Summary
이 프로토콜은 고처리량 96웰 고정 뚜껑 정적 생물막 스크리닝을 위해 자체 조립된 딥 웰 PCR 플레이트 장치를 사용하여 생물막 성장 및 바이오매스 측정을 수행하는 방법론을 제시합니다.
Abstract
박테리아 생물막은 종래의 항균 개입을 사용하여 표면으로부터 박멸하기가 어렵다. 고처리량 96웰 마이크로플레이트 방법은 최소한의 생물막 박멸 농도(MBEC) 값을 계산하기 위해 신속한 항균 감수성 테스트를 위해 박테리아 바이오필름을 배양하는 데 자주 사용됩니다. 표준 바이오필름 장치는 96웰 마이크로플레이트에 장착된 폴리스티렌 고정 뚜껑으로 구성되며 생물막 바이오매스 및 MBEC 값 측정에 이상적이지만 이러한 장치는 바이오매스 축적 및 비용에 사용할 수 있는 페그 표면적에 의해 제한됩니다. 여기에서는 자체 조립 폴리프로필렌 96웰 딥 웰 PCR 플레이트 고정 뚜껑 장치를 사용하여 에스케리치아 콜리 BW25113 및 슈도모나스 aeruginosa PAO1 생물막을 성장시키는 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 크리스탈 바이올렛 바이오매스 염색 및 MBEC 결정 검정을 사용하여 각 종별로 표준 및 딥 웰 장치 상에서 형성된 24시간 생물막의 비교가 기재되어 있다. 깊은 우물 장치의 더 큰 표면적은 두 종 모두에 의해 전체 생물막 형성을 2-4 배 증가시킬 것으로 예상되었다. P. aeruginosa는 표준 장치에 비해 깊은 우물 못에서 훨씬 더 큰 바이오 매스 / mm2 를 형성했습니다. 대장균 은 딥 웰 장치에 비해 표준 폴리스티렌 장치에서 더 큰 바이오 매스 / mm2 를 가졌습니다. 차아염소산나트륨(표백제) 또는 염화벤잘코늄(BZK)과 같은 소독제를 사용한 생물막 박멸 분석은 두 화합물 모두 두 장치 모두에서 대장균 과 P. aeruginosa 생물막을 제거할 수 있지만 MBEC 값은 다르다는 것을 보여주었습니다. BZK 생물막 박멸은 장치 간에 가변 대장균 MBEC 값을 초래했지만, 표백제는 종 및 장치 둘 다에 대해 재현 가능한 MBEC 값을 입증하였다. 이 연구는 더 많은 양의 정적 생물막이 필요한 다운스트림 연구를 위해 폴리프로필렌 장치에서 다량의 생물막을 성장시키기 위한 높은 처리량의 깊은 우물 방법을 제공합니다.
Introduction
슈도모나스 aeruginosa와 Escherichia 콜라이는 그람 음성 프로테오박테리아로, 생물막1로 알려진 세실, 표면 부착 세포 군집을 형성하는 능력에 대해 일반적으로 연구되고 있습니다. 두 종 모두 생물막으로 성장할 때 주로 다른 다당류 및 단백질로 구성된 세포외 고분자 물질 (EPS)의 매트릭스를 분비 할 수 있으며, 이는 세포 외 DNA 및 / 또는 지질을 포함 할 수있어 가혹하고 영양이 제한된 환경에서 추가적인 세포 보호와 향상된 생존을 제공합니다2,3. 두 종에 의한 생물막 생리학 및 형성은 캐나다의 병원 환자 혈액, 요로 및 폐 감염으로부터 가장 일반적으로 격리 된 항균 내성 병원균 상위 5 개를 대표하기 때문에 임상 적 관련성이 있습니다4,5. 생물막은 이러한 박테리아 종에 의해 야기되는 모든 만성 및 재발성 감염의 거의 80%를 구성하는 것으로 추정된다는 점도 유의하는 것이 중요하다6. 분비된 EPS 물질과 느린 대사 활성7,8로 인해, 확립된 생물막은 이식된 의료 기기, 흉터 조직 및 낭포성 섬유증 환자의 폐에서 형성될 때 근절하기가 더욱 어려워지며9,10, 항균 내성이 추가된다.
박테리아 생물막의 반발성 성장 특성은 종종 항균 억제 및/또는 박멸에 더 저항력을 갖게 한다2,9. 따라서, 박테리아 생물막 항균 박멸을 연구하기 위한 시험관내 방법을 확립하는 것은 의료용 플라스틱(예를 들어, 내주 카테터) 및 의료용 임플란트 상에 형성될 때 감염을 근절하기 위한 효과적인 화합물을 선택하는 데 가장 중요하다. 대부분의 신속한 시험관내 생물막 항균 박멸 배양 방법은 생물막 성장을 "연속적인" 배양이 아닌 "정적" 생물막 배양으로 검사하며, 여기서 정적 박테리아 성장은 동일한 성장 배지에서 짧은 (24-96 h) 기간에 걸쳐 생물막 형성의 초기 내지 후기 단계에서 모니터링된다. 연속 생물막 방법은 챔버에서 성장한 더 긴 기간에 걸쳐 생물막 성장을 평가해야 하기 때문에 신속한 분석을 위해 번거로운 방법이며, 이는 더 적은 반복실험으로 성장 배지의 지속적인 흐름 및 교체를 허용한다11. 연속 생물막을 유지하고 확립하는 데 필요한 시간과 노력으로 인해 정적 시험관 내 생물막이 가장 인기가 있는데, 이는 동시에 테스트되는 배양물의 수를 제한하는 정교한 유동 챔버 시스템보다는 플라스틱 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 고처리량 항균 감수성 테스트 분석법에 쉽게 적응하기 때문에 12,13 . 가장 간단한 정적 "인웰" 바이오필름 마이크로플레이트 분석은 표준 폴리스티렌 또는 비닐(300μL 용량) 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 각 웰의 측면과 하단에 생물막 형성을 측정하고 종종 공기와 액체 표면 계면에서 고리로 사용됩니다. 박테리아 인-웰 생물막 형성은 성장 배지 액체가 제거되고 생물막이 세척된 후에 웰에 부착된 침착된 바이오매스를 염색함으로써 측정된다12,13. 이러한 분석은 경제적으로 인기가 있지만 침착 된 생물막은 세포 회수 및 바이오 매스 염색 절차11,14를 위해 헹굼하는 동안 손상 또는 손실되기 쉽기 때문에 고유 한 설계로 인해 재현성 문제가 종종 있습니다.
생물막 손실을 감소시키기 위해, 표준 상용 바이오필름 장치는 본원에서 "표준 생물막 장치"로 지칭되는 표준 96 인웰 플레이트 설계에 삽입가능한 96-웰 페깅된 폴리스티렌 뚜껑을 추가함으로써 인웰 바이오필름 마이크로플레이트 설계시 개선되었다. 고정된 뚜껑을 추가하면 각 마이크로플레이트 웰에서 사용 가능한 표면적이 확장되어 표면 부착성 및 생물막 바이오매스 형성이 향상됩니다15,16. 표준 생물막 고정 뚜껑 장치는 고정된 뚜껑이 약물 또는 성장 조건 문제를 포함하는 새로운 마이크로타이터 플레이트에 삽입될 때 후속 항균 생물막 감수성 및 박멸 테스트를 위해 더 큰 생물막 회수, 제거 및 헹굼을 가능하게 합니다. 인웰 생물막 마이크로플레이트 기술과 유사하게, 제거되고 세척된 고정된 뚜껑 장치로부터 회수된 물질은 전형적으로 크리스탈 바이올렛(CV) 염료 제형(17,18,19)을 수반하는 세포 생존 시험 및 생물막 바이오매스 염색을 허용한다. 표준 생물막 장치는 또한 생물막 항균 감수성을 스크리닝하는 데 최적입니다. 이들 분석은 두 가지 방법으로 생물막 성장 억제를 모니터링한다: 1) 성장 초기에 항균제가 세포에 첨가될 때, 최소 생물막 억제 농도(MBIC) 값을 결정할 수 있다. 2) 항균제에 노출시킨 후 24시간 후에 못 위에 생물막이 형성되어 확립되면, 최소 생물막 박멸농도(MBEC) 값 17,20을 결정할 수 있다. 인웰 바이오필름 마이크로플레이트 장치와 유사하게, 표준 생물막 장치는 장치당 높은 비용, 비오토클레이브 가능, 사용된 폴리스티렌 플레이트 재료로 인해 화학 용매에 대한 내구성이 떨어지는 것과 같은 몇 가지 주목할 만한 한계가 있습니다. 표준 생물막 장치는 또한 페그 비율에 대한 표면적이 낮기 때문에 각 웰의 최대 작업 부피를 200μL로 제한합니다. 이러한 요인들은 표준 생물막 장치를 높은 처리량 형식으로 더 많은 양의 생물막을 요구하는 연구에 사용하기가 더 어렵게 만들 수 있습니다.
여기에서, 우리는 표준 플레이트보다 더 깊은 웰을 갖는 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 장착된 시판되는 폴리프로필렌 세미스커트된 0.5 mL 96-웰 PCR 플레이트를 사용하여 우리 실험실에서 개발된 정적 생물막 고정-뚜껑 96-웰 방법을 설명한다(Table of Materials). 이들 조립된 장치는 생물막 성장에 사용될 때 750 μL의 최대 작동 부피를 갖는다(본원에서 "딥웰 생물막 장치"로 공지됨). 이러한 딥 웰 바이오필름 장치를 사용할 때의 장점은 표준 생물막 장치와 비교할 때 비용이 저렴하고, 오토클레이빙으로 멸균할 수 있으며, 더 큰 외부 PCR-플레이트 "튜브/페그"에서 생물막 형성을 위한 표면적을 증가시킨다는 것입니다. 이 방법을 통해 우리는 Escherichia coli BW25113 및 P. aeruginosa PAO1에 의해 형성된 생물막 바이오 매스를 성장 및 특성화하기위한 이러한 장치의 응용 프로그램을 보여줍니다. 생물막 박멸 검정을 사용하여 MBEC 값을 결정하는 방법은 사차 암모늄 화합물 소독제 벤즈알코늄 클로라이드(BZK) 및 차아염소산나트륨(표백제) 항균제를 사용하여 기술된다. 소독제 BZK는 이 화합물이 오염된 표면으로부터 생물막을 억제하는 데 자주 사용되기 때문에 선택되었지만, 잘 확립된 생물막을 근절하는 데는 덜 효과적이라고 한다21. 표백제는 확립 된 생물막의 박멸에 매우 효과적인 화학 물질이며 화학 소독 22의 주류입니다. 두 소독제 모두 각 생물막 장치21에 대한 MBEC 값의 유용한 비교를 제공한다. MBEC 결정을 위한 CV 염색 및 생물막 박멸 검정을 이용한 이러한 생물막 장치 평가를 위한 프로토콜이 이 기사에 요약되어 있다. 이러한 메서드에 대한 워크플로를 간략하게 설명하기 위해 프로토콜 순서도가 포함되어 있습니다(그림 1).
Protocol
1. 생물막 성장을 위한 무균 배양 준비(일 0-1일)
- 0일째에, 냉동 보존된 스톡(글리세롤 또는 디메틸설폭사이드(DMSO)에서)으로부터 시험을 위해 원하는 박테리아 균주(들)를 균주가 필요로 하는 항균성 선택과 함께 영양 한천 플레이트 상에 직접 줄무늬를 놓는다. 균주 성장을 위해 아가 플레이트를 최적 온도 (37°C) 및 시간 (18-22 h)에서 인큐베이션한다.
- 다음날(Day 1)에, 한천 플레이트로부터의 콜로니를 최적의 성장 조건에서 성장 배지 5 mL에 접종한다. 이들 배양물은 생물막 장치에 대한 접종 개시 제2일째로서 사용될 것이다(단계 2.2 참조; 그림 1).
참고: 본 연구를 위해, 대장균 K-12 BW21153 및 P. aeruginosa PAO1을 분당 160 회전(rpm)에서 진탕하면서 37°C에서 18시간 동안 루리아-베르타니(LB) 배지에서 성장시켰다.- 고정된 뚜껑 장치 상에서 생물막 바이오매스 형성의 통계적 가변성으로 인한 생물막 측정을 위한 생물학적 반복실험을 생성하기 위해 적어도 3개의 독립적으로 배양된 균주를 준비한다.
2. 플레이트의 제조 및 접종 (2 일째)
- 오토클레이브 96웰, 1.1mL/웰 폴리프로필렌 플레이트의 외부 웰을 750μL/웰 멸균수로 채웁니다(그림 2A). 음성 대조군 웰 (접종되지 않은 배지 웰; 컬럼 B)을 750 μL 성장 배지로 채우고 나머지 웰을 675 μL 성장 배지로 채운다.
참고: 위의 단계 2.1 및 아래 단계는 깊은 우물 생물막 장치에 대한 적절한 볼륨을 나열합니다. 표준 생물막 장치를 사용하는 경우, 부피는 다음과 같이 변화되어야 한다: 75 μL의 접종 배양물을 20 μL; 675 μL의 성장 배지 내지 180 μL; 750 μL 내지 200 μL의 멸균수/성장 배지; 800 μL의 CV 염색/아세트산/헹굼 용액을 210 μL로 헹구십시오. 추가적으로, 아래의 단계 3.6의 경우, 표준 생물막 장치 마이크로플레이트를 사용할 때 혼합한 후 500nm(A550nm)에서의 흡광도를 폴리스티렌 마이크로플레이트에서 직접 판독할 수 있습니다. - 제1일 밤새 배양물을 사용하여, 배양물을 600 nm (OD600nm) = 1.0의 광학 밀도 또는 0.5-1 유닛의 맥팔랜드 표준으로 표준화한다.
- 10-3 희석액에 도달할 때까지 시험관 또는 96-웰 딥 웰 마이크로타이터 플레이트에서 각각의 표준화된 배양물의 10배 연속 희석물을 생성한다.
- 도 2B에 나타낸 바와 같이 웰을 함유하는 배지를 1 x 10-3 희석된 배양물의 75 μL에 접종하고, 10-4의 최종 웰 내 박테리아 희석을 위해 접종한다.
- 오토클레이브된 PCR 플레이트(고정된 뚜껑)를 접종된 깊은 웰 플레이트에 조심스럽게 삽입한다. 플레이트를 최적의 변형 조건 (37 °C)에서 진탕 (최대 160 rpm)으로 24 시간 동안 습도 50-60 %의 인큐베이터에서 인큐베이션하십시오.
3. CV 염색을 이용한 장치로부터의 바이오필름 바이오매스 측정(Day 3)
- 무균적으로 각 장치로부터 생물막 고정된 뚜껑을 제거하고, 800 μL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)/웰로 준비된 오토클레이브 깊은 웰 플레이트에 삽입하여 30초 동안 헹구어 플랑크톤 세포를 제거하였다.
- 바이오매스 CV 염색을 위해, 고정된 PCR 플레이트 뚜껑을 dH2O의 800 μL/웰 0.1% (w/v) CV로 준비된 새로운 플레이트로 옮기고 5분 동안 염색한다.
- 800 μL/웰 멸균 PBS로 제조된 깊은 웰 플레이트에서 고정된 뚜껑을 헹구어 과도한 얼룩을 제거하십시오. 플레이트를 위쪽을 향한 못이있는 생물 안전 캐비닛에서 10 분 동안 말리십시오.
- 건조된 PCR 플레이트 뚜껑을 800 μL/웰 30%(v/v) 아세트산을 함유하는 플레이트로 옮기고 뚜껑이 5분 동안 탈염색되도록 하십시오.
- 얼룩덜룩 한 PCR 못 뚜껑을 제거하고 피펫팅으로 용액을 완전히 혼합하십시오. 200 μL를 딥 웰 플레이트로부터 표준 96 웰 마이크로플레이트로 옮기고, 자외선(UV)/가시광선(Vis) 범위 마이크로플레이트 리더에서 파장 550 nm(A550nm)에서 탈염색 용액의 흡광도를 측정하였다.
- 측정된 A550nm 값을 사용하여, 각 생물막 샘플 값으로부터 평균 블랭크(음성 대조군) A550nm 값을 뺍니다. 생물학적 반복실험 샘플을 나타내는 각각의 블랭크-뺀 A550nm 생물막 샘플 값을 평균화한다.
4. 항균제를 사용한 생물막에 도전하여 24시간 항균성 MBEC 값을 계산합니다(3일차)
- 시험하고자 하는 원하는 최고 항균 농도의 2배(2x) 농도가 되는 물에 항균 원액을 준비한다.
- 항균 원액의 2배 희석 시리즈를 2x 농축된 성장 배지에 만들어 8개의 항균 농도가 되도록 한다.
- 그림 2B에 표시된 것처럼 오토클레이브 깊은 우물 플레이트의 외부 웰을 750μL/웰 멸균수로 채웁니다. 플레이트의 컬럼 B (음성 대조군, 박테리아 없음) 및 C (양성 대조군, 항균 노출 없음)를 750 μL / 웰 성장 배지로 채 웁니다. 나머지 웰을 그림 2B와 같이 750μL/웰의 항균 희석 시리즈로 채웁니다.
- 단계 3.1에 설명된 대로 고정된 뚜껑을 제거하고 헹구고 이를 항균 챌린지 플레이트로 옮깁니다.
- 플레이트를 적절한 변형 조건 및 원하는 노출 시간 동안 진탕 (최대 160 rpm)으로 인큐베이션하십시오.
5. 고정된 뚜껑에서 생물막 바이오매스의 회수(4일차)
- 항균성 노출된 고정된 뚜껑을 제거하고 단계 3.1에 설명된 대로 헹구십시오. 고정된 뚜껑을 내부 웰에 750μL/웰 회수 매체가 있고 외부 웰에 750μL/웰 멸균 dH2O가 있는 깊은 웰 플레이트로 옮깁니다.
- 70 mL 회수 배지를 준비하려면 35 mL의 2x 농축 LB, 0.7 mL의 100% 트윈-20, 3.5 mL의 20x 범용 중화 용액 및 30.8 mL의 멸균 dH2O를 멸균 병에 담으십시오.
- 20x 농축된 범용 중화 용액을 제조하기 위해, 1.0 g의 L-히스티딘, 1.0 g의 L-시스테인, 및 2.0 g의 환원된 글루타티온을 dH2O의 최종 부피 20 mL에 첨가한다.
- 5.1 단계의 장치를 초음파 처리 수조 내부에 장착 된 보조 용기에 넣으십시오. 장치를 30 분 동안 초음파 처리하여 생물막을 못에서 회수 매체로 분리하십시오.
- 초음파 처리 후, 고정 된 뚜껑을 제거하고 깊은 우물 복구 미디어 플레이트에 멸균 평판 덮개 뚜껑을 놓습니다. 고정 된 뚜껑은 폐기 할 수 있습니다.
- 플레이트를 최적의 균주 성장 조건에서 단계 5.3으로부터의 회수 배지와 함께 밤새 인큐베이션한다 (16-18 h).
6. 장치 MBEC 값 결정 (5 일째)
- 다음날, 인큐베이션된 딥 웰 플레이트의 각 웰로부터 200 μL를 단계 5.4로부터 새로운 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮긴다. UV/Vis 범위 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 OD600nm 를 판독합니다.
- 음성 대조군(접종되지 않은 블랭크) OD600nm 값을 샘플 웰을 함유하는 각 생물막으로부터 뺍니다.
- OD600nm 값을 사용하여 각 샘플에 대한 MBEC 값을 계산합니다. 여기서 MBEC 값은 특정 항균 처리 종/균주 샘플에 대해 가장 낮은 OD600nm 값(접종되지 않은 대조군과 구별할 수 없음)을 초래한 가장 낮은 항균 농도입니다.
Representative Results
이 연구의 목적은 딥 웰 생물막 장치를 사용하여 더 큰 부피, 높은 처리량 (96-well), 정적 생물막 장치 측정을 수행하는 방법을 제공하는 것이 었습니다. 여기서, 우리는 딥 웰 장치로 알려진 딥 웰 마이크로플레이트에 삽입된 자체 조립된 세미 스커트 PCR 플레이트를 정적 바이오필름을 형성하는 그들의 능력을 조사하기 위해 일반적으로 사용되는 표준 바이오필름 고정 뚜껑 장치와 비교하였다. CV-염색된 바이오매스 및 생물막 박멸 분석법(MBEC)을 사용하여 두 장치 모두에 의한 생물막 형성을 평가하였다.
각 장치 상의 상이한 종에 의한 생물막 형성을 비교하기 위해, 생물막 CV 염색 프로토콜17을 사용하여 대장균 BW25113 및 P. aeruginosa PAO1에 의해 형성된 생물막 바이오매스를 평가하였다. CV 염색은 일반적으로 A550nm 값으로 보고되지만, 각 장치의 성장 부피와 사용 가능한 표면적의 차이로 인해 CV 염색 A550nm 값을 용액 중의 몰 CV 농도로 변환했습니다. 몰 CV 농도는 각 장치의 부피 차이를 설명하고, 각 장치로부터 회수된 바이오매스를 나타내는 CV 농도의 비교를 허용하였다. 그 결과, 두 종 모두 표준 생물막 장치에 비해 딥웰 생물막 장치(2.1배 대장균; 4.1배 P. aeruginosa)에서 유의하게 더 많은 바이오매스를 생산한다는 것을 보여주었다(도 3A-B). 이러한 결과는 표준 디바이스 페그 표면적(108.9 mm2)과 비교하여 딥 웰 PCR 페그(320.4 mm2)의 더 큰 표면적을 고려할 때 예상되었다. 이러한 발견은 또한 표준 장치 웰 (200 μL)과 비교하여 딥 웰 생물막 장치에 사용된 증가된 부피 (750 μL)와 일치한다. 따라서 딥 웰 장치는 표준 생물막 장치를 사용하는 더 작은 못과 비교하여 PCR 튜브 페그에서 바이오 필름 바이오 매스 축적을 증가 시켰습니다.
두 생물막 장치 모두 대장균과 P. aeruginosa에 의해 형성된 생물학적으로 복제된 생물막을 비교했을 때 재현 가능한 생물막을 형성하였다(도 3A-B). 딥 웰 디바이스 상에서 성장한 균주에 대한 기술적 복제 CV-염색된 M A550nm 값에서 더 큰 가변성을 관찰했음에도 불구하고, 쌍방향 양방향 분산 분석(ANOVA) 또는 스튜던트 T-검정(둘 다 p > 0.05). 이 발견은 깊은 우물과 표준 장치에 의한 생물막 형성이 재현 가능한 생물막을 형성한다는 것을 보여줍니다. 그러나, CV 염색 결과 또한 각 장치에서 페그 표면적 차이를 고려하였을 때, 대장균과 P. aeruginosa에 의한 생물막 바이오매스 형성은 바이오매스 축적에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다(표 1). 대장균에 대한 평균 CV 염색된 바이오매스(M)당 mm2(CV M/mm2)의 페그 표면적을 계산한 결과, 표준 생물막 장치와 비교했을 때 폴리프로필렌 딥 웰 장치에서 생물막 형성이 1.5배 더 낮았다(표 1). 그러나, P. aeruginosa에 대해서는 반대의 결과가 얻어졌으며, 이는 표준 생물막 장치와 비교했을 때 폴리프로필렌 딥 웰 장치에서 1.4배 더 높은 CV M/mm2를 입증하였다(표 1). 각 장치를 이용한 생물막 바이오매스 축적에서 관찰된 종별 차이에도 불구하고, 딥 웰 장치는 여전히 각 종에 의한 생물막 바이오매스 형성 전체(2-4배 증가)가 더 크다는 것을 입증하였다(도 3).
딥 웰 생물막 장치의 항균 감수성 테스트 응용을 결정하기 위해, 우리는 생물막 박멸 잠재력에 대해 일반적으로 사용되는 두 가지 소독제인 BZK와 표백제를 비교했습니다. 두 화학 물질 모두 임상 및 산업 응용 분야에서 박테리아 생물막을 예방 (BZK) 및 / 또는 근절 (표백)하는 데 일반적으로 사용됩니다.21,22,23. 각 화합물은 표준 및 딥웰 생물막 장치 상에서 대장균 및 P. aeruginosa에 의해 형성된 생물막에 2배 증가된 농도로 첨가되었다22,23 (도 1, 2B). 음성 대조군 웰과 구별할 수 없는 OD600nm 값을 초래한 BZK 또는 표백제의 최저 농도는 MBEC 값으로 정의되었다. 표백제를 사용한 표준 생물막 장치 상에 형성된 생물막의 처리는 대장균 및 P. aeruginosa에 대해 0.625%의 동일한 표백제 MBEC 값을 초래하였다(표 1, 도 4A-B). 깊은 우물 장치 상에서 형성된 대장균 및 P. aeruginosa 생물막에 대해 결정된 표백제 MBEC 값은 두 종 모두에 의해 2-4배 더 낮은 MBEC 값을 나타냈다 (E. coli; 0.156%; P. aeruginosa 0.313%)는 표준 장치와 비교하였을 때(표 1). 종 간 표백제 MBEC 값의 2배 차이는 딥 웰 장치에 대해 주목되었고, 여기서 P. aeruginosa는 대장균과 비교하여 생물막을 근절하기 위해 2배 더 높은 농도의 표백제를 필요로 하였다(도 4A-B, 표 1). 깊은 우물 장치에서 P. aeruginosa와 대장균 사이의 2배 표백제 MBEC 차이는 대장균과 비교하여 P. aeruginosa에 의한 1.5배 증가된 CV 염색된 바이오매스 형성과 반비례하는 상관관계가 있는 것으로 보인다(도 3A-B). 깊은 우물 장치 못 상의 P. aeruginosa에 의해 형성된 더 많은 양의 바이오매스는 또한 깊은 우물 상의 대장균과 비교했을 때 P. aeruginosa 생물막을 근절하기 위해 더 높은 표백제 농도가 요구되었던 이유를 설명할 수 있다(도 3A-B, 표 1). 따라서, 딥 웰 장치 생물막 박멸 분석은 두 종 모두 표백제에 취약하지만 표준 장치에 비해 더 낮은 (2-4 배) 표백제 농도에서 있음을 보여줍니다. 이것은 딥 웰 디바이스 PCR 플레이트 페그의 3배 더 큰 페그 표면적 및 부피와 반비례하여 상관관계가 있다. 이것은 표백제 노출에 대해, 더 큰 바이오매스 표면적이 생물막 박멸에 필요한 표백제 농도를 낮출 수 있음을 시사한다.
BZK 생물막 박멸 시험은 표백제 결과와 비교했을 때 각 종별 회수 성장 (OD600nm 값) 및 MBEC 값에서 더 큰 변동성을 보였다 (도 4C-D). 이러한 가변성은 BZK가 잘 확립된 생물막을 근절하는 것보다 생물막 형성을 방지하는 데 더 효과적이었다는 것을 보여주는 이전 연구에 근거하여 예상치 못한 것이 아니다24,25,26. 표준 생물막 장치를 사용하여, BZK로 처리된 P. aeruginosa 생물막만이 딥 웰 장치에서 이 균주에 대해 수득된 MBEC 값(20480 μg/mL)보다 8배 낮은 일관된 MBEC 값(2560 μg/mL)을 나타냈다(표 1, 도 4C). 이러한 결과는 표준 장치 못과 비교했을 때 깊은 웰 페깅된 표면 및 플라스틱 조성물 상에 형성된 P. aeruginosa 바이오매스의 양의 차이를 반영할 수 있다. 깊은 우물과 표준 장치 모두에서 대장균에 의해 형성된 생물막의 BZK 박멸은 똑같이 열악하여 깊은 우물 장치의 경우 2560-40960 μg / mL, 표준 장치의 경우 320-10240 μg / mL의 광범위한 BZK MBEC 값을 초래했습니다 (그림 4D). 대장균의 경우, 이러한 가변성은 1-2 복제 웰이 회복 매질에서 낮지만 통계적으로 유의한 성장을 보였으며, 두 장치 중 하나에서 오차가 증가하고 BZK MBEC 결정 정확도가 감소하는 간헐적 인 사례에 의해 설명되었습니다 (그림 4D, 표 1). 이러한 가변성은 이전에 연구24,25,26에서 언급한 바와 같이 대장균 생물막을 근절하는데 BZK를 사용하는 것의 비효율성을 강조한다. 대조적으로 P. aeruginosa 생물막은 두 장치 모두에서 정의 된 농도에서 BZK에 의해 안정적으로 박멸 될 수 있지만 8 배 BZK 농도 차이 (그림 4C). 요약하면, P. aeruginosa에 의해 형성된 생물막의 BZK 박멸 MBEC 값은 각 장치와 별개의 MBEC 값을 보여주지만, 두 장치 모두 대장균을 구별하는데 있어서 동등하게 불량한 정확한 BZK 박멸 표현형을 나타낸다.
따라서, 본원에 기재된 딥 웰 생물막 장치 방법은 표준 생물막 장치와 비교할 때 재현가능한 생물막을 형성하는데 유사하게 효과적이다.
그림 1. 실험의 개략적인 개요. 냉동 보존 된 주식에서 단일 식민지의 0 일째 격리; 제1일차 성장 배지를 단일 콜로니로 접종; 제2일째 생물막 플레이트의 접종; 제3일 CV 염색 또는 항균성 챌린지; 제4일째 생물막 초음파 처리 회수 매질로; 및 5일째 MBEC 값을 결정하기 위해 회수 플레이트의 OD600nm를 판독한다. Servier Medical Art (smart.servier.com)에서 제공하는 그림의 일부 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 프로토콜의 다양한 단계에 대해 표시된 플레이트 레이아웃의 예. A ) 두 개의 박테리아 균주 (E. coli 및 P. aeruginosa)로부터의 제1 박테리아 배양물을 사용하여 초기 24 h 생물막 성장을 위한 최종 플레이트 셋업을, 각각 세 개의 생물학적 반복실험으로 설정한다. 음성 대조군 웰 (회색)은 멸균 대조군으로 사용됩니다 (박테리아가 추가되지 않음). B) 생물막의 항균 도전을 위한 플레이트 설정. 어두워지는 색상은 항균 농도가 증가한다는 것을 나타냅니다. 음성 대조군은 박테리아가 첨가되지 않은 웰 (회색)이며 양성 대조군은 항균 노출이없는 바이오 필름 (오렌지)입니다. 패널 A에서 가져온 생물막 못 뚜껑은 항균 노출을 위해 이 깊은 웰 플레이트로 옮겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. CV 염색된 대장균 BW25113의 몰농도(M)이다. (A) P. aeruginosa PAO1(B) 바이오필름 바이오매스를 표준(원) 및 딥 웰(삼각형) 장치로부터 회수하였다. CV 염색은 550 nm (A550nm)에서 CV의 흡광도를 판독하여 측정하였고, 딥 웰 A550nm 판독값은 장치 간의 부피 차이를 고려하여 3.809 (800 μL/210 μL)의 계수로 조정하였다. CV 몰 농도 (M)는 맥주-램버트 법칙 (CV 농도 = A550nm/εl)에 의해 결정되었다; 여기서 96 웰 편평한 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 210 μL의 경로 길이 (l)는 0.56 cm이고 251500 cm-1M-139의 A550nm에서 물에서 CV의 흡광 계수 (ε)로 측정되었다. 결과는 생물막으로서 성장한 각 균주의 세 가지 생물학적 반복실험으로부터 9개의 기술적 반복실험을 나타내며, 각 생물학적 복제물의 중앙값은 각 플롯에서 가로 막대로 표시된다. 장치들 사이의 바이오매스의 통계적으로 유의한 차이는 두 꼬리 쌍을 이룬 t-검정을 사용하여 생물학적 복제 중앙값 사이에서 결정되었다 (대장균 p= 0.008-0.018 (*); P. aeruginosa p= 0.002-0.009 (**))는 별표가 있는 막대로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 항균성 MBEC 농도의 결정. P. aeruginosa PAO1 (A, C) 및 대장균 BW25113 (B,D)에 대한 표백제 (A, B, D)에 대한 표백제 (A, B) 및 BZK (C,D)에 대한 항 균 성 MBEC 농도의 측정은 표준 (흰색 막대) 및 깊은 우물 (회색 막대) 생물막 고정 장치 상에서 성장하였을 때. 결과는 회수 배지 내로 초음파 처리 및 하룻밤 인큐베이션 후에 회수된 생물막의 OD600nm를 판독함으로써 결정되었다. 딥 웰 OD600nm는 장치들 사이의 부피 차이를 설명하기 위해 3.75 (750 μL/210 μL)의 계수에 의해 조정되었다. 결과는 세 가지 생물학적 반복실험으로 대표되며, 오차 막대는 각 항미생물 농도에서 반복실험 사이의 표준 편차를 보여준다39. 각 막대 플롯 위의 별표(*)는 두 꼬리 스튜던트 T-검정 계산을 사용하여 p-값이 0.05< 빈 대조군에서 OD600nm 값의 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 각 막대 플롯 위의 원 기호(o)는 1 또는 2번의 반복실험만이 빈 대조군으로부터 통계적으로 유의한 OD600nm 값을 갖는 측정값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| BZK MBEC (μg/mL) | 표백제 MBEC (% v / v) | |||
| 균주 테스트 | 깊은 우물 장치 | 표준 장치 | 깊은 우물 장치 | 표준 장치 |
| 대장균 BW25113 | 2560-40960 | 320-10240 | 0.156 | 0.625 |
| P. aeruginosa PAO1 | 20480 | 2560 | 0.313 | 0.625 |
| 깊은 우물 장치 | 표준 장치 | p-값** | 폴드 변경(딥 웰/표준) | |
| 균주 테스트 | 평균 CV M * / mm2 ± SD | 평균 CV M * / mm2 ± SD | ||
| 대장균 BW25113 | 1.99 x 10-8 ± 3.25 x10-9 | 3.03 x 10-8 ± 3.31 x 10-9 | 0.0176 | -1.52 |
| P. aeruginosa PAO1 | 8.01 x 10-8 ± 9.42 x 10-9 | 5.72 x 10-8 ± 9.42 x 10-9 | 0.034 | 1.4 |
표 1. 다양한 장치에서 BZK 및 표백제에 대한 대장균 BW25113 및 P. aeruginosa PAO1 평균 CV-염색된 바이오매스 M/mm2 값 및 생물막 박멸 MBEC 값의 요약이다.
*생물학적 복제 CV M 값의 중앙값을 사용하여 계산된 평균 CV M/mm2 값(그림 3).
**p-값은 두 꼬리 스튜던트 T-테스트를 사용하여 결정됩니다.
Discussion
본 연구는 생물막 형성을 위한 반스커트된 PCR-플레이트 뚜껑이 장착된 폴리프로필렌 딥 웰 마이크로플레이트를 포함하는 더 큰 부피 96-웰 고처리량 정적 생물막 성장 장치(deep well biofilm device; 자료의 표). 우리는이 장치로 생성 된 바이오 필름을 상업적으로 이용 가능한 폴리스티렌 표준 생물막 장치와 비교했습니다 (표 재료). 딥 웰 장치 방법은 딥 웰 장치를 위해 변형된 조정된 부피에서 표준 장치17과 동일한 방법론적 단계 및 솔루션을 사용하므로 이 장치는 대규모 생물막 형성 및 실험 분석에 이상적입니다. 생물막을 형성하는 것으로 알려진 두 개의 그람 음성 종인 대장균 BW25113과 P. aeruginosa PAO1의 성장은 두 장치 모두에서 바이오매스 형성 및 소독제(BZK/표백제) MBEC 값을 조사하였다. 각 장치로부터의 못 위에 형성된 CV 염색된 바이오매스의 비교는 표준 장치와 비교했을 때 대장균 및 P. aeruginosa 둘 다 깊은 우물 생물막 장치 상에서 더 높은 바이오매스를 갖는 생물막을 형성한다는 것을 보여주었다(도 3A-B). 증가된 생물막 바이오매스는 표준 장치 페그 표면적과 비교했을 때 깊은 우물 못의 더 큰 표면적을 반영하였다. 우리가 두 장치와의 페그 표면적 (mm2)의 차이를 설명 할 때, 바이오 매스 형성의 차이가 주목되었는데, 여기서 대장균은 깊은 우물 장치의 PCR 튜브 페그보다 폴리스티렌 표준 장치 못에서 mm2 당 훨씬 더 큰 CV 바이오 매스를 형성했습니다 (표 1). P. aeruginosa는 표준 장치와 비교하여 더 큰 CV 염색된 바이오매스/페그 mm2를 형성하였다(표 1). 이러한 발견은 상이한 장치에서의 생물막 바이오매스 형성의 종별 차이를 강조할 수 있다.
깊은 우물 장치 상의 대장균 및 P. aeruginosa 생물막의 표백제 박멸은 표준 장치보다 2-4배 낮은 농도에서 발생하였다는 점에 유의해야 한다(도 4A-B, 표 1). 각 장치에서 확인 된 표백제 MBEC 값의 차이는 장치 페그 모양의 차이 (깊은 우물 "못"은 테이퍼 튜브이고 표준 못은 원통형), 플라스틱 조성 차이 (폴리프로필렌 대 폴리스티렌) 및 부피 차이 (750 μL 대 200 μL)의 영향을받을 가능성이 큽니다. 예를 들어, P. aeruginosa는 표준 장치와 비교할 때 딥 웰 장치 페그에서 더 큰 CV M 바이오 매스 / mm2를 가졌지 만 대장균은 깊은 우물 못에서 바이오 매스가 적었습니다 (그림 3). 이는 생물막 박멸에 필요한 소독제 농도가 사용 가능한 표면적뿐만 아니라 각 종에 의해 형성된 바이오매스에 의해 영향을 받을 수 있음을 시사한다. 추가적으로, 장치 못 모양의 차이는 특정 종에 대한 다양한 성장 조건에 영향을 미칠 수 있다. 우리의 연구에서, P. aeruginosa는 더 큰 표면적과 폭기로 인해 깊은 우물 못에 더 큰 바이오 매스를 형성 할 수 있습니다.이 종은 교수진 혐기성 혐기성 인 대장균과는 달리 의무적 인 에어로브이기 때문입니다. 현재까지 우리는 폴리프로필렌27,28,29 및 폴리스티렌 30,31 물질 모두에서 대장균과 P. aeruginosa 생물막 형성을 함께 직접 비교한 발표된 연구를 확인하지 못했습니다. 그러나 견고한 대장균과 P. aeruginosa 생물막 형성에 대한 보고서는 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌 물질을 조사하는 독립적 인 연구에서 주목 받았다. 슈도모나드와 관련하여, 많은 슈도모나스 spp.는 폴리프로필렌과 같은 플라스틱을 잠재적인 탄소원으로 사용할 수 있다32. 따라서, 이러한 폴리프로필렌 딥 웰 생물막 장치의 가용성은 정적 생물막 연구에서 유용한 진보이다. 폴리프로필렌은 폴리스티렌보다 화학적으로 내구성이 뛰어나며 탈장 또는 골반 수술을 위한 의료용 임플란트, 봉합사 및 메쉬에 자주 사용되기 때문에 임상적으로 관련된 재료입니다33,34.
바이오필름 바이오매스가 두 장치 모두에 의해 형성되었지만, 딥 웰 디바이스는 표백제 및 BZK에 대한 CV 염색 방법 및 OD600nm 생물막 박멸 MBEC 값에 기초한 바이오매스에서 약간 더 높은 가변성을 가졌다. 이것은 3 가지 주요 요인으로 설명 될 수 있습니다 : 1) 딥 웰 장치는 표준 장치 못에 비해 기울어 진 표준 장치보다 더 큰 페그 표면적을 가지고 있습니다. 2) 테스트 된 두 종 모두 각 장치의 폴리프로필렌 및 폴리스티렌 물질을 부착 할 수있는 능력이 다를 수 있습니다. 3) 각 장치에 사용되는 성장 배지의 부피 (750 μL 깊은 우물, 200 μL 표준)와 웰 측벽에 삽입 된 페그 사이의 간격이 다릅니다. 이러한 문제는 모든 생물막 실험에 한 가지 유형의 장치만 사용된다면 문제가 되지 않지만, 두 장치가 모두 선택되면 차이점을 확인하기 위해 여기에서 수행한 비교를 수행해야 합니다36,37. 각 장치에 사용되는 플라스틱 재료의 차이로 인해 CV 염색 된 생물막 바이오 매스와 MBEC 값을 서로 다른 장치간에 직접 비교해서는 안됩니다. 그러나 방법과 실험이 동일한 장치 (깊은 우물 또는 표준)에서 수행되면 테스트 된 종과 항균제에 대해 얻은 결과는 비교할 수 있습니다.
이 프로토콜은 자체 조립된 깊은 우물 PCR 플레이트 장치가 생물막 형성 및 박멸을 측정하기 위한 더 큰 부피의 바이오필름 장치이며 또한 비용 효율적이라는 것을 보여준다. 비용 관점에서 볼 때, 96 잘 고정 된 뚜껑이있는 표준 바이오 필름 장치는 장치 당 $ 29-36 US USD (USD)로 소매 범위입니다 (재료 표). 폴리스티렌 표준 생물막 장치는 오토클레이브가 불가능하며 플라스틱 화학적 특성으로 인해 용제/산에 대한 내성이 떨어집니다. 본원에 기술된 자체 조립된 폴리프로필렌 딥 웰 플레이트는, 별도의 세미 스커트된 96 웰 PCR 플레이트(Table of Materials)를 장착하여 조립된 장치당 총 $14 USD의 비용이 들며, 이는 표준 생물막 장치 비용의 절반이다. 가격은 지역, 유통 업체 및 가용성에 따라 다를 수 있으며 기관 할인 후 비용은 $ 9 USD / 딥 웰 장치로 해결되었습니다. 이 자체 조립 된 깊은 우물 폴리프로필렌 PCR 플레이트 장치는 살균을 위해 오토클레이빙이 가능하다는 추가 장점이 있으며 표준 장치보다 2-4 배 더 많은 바이오 필름 바이오 매스를 제공합니다.
결론적으로, 이 프로토콜과 딥 웰 및 표준 바이오필름 디바이스의 생물막 성장 비교로부터의 대표적인 발견은 두 장치 모두 박테리아 생물막을 배양할 수 있지만, 깊은 웰 디바이스는 2-4배 더 많은 바이오필름을 형성한다는 것을 보여준다. 딥 웰 바이오필름 장치는 약물 감수성 스크리닝 연구와 같은 더 큰 부피의 고처리량 생물막 형성 실험을 위한 실행 가능하고 저렴한 대안을 제공합니다. 이 기술은 분석을 위해 다량의 생물막 물질을 필요로 할 수 있는 하류 '-omics' 추출(프로테오믹스, 대사체학, 전사체) 또는 실험적 분석(효소적, 형광성)에 유용한 생물막을 생성할 수 있다. 딥 웰 바이오필름 장치는 임상적으로 관련된 저비용, 더 큰 부피, 화학적으로 내구성이 강한 플라스틱 재료를 사용하여 고처리량 96웰 분석법에서 바이오필름을 연구하고자 하는 실험실에 권장됩니다.
Disclosures
저자는 공개 할 내용이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업에 대한 기금은 캐나다 디스커버리 그랜트 (RGPIN- 2016-05891)의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant)의 DCB와 캐나다 유전체학 연구 개발 이니셔티브 그랜트 (GRDI) 프로그램 (GRDI7 2254557)의 MRM 및 GRG에 대한 운영 보조금으로 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| 2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
| Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
| Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
| crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
| Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
| Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
| Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
| L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
| L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
| L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
| MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
| McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
| McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
| NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
| PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
| Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
| Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
| sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
| Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
| Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | --- | materials for deepwell device sterilization |
| Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
| Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
| Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
| Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |
References
- Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
- Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
- Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P.
- Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, Suppl 4 22-31 (2019).
- Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
- Mah, T. F.
- Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
- Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.". Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
- Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, Unit 1B.1 (2005).
- Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
- O'Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
- vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
- Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
- Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
- Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
- Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
- Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
- Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
- El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
- Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
- Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
- Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
- Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
- Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
- Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
- Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International. , Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020).
- Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
- Prahl, S. Crystal violet. , Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017).
