Summary
O folículo dentário contém uma população epitelial e células mesenquimais. A população epitelial foi selecionada da população heterogênea de folículos dentário, proporcionando um meio de cultura distinto. As células epiteliais sobreviveram e formaram colônias em um meio livre de soro.
Abstract
O folículo dentário (DF) foi colhido durante a remoção de um terceiro molar impactado por um cirurgião maxilofacial oral. O isolamento das células epiteliais foi realizado no dia da colheita do DF. O DF foi lavado três vezes com DPBS e depois dissecado com tesoura de tecido até que o tecido tivesse uma consistência polpa ou macia. Populações unicelulares foram pelotadas por centrifugação e lavadas com meio sem soro de queratinócito. Populações de células heterogêneas foram distribuídas em um prato de cultura. O meio sem soro de queratinócito foi usado para selecionar as células epiteliais. O meio cultural foi alterado diariamente até que não foram observados detritos flutuantes ou células mortas. As células epiteliais apareceram entre 7 e 10 dias após a distribuição da população celular. As células epiteliais sobreviveram em meio livre de soro, enquanto α meio essencial mínimo complementado com soro bovino fetal de 10% permitiu a proliferação de células do tipo mesenquimal. O DF é uma fonte tecidual para o isolamento de células epiteliais dentárias.
O objetivo deste estudo foi estabelecer um método para o isolamento das células epiteliais do DF humano. O ligamento periodontal (PDL) foi utilizado para o isolamento de células epiteliais dentárias humanas. A aquisição de células epiteliais de PDL humano nem sempre é bem sucedida devido ao pequeno volume tecidual, levando a um baixo número de células epiteliais. O DF tem um volume maior que o PDL e contém mais células. O DF pode ser uma fonte tecidual para a cultura primária das células epiteliais dentárias humanas. Este protocolo é mais fácil e eficiente do que o método de isolamento usando PDL. A aquisição de células epiteliais dentárias humanas pode facilitar estudos adicionais de interações epiteliais-mesenquimais dentárias.
Introduction
A formação dentária começa com a invaginação do epitélio oral1. De acordo com o estágio de desenvolvimento dentário, o epitélio oral tem nomes diferentes, incluindo epitélio de esmalte interno e externo, laço cervical e bainha de raiz epitelial de Hertwig (HERS). Os compartimentos epiteliais se comunicam com as células mesenquimais circundantes. Interações epiteliais-mesenquimais regulam a formação dentária e a regeneração tecidual. A aquisição de células epiteliais dentárias, como os queratinócitos orais e as células da baia de raiz epitelial de Hertwig (HERSCs), é crucial para o estudo das interações epiteliais-mesenquimais dentárias2.
As células epiteliais dentárias derivadas de roedores são isoladas da estrutura epitelial, como o HERS. Li e colegas isolaram e imortalizaram HERSCs derivados do molar de rato após a colheita da porção apical dos germes dentários em desenvolvimento de ratos de 8 dias de idade3. O HERS foi separado do tecido apical sob ampliação. Considerando o estágio e a idade do desenvolvimento dentário, a colheita do HERS de humanos é quase impossível por causa de questões éticas: um germe dentário em desenvolvimento precisa ser removido de uma criança para colher o HERS humano. Germes dentários imaturos raramente são extraídos. As células epiteliais dentárias humanas podem ser isoladas do ligamento gengiva e periodontal (PDL). As células derivadas da estrutura epitelial participam da formação dentária juntamente com componentes mesenquimais e podem ser mais adequadas para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais dentárias do que queratinócitos orais. As células epiteliais de Malassez (ERM) são remanescentes epiteliais derivados do HERS e residem em pequenos números no PDL4. Estudos relatam o isolamento de HERSCs humanos do PDL5. No entanto, a colheita de HERSCs humanos a partir de tecido PDL nem sempre é bem sucedida devido à escassez da população epitelial neste local5,6.
Embora os HERSCs derivados de roedores sejam mantidos em mídias contendo soro3,7, as células epiteliais derivadas do DF são cultivadas com mídia livre de soro semelhante a outras células epiteliais humanas, como queratinócitos epidérmicos normais e queratinócitos orais humanos normais8,9. Isso implica diferenças fisiológicas ou funcionais entre células epiteliais dentárias de roedores e células epiteliais dentárias humanas. A compreensão do mecanismo relativo às interações epiteliais-mesenquimais dentárias pode contribuir para o desenvolvimento de aplicações clínicas, incluindo recolocação periodontal durante replantação, regeneração periodontal em doença periodontal, regeneração complexa de celulose e geração biodestina. Considerando as características da pesquisa translacional, as células epiteliais dentárias humanas podem ser mais apropriadas do que as células epiteliais de roedores para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais.
O DF humano é um tecido conjuntivo solto e muitas vezes reside em um dente impactado. O DF contém precursores mesenquimais10. No entanto, até onde sabemos, nenhum estudo relatou o isolamento de células epiteliais de folículos dentários antes de 2021. Oh e Yi relataram o isolamento das células epiteliais do DF humano em 20218. O fenótipo epitelial foi confirmado por manchas ocidentais e análise morfológica. A análise da origem das células epiteliais derivadas do DF demonstrou resultados semelhantes com outros estudos. As células epiteliais derivadas do DF não eram nem endoteliais nem hematopoiéticas5,11, e Oh e Yi sugeriram nomear essas células como DF-HERSCs. O DF tem um volume maior que o PDL, e mais células epiteliais podem ser isoladas do DF. Isso aumenta o surgimento de colônias epiteliais e resulta em uma alta taxa de sucesso na colheita de células epiteliais do DF. Este estudo sugere o uso do DF como fonte tecidual para o isolamento de células epiteliais dentárias.
No presente estudo, as células únicas foram isoladas do DF de acordo com os procedimentos descritos anteriormente10,12. O DF contém populações de células heterogêneas, e vários tipos de células podem estar presentes na fase inicial do procedimento. Morsczek e colegas isolaram células-tronco mesenquimais derivadas do DF10. Nós imaginamos que o DF contém células epiteliais e que apenas células epiteliais podem sobreviver sob condições livres de soro. Este estudo difere do de Morsczek et al. em termos da seleção da população epitelial e da inibição das células mesenquimais. A seleção foi realizada utilizando-se uma mídia sem soro de queratinócito (SFM), que permite a proliferação de células epiteliais e inibe a proliferação de células mesenquimais. Este estudo teve origem em um relatório de Oh e Yi8. O objetivo deste estudo foi descrever detalhes do método utilizado nesse relatório para o isolamento de células epiteliais do DF humano.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Universitário Kyung Hee em Gangdong (aprovação do IRB nº. KHNMC 2017-06-009).
1. Recolher DF
NOTA: Os pacientes deram consentimento informado antes da cirurgia para a remoção de um terceiro molar maduro ou imaturo impactado. Foram excluídos pacientes com a seguinte doença: diabetes, hipertensão, tuberculose, hepatite, síndrome da imunodeficiência adquirida. As gestantes também foram excluídas.
- Colheita DF durante a extração cirúrgica de terceiro molares impactados (Figura 1A).
NOTA: A cirurgia foi realizada por um cirurgião maxilofacial oral. A cooperação é necessária com um dentista para coleta de tecidos. - Armazene DF na solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco com 3% de penicilina-estreptomicina a 4 °C antes do uso. Realizar procedimentos de isolamento no dia da colheita do DF (Figura 1B).
2. Isole populações unicelulares do DF
- Prepare as soluções de estoque de colagenase tipo I e protease em DPBS para que as concentrações finais de colagenase tipo I e protease sejam de 1 mg/mL e 2,4 mg/mL, respectivamente.
- Prepare três tubos de lavagem de 50 mL com 20 mL de DPBS por tubo. Rotule os tubos como 1, 2 e 3.
- Lave o DF nos tubos de lavagem sequencialmente. Segure o DF com pinças e coloque o DF no tubo 1. Tire o DF do tubo 1 e coloque-o no tubo 2. Tire o DF do tubo 2 e coloque-o no tubo 3. Agite suavemente o DF 10-15 vezes em cada tubo. Depois de lavar três vezes, coloque o DF em um prato de cultura de 60 mm (Figura 2A).
- Pique o DF com tesoura de tecido (Figura 2B). Transfira apenas uma pequena porção para o prato de cultura para minimizar a perda de tecido. Repita o corte até que o DF tenha uma aparência polpírica ou macia (Figura 2C).
- Misture 1 mL de colagenase tipo I e 1 mL de solução protease em um tubo cônico de 15 mL para obter concentrações finais de 1 mg/mL e 2,4 mg/mL, respectivamente.
- Transfira o DF picado para o tubo cônico de 15 mL a partir da etapa 2.5. Agite suavemente e incubar o tubo por 1h a 37 °C.
- Adicione 5 mL de 0,05% trypsin-EDTA ao tubo, agite e incuba o tubo por 15 min a 37 °C.
- Prepare o meio queratinócito contendo queratinócito SFM 10% de soro bovino fetal (FBS). Adicione 3 mL de meio de queratinócito em um novo tubo cônico de 50 mL. Coloque um coador de 40 μm em cima deste tubo e use uma pipeta sorológica de 10 mL para aspirar o supernatante a partir do passo 2.6 e passá-lo através do coador.
NOTA: Minimizar a incorporação de restos de tecido digerido ao tomar o supernante. Remova os restos de tecido com um coador de 40 μm para minimizar a falha. Os restos de tecido podem passar por 70 μm de coador e dificultar a formação de colônias. FBS no meio queratinócito inativará as enzimas. - Repita as etapas 2.7 e 2.8.
- Transfira a suspensão coletada para um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 288 × g por 3 min a 4 °C. Remova o supernatante.
NOTA: Tenha cuidado para evitar qualquer remoção acidental de células pelleted, que são em sua maioria invisíveis. - Adicione 3 mL de queratinócito SFM e lave as células duas vezes com uma pipeta de 1 mL com centrifugação como na etapa 2.11.
- Emplaque a população unicelular em um prato de cultura de 60 mm usando queratinócito SFM. Mantenha o prato de cultura com um volume final de 5 mL em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C. Mude o meio de cultura diariamente até que nenhum tecido ou detritos celulares sejam observados.
NOTA: Remova detritos flutuantes no meio de cultura alterando o meio. A remoção retardada de detritos teciduais ou células mortas tem um efeito desfavorável na cultura primária. - Examine a placa da etapa 2.13 para verificar o crescimento das células epiteliais (Figura 3A).
NOTA: As células epiteliais crescem entre 7 e 10 dias após o revestimento de populações unicelulares. - Expanda as colônias epiteliais e subcultura as células.
- Aspire o meio e lave o fundo da placa de cultura uma vez com 3 mL de queratinócito SFM.
- Adicione 2 mL de protease de dissociação celular e incuba em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C por 3 min.
NOTA: Repita o passo 2.15.2 se o destacamento celular não for eficaz. - Adicione 2 mL de meio queratincyte à placa de cultura e transfira o conteúdo em um tubo cônico de 15 mL.
NOTA: A adição de mais meio de queratinócito não é necessária se a etapa 2.15.2 for repetida. - Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 288 × g por 3 min a 4 °C.
- Remova o supernatário e lave a pelota celular duas vezes com 3 mL de queratinócito SFM.
- Emplaque as células em um prato de cultura de 100 mm usando queratinócito SFM (volume final de 10 mL por prato de 100 mm).
- Prepare e armazene estoques de células em um tanque de nitrogênio líquido.
- Células colhidas descritas nas etapas 2.15.1-2.15.5.
- Distribua as células em criovias em 1 mL de meio de congelamento (80% de queratinócito SFM, 10% dimetilsulfoxida, 10% FBS).
- Coloque os frascos em um recipiente de congelamento e armazene-os a -80 °C por 24 h.
- Transfira os frascos do congelador profundo para um tanque de nitrogênio líquido.
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Representative Results
Colheita do DF
A cirurgia foi realizada por um cirurgião maxilofacial oral. Materiais derivados do homem, incluindo o fragmento dentário, tecido gengival e DF, foram coletados por um cirurgião (Figura 1A). O DF pode estar preso ao fragmento de dente. Um cirurgião maxilofacial oral será capaz de identificar o DF. A cooperação e a comunicação com o cirurgião são necessárias para a coleta de tecidos. O DF é um tecido de membrana em forma irregular. O tecido gengival tem uma superfície queratinizada e pode ser distinguido do DF. O tecido pulpar reside na câmara de polpa e raramente é separado dos dentes durante a cirurgia. O DF foi armazenado em DPBS com penicilina-estreptomicina de 3% a 4 °C antes do uso (Figura 1B).
Tratamento mecânico do DF
Detritos teciduais e sangue foram removidos pela lavagem do DF com DPBS. Três tubos cônicos foram preparados com solução de lavagem. Após a lavagem, o DF foi transferido para um prato de cultura de 60 mm ou 100 mm (Figura 2A). O DF deve ser picado com tesoura até que o tecido tenha uma aparência polpa ou macia (Figura 2B, C).
Surgimento da população epitelial
Depois de emplacar populações de células heterogêneas, muitas células e pequenos detritos flutuavam no meio da cultura. O número de células flutuantes diminuiu gradualmente com sucessivas mudanças médias. Mudanças médias atrasadas podem causar um ambiente de cultura turva. No estágio inicial, diferentes tipos de células aparecem na parte inferior do prato de cultura, mas desaparecem quando mantidos em queratinócito SFM. Células com morfologia epitelial aparecem dentro de 7-10 dias após o revestimento de populações unicelulares (Figura 3A). O número de células em forma de paralelepípedo varia de 1 a 10 no momento do surgimento de células epiteliais, que se expandem em colônias ao longo do tempo (Figura 3B).
O procedimento de picar foi repetido para aumentar a área de contato do DF com 0,05% de trypsin-EDTA para promover a dissociação celular. Mais células individuais foram colhidas da polpa DF do que o DF intacto. A pegajosa da polpa DF indicou a probabilidade de sucesso do isolamento das células epiteliais. As mudanças médias diárias impediram que o queratinócito SFM se tornasse turvo, o que é importante para a sobrevivência das células epiteliais.
Figura 1: Materiais derivados do homem. (A) Os materiais derivados do homem foram coletados por um cirurgião maxilofacial oral. A seta amarela indica o DF. Setas pretas indicam o fragmento de dente e tecido mole ligado ao dente. (B) O DF foi armazenado em PBS suplementado com penicilina-estreptomicina de 3% a 4 °C. Os procedimentos de isolamento foram realizados no prazo de 24h de coleta. Abreviaturas: DF = folículo dentário; PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Tratamento de folículos dentários. (A) O DF foi transferido para um prato de cultura de 60 mm após a lavagem com DPBS três vezes. (B) O DF foi picado com tesoura de tecido. (C) O DF picado tinha uma aparência polpada ou mole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Emergência de células epiteliais. (A) Células com morfologia epitelial aparecem dentro de 7-10 dias após o revestimento de populações unicelulares. (B) Expansão ex vivo de células epiteliais derivadas do DF por subcultura. Barras de escala = 100 μm. Abreviação: DF = folículo dentário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo inclui etapas críticas. A colheita de populações unicelulares é essencial para o isolamento bem sucedido das células epiteliais do DF. Procuramos isolar células epiteliais do DF com base em nossa hipótese de que há mais células epiteliais no DF. O procedimento de picar aumenta o desprendimento e a liberação de células do DF. O procedimento de picar foi melhorado, e o picar se repetiu até que o DF apareceu polpa para facilitar a liberação de células únicas. A obtenção do número máximo de células únicas aumenta a probabilidade de surgimento da população epitelial. A contaminação ocorre frequentemente durante o isolamento de células epiteliais do DF. O uso de 40 μm strainers minimiza a inclusão de detritos teciduais em populações unicelulares, pois os restos de tecido podem passar por 70 μm de coador e inibir a colonização de células epiteliais.
As células epiteliais parecem ser mais vulneráveis a certos ambientes do que as células mesenquimais, e a mudança diária do meio cultural também proporcionou um ambiente limpo para o surgimento da população epitelial. Perder células devido a mudanças médias frequentes pode ser uma limitação deste protocolo. No entanto, a mudança diária do meio foi realizada após a solução de problemas para este protocolo e, consequentemente, as células epiteliais apareceram e se expandiram. Atrasar a mudança média pode afetar as culturas. Como a pelota celular após a centrifugação é quase invisível, a ponta estreita de um tubo cônico de 15 mL aumenta a facilidade de remoção de supernasces sem perder a pelota celular. Portanto, este protocolo sugere transferir o conteúdo do tubo cônico de 50 mL para um tubo cônico de 15 mL.
O DF fornece um volume maior de tecido e mais células únicas do que o PDL. Assim, o DF pode ser usado em vez do PDL como fonte de tecido para o isolamento de células epiteliais dentárias humanas. A seleção e a inibição dos tipos celulares no DF podem ser feitas simplesmente através de um meio de cultura seletiva. O SFM induz o crescimento epitelial, enquanto o meio que contém soro seleciona para células mesenquimais. Essa metodologia permite fácil acessibilidade às células epiteliais dentárias humanas. Morsczek e colegas anteriormente isolaram precursores mesenquimais derivados do DF. Este estudo difere do deles pela seleção de populações epiteliais e pela inibição de células mesenquimais.
O papel regulatório das células epiteliais dentárias durante a formação dentárias é de grande interesse na pesquisa odontológica. Estudar interações epiteliais-mesenquimais durante o desenvolvimento dos dentes pode sugerir pistas para a resolução de problemas clínicos13. A regeneração tecidual combinando componentes epiteliais e mesenquimais foi tentada14. Fatores derivados de células epiteliais dentárias, como um derivado da matriz de esmalte, têm sido avaliados como alvos terapêuticos visando a regeneração periodontal, regeneração complexa da celulose e recolocação periodontal2,15. A combinação de fatores de regeneração, incluindo células-tronco, folhas de células epiteliais-mesenquimais, fatores derivados de células e biomateriais, pode gerar biodentes em caso de perda dentária ou agênese16. Genes associados à agênese dentária, como os genes PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR e WNT10A, são genes reguladores chave potenciais candidatos para interações epiteliais-mesenquimais17. Além disso, dados derivados do método de sequenciamento de última geração de estudos associados à agênese dentária podem propor similarmente novos genes-alvo putativos que regulam o controle molecular durante interações epiteliais-mesenquimais dentárias.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subsídios da National Research Foundation of Korea (NRF) financiados pelo governo coreano (NRF-2017R1C1B2008406 e NRF-2021R1F1A1064350). Dr. Hee-Yeon Bae gentilmente forneceu o DF para a cultura primária.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
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