Summary
牙囊含有上皮群和间充质细胞。通过提供独特的培养基，从异质性牙卵泡细胞群中选择上皮群体。上皮细胞存活并在无血清培养基中形成菌落。
Abstract
牙囊（DF）是在口腔颌面外科医生切除受影响的第三磨牙期间收获的。在DF收获当天进行上皮细胞分离。用DPBS洗涤DFBS三次，然后用组织剪刀解剖，直到组织具有浆状或粘稠度。通过离心造粒单细胞群并用角质形成细胞无血清培养基洗涤。异质细胞群分布在培养皿中。使用角质形成细胞血清无培养基选择上皮细胞。每天更换培养基，直到没有观察到漂浮的碎片或死细胞。上皮细胞在细胞群分布后7-10天内出现。上皮细胞在无血清培养基中存活，而α修饰的最小必需培养基补充10%胎牛血清允许间充质型细胞增殖。DF是分离牙齿上皮细胞的组织源。
本研究的目的是建立一种从人DF中分离上皮细胞的方法。牙周韧带（PDL）用于分离人牙齿上皮细胞。由于组织体积小，从人PDL获取上皮细胞并不总是成功的，导致上皮细胞数量少。DF的体积比PDL大，并且包含更多的细胞。DF可以是人牙齿上皮细胞原代培养的组织来源。该协议比使用PDL的隔离方法更容易，更有效。获取人类牙齿上皮细胞可能有助于进一步研究牙齿上皮 - 间充质相互作用。
Introduction
牙齿形成始于口腔上皮的内陷1。根据牙齿发育阶段，口腔上皮有不同的名称，包括内外珐琅质上皮，宫颈袢和赫特维格上皮根鞘（HERS）。上皮区室与周围的间充质细胞相通。上皮-间充质相互作用调节牙齿形成和组织再生。获取牙齿上皮细胞，如口腔角质形成细胞和赫特维格上皮根鞘细胞（HERSC），对于研究牙齿上皮-间充质相互作用至关重要2。
啮齿动物来源的牙齿上皮细胞从上皮结构中分离出来，例如HERS。Li及其同事在收获了8日龄大鼠发育中的牙齿胚芽的顶端部分后，分离并永生化了大鼠摩尔衍生的HERSC3。HERS在放大镜下从顶端组织分离出来。考虑到牙齿发育阶段和年龄，由于伦理问题，从人类身上收获HERS几乎是不可能的：需要从幼儿身上去除发育中的牙齿胚芽才能收获人类的HERS。未成熟的牙齿细菌很少被提取。人牙齿上皮细胞可以从牙龈和牙周韧带（PDL）中分离出来。上皮结构衍生的细胞与间充质成分一起参与牙齿的形成，并且可能比口腔角质形成细胞更适合研究牙齿上皮 - 间充质相互作用。Malassez（ERM）的上皮细胞残留物是HERS衍生的上皮残留物，并且少量存在于PDL4中。研究报告了人类HERSC与PDL5的分离。然而，从PDL组织中收获人类HERSC并不总是成功的，因为该位置上皮种群的稀缺性5，6。
虽然啮齿类动物来源的 HERSC 维持在含血清的培养基中3，7，但人 DF 来源的上皮细胞是用类似于其他人上皮细胞的无血清培养基培养的，例如正常人表皮角质形成细胞和正常人口腔角质形成细胞8，9。这意味着啮齿动物牙齿上皮细胞和人牙齿上皮细胞之间的生理或功能差异。了解牙齿上皮 - 间充质相互作用的机制可能有助于临床应用的发展，包括再植期间的牙周重新附着，牙周病中的牙周再生，牙髓 - 牙本质复合物再生和生物牙齿生成。考虑到转化研究的特点，人牙齿上皮细胞可能比啮齿动物牙齿上皮细胞更适合研究上皮-间充质相互作用。
人类DF是松散的结缔组织，通常位于受累的牙齿中。DF含有间充质前体10。然而，据我们所知，没有研究报告在2021年之前从牙囊中分离出上皮细胞。Oh和Yi在20218年报告了从人类DF中分离出上皮细胞的情况。通过蛋白质印迹和形态学分析证实上皮表型。对DF衍生上皮细胞起源的分析显示出与其他研究相似的结果。DF来源的上皮细胞既不是内皮细胞也不是造血细胞5，11，Oh和Yi建议将这些细胞命名为DF-HERSC。DF的体积大于PDL，并且可以从DF中分离出更多的上皮细胞。这增强了上皮菌落的出现，并导致从DF中收获上皮细胞的成功率很高。这项研究建议使用DF作为分离牙齿上皮细胞的组织源。
在本研究中，根据先前描述的程序从DF中分离出单个细胞10，12。DF包含异质性细胞群，并且在手术的早期阶段可能存在几种细胞类型。Morsczek及其同事分离出DF衍生的间充质干细胞10。我们假设DF含有上皮细胞，只有上皮细胞才能在无血清条件下存活。这项研究与Morsczek等人在上皮群体的选择和间充质细胞的抑制方面有所不同。选择使用角质形成细胞血清无培养基（SFM）进行，其允许上皮细胞增殖并抑制间充质细胞增殖。这项研究起源于Oh和Yi8的一份报告。本研究的目的是描述该报告中使用的从人DF中分离上皮细胞的方法的细节。
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Protocol
本研究已获江东庆熙大学医院机构审查委员会批准（IRB批准号：KHNMC 2017-06-009）。
1. 收集DF
注意：患者在手术前给予知情同意，以切除成熟或未成熟的受影响的第三磨牙。排除了患有以下疾病的患者：糖尿病，高血压，肺结核，肝炎，获得性免疫缺陷综合征。孕妇也被排除在外。
- 在手术提取受影响的第三磨牙期间收获DF（图1A）。
注：手术由口腔颌面外科医生进行。需要与牙医合作进行组织收集。 - 使用前将DF储存在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中，其中含有3%青霉素 - 链霉素，温度为4°C。在DF收获当天执行隔离程序（图1B）。
2. 从DF中分离出单细胞群
- 在DPBS中制备I型胶原酶和蛋白酶的储备溶液，使I型胶原酶和蛋白酶的最终浓度分别为1mg / mL和2.4mg / mL。
- 准备三个50 mL洗涤管，每管20 mL DPBS。将试管标记为 1、2 和 3。
- 在洗涤管中按顺序清洗DF。用镊子握住DF，然后将DF放入管1中。将DF从管1中取出，并将其放入管2中。将DF从管2中取出，并将其放入管3中。在每管中轻轻摇晃DF10-15次。洗涤三次后，将DF置于60mm培养皿中（图2A）。
- 用组织剪刀切碎DF（图2B）。仅将一小部分转移到培养皿中，以尽量减少组织损失。重复切割，直到DF具有浆状或粘稠的外观（图2C）。
- 将1 mL I型胶原酶和1 mL蛋白酶溶液混合在15 mL锥形管中，分别获得1mg / mL和2.4mg / mL的最终浓度。
- 将切碎的DF从步骤2.5转移到15 mL锥形管中。在37°C下轻轻摇晃并孵育管1小时。
- 向试管中加入5mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，摇动，并在37°C下孵育管15分钟。
- 制备含有角质形成细胞SFM 10%胎牛血清（FBS）的角质形成细胞培养基。将3mL角质形成细胞培养基加入新的50mL锥形管中。将40μm过滤器放在该管的顶部，并使用10mL血清学移液管从步骤2.6吸出上清液并将其通过过滤器。
注意：在服用上清液时，尽量减少消化组织残留物的掺入。用40μm过滤器去除组织残留物，以尽量减少故障。组织残留物可能通过70μm过滤器并阻碍菌落形成。角质形成细胞培养基中的FBS会使酶失活。 - 重复步骤 2.7 和 2.8。
- 将收集的悬浮液转移到15mL锥形管中。
- 在4°C下以288× g 离心15mL锥形管3分钟。 除去上清液。
注意：小心避免意外去除颗粒细胞，这些细胞大多是不可见的。 - 加入3mL角质形成细胞SFM，并用1mL移液器离心两次细胞，如步骤2.11所示。
- 使用角质形成细胞SFM将单细胞群接种到60mm培养皿中。在37°C下将培养皿在5%CO 2 的加湿气氛中保持最终体积为5mL的培养皿。 每天更换培养基，直到没有观察到组织或细胞碎片。
注意：通过更换培养基去除培养基中的漂浮物。延迟去除组织碎片或死细胞对原代培养物有不利影响。 - 检查步骤2.13中的板以检查上皮细胞的生长（图3A）。
注意：上皮细胞在接种单细胞群后7-10天内生长。 - 扩增上皮菌落并传代培养细胞。
- 吸出培养基并用3mL角质形成细胞SFM洗涤培养板底部一次。
- 加入2mL细胞解离蛋白酶，并在37°C下在5%CO 2 的加湿气氛中孵育3分钟。
注意：如果细胞分离无效，请重复步骤2.15.2。 - 向培养板中加入2mL角质形成细胞培养基，并将内容物转移到15mL锥形管中。
注意：如果重复步骤2.15.2，则不需要添加更多的角质形成细胞培养基。 - 在4°C下以288× g 离心15mL锥形管3分钟。
- 除去上清液并用3mL角质形成细胞SFM洗涤细胞沉淀两次。
- 使用角质形成细胞SFM（每100mm培养皿10mL的最终体积）将细胞接种在100mm培养皿中。
- 准备细胞储备并将其储存在液氮罐中。
- 如步骤2.15.1-2.15.5中所述收获细胞。
- 将细胞在1mL冷冻培养基（80%角质形成细胞SFM，10%二甲基亚砜，10%FBS）中分配到冷冻管中。
- 将小瓶置于冷冻容器中，并将其储存在-80°C下24小时。
- 将小瓶从深冰箱转移到液氮罐中。
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Representative Results
脱模剂收获
手术由口腔颌面外科医生进行。由外科医生收集人源材料，包括牙齿碎片，牙龈组织和DF（图1A）。DF可能附着在牙齿碎片上。口腔颌面外科医生将能够识别DF。组织收集需要与外科医生的合作和沟通。DF是一种形状不规则的膜样组织。牙龈组织具有角质化表面，可与DF区分开来。牙髓组织驻留在牙髓室中，在手术过程中很少与牙齿分离。使用前将DF与3%青霉素 - 链霉素一起储存在DPBS中，温度为4°C（图1B）。
DF的机械处理
通过用DPBS洗涤DF来去除组织碎片和血液。用洗涤液制备了3个锥形管。洗涤后，将DF转移到60 mm或100mm培养皿中（图2A）。应用剪刀切碎DF，直到组织具有纸浆状或糊状外观（图2B，C）。
上皮人群的出现
在接种异质细胞群后，许多细胞和小碎片漂浮在培养基中。随着培养基的连续变化，漂浮细胞的数量逐渐减少。培养基更换延迟可能导致培养环境浑浊。在初始阶段，不同的细胞类型出现在培养皿的底部，但在角质形成细胞SFM中维持时消失。具有上皮形态的细胞在接种单细胞群后7-10天内出现（图3A）。在上皮细胞出现时，鹅卵石形细胞的数量从1到10不等，随着时间的推移扩增成菌落（图3B）。
重复切碎程序以增加DF接触面积，0.05%胰蛋白酶-EDTA促进细胞解离。从DF纸浆中收获的单细胞比完整的DF更多。DF纸浆的粘性表明分离上皮细胞的成功概率。每日培养基更换可防止角质形成细胞SFM变得浑浊，这对上皮细胞存活很重要。
图1：人源材料。 （A）人源材料由口腔颌面外科医生收集。黄色箭头表示 DF。黑色箭头表示牙齿碎片和牙齿附着的软组织。（B）将DF储存在补充有3%青霉素 - 链霉素的PBS中，温度为4°C。 在收集后24小时内执行隔离程序。缩写： DF = 牙囊;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：牙囊的治疗。 （A）用DPBS洗涤三次后，将DF转移到60mm培养皿中。（B）用纸巾剪刀将DF切碎。（C）切碎的DF具有浆状或糊状外观。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：上皮细胞的出现。 （A）具有上皮形态的细胞在接种单细胞群后7-10天内出现。（B）通过传代培养脱 体 扩增DF来源的上皮细胞。比例尺 = 100 μm。缩写：DF = 牙囊。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
此协议包括关键步骤。收获单细胞群对于从DF中成功分离上皮细胞至关重要。我们试图根据我们的假设从DF中分离出上皮细胞，即DF中有更多的上皮细胞。切碎程序增强了细胞从DF的分离和释放。切碎过程得到改善，并重复切碎，直到DF出现浆状，以促进单细胞的释放。获得最大数量的单细胞增加了上皮群体出现的可能性。在从DF中分离上皮细胞期间经常发生污染。使用40μm过滤器可最大限度地减少单细胞群中组织碎片的夹杂，因为组织残留物可以通过70μm过滤器并抑制上皮细胞定植。
上皮细胞似乎比间充质细胞更容易受到某些环境的影响，培养基的日常变化也为上皮群体的出现提供了干净的环境。由于频繁的培养基更换而丢失细胞可能是该协议的局限性。然而，在对该方案进行故障排除后，每天更换培养基，因此，上皮细胞出现并扩增。延迟培养基变化会影响培养基。由于离心后的细胞沉淀几乎看不见，因此15mL锥形管的窄尖端增加了上清液去除的难易程度，而不会丢失细胞沉淀。因此，该协议建议将50 mL锥形管的内容物转移到15 mL锥形管中。
DF提供比PDL更大的组织体积和更多的单细胞。因此，DF可以代替PDL用作分离人牙齿上皮细胞的组织源。DF中细胞类型的选择和抑制可以简单地通过选择性培养基完成。SFM诱导上皮生长，而含血清的培养基选择间充质细胞。这种方法可以很容易地接触到人类牙齿上皮细胞。Morsczek及其同事先前分离出DF衍生的间充质前体。这项研究与他们的不同之处在于上皮群体的选择和对间充质细胞的抑制。
牙齿上皮细胞在牙齿形成过程中的调节作用在牙科研究中具有极大的意义。研究牙齿发育过程中的上皮-间充质相互作用可能为解决临床问题提供线索13。已尝试通过结合上皮和间充质成分进行组织再生14。牙上皮细胞衍生因子，如珐琅质基质衍生物，已被评估为旨在牙周再生，牙髓 - 牙本质复合物再生和牙周再附着的治疗靶点2，15。再生因子的组合，包括干细胞、上皮-间充质细胞片、细胞衍生因子和生物材料，在牙齿脱落或发育不良的情况下可能产生生物牙齿16。牙齿发育不全相关基因，如 PAX9、 MSX1、 AXIN2、 EDA、 EDAR和 WNT10A 基因，是上皮-间充质相互作用的潜在候选关键调控基因17。此外，来自牙齿发育不全相关研究的下一代测序方法衍生数据可能同样提出推定的新型靶基因，这些基因在牙齿上皮 - 间充质相互作用期间调节分子控制。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金会由韩国政府资助（NRF-2017R1C1B2008406和NRF-2021R1F1A1064350）。Hee-Yeon Bae博士为初级培养提供了DF。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
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