Denne artikel præsenterer en metode til spatiotemporal analyse af mobile, enkelt-molekyle Förster resonans energioverførsel (smFRET)-baserede sonder ved hjælp af widefield fluorescens mikroskopi. Den nyudviklede software toolkit gør det muligt at afgøre smFRET tidsspor af bevægelige sonder, herunder den korrekte FRET-effektivitet og de molekylære positioner, som tidsfunktioner.
Single-molecule Förster resonans energioverførsel (smFRET) er en alsidig teknik rapportering om afstande i sub-nanometer til nanometer rækkevidde. Det har været anvendt i en bred vifte af biofysiske og molekylære biologiske eksperimenter, herunder måling af molekylære kræfter, karakterisering af kropsbygningsdynamikken i biomolekyler, observation af intracellulær colocalization af proteiner og bestemmelse af receptor-ligand interaktionstider. I en widefield mikroskopi konfiguration, eksperimenter udføres typisk ved hjælp af overflade-immobiliserede sonder. Her præsenteres en metode, der kombinerer sporing af enkeltmolekyler med skiftevis excitation (ALEX) smFRET-eksperimenter, der tillader erhvervelse af smFRET-tidsspor af overfladebundne, men alligevel mobile sonder i plasmamembraner eller glasstøttede lipid-bilayers. Til analyse af registrerede data blev der udviklet en automatiseret, open source-softwaresamling, der understøtter i) lokalisering af fluorescerende signaler, (ii) sporing af enkeltpartikler, iii) bestemmelse af FRET-relaterede mængder, herunder korrektionsfaktorer, iv) streng verifikation af smFRET-spor og (v) intuitiv præsentation af resultaterne. De genererede data kan bekvemt bruges som input til yderligere udforskning via specialiseret software, f.eks. til vurdering af sondernes diffusion eller undersøgelse af FRET-overgange.
Förster resonans energioverførsel (FRET) har været en vigtig drivkraft i molekylær biologisk og biofysisk forskning, da det giver mulighed for undersøgelse af processer ved sub-nanometer opløsning. Da effektiviteten af energioverførsel mellem donor og acceptorfluoripher i høj grad afhænger af den interfarvede afstand i sub-nanometeret til nanometerområdet, er det effektivt blevet brugt som spektroskopisk lineal til at udforske statisk og dynamisk kropsbygning af biomolekyler1,2,3,4. Derudover har FRET-fænomenet været meget udbredt til colocalization undersøgelser af membran-associerede og intracellulære proteiner på et bulkniveau5,6. I de sidste to årtier blev metoden tilpasset til overvågning af smFRET-hændelser7, hvilket bidrog til at øge den tidsmæssige og rumlige opløsning betydeligt og løste selv sjældne delpopulationer i heterogene prøver. Udstyret med disse teknikker blev der opnået unik indsigt i dynamikken i molekylære maskiner såsom udskriftsbehandlingshastigheden af RNA polymerase II8, replikationshastighed af DNA-polymeraser9,10, nukleosomtranslokationshastighed11, udskriftssplejsning og stallingshastighed af samlede splekom12, aktiviteten af ribosomale delpopulationer13 og kinesinmotorers ganghastighed14 , for at nævne nogle få. Receptor-ligand interaktion varigheder15 og molekylære kræfter16 er blevet kvantificeret.
Intensitetsbaserede smFRET-undersøgelser er typisk afhængige af sensibiliseret emission for at måle FRET-effektivitet: en strålekløver i emissionsvejen adskiller rumligt lys, der stammer fra donor- og acceptorfluoriorter ved donor excitation, hvilket giver mulighed for kvantificering af individuelle fluorescensintensiteter. Effektiviteten kan efterfølgende beregnes som den del af fotoner, der udsendes af acceptoren med hensyn til det samlede fotonantal17. Desuden tillader acceptor excitation efter donor excitation (ALEX) måling af stoichiometri af FRET begivenheder, medvirken i forskelsbehandlingen mellem ægte lave FRET signaler fra signaler, der opstår, f.eks fra sonder byder på en fotoblecheret acceptor fluorophore18.
Enkelt-molekyle FRET eksperimenter er almindeligt udført på en af to måder. For det første belyses et lille område i prøvevolumen ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Enkelt sonde molekyler i opløsning er begejstrede, når de tilfældigvis diffus inden for brændvolumen. Med denne teknik kan hurtige fotontællingsdetektorer bruges, hvilket muliggør submikrosekundtidsopløsning. For det andet er sonder specielt immobiliseret på overflader og overvåges via widefield mikroskopi, ofte ved hjælp af total intern refleksion (TIR) konfiguration for at minimere baggrund fluorescens. Sonde immobilisering giver mulighed for meget længere optagelsestider end ved hjælp af den første tilgang. Derudover tillader det større synsfelt overvågning af flere sonder parallelt. Behovet for et kamera gør denne metode langsom i forhold til den, der er beskrevet ovenfor. Tidsopløsningen er begrænset til millisekunderne til andet område.
Hvis der kræves spor i lang tid, f.eks. til at studere dynamiske processer på et millisekund til anden gangskala, er den første metode ikke relevant, da fluorescensudbruddene typisk er for korte. Den anden fremgangsmåde mislykkes, når immobilisering ikke er mulig, f.eks. i levende celleeksperimenter med sonder, der spredes i cellemembranen. Desuden er det blevet observeret, at biologiske modelsystemer kan variere deres respons dramatisk afhængigt af mobiliteten af den kontaktede overflade16.
Mens kombinerede smFRET og single-partikel tracking eksperimenter optagelse mobile FRET sonder er blevet udført i de seneste19, der er ingen offentligt tilgængelig software til evaluering af data. Dette førte til udviklingen af en ny analyseplatform, som giver mulighed for bestemmelse af flere egenskaber af mobile fluorescerende sonder, herunder smFRET-effektivitet og stoichimetri, positioner med nøjagtighed underpixel og fluorescensintensiteter som tidsfunktioner. Metoder til filtrering af de resulterende spor ved at undersøge trinvis blegning adfærd, nærmeste nabo afstande, emission intensiteter, og andre træk blev etableret for udelukkende at vælge korrekt syntetiseret og funktionelle enkelt-sonde molekyler. Softwaren understøtter også eksperimentelle og analytiske teknikker, der for nylig blev aftalt i en multilaboratorisk undersøgelse for at producere pålidelige, kvantitative smFRET-data17. Gennemførelsen overholder navnlig de validerede procedurer for beregning af FRET-effektivitet og stoichimetri. Fluorescensintensiteter ved donor excitation i donor emission kanal IDD og acceptor emission kanal IDA anvendes til beregning af den tilsyneladende FRET effektivitet Eapp ved hjælp af Eq (1).
(1)
Ved hjælp af fluorescensintensiteten i acceptoremissionskanalen ved acceptor excitation IAA beregnes den tilsyneladende stoichimetri ved hjælp af Eq (2).
(2)
FRET-effektivitet E og stoichiometri S kan udledes af Eapp og Sapp ved at overveje fire korrektionsfaktorer.
α beskriver udsivningen af donorfluescens i acceptoremissionskanalen og kan bestemmes ved hjælp af en prøve, der kun indeholder donorfluoriorter, eller ved at analysere dele af baner, hvor acceptoren er blevet bleget. δ korrigerer for donor excitation lyskildens direkte excitation og kan måles ved hjælp af en prøve med kun acceptorfluoriorter eller ved at analysere dele af baner, hvor donoren er blevet bleget.
.
γ skalerer IDD for at rette op på divergerende detektionseffektivitet i donor- og acceptoremissionskanaler og forskellige kvanteeffektiviteter i fluorophorerne. Faktoren kan beregnes ved at analysere stigningen i donorintensiteten ved acceptor blegning i baner med høj FRET effektivitet20 eller ved at studere en prøve byder på flere diskrete FRET stater.
β skalaer IAA til at korrigere for forskellige effektivitetsgevinster af donor og acceptor excitation. Hvis γ blev bestemt via acceptor blegning analyse, β kunne beregnes ud fra en stikprøve af kendte donor-til-acceptor ratio21. Ellers giver fret-prøven med flere stater også β.
Tilsammen gør korrektionerne det muligt at beregne den korrigerede FRET-effektivitet ved hjælp af Eq (3).
(3)
og den korrigerede stoichimetri ved hjælp af Eq (4).
(4)
Ideelt set giver den korrigerede stoichimetri for et 1:1 donor-til-acceptor-forhold S = 0,5. I praksis giver et reduceret signal-til-støj-forhold en spredning af de målte værdier af S, hvilket hæmmer forskelsbehandlingen fra donorsignaler (S = 1) og acceptorsignaler (S = 0). De resulterende tidsspor kan bruges som input til en mere detaljeret analyse af enkeltmolekylets baner for at få oplysninger som spatiotemporal kraftprofiler16, mobiliteten af enkeltmolekylehændelserne22 eller overgangskinetik mellem forskellige tilstande1.
Følgende protokol beskriver eksperimentelle parametre og procedurer for smFRET-sporingseksperimenter samt arbejdsprincippet bag dataanalyse ved hjælp af den nyudviklede softwarepakke. Ved erhvervelse af eksperimentelle data anbefales det at anvende en mikroskopiopsætning, der opfylder følgende krav: i) evne til at detektere emissionen af enkeltfarvemolekyler; ii) bredfeltsbelysning: navnlig for levende celleforsøg anbefales total intern refleksion (TIR23,24,25) konfiguration; iii) geografisk adskillelse af emissionslys i henhold til bølgelængde, således at donor og acceptor fluorescens projices på forskellige områder af samme kamerachip25 eller forskellige kameraer iv) graduering af lyskilder til donor og acceptor excitation med millisekunder præcision, f.eks ved hjælp af direkte modulatable lasere eller graduering via acousto-optiske modulatorer. Dette gør det muligt stroboskopisk belysning for at minimere fotobleaching af fluorophores samt vekslende excitation til bestemmelse stoichiometrier; v) output af én fil pr. optaget billedsekvens i et format, der kan læses af PIMS Python-pakken26. TIFF-filer med flere sider understøttes især.
Denne artikel beskriver en pipeline til automatiserede optagelser og kvantitativ analyse af smFRET-data, der stammer fra mobile, men overfladebundne sondemolekyler. Det supplerer de to fremherskende tilgange til smFRET eksperimenter, der involverer enten overflade-immobiliserede sonder eller sonder diffusing i opløsning ind og ud af en konfocal excitation volume17. Det giver den korrekte FRET effektivitet og de molekylære positioner som en funktion af tiden. Det kan derfor bruges som input til specialiserede analyseprogrammer, f.eks. til at kvantificere overgangs kinetik1, FRET-histogrammer39 eller todimensionel diffusion22.
Softwaren frigives under en gratis og open source-licens, der er godkendt af Open Source Initiative, der giver brugeren den evige ret til gratis brug, ændring og omfordeling. Github blev valgt som udviklings- og distributionsplatform for at gøre det så nemt som muligt at få softwaren og deltage i udviklingsprocessen ved at rapportere fejl eller bidrage med kode40. Skrevet i Python, softwaren afhænger ikke af proprietære komponenter. Valget af Jupyter notebooks som brugergrænseflader letter inspektionen af data på hvert analysetrin og giver mulighed for at skræddersy og udvide rørledningen specielt til det eksperimentelle system ved hånden. Den sdt-python bibliotek32 tjener som fundament og gennemfører funktionalitet til at evaluere fluorescens mikroskopi data, såsom enkelt-molekyle lokalisering, diffusion analyse, fluorescens intensitet analyse, farve kanal registrering, colocalization analyse, og ROI håndtering.
I princippet kan enkeltpartikelsporing udføres i en-, to- eller tredimensionelle systemer. Her blev enkeltmolekyleanalysepipelinen skræddersyet til studiet af 2D-mobile systemer. Dette valg afspejler tilgængeligheden af enkle systemer, såsom planar-støttede lipid bilayers (SLBs), til at præsentere mobile fluorescerende sonder. Sådanne lipid bilayer systemer er typisk består af to eller flere fosfolipider moieties, hvor bulk fraktion bestemmer de vigtigste fysisk-kemiske parametre i SLB (såsom fase og viskositet), og den mindre fraktion giver fastgørelsessteder for biomolekyler. Disse vedhæftede filer kan være biotinylerede fosfolipider til avidin- eller streptavidin-baserede proteinplatforme eller nikkel-NTA konjugerede fosfolipider til proteinplatforme med histidin tags41. Valget af den rette platform til at forbinde proteiner med SLB afhænger af det videnskabelige spørgsmål. Læserne kan henvise til litteraturen16,38,42 for eksempler på succesfuldt anvendte strategier. Massefylden af sonder i prøven skal være tilstrækkelig lav til at undgå overlappende punktspredningsfunktioner. typisk anbefales mindre end 0,1 molekyler pr. μm2. Se afsnittet om repræsentative resultater (især figur 6) for et eksempel, der viser en passende sondetæthed. Analysemetoden gælder også for enkelt fluorescerende mærkede proteinmolekyler, der spredes i plasmamembranen i levende celler.
Et kritisk aspekt af smFRET eksperimenter er produktion og karakterisering af FRET sonder selv. Når de vælger fluorophorer til et FRET-par, skal deres Förster-radius matche de forventede interfarveafstande43. Farvestoffer, der er resistente over for fotobleaching, foretrækkes, da de giver langtidsspor. Men for forhøjede blegningshastigheder kan en fluorophore-art bruges til at genkende multiemitterhændelser, der stammer fra colocalized molekyler via trinvis fotobleachinganalyse; se trin 8.1.4 i protokolafsnittet. Fluorophorepar skal være sted-specifikt og kovalent fastgjort til molekyler af interesse, danner intra- eller intermolekylær FRET par.
Kombinationen af smFRET med andre lettilgængelige teknikker kan øge dens rumlige opløsning ud over diffraktionsgrænsen (via STED44). SmFRET tracking algoritme præsenteret her udvider tilgangens anvendelighed til nye eksperimentelle indstillinger og modelsystemer. Dette omfatter undersøgelser af i) kinetiske ændringer i stoichiometri af mobile biomolekyler, ii) dynamisk sammenslutning af mobile biomolekyler, iii) hastigheden af enzymatiske reaktioner hos frit diffuserende reaktanter og (iv) kinetik af kropslige ændringer af mobile biomolekyler. De to første eksempler kræver modelsystemer, der viser intermolekylær FRET, dvs. donor og acceptor, er konjugeret for at adskille biomolekylære enheder af interesse. Sidstnævnte eksempler kan gøre brug af biosensorer, der bærer donor og acceptor inden for samme molekylære enhed (intramolekylær FRET).
Intramolekylære FRET-baserede sensorer kan give indsigt i iboende kropslige ændringer af biomolekyler1,2,3,4, kropslige ændringer forårsaget af endogene eller ekstern kraftbelastning (molekylære kraftsensorer16) eller ionkoncentrationer i nanomiljøet, såsom calcium45 og pH46 . Afhængigt af modelsystemet og den foretrukne forankringsplatform kan sådanne smFRET-hændelser enten spores i 2D eller 3D: (i) planarsporing af smFRET-hændelser kan anvendes til kvantificering af receptor-ligand-interaktionstider inden for en plasmamembran, sammenslutningen af membranforankrede signalforstærkningskaskader og stoichiometriændringerne i overfladereceptorer; ii) volumensporing af smFRET-hændelser kan anvendes til intra- eller intermolekulære FRET-sonder i levende celler eller i in vitro-rekonstituerede systemer.
SmFRET-sporingsmetoden blev udviklet hovedsageligt med intramolekulære FRET-sonder i tankerne. Disse sonder har et fast og velkendt antal fluorescerende etiketter, et faktum, der blev udnyttet til at afvise data fra agglomererede og forkert syntetiserede (f.eks. ufuldstændigt mærkede) molekyler samt fra sonder, hvor en af fluorophorerne er blevet fotoblecheret. Men ved at justere filtreringstrinnene kan metoden også anvendes på intermolekulære FRET-sonder. For eksempel, i stedet for kun at acceptere molekyler med en enkelt donor og en enkelt acceptor fluorophore, kunne man undersøge de rumlige baner af donor og acceptor farvestoffer og vælge, for eksempel for co-diffusing donor-acceptor baner.
Da 3D-DAOSTORM-algoritmen har støtte til bestemmelse af et signals position langs den optiske akse via bygningsfejlen på grund af en cylindrisk linse i emissionsstrålevejen, kunne 3D-eksperimenter let integreres i analysepipelinen. I dette tilfælde vil acceptorsignalet ved acceptor excitation tjene til at bestemme stoichimetrien og den aksiale position. Analysesoftwaren kan også anvendes til at evaluere data fra eksperimenter med immobiliserede sonder ved at udnytte sin store grad af automatiserings- og filtreringsordninger. Faktisk blev smFRET effektivitet datasæt fra Holliday vejkryds immobiliseret på gel-fase bilayers38 analyseret ved hjælp af en tidlig version af softwaren.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den østrigske Videnskabsfond (FWF) projekter P30214-N36, P32307-B, og af Wien Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS) | Avanti Polar Lipids | 790404P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective | Zeiss | 000000-1084-514 | |
Axio Observer microscope body | Zeiss | ||
Bandpass filter | Chroma Technology Corp | ET570/60m | donor emission filter |
Bandpass filter | Chroma Technology Corp | ET675/50m | acceptor emission filter |
conda-forge | conda-forge community | community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda | |
Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5 | MENZEL | ||
Dichroic mirror | Semrock Inc | FF640-FDi01-25×36 | separation of donor and acceptor emission |
Dichroic mirror (quad band) | Semrock Inc | Di01-R405/488/532/635-25×36 | separation of excitation and emission light |
DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | for imaging buffer |
fret-analysis | Schütz group at TU Wien | Python package for smFRET data analysis; version 3 | |
Fura-2 AM | Thermo Fisher Scientific | 11524766 | |
HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | for imaging buffer |
iBeam Smart 405-S 405 nm laser | Toptica Photonics AG | ||
iXon Ultra 897 EMCCD camera | Andor Technology Ltd | ||
Lab-Tek chambers (8 wells) | Thermo Fisher Scientific | 177402PK | for sample preparation and imaging |
Millenia Prime 532 nm laser | Spectra Physics | ||
miniconda | Anaconda Inc. | Python 3 distribution. Min. version: 3.7 | |
Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression) | Addgene | 20860 & 20859 | |
OBIS 640 nm laser | Coherent Inc | 1185055 | |
Optosplit II | Cairn Research | ||
Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5253 | for imaging buffer |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
sdt-python | Schütz group at TU Wien | Python library for data analysis; version 17 | |
TetraSpek bead size kit | Thermo Fisher Scientific | T14792 | Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration |
USC500TH Ultrasound bath | VWR | for SUV formation |