Summary
Il follicolo dentale contiene una popolazione epiteliale e cellule mesenchimali. La popolazione epiteliale è stata selezionata dalla popolazione eterogenea di cellule follicolari dentali fornendo un terreno di coltura distinto. Le cellule epiteliali sopravvissero e formarono colonie in un mezzo privo di siero.
Abstract
Il follicolo dentale (DF) è stato raccolto durante la rimozione di un terzo molare colpito da un chirurgo maxillo-facciale orale. L'isolamento delle cellule epiteliali è stato eseguito il giorno della raccolta DF. Il DF è stato lavato tre volte con DPBS e poi sezionato con forbici di tessuto fino a quando il tessuto ha avuto una consistenza polposa o schiacciata. Le popolazioni unicellulari sono state pellettizzate mediante centrifugazione e lavate con un mezzo privo di siero di cheratinociti. Popolazioni cellulari eterogenee sono state distribuite in un piatto di coltura. Il mezzo privo di siero dei cheratinociti è stato utilizzato per selezionare le cellule epiteliali. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni giorno fino a quando non sono stati osservati detriti galleggianti o cellule morte. Le cellule epiteliali sono apparse entro 7-10 giorni dalla distribuzione della popolazione cellulare. Le cellule epiteliali sono sopravvissute in mezzo privo di siero, mentre il mezzo essenziale minimo di modificazione α integrato con il 10% di siero bovino fetale ha permesso la proliferazione di cellule di tipo mesenchimale. Il DF è una fonte di tessuto per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali.
Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un metodo per l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano. Il legamento parodontale (PDL) è stato utilizzato per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali umane. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dalla PDL umana non ha sempre successo a causa del piccolo volume tissutale, che porta a un basso numero di cellule epiteliali. DF ha un volume maggiore di PDL e contiene più celle. DF può essere una fonte di tessuto per la coltura primaria di cellule epiteliali dentali umane. Questo protocollo è più semplice ed efficiente rispetto al metodo di isolamento che utilizza PDL. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali umane può facilitare ulteriori studi sulle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali.
Introduction
La formazione dei denti inizia con l'invaginazione dell'epitelio orale1. Secondo lo stadio di sviluppo del dente, l'epitelio orale ha nomi diversi, tra cui l'epitelio dello smalto interno ed esterno, l'ansa cervicale e la guaina epiteliale della radice di Hertwig (HERS). I compartimenti epiteliali comunicano con le cellule mesenchimali circostanti. Le interazioni epitelio-mesenchimali regolano la formazione dei denti e la rigenerazione dei tessuti. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali, come i cheratinociti orali e le cellule della guaina epiteliale della radice di Hertwig (HERSC), è fondamentale per lo studio delle interazioni epiteliale-mesenchimale dentale2.
Le cellule epiteliali dentali derivate dai roditori sono isolate dalla struttura epiteliale, come l'HERS. Li e colleghi hanno isolato e immortalato le HERSC di derivazione molare del ratto dopo aver raccolto la porzione apicale dei germi dei denti in via di sviluppo da ratti di 8 giorni3. L'HERS è stato separato dal tessuto apicale sotto ingrandimento. Considerando lo stadio di sviluppo dei denti e l'età, la raccolta dell'HERS dagli esseri umani è quasi impossibile a causa di problemi etici: un germe dentale in via di sviluppo deve essere rimosso da un bambino piccolo per raccogliere l'HERS umano. I germi dei denti immaturi vengono estratti raramente. Le cellule epiteliali dentali umane possono essere isolate dalla gengiva e dal legamento parodontale (PDL). Le cellule derivate dalla struttura epiteliale partecipano alla formazione dei denti insieme ai componenti mesenchimali e potrebbero essere più adatte per lo studio delle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali rispetto ai cheratinociti orali. I resti di cellule epiteliali di Malassez (ERM) sono resti epiteliali derivati da HERS e risiedono in piccoli numeri nel PDL4. Gli studi riportano l'isolamento delle HERSC umane dalla PDL5. Tuttavia, la raccolta di HERSC umane dal tessuto PDL non ha sempre successo a causa della scarsità della popolazione epiteliale in questa posizione5,6.
Sebbene le HERSC derivate dai roditori siano mantenute in mezzi contenenti siero3,7, le cellule epiteliali umane derivate da DF sono coltivate con mezzi privi di siero simili ad altre cellule epiteliali umane, come i normali cheratinociti epidermici umani e i normali cheratinociti orali umani8,9. Ciò implica differenze fisiologiche o funzionali tra le cellule epiteliali dentali dei roditori e le cellule epiteliali dentali umane. Comprendere il meccanismo relativo alle interazioni epiteliale-mesenchimale dentale potrebbe contribuire allo sviluppo di applicazioni cliniche, tra cui il riattaccamento parodontale durante il reimpianto, la rigenerazione parodontale nella malattia parodontale, la rigenerazione del complesso polpa-dentina e la generazione di biodenti. Considerando le caratteristiche della ricerca traslazionale, le cellule epiteliali dentali umane possono essere più appropriate delle cellule epiteliali dentali dei roditori per lo studio delle interazioni epitelio-mesenchimali.
Il DF umano è un tessuto connettivo sciolto e spesso risiede in un dente colpito. Il DF contiene precursori mesenchimali10. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha riportato l'isolamento delle cellule epiteliali dai follicoli dentali prima del 2021. Oh e Yi hanno riferito l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano nel 20218. Il fenotipo epiteliale è stato confermato dal western blotting e dall'analisi morfologica. L'analisi dell'origine delle cellule epiteliali derivate da DF ha dimostrato risultati simili con altri studi. Le cellule epiteliali derivate da DF non erano né endoteliali né ematopoietiche5,11, e Oh e Yi suggerivano di nominare queste cellule come DF-HERSC. Il DF ha un volume maggiore rispetto al PDL e più cellule epiteliali possono essere isolate dal DF. Ciò migliora l'emergere di colonie epiteliali e si traduce in un alto tasso di successo nella raccolta di cellule epiteliali da DF. Questo studio suggerisce di utilizzare il DF come fonte di tessuto per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali.
Nel presente studio, singole cellule sono state isolate dal DF secondo le procedure precedentemente descritte10,12. Il DF contiene popolazioni cellulari eterogenee e diversi tipi di cellule potrebbero essere presenti nella fase iniziale della procedura. Morsczek e colleghi hanno isolato cellule staminali mesenchimali derivate da DF10. Abbiamo ipotizzato che il DF contenga cellule epiteliali e che solo le cellule epiteliali possano sopravvivere in condizioni prive di siero. Questo studio differisce da quello di Morsczek et al. in termini di selezione della popolazione epiteliale e di inibizione delle cellule mesenchimali. La selezione è stata eseguita utilizzando mezzi privi di siero di cheratinociti (SFM), che consentono la proliferazione delle cellule epiteliali e inibiscono la proliferazione delle cellule mesenchimali. Questo studio ha avuto origine da un rapporto di Oh e Yi8. Lo scopo di questo studio era quello di descrivere i dettagli del metodo utilizzato in quel rapporto per l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Kyung Hee University Hospital di Gangdong (approvazione IRB n. KHNMC 2017-06-009).
1. Raccogli DF
NOTA: I pazienti hanno dato il consenso informato prima dell'intervento chirurgico per la rimozione di un terzo molare colpito maturo o immaturo. Sono stati esclusi i pazienti con la seguente malattia: diabete, ipertensione, tubercolosi, epatite, sindrome da immunodeficienza acquisita. Anche le donne incinte sono state escluse.
- Raccolta df durante l'estrazione chirurgica dei terzi molari colpiti (Figura 1A).
NOTA: La chirurgia è stata eseguita da un chirurgo maxillo-facciale orale. È necessaria la collaborazione con un dentista per la raccolta dei tessuti. - Conservare DF in soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco con il 3% di penicillina-streptomicina a 4 °C prima dell'uso. Eseguire procedure di isolamento il giorno della raccolta DF (Figura 1B).
2. Isolare le popolazioni monocellulari da DF
- Preparare soluzioni madre di collagenasi di tipo I e proteasi in DPBS in modo che le concentrazioni finali di collagenasi di tipo I e proteasi siano rispettivamente di 1 mg/mL e 2,4 mg/mL.
- Preparare tre tubi di lavaggio da 50 ml con 20 ml di DPBS per tubo. Etichettare i tubi come 1, 2 e 3.
- Lavare il DF nei tubi di lavaggio in sequenza. Tenere il DF con una pinzetta e posizionare il DF nel tubo 1. Estrarre il DF dal tubo 1 e posizionarlo nel tubo 2. Estrarre il DF dal tubo 2 e posizionarlo nel tubo 3. Agitare delicatamente DF 10-15 volte in ogni tubo. Dopo aver lavato tre volte, posizionare il DF in una piastra di coltura da 60 mm (Figura 2A).
- Tritare il DF con forbici tissutali (Figura 2B). Trasferire solo una piccola porzione al piatto di coltura per ridurre al minimo la perdita di tessuto. Ripetere il taglio fino a quando il DF ha un aspetto polposo o squishy (Figura 2C).
- Mescolare 1 mL di collagenasi di tipo I e 1 mL di soluzione di proteasi in un tubo conico da 15 mL per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 1 mg/mL e 2,4 mg/mL.
- Trasferire il DF tritato nel tubo conico da 15 mL dal punto 2.5. Agitare delicatamente e incubare il tubo per 1 ora a 37 °C.
- Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% al tubo, agitare e incubare il tubo per 15 minuti a 37 °C.
- Preparare il mezzo cheratinocitario contenente cheratinociti SFM 10% siero bovino fetale (FBS). Aggiungere 3 mL di cheratinociti in un nuovo tubo conico da 50 mL. Posizionare un filtro da 40 μm sopra questo tubo e utilizzare una pipetta sierologica da 10 ml per aspirare il surnatante dal punto 2.6 e passarlo attraverso il filtro.
NOTA: Ridurre al minimo l'incorporazione di resti di tessuto digerito durante l'assunzione del surnatante. Rimuovere i residui di tessuto con un filtro da 40 μm per ridurre al minimo il fallimento. I resti di tessuto possono passare attraverso filtri da 70 μm e ostacolare la formazione di colonie. FBS nel mezzo cheratinocitario inattiverà gli enzimi. - Ripetere i passaggi 2.7 e 2.8.
- Trasferire la sospensione raccolta in un tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare il tubo conico da 15 mL a 288 × g per 3 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
NOTA: Fare attenzione ad evitare qualsiasi rimozione accidentale di celle pellettate, che sono per lo più invisibili. - Aggiungere 3 mL di SFM cheratinocitario e lavare le cellule due volte con una pipetta da 1 mL con centrifugazione come nel passaggio 2.11.
- Placcare la popolazione unicellulare in un piatto di coltura da 60 mm usando cheratinociti SFM. Mantenere la superficie di coltura con un volume finale di 5 ml in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 a 37 °C. Cambiare il terreno di coltura ogni giorno fino a quando non si osservano detriti di tessuto o cellule.
NOTA: rimuovere i detriti galleggianti nel terreno di coltura cambiando il mezzo. La rimozione ritardata di detriti tissutali o cellule morte ha un effetto sfavorevole sulla coltura primaria. - Esaminare la piastra dal passaggio 2.13 per verificare la crescita delle cellule epiteliali (Figura 3A).
NOTA: Le cellule epiteliali crescono entro 7-10 giorni dopo la placcatura delle popolazioni monocellulari. - Espandere le colonie epiteliali e sottoculare le cellule.
- Aspirare il mezzo e lavare il fondo della piastra di coltura una volta con 3 ml di SFM cheratinociti.
- Aggiungere 2 mL di proteasi di dissociazione cellulare e incubare in atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C per 3 min.
NOTA: ripetere il passaggio 2.15.2 se il distacco delle cellule non è efficace. - Aggiungere 2 mL di cheratinociti alla piastra di coltura e trasferire il contenuto in un tubo conico da 15 mL.
NOTA: l'aggiunta di più cheratinociti non è necessaria se si ripete il passaggio 2.15.2. - Centrifugare il tubo conico da 15 mL a 288 × g per 3 min a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare due volte con 3 ml di SFM cheratinocitario.
- Placcare le cellule in una capsula di coltura da 100 mm usando cheratinociti SFM (volume finale di 10 ml per piatto da 100 mm).
- Preparare e conservare le scorte di cellule in un serbatoio di azoto liquido.
- Cellule di raccolta come descritto nei passaggi 2.15.1-2.15.5.
- Distribuire le cellule in criovioli in 1 mL di mezzo di congelamento (80% cheratinociti SFM, 10% dimetilsolfossido, 10% FBS).
- Mettere i flaconcini in un contenitore congelante e conservarli a -80 °C per 24 ore.
- Trasferire i flaconcini dal congelatore a un serbatoio di azoto liquido.
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Representative Results
Raccolta DF
La chirurgia è stata eseguita da un chirurgo maxillo-facciale orale. I materiali di derivazione umana, tra cui il frammento del dente, il tessuto gengivale e il DF, sono stati raccolti da un chirurgo (Figura 1A). Il DF potrebbe essere attaccato al frammento del dente. Un chirurgo maxillo-facciale orale sarà in grado di identificare il DF. La cooperazione e la comunicazione con il chirurgo sono necessarie per la raccolta dei tessuti. Il DF è un tessuto simile a una membrana di forma irregolare. Il tessuto gengivale ha una superficie cheratinizzata e può essere distinto dal DF. Il tessuto pulpare risiede nella camera pulpare ed è raramente separato dai denti durante l'intervento chirurgico. Il DF è stato conservato in DPBS con il 3% di penicillina-streptomicina a 4 °C prima dell'uso (Figura 1B).
Trattamento meccanico di DF
I detriti tissutali e il sangue sono stati rimossi lavando il DF con DPBS. Tre tubi conici sono stati preparati con soluzione di lavaggio. Dopo il lavaggio, il DF è stato trasferito su una pala di coltura da 60 mm o 100 mm (Figura 2A). Il DF deve essere tritato con le forbici fino a quando il tessuto ha un aspetto polposo o molle (Figura 2B, C).
Comparsa di popolazione epiteliale
Dopo aver placcato popolazioni cellulari eterogenee, molte cellule e piccoli detriti galleggiavano nel terreno di coltura. Il numero di cellule fluttuanti diminuiva gradualmente con successivi cambiamenti del mezzo. Il cambiamento ritardato del mezzo può causare un ambiente di coltura torbido. Nella fase iniziale, diversi tipi di cellule appaiono nella parte inferiore del piatto di coltura, ma scompaiono se mantenuti nei cheratinociti SFM. Le cellule con morfologia epiteliale compaiono entro 7-10 giorni dalla placcatura delle popolazioni monocellulari (Figura 3A). Il numero di cellule a forma di ciottolo varia da 1 a 10 al momento dell'emergere di cellule epiteliali, che si espandono in colonie nel tempo (Figura 3B).
La procedura di tritatura è stata ripetuta per aumentare l'area di contatto DF con lo 0,05% di tripsina-EDTA per promuovere la dissociazione cellulare. Più cellule singole sono state raccolte dalla polpa DF rispetto al DF intatto. La viscosità della polpa DF indicava la probabilità di successo dell'isolamento delle cellule epiteliali. I cambiamenti giornalieri del mezzo hanno impedito ai cheratinociti SFM di diventare torbidi, il che è importante per la sopravvivenza delle cellule epiteliali.
Figura 1: Materiali di derivazione umana. (A) I materiali di derivazione umana sono stati raccolti da un chirurgo maxillo-facciale orale. La freccia gialla indica il DF. Le frecce nere indicano il frammento del dente e il tessuto molle attaccato al dente. (B) Il DF è stato conservato in PBS integrato con il 3% di penicillina-streptomicina a 4 °C. Le procedure di isolamento sono state eseguite entro 24 ore dalla raccolta. Abbreviazioni: DF = follicolo dentale; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Trattamento dei follicoli dentali. (A) Il DF è stato trasferito in un piatto di coltura di 60 mm dopo essere stato lavato con DPBS tre volte. (B) Il DF è stato tritato con forbici di tessuto. (C) Il DF tritato aveva un aspetto polposo o molle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Comparsa di cellule epiteliali. (A) Le cellule con morfologia epiteliale compaiono entro 7-10 giorni dalla placcatura di popolazioni monocellulari. (B) Espansione ex vivo di cellule epiteliali derivate da DF mediante sottocoltura. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazione: DF = follicolo dentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo include passaggi critici. La raccolta di popolazioni monocellulari è essenziale per il successo dell'isolamento delle cellule epiteliali dalla DF. Abbiamo cercato di isolare le cellule epiteliali dal DF sulla base della nostra ipotesi che ci siano più cellule epiteliali nel DF. La procedura di tritatura migliora il distacco e il rilascio delle cellule dal DF. La procedura di tritatura è stata migliorata e la tritatura è stata ripetuta fino a quando il DF è apparso polposo per facilitare il rilascio di singole cellule. Ottenere il numero massimo di singole cellule aumenta la probabilità di emergere della popolazione epiteliale. La contaminazione si verifica frequentemente durante l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF. L'uso di filtri da 40 μm riduce al minimo l'inclusione di detriti tissutali in popolazioni monocellulari, poiché i resti di tessuto possono passare attraverso filtri da 70 μm e inibire la colonizzazione delle cellule epiteliali.
Le cellule epiteliali sembrano essere più vulnerabili a determinati ambienti rispetto alle cellule mesenchimali e il cambiamento quotidiano del terreno di coltura ha anche fornito un ambiente pulito per l'emergere della popolazione epiteliale. La perdita di cellule a causa di frequenti cambi di mezzo può essere una limitazione di questo protocollo. Tuttavia, il cambio giornaliero del mezzo è stato eseguito dopo la risoluzione dei problemi per questo protocollo e, di conseguenza, le cellule epiteliali sono apparse e si sono espanse. Ritardare il cambiamento del mezzo può influenzare le culture. Poiché il pellet cellulare dopo la centrifugazione è quasi invisibile, la punta stretta di un tubo conico da 15 ml aumenta la facilità di rimozione del surnatante senza perdere il pellet cellulare. Pertanto, questo protocollo suggerisce di trasferire il contenuto del tubo conico da 50 ml a un tubo conico da 15 ml.
Il DF fornisce un volume maggiore di tessuto e più cellule singole rispetto al PDL. Quindi, il DF può essere utilizzato al posto del PDL come fonte di tessuto per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali umane. La selezione e l'inibizione dei tipi di cellule nel DF possono essere effettuate semplicemente attraverso un terreno di coltura selettivo. La SFM induce la crescita epiteliale, mentre il mezzo contenente siero seleziona le cellule mesenchimali. Questa metodologia consente una facile accessibilità alle cellule epiteliali dentali umane. Morsczek e colleghi hanno precedentemente isolato precursori mesenchimali derivati da DF. Questo studio si differenzia dal loro per la selezione delle popolazioni epiteliali e l'inibizione delle cellule mesenchimali.
Il ruolo regolatore delle cellule epiteliali dentali durante la formazione dei denti è di grande interesse nella ricerca dentale. Lo studio delle interazioni epitelio-mesenchimali durante lo sviluppo dei denti può suggerire indizi per la risoluzione di problemi clinici13. È stata tentata la rigenerazione tissutale combinando componenti epiteliali e mesenchimali14. I fattori derivati dalle cellule epiteliali dentali, come un derivato della matrice dello smalto, sono stati valutati come bersagli terapeutici che mirano alla rigenerazione parodontale, alla rigenerazione del complesso polpa-dentina e al riattaccamento parodontale2,15. La combinazione di fattori di rigenerazione, tra cui cellule staminali, fogli di cellule epiteliali-mesenchimali, fattori di derivazione cellulare e biomateriali, può generare bio-denti in caso di perdita dei denti o agenesia16. I geni associati all'agenesia dentale, come i geni PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR e WNT10A, sono potenziali geni regolatori chiave candidati per le interazioni epitelio-mesenchimali17. Inoltre, i dati derivati dal metodo di sequenziamento di nuova generazione da studi associati all'agenesia dentale possono allo stesso modo proporre nuovi geni bersaglio putativi che regolano il controllo molecolare durante le interazioni epitelio-mesenchimali dentali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (NRF-2017R1C1B2008406 e NRF-2021R1F1A1064350). Il Dr. Hee-Yeon Bae ha gentilmente fornito il DF per la cultura primaria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
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