाल किए गए पीबीएस को वितरित करें।
    4. अच्छी तरह से और नमूने पर कोशिकाओं को कवर करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पतला DAPI के 200-400 μL जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में अच्छी तरह से प्लेट लपेटें और DAPI कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दें।
    5. DAPI ले लीजिए और इसे इसी अपशिष्ट बोतल में वितरित करें। DAPI को हटाने के लिए PBS का उपयोग करके अच्छी तरह से प्लेट को 3 बार कुल्ला करें, और इसी अपशिष्ट बोतल में उपयोग किए गए पीबीएस को वितरित करें।
  3. सेल इमेजिंग
    1. धुंधला होने के बाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि बनाएं। जब भी संभव हो, प्रतिदीप्ति छवियों के अलावा कोशिकाओं की चरण-विपरीत छवियां लें। नमूनों के निरंतर क्षरण के कारण होने वाले संभावित परिवर्तनों से बचने या कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके या तुरंत धुंधला होने के बाद बायोडिग्रेडेबल नमूनों पर कोशिकाओं की छवि बनाएं। फिक्सेशन के बाद 2-8 डिग्री सेल्सियस पर एक बफर समाधान में अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं को स्टोर करें, और प्रतिदीप्ति संकेतों के नुकसान से बचने के लिए धुंधला होने के बाद जितनी जल्दी हो सके कोशिकाओं की छवि बनाएं।
    2. प्रत्यक्ष संस्कृति और प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति के लिए, दो प्रकार की कोशिकाओं की छवि और मूल्यांकन करें: (1) नमूनों पर कोशिकाएं (नमूनों के साथ सीधे संपर्क में) और (2) नमूनों के आसपास की अच्छी तरह से प्लेट पर अनुयायी कोशिकाएं (नमूनों के साथ अप्रत्यक्ष संपर्क), जैसा कि चित्र3 ए में दिखाया गया है।
    3. एक्सपोजर संस्कृति के लिए, जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, यह निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति छवियों को लेते समय एक छवि गाइड का उपयोग करें कि क्या सेल प्रतिक्रिया नमूनों के गतिशील गिरावट ढाल के जवाब में अलग होगी। आंतरिक अंगूठी (केंद्र से 3.5 मिमी दूर) और बाहरी अंगूठी (केंद्र से 7 मिमी दूर) के भीतर क्षेत्र में स्थित कोशिकाओं की छवि और विश्लेषण अलग-अलग।
      नोट:: छवि मार्गदर्शिका कक्षों और नमूनों के बीच की दूरी को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है।
    4. प्रत्येक नमूने के लिए और अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में, बेतरतीब ढंग से ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र से कम से कम पांच छवियां लें जहां कोशिकाएं या तो प्रत्यक्ष संपर्क में हैं या पूर्वनिर्धारित दूरी पर नमूनों के साथ अप्रत्यक्ष संपर्क में हैं।
  4. छवि विश्लेषण
    1. चरण 4.3 से प्राप्त सभी सेल छवियों के लिए, छवि विश्लेषण के लिए ImageJ जैसे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सेल प्रसार क्षेत्र और पहलू अनुपात को मापकर सेल आकृति विज्ञान को मापें।
    2. प्रत्येक छवि क्षेत्र में कक्षों की संख्या की गणना करें. प्रति इकाई क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या के रूप में प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क स्थितियों के तहत सेल आसंजन घनत्व की गणना करें।

5. मीडिया और नमूनों के Postculture विश्लेषण

  1. पोस्टकल्चर माध्यम के पीएच को मापें।
    नोट:: कुछ नमूने उनके अवक्रमण के दौरान माध्यम का pH मान परिवर्तित करें। उदाहरण के लिए, मैग्नीशियम मिश्र धातुओं जैसे बायोडिग्रेडेबल धातुएं आमतौर पर उनके क्षरण के कारण माध्यम के पीएच मूल्य में वृद्धि करती हैं31। इसके विपरीत, पीएलजीए जैसे बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर अक्सर माध्यम के पीएच मूल्य को कम करते हैं जब वे 32 को नीचा दिखाते हैं। पोस्टकल्चर माध्यम के पीएच मूल्य को मापने से विट्रो में इन नमूनों के क्षरण का संकेत मिल सकता है।
    1. सेल निर्धारण से पहले, चरण 4.1.1 के रूप में पोस्टकल्चर माध्यम को इकट्ठा करें।
    2. संग्रह के तुरंत बाद प्रत्येक में पोस्टकल्चर माध्यम के पीएच मूल्यों को मापें, एक प्रीकैलिब्रेट किए गए पीएच मीटर का उपयोग करके।
      नोट: मीडिया का पीएच समय के साथ पर्यावरणीय स्थितियों जैसे सीओ 2 स्तर और तापमान के कारण बहाव हो सकता है, जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए।
  2. बायोडिग्रेडेबल नमूनों के अवक्रमण व्यवहार के लिए मध्यम रचनाओं का विश्लेषण करें। कुछ नमूनों के लिए जो माध्यम के रंग परिवर्तन का कारण बनते हैं, गिरावट व्यवहार को निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके पोस्टकल्चर माध्यम के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) मूल्य को मापें। वैकल्पिक रूप से, पोस्टकल्चर माध्यम में गिरावट उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए पराबैंगनी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूवी-वीआईएस) और फूरियर ट्रांसफॉर्म इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी-क्षीण कुल परावर्तकता (FTIR-ATR) का उपयोग करें।
    नोट:: पोस्ट-कल्चर माध्यम में गिरावट उत्पादों को मापने के नमूने के गिरावट व्यवहार को समझने के लिए मूल्यवान है। सबसे आम तरीकों में से एक एक आगमनात्मक रूप से युग्मित प्लाज्मा-ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोमीटर (आईसीपी-ओईएस) का उपयोग करके पोस्टकल्चर माध्यम में रुचि के आयनों को मापना है। आईसीपी-ओईएस का उपयोग धातुओं और सिरेमिक के पोस्टकल्चर माध्यम की रचनाओं को मापने के लिए किया जा सकता है, लेकिन पॉलिमर के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। पॉलिमर में आमतौर पर कार्बन, हाइड्रोजन और ऑक्सीजन होते हैं, और इन तत्वों का सटीक परिमाणीकरण आईसीपी-ओईएस के लिए मुश्किल होता है।
    1. पीएच माप के लिए चरण 5.1.2 का पालन करते हुए, आयन सांद्रता के इष्टतम माप के लिए एक वांछनीय कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग करके माध्यम को इकट्ठा और पतला करें।
    2. एक आईसीपी-ओईएस का उपयोग करके पोस्टकल्चर माध्यम में रुचि के आयनों की सांद्रता को मापें।
  3. नमूनों का पोस्टकल्चर विश्लेषण
    नोट: इन विट्रो सेल अध्ययन के बाद, बायोडिग्रेडेबल नमूने आयाम, द्रव्यमान, सतह आकृति विज्ञान, माइक्रोस्ट्रक्चर और संरचना में बदल सकते हैं। नमूनों का पोस्टकल्चर विश्लेषण नमूनों के क्षरण तंत्र को समझने में मदद करता है।
    1. सेल संस्कृति के बाद, नमूना आयाम, रंग, आकृति विज्ञान और अन्य दृश्यमान विशेषताओं में संभावित परिवर्तन दिखाने के लिए नमूनों की तस्वीरें लें।
    2. पोस्टकल्चर नमूनों को सूखा या निर्जलित करें और द्रव्यमान, आयाम और मात्रा में किसी भी बदलाव को मापने के लिए नमूना द्रव्यमान, आयाम और मात्रा को मापें।
    3. नमूनों के माइक्रोस्ट्रक्चर और आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) का उपयोग करें। नमूनों पर गिरावट उत्पादों की संरचना और चरण को चिह्नित करने के लिए ऊर्जा फैलाव एक्स-रे स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईडीएक्स) और एक्स-रे विवर्तन (XRD) का उपयोग करें। नमूना सतहों पर रासायनिक बंधन का पता लगाने के लिए FTIR-ATR का उपयोग करें।

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Representative Results

चित्रा 4 विभिन्न संस्कृति विधियों का उपयोग करके प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क स्थितियों के तहत BMSCs की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों को दर्शाता है। चित्रा 4A, B ZC21 मैग्नीशियम मिश्र धातुओं के साथ एक ही 24 ज प्रत्यक्ष संस्कृति के बाद प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क स्थितियों के तहत BMSCs को दिखाते हैं। ZC21 मिश्र धातुओं में 97.5 wt% मैग्नीशियम, 2 wt% जस्ता और 0.5 wt% कैल्शियम होता है। जिन कोशिकाओं का ZC21 मिश्र धातु के नमूनों के साथ कोई सीधा संपर्क नहीं है, वे उन लोगों की तुलना में बेहतर फैलते हैं जिनका नमूनों के साथ सीधा संपर्क होता है। जैसा कि चित्रा 4C, D में दिखाया गया है, प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क स्थितियों के तहत कोशिकाएं सभी Fe3 + आयनों द्वारा क्रॉसलिंक किए गए हाइलूरोनिक एसिड (HyA) हाइड्रोजेल के साथ 24 घंटे के प्रत्यक्ष जोखिम के बाद सामान्य आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती हैं। हालांकि, अप्रत्यक्ष संपर्क स्थिति के तहत कक्षों की संख्या प्रत्यक्ष संपर्क स्थिति 33 के तहत की तुलना में कम है। एक अन्य अध्ययन ने 24 घंटे के एक्सपोजर कल्चर 19 के बाद बीएमएससी पर ZSr41 मिश्र धातुओं (π = 1.1 मिमी) के क्षरण के प्रभावों की सूचना दी। ZSr41 मिश्र धातुओं में 95 wt% मैग्नीशियम, 4 wt% जस्ता और 1 wt% strontium शामिल हैं। चित्रा 4E BMSCs के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों को अच्छी तरह से केंद्र से 3.5 मिमी दूर एक स्थान पर अच्छी तरह से संस्कृति के अनुयायी से पता चलता है, biodegradable pins19 के साथ एक 24 ज जोखिम संस्कृति के बाद।

चित्रा 5 परिमाणित सेल आसंजन घनत्व के लिए उदाहरण डेटा दिखाता है। जैसा कि चित्रा 5ए में दिखाया गया है, 24 ज प्रत्यक्ष जोखिम (24h_DE) संस्कृति में, ZC21 के साथ सीधे संपर्क में BMSCs में किसी भी अन्य समूह की तुलना में काफी अधिक सेल आसंजन घनत्व होता है। 24 ज प्रत्यक्ष संस्कृति (24h_D) में, ZC21 के साथ सीधे संपर्क में BMSCs Mg समूह की तुलना में काफी अधिक सेल आसंजन घनत्व दिखाते हैं, जो ग्लास संदर्भ समूह की तुलना में काफी कम है, लेकिन Ti मिश्र धातु (T64) नियंत्रण की तुलना में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं है। जैसा कि चित्रा 5 बी में दिखाया गया है, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति की अप्रत्यक्ष संपर्क स्थिति में, बीएमएससी आसंजन घनत्व एमजी समूह की तुलना में जेडसी 21 समूह के लिए काफी अधिक है। हालांकि, यह T64 और कोशिकाओं-केवल नियंत्रण समूहों की तुलना में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाता है। प्रत्यक्ष संस्कृति की अप्रत्यक्ष संपर्क स्थिति में, बीएमएससी आसंजन घनत्व एमजी समूह की तुलना में ZC21 समूह के लिए काफी अधिक है, लेकिन T64 और कोशिकाओं-केवल नियंत्रण समूहों की तुलना में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाता है।

चित्रा 6A प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति और प्रत्यक्ष संस्कृति के बाद पोस्टकल्चर माध्यम के पीएच मूल्य को दर्शाता है। प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति के लिए, सभी नमूनों के लिए मध्यम श्रेणी के पीएच मान 8.3 से 8.4 तक होते हैं। प्रत्यक्ष संस्कृति में, मध्यम के पीएच मान समूहों में 7.9 से 8 तक होते हैं। चित्रा 9B पोस्टकल्चर माध्यम में Mg2 + आयन एकाग्रता को दर्शाता है। प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति और प्रत्यक्ष संस्कृति दोनों में, ZC21 और Mg समूहों में Mg2 + आयन सांद्रता किसी भी अन्य नियंत्रण समूहों की तुलना में काफी अधिक है। चित्रा 7 ZSr41 के लिए XRD पैटर्न और एक 3 दिन के जोखिम संस्कृति के बाद शुद्ध Mg से पता चलता है. चित्र 7A में, Mg, Ca(OH)2, ZnO, MgO:H2O, Ca(HPO4)(H2O)2, और Ca5(PO4)3(OH) (यानी, hydroxyapatite या HA), Mg17Sr2 के क्रिस्टलीय चरण ZSr41 की सतह पर पाए जाते हैं। चित्र 7B में, Mg, Ca(OH)2, Mg3(PO4)2, Mg7(PO4)2(OH)8, Ca2P2O7:5H2O के क्रिस्टलीय चरण शुद्ध Mg19 की सतह पर हैं। चित्र 8A MgO-लेपित Mg के लिए सतह मौलिक संरचना के SEM छवियों और EDX मानचित्रों के ओवरले को दर्शाता है और BMSCs के साथ प्रत्यक्ष संस्कृति के 24 घंटे के बाद Mg सब्सट्रेट्स और ग्लास के नियंत्रण को दर्शाता है। चित्र 8B नमूना सतहों की मात्रात्मक सतह मौलिक संरचना को दर्शाता है, जो सेल संस्कृति 34 के दौरान गठित विभिन्न निक्षेपों को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध आरेख चूहे weanlings से BMSCs फसल के लिए चरणों को दिखा रहा है. यह आंकड़ा 35 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त नाम: BMSCs = अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: तीन सेल संस्कृति विधियों को दर्शाने वाला योजनाबद्ध आरेख। (A) प्रत्यक्ष संस्कृति, (B) प्रत्यक्ष एक्सपोज़र संस्कृति, और (C) एक्सपोज़र संस्कृति। इस आंकड़े को 36 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रत्यक्ष संस्कृति और प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति को दर्शाने वाले योजनाबद्ध आरेख. (A) प्रत्यक्ष संस्कृति और प्रत्यक्ष एक्सपोज़र संस्कृति में प्रत्यक्ष संपर्क और अप्रत्यक्ष संपर्क स्थितियों के तहत कोशिकाएं। (बी) एक्सपोजर संस्कृति में नमूनों के केंद्र से दूर विभिन्न दूरी पर अच्छी तरह से प्लेट का पालन करने वाली कोशिकाओं की तस्वीरें लेने के लिए एक इमेजिंग गाइड का उपयोग। चित्र 3B को 37 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: BMSCs की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां(A, B) ZC21 मिश्र धातुओं के साथ 24 h प्रत्यक्ष संस्कृति के बाद प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क की स्थिति। (C, D) HyA hydrogels के साथ प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति. (ई) ZSr41 मिश्र धातुओं के साथ एक 24 ज जोखिम संस्कृति के बाद संस्कृति प्लेट पर। स्केल बार = 100 μm. A और B को 1 से पुन: पेश किया जाता है; C और D को 33 से पुन: पेश किया जाता है; और E को 19 से पुन: पेश किया जाता है। संक्षिप्त रूप: BMSCs = अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं; HyA = hyaluronic एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: BMSCs के सेल आसंजन घनत्व के लिए मात्रात्मक परिणाम( A) प्रत्यक्ष संपर्क और (B) 24 h प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति (24 h_DE) और प्रत्यक्ष संस्कृति (24 h_D) के बाद अप्रत्यक्ष संपर्क की स्थिति। यह आंकड़ा 1 से पुन: पेश किया गया है। संक्षिप्त रूप: BMSCs = अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं; DE = प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति; D = Direct Culture कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: 24 घंटे प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति और प्रत्यक्ष संस्कृति के बाद माध्यम के पोस्टकल्चर विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए) पीएच मान और (बी) एमजी 2 + आयन सांद्रता। यह आंकड़ा 1 से पुन: पेश किया गया है। संक्षिप्त रूप: DE = प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति; D = Direct Culture कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: BMSCs के साथ संस्कृति के 3 दिनों के बाद बायोडिग्रेडेबल धातु के नमूनों के चरण विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि पोस्टकल्चर परिणाम। (A) ZSr41 के लिए एक्स-रे विवर्तन स्पेक्ट्रम। (B) शुद्ध Mg के लिए XRD स्पेक्ट्रम। यह आंकड़ा 19 से पुन: पेश किया गया है। संक्षिप्त रूप: BMSCs = अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं; XRD = एक्स-रे विवर्तन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: सतह माइक्रोस्ट्रक्चर, आकृति विज्ञान और संरचना सहित बीएमएससी के साथ प्रत्यक्ष संस्कृति के 24 घंटे के बाद नमूनों के सतह विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि पोस्टकल्चर परिणाम। (ए) MgO-लेपित Mg., गैर-लेपित Mg नियंत्रण, और ग्लास संदर्भ के लिए सतह मौलिक संरचना के SEM छवियों और EDX मानचित्रों का ओवरले। (बी) सतही मौलिक संरचना (पर%) ईडीएक्स विश्लेषण से परिमाणित। स्केल सलाखों = 200 μm. 34 से reproduced. संक्षिप्त रूप: BMSCs = अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं; SEM = स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; EDX = ऊर्जा फैलाव एक्स-रे स्पेक्ट्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: विभिन्न प्रकार की सामग्रियों के लिए गिरावट तंत्र, उत्पाद और दरें, और पोस्टकल्चर नमूना और मध्यम विश्लेषण के लिए एकत्र किए गए परिणाम। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

विवो में अनुप्रयोगों के विभिन्न पहलुओं के लिए ब्याज के बायोमैटेरियल्स की इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न सेल संस्कृति विधियों का उपयोग किया जा सकता है। यह लेख तीन इन विट्रो संस्कृति विधियों को प्रदर्शित करता है, यानी, प्रत्यक्ष संस्कृति, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति, और एक्सपोजर संस्कृति, विवो परिदृश्यों में अलग-अलग नकल करने के लिए जहां मानव शरीर के अंदर बायोडिग्रेडेबल इम्प्लांट सामग्री का उपयोग किया जाता है। प्रत्यक्ष संस्कृति विधि का उपयोग मुख्य रूप से प्रत्यारोपण सामग्री के आसपास के नए बीज वाली कोशिकाओं के व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति विधि विवो परिदृश्य में नकल करती है जहां प्रत्यारोपण सामग्री स्थापित कोशिकाओं और ऊतकों के साथ सीधे संपर्क में आती है। एक्सपोजर कल्चर विधि का उपयोग यह दिखाने के लिए किया जा सकता है कि प्रत्यारोपण सामग्री से गिरावट उत्पाद और स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन स्थापित कोशिकाओं और ऊतकों को कैसे प्रभावित कर सकते हैं जो सीधे प्रत्यारोपण सामग्री के संपर्क में नहीं हैं।

प्रत्यक्ष संस्कृति में, प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष दोनों संपर्क स्थितियों के तहत नई बीज वाली कोशिकाओं का मूल्यांकन किया जाता है। प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति में, स्थापित कोशिकाओं का मूल्यांकन प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क दोनों स्थितियों के तहत किया जा सकता है। एक्सपोजर संस्कृति में, अप्रत्यक्ष संपर्क स्थितियों के तहत केवल स्थापित कोशिकाओं का मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रत्यक्ष संस्कृति में सीधे संपर्क की स्थिति के तहत नए बीज वाली कोशिकाएं भौतिक गुणों और माध्यम में सामग्री-प्रेरित परिवर्तनों जैसे आयन एकाग्रता और पीएच मूल्य में परिवर्तन से प्रभावित होती हैं।

उपर्युक्त सामग्री गुणों में सतह आकृति विज्ञान, हाइड्रोफिलिसिटी, सतह मुक्त ऊर्जा, कठोरता और संरचना शामिल हो सकते हैं। प्रत्यक्ष संस्कृति विधि में अप्रत्यक्ष संपर्क स्थितियों के तहत नए बीज वाली कोशिकाएं और प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति और एक्सपोजर संस्कृति विधियों में सभी स्थापित कोशिकाएं मुख्य रूप से माध्यम में सामग्री-प्रेरित परिवर्तनों से प्रभावित होती हैं। इस आलेख में वर्णित तीन अलग-अलग विधियाँ पारंपरिक विधियों जैसे मध्यम निकालने की विधि की तुलना में इन विवो वातावरण के व्यावहारिक परिदृश्य के करीब हैं। मध्यम निकालने की विधि केवल सामग्री के अवक्रमण उत्पादों की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करती है और नमूना गिरावट की गतिशील प्रक्रिया को प्रतिबिंबित नहीं करती है। इस लेख में वर्णित संस्कृति विधियों में, जैसा कि कोशिकाओं को प्रत्यारोपण सामग्री के साथ सुसंस्कृत किया जाता है, बायोडिग्रेडेबल सामग्री और मध्यम वातावरण का गतिशील परिवर्तन सीटू में कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है।

हालांकि कोई इन विट्रो अध्ययन पूरी तरह से विवो अध्ययनों में प्रतिस्थापित नहीं कर सकता है, इन विट्रो अध्ययन पूरक हैं और कम लागत और कुशल तरीके से मूल्यवान डेटा प्रदान कर सकते हैं। विवो अध्ययनों में आमतौर पर एक मॉडल में सभी एकाधिक चर शामिल होते हैं, जबकि इन विट्रो सेल संस्कृति सेल-सामग्री इंटरैक्शन पर एक कारक के प्रभावों का अध्ययन कर सकती है। इस आलेख में पेश की गई विधियाँ विवो अध्ययन में प्रासंगिक के विभिन्न परिदृश्यों की नकल कर सकती हैं। हम विवो अध्ययन में के लिए पूरक प्रदान करने के लिए विभिन्न चर के बीच लिंकेज बना सकते हैं। एक इन विवो मॉडल में आमतौर पर केवल एक जानवर के प्रकार में एक ही ऊतक शामिल होता है। हालांकि, इन विट्रो अध्ययनों में एक संस्कृति में विभिन्न सेल प्रकार शामिल हो सकते हैं, जो सेल-सामग्री इंटरैक्शन पर विभिन्न चर के संयुक्त प्रभावों का अध्ययन कर सकते हैं। इसके अलावा, विवो मॉडल में सेल-सामग्री इंटरैक्शन पर गतिशील पर्यावरणीय परिवर्तनों के प्रभावों का अध्ययन करना अपेक्षाकृत मुश्किल है। इस आलेख में वर्णित विधियाँ गतिशील परिवर्तनों के प्रभावों की जांच कर सकती हैं जैसे कि सेल व्यवहार पर माध्यम में आयन सांद्रता38.

इस लेख में प्रस्तुत विधियां पॉलिमर, धातुओं, सिरेमिक, कंपोजिट और नैनोकणों सहित सभी प्रकार की सामग्रियों की इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी को समझने और इच्छित अनुप्रयोगों के आधार पर विभिन्न कोशिकाओं, बैक्टीरिया या कवक के साथ उनकी बातचीत का निर्धारण करने के लिए लागू होती हैं। उदाहरण के लिए, Xu et al. ने प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति विधि 33 के माध्यम से BMSCs के साथ HyA-आधारित हाइड्रोजेल की इन विट्रो साइटोकॉम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन किया। सेल आसंजन घनत्व और सेल आकारिकी का विश्लेषण प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संपर्क स्थितियों के तहत किया गया था। HyA-आधारित हाइड्रोजेल कंपोजिट की साइटोटॉक्सिसिटी सेल संस्कृति प्रयोग के दौरान क्रॉसलिंक्ड HyA हाइड्रोजेल से जारी Fe3 + और H + आयनों की सांद्रता से संबंधित हो सकती है। Tian et al. सुसंस्कृत मानव यूरोथेलियल कोशिकाओं (HUCs) के साथ चार अलग-अलग Mg मिश्र धातुओं के साथ 24 h और 48 h के लिए एक्सपोज़र संस्कृति विधि का उपयोग करके और MgO और Mg (OH) 2 के उनके अघुलनशील गिरावट उत्पादों का उपयोग करके प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति का उपयोग करके संभावित मूत्रवाहिनी स्टेंट अनुप्रयोग के लिए जस्ता (Zn) और स्ट्रोंटियम (Sr) युक्त Mg मिश्र धातुओं के साइटोकॉम्पैटिबिलिटी और गिरावट के व्यवहार की जांच करने के लिए प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति का उपयोग करते हुए 24 घंटे . इस अध्ययन में, 4 wt% Zn और 0.5 wt% Sr युक्त ZSr41_B को 24 h और 48 h एक्सपोज़र संस्कृतियों दोनों में अन्य सभी Mg-4Zn-xSr मिश्र धातुओं के बीच HUCs के साथ बेहतर cytocompatibility पाया गया था। परिणामों से यह भी पता चला है कि मैग्नीशियम ऑक्साइड (MgO) और मैग्नीशियम हाइड्रॉक्साइड (Mg(OH)2) की सांद्रता 24 घंटे के प्रत्यक्ष जोखिम संस्कृति के बाद 1.0 mg / mL से अधिक होने पर अच्छी तरह से प्लेट पर कोई दृश्यमान अनुयायी कोशिकाएं नहीं पाई गईं। इसलिए, तियान एट अल ने निष्कर्ष निकाला कि एमजी मिश्र धातुओं की गिरावट दर को कम करना भविष्य के नैदानिक अनुवाद की ओर संभावित दुष्प्रभावों को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है। Wetteland et al. एक बायोडिग्रेडेबल PLGA polymer40 में hydroxyapatite (nHA) और nMgO नैनोकणों dispersing द्वारा एक बहुलक आधारित nanocomposite बनाया। इस nanocomposite प्रत्यक्ष संस्कृति विधि का उपयोग कर विभिन्न नमूनों के साथ BMSCs culturing द्वारा अध्ययन किया गया था। परिणामों से पता चला है कि बहुलक में नैनोकणों के बेहतर फैलाव से एनएचए / पीएलजीए पर बीएमएससी आसंजन में सुधार हो सकता है लेकिन एनएमजीओ / पीएलजीए पर सेल व्यवहार्यता कम हो सकती है। इन विट्रो सेल अध्ययनों के परिणामों के आधार पर, वेटलैंड एट अल ने विभिन्न बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए इंजीनियरिंग इष्टतम सिरेमिक / बहुलक नैनोकम्पोजिट्स के लिए मूल्यवान अंतर्दृष्टि की सूचना दी।

सेल morphologies और सेल संख्याओं को देखा जा सकता है और इस तरह के ImageJ के रूप में मात्रात्मक छवि विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग प्रतिदीप्ति छवियों में परिमाणित किया जा सकता है। हम सेल आसंजन घनत्व, सेल पहलू अनुपात, और विभिन्न नमूना समूहों के लिए सेल प्रसार क्षेत्रों को परिमाणित करके सेल आसंजन और आकृति विज्ञान पर विभिन्न सामग्रियों के प्रभावों की जांच कर सकते हैं। रिक्त नियंत्रण समूह से कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, जहां केवल कोशिकाओं को माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, नमूना सामग्री से किसी भी प्रभाव के बिना संदर्भ के मानक के रूप में काम कर सकता है। हम यह निर्धारित कर सकते हैं कि क्या नमूना सामग्री सेल आसंजन और विट्रो में आकृति विज्ञान को प्रभावित करेगी, सेल आसंजन घनत्व और नमूना समूहों के सेल आकारिकी की तुलना खाली नियंत्रण के साथ। सेल स्प्रेडिंग क्षेत्र नमूना सतह पर सेल आसंजन की वरीयता का खुलासा करता है, यह दर्शाता है कि कोशिकाएं नमूना सामग्री के साथ कैसे बातचीत करती हैं। इस लेख में, हमने डीएपीआई स्टेनिंग के लिए प्रतिक्रिया समय को विक्रेता-अनुशंसित इष्टतम समय से कम करने के लिए कम कर दिया क्योंकि बायोडिग्रेडेबल नमूने, जैसे शुद्ध मैग्नीशियम, जलीय समाधानों में तेजी से नीचा दिखाते हैं। बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों का पालन करने वाली कोशिकाओं की आकृति विज्ञान बदल सकती है यदि धुंधला प्रक्रिया में बहुत लंबा समय लगता है और नमूनों के लिए पानी के संपर्क का समय बहुत लंबा होता है। इसके अलावा, बायोडिग्रेडेबल सामग्री के अनुयायी कोशिकाओं के लिए, सेल छवियों को नमूना गिरावट के कारण सेल आसंजन और आकृति विज्ञान में किसी भी संभावित परिवर्तन को कम करने के लिए तुरंत लिया जाना चाहिए।

कोशिकाओं के परिणामों को इकट्ठा करने के अलावा, पोस्टकल्चर माध्यम और नमूना विश्लेषण महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे प्रत्यारोपण सामग्री के क्षरण तंत्र, उत्पादों और दरों का विश्लेषण करने के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करेंगे। उदाहरण के लिए, पीएलजीए जैसे बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर सेल कल्चर 32 के दौरान मोनोमेरिक या ओलिगोमेरिक हाइड्रॉक्सिल-कार्बोक्जिलिक एसिड जैसे अम्लीय गिरावट उपोत्पाद उत्पन्न कर सकते हैं, जो सेल विकास और प्रसार को प्रभावित कर सकते हैं। इसके विपरीत, बायोडिग्रेडेबल धातुएं, जैसे मैग्नीशियम और इसके मिश्र धातु, अपने क्षरण के दौरान हाइड्रॉक्साइड आयनों और हाइड्रोजन गैस का उत्पादन करते हैं31, जो स्थानीय पीएच को काफी बढ़ा सकते हैं, और गंभीर क्षारीयता का स्थानीय सेल कार्यों पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है। विभिन्न बायोडिग्रेडेबल सिरेमिक भी मध्यम 41 के पीएच को बढ़ा सकते हैं। सामान्य तौर पर, कोशिकाओं को ठीक से काम करने के लिए संस्कृति माध्यम में एक विशिष्ट पीएच रेंज की आवश्यकता होती है, और यह ज्ञात है कि शरीर के तरल पदार्थों में पीएच मूल्यों में वृद्धि या कमी जीवन के लिए हानिकारक है। पोस्टकल्चर माध्यम के पीएच को मापना किसी भी संभावित नुकसान को समझने के लिए मूल्यवान है जो बायोडिग्रेडेबल नमूना सामग्री सेल संस्कृति में पैदा कर सकती है। इसलिए, इन बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों के कोशिकाओं को कैसे प्रभावित करते हैं, इसके संभावित तंत्र को समझने के लिए पोस्टकल्चर माध्यम के पीएच मूल्य को मापना आवश्यक है।

बायोडिग्रेडेबल सामग्री के लिए पोस्टकल्चर माध्यम में महत्वपूर्ण आयन सांद्रता को मापना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, Cortez Alcaraz et al. ने पोस्टकल्चर माध्यम के Mg2 + और Ca2 + आयन सांद्रता को मापा जब उन्होंने BMSCs34 के साथ प्रत्यक्ष संस्कृति का उपयोग करके मैग्नीशियम ऑक्साइड नैनोपार्टिकल-लेपित मैग्नीशियम नमूनों का अध्ययन किया। मैग्नीशियम आयनों की सांद्रता सेल संस्कृति के दौरान विट्रो में विभिन्न नमूनों के क्षरण गुणों का संकेत देती है, और कैल्शियम आयनों की सांद्रता सेल प्रसार के दौरान कैल्शियम जमाव के बारे में जानकारी प्रदान कर सकती है। Xu et al. ने पोस्टकल्चर माध्यम के Fe3 + आयन सांद्रता को मापा जब उन्होंने BMSCs के साथ प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति का उपयोग करके HyA हाइड्रोजेल का अध्ययन किया। उन्होंने HyA33 के क्रॉसलिंकिंग घनत्व को समायोजित करने के लिए Fe3+ आयनों का उपयोग किया। Fe3 + आयन संस्कृति माध्यम के पीएच मूल्य को कम कर सकते हैं, और Fe3 + आयनों की उच्च सांद्रता कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकती है। इसलिए, बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों और उनके संबंधित गिरावट उत्पादों की साइटोकॉम्पैटिबिलिटी में सुधार करने के लिए ब्याज के आयनों की सांद्रता को मापना महत्वपूर्ण है।

हम विभिन्न सामग्रियों के लिए सेल-सामग्री इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए अलग-अलग डेटा एकत्र कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, जैसा कि पूरक तालिका 1 में दिखाया गया है, एमजी मिश्र धातु पानी के साथ प्रतिक्रिया करके नीचा दिखाते हैं, और गिरावट उत्पादों में Mg2 + और OH- आयन, H2 गैस, और कुछ अन्य अघुलनशील गिरावट उत्पाद जैसे Mg (OH) 2 शामिल हो सकते हैं। XRD, SEM, और EDX, जिसका उपयोग सामग्री पर गठित खनिज जमाव को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। हम सेल व्यवहार पर माध्यम में Mg2 + आयनों और पीएच मूल्यों की एकाग्रता के प्रभावों का अध्ययन कर सकते हैं। इसके अलावा, हम धातु के क्षरण के दौरान गैस विकास का अध्ययन करने के लिए इन परिणामों का उपयोग कर सकते हैं। इन विट्रो अध्ययनों ने एच 2 गैस के महत्वपूर्ण सहिष्णुता स्तर को <0.01 एमएल / सेमी 2 / दिन होने की सूचना दी है, और यह अस्थायी प्रत्यारोपण अनुप्रयोगों के लिए मैग्नीशियम मिश्र धातुओं को स्क्रीन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। अनिवार्य रूप से, गैस विकास की मात्रा मैग्नीशियम मिश्र धातुओं की गिरावट दर पर निर्भर करती है। एक अन्य उदाहरण में, PLGA पानी की उपस्थिति में अपने एस्टर लिंकेज के हाइड्रोलिसिस के कारण degrades। लैक्टिक एसिड और ग्लाइकोलिक एसिड के क्षरण उत्पादों, साथ ही साथ माध्यम में पीएच मूल्यों का अध्ययन सेल-सामग्री इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। इस लेख में वर्णित विधियों में सेल संस्कृति मीडिया में जारी किए गए आयनों और पीएच मूल्यों का माप और सामग्री का बड़े पैमाने पर परिवर्तन शामिल है, जिसका उपयोग सामग्री की गिरावट दर का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।

विभिन्न सामग्री आमतौर पर विट्रो में और विवो में अलग-अलग व्यवहार करती हैं, और साइटोकॉम्पैटिबिलिटी अध्ययन के तरीकों को आवेदन वातावरण और सामग्री प्रकार के आधार पर चुना जाना चाहिए। आर्थोपेडिक अनुप्रयोगों के लिए, प्रासंगिक हड्डी कोशिकाओं और प्रत्यारोपण के बीच बातचीत का मूल्यांकन करना वांछनीय है जब वे एक दूसरे के साथ सीधे संपर्क में होते हैं। प्रत्यक्ष संस्कृति विधि का उपयोग नई बीज वाली कोशिकाओं और प्रत्यारोपण के बीच बातचीत की जांच करने के लिए किया जा सकता है। कार्डियोवैस्कुलर अनुप्रयोगों में, जैसा कि स्थापित कोशिकाएं प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से प्रत्यारोपित स्टेंट सामग्री के संपर्क में आएंगी, प्रत्यक्ष एक्सपोजर संस्कृति और एक्सपोजर संस्कृति विधियों का उपयोग कार्डियोवैस्कुलर अनुप्रयोगों के लिए बायोडिग्रेडेबल धातुओं की साइटोकॉम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। हमारा मानना है कि इस लेख में वर्णित इन विट्रो विधियां बायोडिग्रेडेबल इम्प्लांट सामग्री की साइटोकॉम्पैटिबिलिटी के लिए प्रारंभिक सबूत प्रदान करने के लिए संभव हैं। संस्कृति विधियों को विभिन्न अवक्रमण तंत्र, उत्पादों और दरों के साथ विभिन्न सामग्रियों के लिए संशोधित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न सामग्रियों के लिए कृषि समय को विभिन्न सामग्री प्रकारों की विभिन्न गिरावट दरों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। विभिन्न परिणामों को विभिन्न अवक्रमण तंत्र और सामग्री के उत्पादों के आधार पर एकत्र किया जा सकता है।

संक्षेप में, कोशिकाओं, माध्यम और नमूना सामग्री का गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है, इन विट्रो सेल संस्कृति से पहले और बाद में, बायोडिग्रेडेबल इम्प्लांट सामग्री और साइटोसोसंगिटी पर उनके गिरावट उत्पादों के प्रभावों को समझने के लिए। इस लेख में प्रस्तुत तीन संस्कृति विधियों का उपयोग बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर, सिरेमिक और चिकित्सा प्रत्यारोपण और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए धातुएं शामिल हैं। ये इन विट्रो सेल अध्ययन बायोडिग्रेडेबल सामग्रियों की स्क्रीनिंग के लिए मूल्यवान हैं, उत्पाद विकास के शुरुआती चरण में प्रत्यारोपण योग्य उपकरणों और मचानों के डिजाइन को अनुकूलित करते हैं, और कोशिकाओं के लिए संभावित विषाक्तता को कम करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ सीबीईटी पुरस्कार 1512764 और एनएसएफ पीआईआरई 1545852), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच एनआईडीसीआर 1R03DE028631), कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (यूसी) रीजेंट्स संकाय विकास फैलोशिप, और अनुसंधान बीज अनुदान (हुइनान लियू) पर समिति, और यूसी-रिवरसाइड शोध प्रबंध अनुसंधान अनुदान (जियाजिया लिन) से वित्तीय सहायता की सराहना की। लेखकों ने XRD उपकरणों के उपयोग के लिए SEM / EDS और डॉ पेरी चेउंग के उपयोग के लिए यूसी-रिवरसाइड में उन्नत माइक्रोस्कोपी और माइक्रोएनालिसिस (CFAMM) के लिए केंद्रीय सुविधा की सराहना की। लेखक भी आंशिक संपादन के लिए थान Vy गुयेन और Queenie Xu की सराहना करते हैं। लेखक भी वीडियो के लिए कथन रिकॉर्ड करने के लिए सिंडी ली को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस लेख में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष, या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन या राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के विचारों को प्रतिबिंबित करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL serological pipette VWR 490019-704
12-well tissue-culture-treated plates Thermo Fisher Scientific 353043
15 mL conical tube (Polypropylene) VWR 89039-666
18 G needle BD 305196
25½ G needle BD 305122
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) Invitrogen D3571
50 mL conical tube (Polypropylene) VWR 89039-658
70 μm nylon strainer Fisher Scientific 50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidin Life technologies A12379
Biological safety cabinet LABCONCO Class II, Type A2
Centrifuge Eppendorf Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Clear Fused Quartz Round Dish AdValue Technology FQ-4085
CO2 incubator SANYO MCO-19AIC
CoolCell Freezer Container Corning 432000 foam container designed to regulate temperature decrease
Cryovial Thermo Fisher Scientific 5000-1020
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5648
EDX analysis software Oxford Instruments AztecSynergy
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) FEI 50mm2 X-Max50 SDD
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Inc. SH30910
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti
Formaldehyde VWR 100496-496
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
ImageJ software National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductively coupled plasma
optical emission spectrometry (ICP-OES)		 PerkinElmer Optima 8000
Optical microscope VWR VistaVision
Penicillin/streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific, Inc., 15070063
pH meter VWR model SB70P
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 97062-730
Scanning electronic microscope (SEM) FEI Nova NanoSEM 450
surgical blade VWR 76353-728
Tissue Culture Flasks VWR T-75, MSPP-90076
Transwell inserts Corning 3460
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) Sigma-Aldrich T4049
X-ray diffraction instrument (XRD) PANalytical Empyrean Series 2

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References

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Xu, C., Chen, Y., Lin, J., Liu, H. H. Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro. J. Vis. Exp. (182), e63065, doi:10.3791/63065 (2022).

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