Summary
Diş folikülleri epitel popülasyonu ve mezenkimal hücreler içerir. Epitel popülasyonu, farklı bir kültür ortamı sağlanarak heterojen diş folikül hücre popülasyonundan seçilmiştir. Epitel hücreleri hayatta kaldı ve serumsuz bir ortamda koloniler oluşturdu.
Abstract
Diş kökü (DF), etkilenen üçüncü azı dişinin oral maksillofasiyal bir cerrah tarafından çıkarılması sırasında hasat edildi. Epitel hücre izolasyonu DF hasat gününde gerçekleştirildi. DF, DPBS ile üç kez yıkandı ve daha sonra doku pulpalı veya yumuşak bir kıvama gelene kadar doku makası ile parçalandı. Tek hücreli popülasyonlar santrifüjleme ile peletlendi ve keratinosit serumsuz ortamla yıkandı. Heterojen hücre popülasyonları bir kültür çanağı içinde dağıtıldı. Epitel hücrelerini seçmek için keratinosit serumsuz ortam kullanıldı. Kültür ortamı, yüzen enkaz veya ölü hücre gözlenene kadar günlük olarak değiştirildi. Epitel hücreleri hücre popülasyon dağılımından sonraki 7-10 gün içinde ortaya çıktı. Epitel hücreleri serumsuz ortamda hayatta kalırken, %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş α modifikasyonlu minimal esansiyel ortam mezenkimal tip hücrelerin çoğalmasını sağladı. DF, dental epitel hücrelerinin izolasyonu için bir doku kaynağıdır.
Bu çalışmanın amacı epitel hücrelerinin insan DF'den izolesi için bir yöntem oluşturmaktı. Periodontal ligament (PDL) insan diş epitel hücrelerinin izolasyonu için kullanıldı. Epitel hücrelerinin insan PDL'sinden temini, küçük doku hacmi nedeniyle her zaman başarılı değildir ve bu da düşük sayıda epitel hücresine yol açmaktadır. DF, PDL'den daha büyük bir hacme sahiptir ve daha fazla hücre içerir. DF, insan diş epitel hücrelerinin birincil kültürü için bir doku kaynağı olabilir. Bu protokol, PDL kullanan yalıtım yönteminden daha kolay ve daha verimlidir. İnsan diş epitel hücrelerinin temini, dental epitel-mezenkimal etkileşimlerin daha fazla çalışmalarını kolaylaştırabilir.
Introduction
Diş oluşumu oral epitelin invaginasyonu ile başlar1. Diş gelişim evresine göre, oral epitel iç ve dış emaye epitel, servikal döngü ve Hertwig'in epitel kök kılıfası (HERS) dahil olmak üzere farklı isimlere sahiptir. Epitel bölmeleri çevredeki mezenkimal hücrelerle iletişim kurar. Epitel-mezenkimal etkileşimler diş oluşumunu ve doku yenilenmesini düzenler. Oral keratinositler ve Hertwig'in epitel kök kılıf hücreleri (HERSC' ler) gibi diş epitel hücrelerinin temini, diş epitel-mezenkimal etkileşimlerinin incelenmesi için çok önemlidir2.
Kemirgen türevi diş epitel hücreleri, HERS gibi epitel yapısından izole edilir. Li ve meslektaşları, gelişmekte olan diş mikroplarının apikal kısmını 8 günlük sıçanlardan topladıktan sonra fare azı dişi türevi HERSC'leri izole etti ve ölümsüzleştirdi3. HERS büyütme altında apikal dokudan ayrıldı. Diş gelişim evresi ve yaşı göz önüne alındığında, etik sorunlar nedeniyle HERS'yi insanlardan hasat etmek neredeyse imkansızdır: insan HERS'ini hasat etmek için gelişmekte olan bir diş mikropunun küçük bir çocuktan çıkarılması gerekir. Olgunlaşmamış diş mikropları nadiren çıkarılır. İnsan diş epitel hücreleri diş eti ve periodontal bağdan (PDL) izole edilebilir. Epitel yapıdan türetilmiş hücreler mezenkimal bileşenlerle birlikte diş oluşumuna katılırlar ve ağız keratinositlerine göre diş epitel-mezenkimal etkileşimlerinin incelenmesi için daha uygun olabilir. Malassez'in (ERM) epitel hücre dayanaları HERS türevi epitel kalıntılarıdır ve PDL4'te az sayıda bulunmaktadır. Çalışmalar, insan HERSC'lerin PDL5'ten izole edilmesini rapor eder. Bununla birlikte, PDL dokusundan insan HERSC'leri toplamak, bu konumdaki epitel popülasyonunun azlığı nedeniyle her zaman başarılı değildir5,6.
Kemirgen türevi HERSC'ler serum içeren medyada tutulsa da3,7, insan DF türevi epitel hücreleri, normal insan epidermal keratinositleri ve normal insan oral keratinositleri8,9 gibi diğer insan epitel hücrelerine benzer serumsuz ortamlarla kültürlenir. Bu, kemirgen diş epitel hücreleri ile insan diş epitel hücreleri arasındaki fizyolojik veya fonksiyonel farklılıkları ima eder. Dental epitel-mezenkimal etkileşimlerle ilgili mekanizmanın anlaşılması, replantasyon sırasında periodontal reattachment, periodontal hastalıkta periodontal rejenerasyon, pulp-dentin kompleks rejenerasyonu ve biyo-diş üretimi dahil olmak üzere klinik uygulamaların gelişimine katkıda bulunabilir. Çevirisel araştırmaların özellikleri göz önüne alındığında, epitel-mezenkimal etkileşimlerin incelenmesi için insan diş epitel hücreleri kemirgen diş epitel hücrelerinden daha uygun olabilir.
İnsan DF gevşek bir bağ dokusudur ve genellikle etkilenen bir dişte bulunur. DF mezenkimal öncüller içerir10. Bununla birlikte, bilgimize göre, 2021'den önce hiçbir çalışma epitel hücrelerinin diş köklerinden izole edilmesini bildirmemiştir. Oh ve Yi, 20218'de epitel hücrelerinin insan DF'den izole olduğunu bildirdi. Epitel fenotip batı şişkinliği ve morfolojik analiz ile doğrulandı. DF türevi epitel hücrelerinin kökeninin analizi, diğer çalışmalarla benzer sonuçlar göstermiştir. DF türevi epitel hücreleri ne endotel ne de hematopoetik5,11'di ve Oh ve Yi bu hücreleri DF-HERSC olarak adlandırmayı önerdi. DF, PDL'den daha büyük bir hacme sahiptir ve DF'den daha fazla epitel hücresi yalıtılabilir. Bu, epitel kolonilerinin ortaya çıkışını arttırır ve DF'den epitel hücrelerinin toplanmasında yüksek bir başarı oranı ile sonuçlanır. Bu çalışma, diş epitel hücrelerinin izolasyonu için DF'nin bir doku kaynağı olarak kullanılmasını önermektedir.
Bu çalışmada, daha önce açıklanan prosedürlere göre tek hücreler DF'den izole edildi10,12. DF heterojen hücre popülasyonları içerir ve prosedürün erken aşamasında birkaç hücre tipi bulunabilir. Morsczek ve meslektaşları DF türevi mezenkimal kök hücreleri izole ettiler10. DF'nin epitel hücreleri içerdiğini ve serumsuz koşullarda sadece epitel hücrelerinin hayatta kalabileceğini vardır diye hipotez ettik. Bu çalışma, epitel popülasyonunun seçimi ve mezenkimal hücrelerin inhibisyonu açısından Morsczek ve ark. Seçim, epitel hücre çoğalmasına izin veren ve mezenkimal hücre çoğalmasını engelleyen keratinosit serumsuz ortam (SFM) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu çalışma Oh ve Yi8 tarafından hazırlanan bir rapordan kaynaklanmıştır. Bu çalışmanın amacı, epitel hücrelerinin insan DF'den izolesi için bu raporda kullanılan yöntemin ayrıntılarını açıklamaktı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Gangdong'daki Kyung Hee Üniversite Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (IRB onayı no. KHNMC 2017-06-009).
1. DF Topla
NOT: Hastalar ameliyattan önce olgun veya olgunlaşmamış etkilenen üçüncü azı dişinin çıkarılması için bilgilendirilmiş onay verdiler. Aşağıdaki hastalığa sahip hastalar hariç tutuldu: diyabet, hipertansiyon, tüberküloz, hepatit, edinilmiş immün yetmezlik sendromu. Hamile kadınlar da dışlandı.
- Etkilenen üçüncü azı dişlerinin cerrahi ekstraksiyonu sırasında hasat DF (Şekil 1A).
NOT: Cerrahi oral maksillofasiyal cerrah tarafından yapıldı. Doku toplanması için bir diş hekimi ile işbirliği gereklidir. - DF'i kullanmadan önce 4 °C'de %3 penisilin-streptomisin içeren Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) saklayın. DF hasat gününde izolasyon prosedürleri gerçekleştirin (Şekil 1B).
2. Tek hücreli popülasyonları DF'den izole edin
- DPBS'de kollajenaz tip I ve proteaz stok çözeltileri hazırlayın, böylece kollajenaz tipi I ve proteazın son konsantrasyonları sırasıyla 1 mg/mL ve 2,4 mg/mL'dir.
- Tüp başına 20 mL DPBS ile üç adet 50 mL yıkama tüpü hazırlayın. Tüpleri 1, 2 ve 3 olarak etiketle.
- DF'yi yıkama tüplerinde sırayla yıkayın. DF'yi cımbızla tutun ve DF'yi tüp 1'e yerleştirin. DF'yi tüp 1'den çıkar ve tüp 2'ye yerleştirin. DF'yi tüp 2'den çıkar ve tüp 3'e yerleştirin. DF'i her tüpte 10-15 kez hafifçe sallayın. Üç kez yıkadıktan sonra, DF'yi 60 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin (Şekil 2A).
- DF'nin doku makası ile kıyması (Şekil 2B). Doku kaybını en aza indirmek için kültür çanasına sadece küçük bir kısmını aktarın. DF hamurlu veya yumuşak bir görünüme sahip olana kadar kesimi tekrarlayın (Şekil 2C).
- Sırasıyla 1 mg/mL ve 2,4 mg/mL'lik son konsantrasyonları elde etmek için 15 mL konik tüpte 1 mL kollajenaz tip I ve 1 mL proteaz çözeltisini karıştırın.
- Kıyılmış DF'i adım 2.5'ten 15 mL konik tüpe aktarın. Tüpü 37 °C'de 1 saat boyunca hafifçe çalkalayın ve kuluçkaya yatırın.
- Tüpe% 0.05 trypsin-EDTA'nın 5 mL'sini ekleyin, sallayın ve tüpü 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Keratinosit SFM%10 fetal sığır serumu (FBS) içeren keratinosit ortamı hazırlayın. Yeni bir 50 mL konik tüpe 3 mL keratinosit ortamı ekleyin. Bu tüpün üzerine 40 μm süzgeç yerleştirin ve 2.6 adımdan itibaren süpernatantı aspire etmek ve süzgeçten geçirmek için 10 mL serolojik pipet kullanın.
NOT: Süpernatant alırken sindirilmiş doku kalıntılarının birleştirilmesini en aza indirin. Başarısızlığı en aza indirmek için doku kalıntılarını 40 μm süzgeçle çıkarın. Doku kalıntıları 70 μm süzgeçlerden geçebilir ve koloni oluşumunu engelleyebilir. Keratinosit ortamındaki FBS enzimleri devre dışı bırakacaktır. - 2.7 ve 2.8.
- Toplanan süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- 15 mL konik tüpü 288 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin. Üsttekini çıkarın.
NOT: Çoğunlukla görünmez olan peletlenmiş hücrelerin yanlışlıkla çıkarılmasını önlemeye dikkat edin. - 3 mL keratinosit SFM ekleyin ve hücreleri adım 2.11'de olduğu gibi santrifüjlü 1 mL pipetle iki kez yıkayın.
- Tek hücreli popülasyonu keratinosit SFM kullanarak 60 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin. Kültür çanağini 37 °C'de %5 CO2'lik nemli bir atmosferde 5 mL'lik son hacimde saklayın. Doku veya hücre döküntümü gözlenene kadar kültürü günlük olarak değiştirin.
NOT: Ortamı değiştirerek kültür ortamındaki kayan kalıntıları kaldırın. Doku kalıntılarının veya ölü hücrelerin gecikmeli olarak çıkarılması birincil kültür üzerinde elverişsiz bir etkiye sahiptir. - Epitel hücrelerinin büyümesini kontrol etmek için plakayı adım 2.13'ten inceleyin (Şekil 3A).
NOT: Epitel hücreleri tek hücreli popülasyonları kaplatma sonrasında 7-10 gün içinde büyür. - Epitel kolonilerini genişletin ve hücreleri alt kültüre edin.
- Ortamı aspire edin ve kültür plakasının altını bir kez 3 mL keratinosit SFM ile yıkayın.
- 2 mL hücre ayrışması proteaz ekleyin ve 3 dakika boyunca 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde kuluçkaya yatırın.
NOT: Hücre ayırma etkili değilse 2.15.2 adımlarını yineleyin. - Kültür plakasına 2 mL keratinosit ortamı ekleyin ve içeriği 15 mL konik bir tüpe aktarın.
NOT: Adım 2.15.2 yinelenirse daha fazla keratinosit ortamı eklemek gerekli değildir. - 15 mL konik tüpü 288 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 3 mL keratinosit SFM ile iki kez yıkayın.
- Hücreleri keratinosit SFM (100 mm çanak başına 10 mL son hacim) kullanarak 100 mm'lik bir kültür çanağında plakalayın.
- Hücre stoklarını sıvı bir azot tankında hazırlayın ve saklayın.
- 2.15.1-2.15.5 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri hasat edin.
- Hücreleri 1 mL donma ortamında cryovials'a dağıtın (%80 keratinosit SFM, %10 dimetilsüllfoksit, %10 FBS).
- Şişeleri dondurucu bir kaba yerleştirin ve 24 saat boyunca -80 °C'de saklayın.
- Şişeleri derin dondurucudan sıvı bir azot tankına aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DF hasadı
Ameliyat oral maksillofasiyal cerrah tarafından yapıldı. Diş parçası, diş eti dokusu ve DF dahil olmak üzere insan kaynaklı malzemeler bir cerrah tarafından toplanmıştır (Şekil 1A). DF diş parçasına bağlı olabilir. Oral maksillofasiyal cerrah DF'yi tanımlayabilecektir. Doku toplanması için cerrahla işbirliği ve iletişim gereklidir. DF düzensiz şekilli membran benzeri bir dokudur. Diş eti dokusu keratinize bir yüzeye sahiptir ve DF'den ayırt edilebilir. Pulpa dokusu pulpa odasında bulunur ve ameliyat sırasında dişlerden nadiren ayrılır. DF, kullanılmadan önce 4 °C'de %3 penisilin-streptomisi ile DPBS'de depolanmıştır (Şekil 1B).
DF'nin mekanik tedavisi
DF DPBS ile yıkanarak doku kalıntıları ve kan alındı. Yıkama solüsyonu ile üç konik tüp hazırlandı. Yıkandıktan sonra, DF 60 mm veya 100 mm kültür çanağı üzerine aktarıldı (Şekil 2A). DF, doku pulpalı veya lapa gibi bir görünüme sahip olana kadar makasla kıyılmalıdır (Şekil 2B, C).
Epitel popülasyonunun ortaya çıkışı
Heterojen hücre popülasyonlarını kapladıktan sonra, kültür ortamında birçok hücre ve küçük döküntü yüzdü. Yüzen hücrelerin sayısı art arda gelen orta değişikliklerle giderek azaldı. Gecikmiş orta değişim bulanık bir kültür ortamına neden olabilir. İlk aşamada, kültür çanağının altında farklı hücre tipleri görülür, ancak keratinosit SFM'de muhafaza edildiğinde kaybolur. Epitel morfolojisi olan hücreler tek hücreli popülasyonları kaplatma sonrasında 7-10 gün içinde ortaya çıkar (Şekil 3A). Parke taşı şeklindeki hücrelerin sayısı, zamanla kolonilere genişleyen epitel hücrelerinin ortaya çıkması sırasında 1 ila 10 arasında değişmektedir (Şekil 3B).
Hücre ayrışmasını teşvik etmek için DF temas alanını %0,05 tripsin-EDTA ile artırmak için kıyma prosedürü tekrarlandı. DF hamurundan bozulmamış DF'den daha fazla tek hücre hasat edildi. DF hamurunun yapışkanlığı, epitel hücrelerinin izolasyonunun başarı olasılığını gösterdi. Günlük ortam değişiklikleri keratinosit SFM'nin bulanıklaşmasını engelledi, bu da epitel hücre sağkalım için önemli.
Şekil 1: İnsan kaynaklı malzemeler. (A) oral maksillofasiyal cerrah tarafından insan kaynaklı malzemeler toplanmıştır. Sarı ok DF'i gösterir. Siyah oklar diş parçasını ve dişe bağlı yumuşak dokuyu gösterir. (B) DF, 4 °C'de %3 penisilin-streptomisi ile desteklenmiş PBS'de depolandı. İzolasyon işlemleri toplamadan 24 saat içinde gerçekleştirildi. Kısaltmalar: DF = diş kökü; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Diş köklerinin tedavisi. (A) DF, DPBS ile üç kez yıkandıktan sonra 60 mm'lik bir kültür yemeğine aktarıldı. (B) DF doku makası ile kıyılmıştır. (C) Kıyılmış DF hamurlu veya lapa gibi bir görünüme sahipti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Epitel hücrelerinin ortaya çıkışı. (A) Epitel morfolojisi olan hücreler, tek hücreli popülasyonların kaplandıktan sonraki 7-10 gün içinde ortaya çıkar. (B) DF türevi epitel hücrelerinin alt kültüre göre ex vivo genişlemesi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: DF = diş folikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol kritik adımları içerir. Tek hücreli popülasyonların toplanması, epitel hücrelerinin DF'den başarılı bir şekilde izole edilmesinin olmazsa olmazıdır. DF'de daha fazla epitel hücresi olduğu hipotezimize dayanarak epitel hücrelerini DF'den izole etmeye çalıştık. Kıyma prosedürü, hücrelerin DF'den ayrılarak salınmalarını artırır. Kıyma prosedürü geliştirildi ve DF tek hücrelerin salınımını kolaylaştırmak için hamurlu görünene kadar kıyma tekrarlandı. Maksimum tek hücre sayısını elde etmek, epitel popülasyonunun ortaya çıkış olasılığını arttırır. Kontaminasyon sıklıkla epitel hücrelerinin DF'den izolasyonu sırasında ortaya çıkar. 40 μm süzgeçlerin kullanımı, doku kalıntılarının 70 μm süzgeçlerden geçebileceği ve epitel hücre kolonizasyonunu inhibe edebileceğinden, doku kalıntılarının tek hücreli popülasyonlara dahil edilmesini en aza indirir.
Epitel hücreleri belirli ortamlara karşı mezenkimal hücrelere göre daha savunmasız görünmektedir ve kültür ortamının günlük olarak değişmesi de epitel popülasyonunun ortaya çıkması için temiz bir ortam sağlamıştır. Sık orta değişiklik nedeniyle hücreleri kaybetmek bu protokolün bir sınırlaması olabilir. Bununla birlikte, bu protokol için sorun giderme işleminden sonra ortamın günlük değişimi gerçekleştirildi ve sonuç olarak epitel hücreleri ortaya çıktı ve genişledi. Orta değişimi geciktirmek kültürleri etkileyebilir. Santrifüjleme sonrası hücre peleti neredeyse görünmez olduğundan, 15 mL konik tüpün dar ucu, hücre peletini kaybetmeden süpernatant çıkarma kolaylığını arttırır. Bu nedenle, bu protokol 50 mL konik tüpün içeriğinin 15 mL konik bir tüpe aktarılmasını önerir.
DF, PDL'den daha büyük bir doku hacmi ve daha fazla tek hücre sağlar. Bu nedenle, DF, insan diş epitel hücrelerinin izolasyonu için bir doku kaynağı olarak PDL yerine kullanılabilir. DF'deki hücre tiplerinin seçimi ve inhibisyonu sadece seçici bir kültür ortamı aracılığıyla yapılabilir. SFM epitel büyümesine neden olarak, serum içeren ortam ise mezenkimal hücreler için seçim yapıyor. Bu metodoloji, insan diş epitel hücrelerine kolay erişilebilirlik sağlar. Morsczek ve meslektaşları daha önce DF türevi mezenkimal öncülleri izole ettiler. Bu çalışma epitel popülasyonlarının seçimi ve mezenkimal hücrelerin inhibisyonu ile onlarınkinden farklıdır.
Diş epitel hücrelerinin diş oluşumu sırasındaki düzenleyici rolü diş araştırmalarında büyük ilgi çekse de büyük ilgi çekicidir. Diş gelişimi sırasında epitel-mezenkimal etkileşimlerin incelenmesi klinik sorunların çözümü için ipuçları önerebilir13. Epitel ve mezenkimal bileşenlerin birleştirilmesiyle doku yenilenmesi denenmiştir14. Emaye matrisi türevi gibi dental epitel hücre türevi faktörler periodontal rejenerasyon, pulp-dentin kompleks rejenerasyon ve periodontal reattachment2,15'i hedefleyen terapötik hedefler olarak değerlendirilmiştir. Kök hücreler, epitel-mezenkimal hücre tabakaları, hücreden türetilmiş faktörler ve biyomalzemeler de dahil olmak üzere rejenerasyon faktörlerinin kombinasyonu, diş kaybı veya agenezis durumunda biyo-diş üretebilir16. PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR ve WNT10A genleri gibi diş agenezisi ile ilişkili genler, epitel-mezenkimal etkileşimler için potansiyel aday anahtar düzenleyici genlerdir17. Ayrıca, diş agenezisi ile ilişkili çalışmalardan elde edilen yeni nesil dizileme yöntemi kaynaklı veriler, benzer şekilde diş epitel-mezenkimal etkileşimleri sırasında moleküler kontrolü düzenleyen putatif yeni hedef genler önerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kore hükümeti (NRF-2017R1C1B2008406 ve NRF-2021R1F1A1064350) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) hibeleriyle desteklenmiştir. Dr. Hee-Yeon Bae, birincil kültür için DF'yi nazik olarak sağladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig's epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Developmental Biology. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig's epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig's epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig's epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
