自动化的单分子FRET探针二维时空分析

摘要

本文介绍了一种利用宽场荧光显微镜对基于移动单分子荧光共振能量转移（smFRET）探针进行时空分析的方法。新开发的软件工具包能够确定运动探针的smFRET时间轨迹，包括随时间变化的准确FRET效率和分子位置。

摘要

单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种多功能技术，可用于检测亚纳米至纳米尺度的距离。该技术已广泛应用于多种生物物理和分子生物学实验中，包括分子力的测量、生物大分子构象动态的表征、蛋白质在细胞内的共定位观察，以及受体-配体相互作用时间的测定。在宽场显微镜配置中，实验通常使用表面固定的探针进行。本文介绍了一种将单分子追踪与交替激发（ALEX）smFRET实验相结合的方法，能够获取等离子膜或玻璃支撑脂双层中表面结合但具有移动性的探针的smFRET时间轨迹。针对所记录数据的分析，开发了一套自动化、开源的软件工具集，支持（i）荧光信号的定位，（ii）单粒子追踪，（iii）FRET相关参数的计算（包括校正因子），（iv）smFRET轨迹的严格验证，以及（v）结果的直观呈现。所生成的数据可便捷地作为输入，用于后续通过专用软件进行深入分析，例如探针扩散行为的评估或FRET跃迁过程的研究。

引言

荧光共振能量转移（FRET）一直是分子生物学和生物物理学研究的重要推动力，因为它能够以亚纳米级分辨率研究各种过程。由于供体与受体荧光染料之间的能量转移效率强烈依赖于亚纳米至纳米尺度的染料间距，FRET 已被有效用作一种光谱尺，用于探究生物大分子的静态与动态构象^1,2,3,4。此外，FRET 现象还被广泛用于在群体水平上研究膜相关蛋白和细胞内蛋白的共定位^5,6。在过去的二十年中，该方法被改进用于监测单分子 FRET（smFRET）事件⁷，显著提高了时间和空间分辨率，并能够解析异质样品中罕见的亚群。借助这些技术，研究人员获得了关于分子机器动态行为的独特见解，例如 RNA 聚合酶 II 的转录加工速率⁸、DNA 聚合酶的复制速度^9,10、核小体的移位速率¹¹、剪接体组装后的转录本剪接与停滞速率¹²、核糖体亚群的活性¹³，以及驱动蛋白马达的行走速度¹⁴等。受体-配体相互作用的持续时间¹⁵和分子间作用力¹⁶也已得到量化。

基于强度的单分子FRET研究通常依赖敏化发射来测量FRET效率：在激发供体后，发射光路中的分束器在空间上分离来自供体和受体荧光团的光信号，从而可对各自的荧光强度进行定量。随后，FRET效率可计算为受体发射的光子数占总光子数的比例¹⁷。此外，供体激发后的受体激发（ALEX）可用于测量FRET事件的化学计量比，有助于区分真实的低FRET信号与例如由受体荧光团光漂白所导致的信号¹⁸。

单分子FRET实验通常采用以下两种方法之一进行。第一种方法是使用共聚焦显微镜照射样品体积中的微小区域。当溶液中的单个探针分子扩散进入焦点体积时，会被激发。利用该技术可使用快速光子计数探测器，实现亚微秒级的时间分辨率。第二种方法是将探针特异性地固定在表面，并通过宽场显微镜进行监测，通常采用全内反射（TIR）构型以最大限度减少背景荧光。探针的固定化使得记录时间远长于第一种方法。此外，更大的视场允许同时监测多个探针。但由于需要使用相机，该方法相较于上述方法速度较慢，时间分辨率被限制在毫秒到秒的范围。

如果需要长时间的记录，例如研究毫秒到秒时间尺度上的动态过程，则第一种方法不适用，因为荧光爆发通常过于短暂。当无法实现固定时，第二种方法也会失效，例如在活细胞实验中，探针在细胞膜内扩散的情况。此外，已有研究发现，生物模型系统对接触表面的流动性不同，其响应可能会发生显著变化¹⁶。

尽管过去已开展过结合单分子FRET（smFRET）与单粒子追踪实验以记录可移动FRET探针的研究¹⁹，但目前尚无公开可用的软件用于此类数据的分析。这促使了新分析平台的开发，该平台能够确定可移动荧光探针的多种性质，包括smFRET效率和化学计量比、亚像素精度的空间位置，以及随时间变化的荧光强度。已建立多种方法，通过逐步漂白行为、最近邻距离、发射强度及其他特征对所得轨迹进行筛选，以专门选择正确合成且功能正常的单探针分子。该软件还支持近期多实验室研究中达成共识的实验与分析技术，以生成可靠且定量的smFRET数据¹⁷。特别是，其实现遵循了经过验证的FRET效率与化学计量比计算流程。在供体激发条件下，供体发射通道的荧光强度 I_DD 和受体发射通道的荧光强度 I_DA 被用于根据公式（1）计算表观FRET效率 E_app。

（1）

通过受体激发后在受体发射通道中测得的荧光强度 I_AA，可利用公式（2）计算表观化学计量比。

（2）

通过考虑四个校正因子，可以从E_app和S_app推导出FRET效率E和化学计量比S。

α 描述的是供体荧光渗漏到受体发射通道的现象，可通过仅含供体荧光团的样品，或通过分析受体已被漂白的轨迹部分来确定。δ 用于校正供体激发光源对受体的直接激发，可通过仅含受体荧光团的样品，或通过分析供体已被漂白的轨迹部分来测定。

。

γ 因子通过调节供体和受体发射通道中发散的检测效率以及荧光染料不同的量子效率来校正 I_DD。该因子可通过分析高FRET效率轨迹中受体漂白后供体强度的增加²⁰，或通过研究具有多个离散FRET状态的样本来计算。

β 用于对 I_AA 进行缩放，以校正供体和受体激发效率的差异。如果 γ 是通过受体漂白分析确定的，则 β 可通过已知供体-受体比例的样品计算得到²¹。否则，多状态 FRET 样品也可提供 β 值。

综合这些校正，可利用公式（3）计算校正后的FRET效率。

（3）

以及使用公式（4）校正后的化学计量比。

（4）

理想情况下，供体与受体比例为1:1时校正后的化学计量比应为 S = 0.5。实际上，较低的信噪比会导致测得的 S 值分布分散，从而难以区分仅含供体的信号（S = 1）和仅含受体的信号（S = 0）。所得的时间轨迹可用于对单分子轨迹进行更详细的分析，以获取诸如时空力谱¹⁶、单分子事件的迁移性²²，或不同状态之间的转换动力学¹等信息。

以下方案描述了单分子FRET（smFRET）追踪实验的实验参数和操作步骤，以及使用新开发的软件套件进行数据分析的基本原理。为获取实验数据，建议采用满足以下要求的显微镜系统：i) 能够检测单个染料分子的发射光；ii) 宽场照明：特别是对于活细胞实验，推荐使用全内反射（TIR^23,24,25）配置；iii) 根据波长对发射光进行空间分离，使供体和受体荧光投射到同一相机芯片的不同区域或不同相机上²⁵；iv) 对供体和受体激发光源进行毫秒级精度的调制，例如使用可直接调制的激光器或通过声光调制器实现调制。这允许采用频闪光照明以最小化荧光团的光漂白，并通过交替激发来确定化学计量比；v) 每条记录的图像序列输出为一个文件，文件格式需可被PIMS Python软件包²⁶读取。特别是支持多页TIFF文件。

方案

1. 软件先决条件

1. 安装 miniconda Python 发行版²⁷（所需最低 Python 版本：3.7）。
2. 在 Windows 开始菜单中打开 Anaconda 命令提示符，或在 Linux 或 macOS 系统中打开终端并执行 conda activate。
3. 通过执行以下命令启用社区维护的 conda-forge 软件包仓库²⁸：
   conda config --add channels conda-forge
   conda config --set channel_priority strict
   conda update --all
4. 执行以下命令安装所需的 Python 软件包：
   conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
5. 熟悉分析软件的用户界面 JupyterLab（可参考软件文档²⁹）。
6. 安装版本控制系统 git，后续将用于下载和更新分析软件。若使用 Linux 系统，请使用发行版自带的包管理软件进行下载和更新；否则，请执行：
   conda install git
7. 可选：安装 sidecar Python 软件包，以便在分析过程中对数据集进行过滤后显示结果：
   conda install sidecar

2. 样品测量

图 1：图像采集。（A）激发序列。在使用 405 nm 激光记录染料标记细胞的可选图像后，分别使用 532 nm 和 640 nm 激光交替且重复地激发供体和受体，激发时间为 t_ill。供体与受体激发之间的时间 t_r 必须足够长，以允许相机完成图像读出。延迟时间 t_delay 可用于调节采集帧率，从而调整光漂白前的观察时间跨度。此图板修改自 ¹⁶。（B）使用定位标记（fiducial markers）计算两个发射通道之间的坐标变换。匹配的定位标记以颜色标示。应记录多幅偏移图像，以确保覆盖整个视场。（C）使用高度标记的样品记录用于平场校正的激光轮廓。先记录受体轮廓并使其光漂白，随后采集供体轮廓。应在样品的不同区域采集多幅图像，取平均并进行平滑处理，以减少样品缺陷（例如图像顶部中央的亮斑）的影响。（D）根据如 C 所述记录的 20 幅激光轮廓图计算得到的平场校正图 p(x,y)。缩写：FRET = Förster 共振能量转移；Im_DD = 供体激发下的供体发射图像；Im_DA = 供体激发下的受体发射图像；Im_AA = 受体激发下的受体发射图像。比例尺 = 5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 使用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机时，开启 EM 增益以在高信噪比条件下观测单分子信号（参见制造商说明书）。
2. 激发序列（详见图 1A）。
   1. 可选：记录一幅图像用于分割，以将数据分析限定于视场中的特定区域。例如，使用 405 nm 激光激发 Fura-2 负载的细胞，并采集其在约 510 nm 处的发射光，从而仅分析位于细胞与支撑脂双层（SLB）界面处的探针信号。随后，等待时间 t_r 以允许相机读出。
      注：对于 EMCCD 相机，t_r 取决于所选感兴趣区域（ROI）的行数。因此，选择较小的 ROI 可能更有利，因为它可减少帧间延迟和记录数据的大小。此外，启用帧转移模式可进一步缩短 t_r。
   2. 交替重复激发供体和受体荧光团。
      1. 激发供体持续照明时间 t_ill（通常 5–10 ms 已足够短，可避免运动模糊），同时触发相机。
      2. 等待时间 t_r 以允许相机读出。
      3. 激发受体，同时触发相机。
      4. 等待时间 t_delay。
         注：该时间必须长于 t_r，以确保相机完成读出，但除此之外可任意选择，应权衡时间分辨率与轨迹长度的需求。
      5. 重复步骤 2.2.2.1–2.2.2.4。重复次数应足够多，以确保视场内每个探针至少有一个荧光团发生光漂白，从而可通过逐步光漂白分析区分单分子信号与聚集体信号。
         注：选择合适的 t_ill 和激发激光强度通常需要一些实验探索：照明时间越长、激光强度越高，所得图像的信噪比越好，但所得时间轨迹越短。
3. 为每个样品记录足够数量的视频。

3. 确定校正因子的附加测量

1. 记录一系列在供体和受体发射通道中均可见的随机分布的定位标记，用于图像配准（即寻找将供体发射通道坐标映射到受体发射通道坐标，反之亦然的变换）。参见图1B。
   注：图像配准由软件完成；参见步骤6.1.4。
2. 测量供体和受体激发光源的强度分布，用于平场校正（即校正视场内激发光不均匀的问题）。为此，准备一个含有高密度FRET探针的样品，首先在受体激发条件下采集图像，随后对受体进行光漂白，再在供体激发条件下记录图像。为提高稳定性，可在不同样品区域重复多次。参见图1C、D。或者，可分别记录仅标记供体分子的样品和仅标记受体荧光团的样品。
   注：平场校正由分析软件完成；参见步骤8.1.2。
3. 记录不含受体荧光团的探针单分子样品（如第2节所述），以确定供体发射渗漏至受体通道的情况。
   注：供体渗漏也可在受体光漂白后，通过实际探针的时间轨迹计算得出。若记录了足够数量的此类事件，则无需额外测量。分析软件支持上述两种方法；参见补充信息第3.15节。
4. 采集不含供体荧光团的探针记录，用于量化供体激发光源对受体的直接激发。
   注：直接受体激发也可在供体光漂白后，通过实际探针的时间轨迹推导得出。若记录了足够数量的此类事件，则无需额外测量。分析软件支持上述两种方法；参见补充信息第3.15节。
5. 记录含有两种不同FRET效率的单分子样品，用于校正供体与受体发射通道检测效率的差异以及染料量子产率的不同。
   注：此类样品可以是例如Holliday junction¹，其在两种构象之间波动，或是在不同且明确定义的距离上连接FRET对的DNA棒状结构。若探针具有较高且足够稳定的FRET效率，校正也可通过探针时间轨迹中的受体漂白事件计算得出，此时无需额外测量。分析软件支持上述两种方法；参见补充信息第3.15节。

4. 单分子定位算法

注意：多个分析步骤需要单分子定位。根据信号密度、背景和信噪比，选择高斯拟合算法³⁰或质心计算方法³¹。

1. 为进行高斯拟合，通过相应的用户界面选择 3D-DAOSTORM³⁰ 算法。
   注意：3D-DAOSTORM 旨在区分即使点扩散函数重叠的信号。虽然这通常是优势，但存在一个注意事项：单个明亮信号有时会被识别为两个相邻信号，这可能会干扰追踪算法，导致检测出两条短轨迹而非一条长轨迹。
   设置以下参数（详细信息请参见提供该算法实现的 sdt-python 库的文档³²）。
   1. radius：根据有效像素尺寸，以像素为单位设置高斯拟合函数的初始 σ 值。
   2. threshold：为局部强度最大值设置最小振幅（即最亮像素值，已校正估计的局部背景），以决定是否进行拟合。
      注意：阈值可能是最重要的参数。若设置过低，噪声可能被视为荧光信号，且明亮信号可能被两个高斯函数拟合；若设置过高，则微弱信号将无法被拟合。
   3. model：设置为 2d 以拟合圆形高斯函数。
      注意：其他模型不适用于单分子FRET数据。
   4. find filter：在寻找局部最大值前应用滤波器以降低噪声，这在信噪比较低的情况下尤为有用。可选的滤波器包括：i) identity：无滤波；ii) Crocker-Grier：来自Crocker-Grier算法^31,33的带通滤波器；或 iii) Gaussian：由sigma参数设定σ值的高斯模糊。
      注意：对于Crocker-Grier滤波器，feat. size 参数应大致等于点扩散函数的像素半径。
      注意：拟合过程使用未滤波的原始数据进行。
   5. min. distance：若两个潜在信号之间的距离小于最小距离（像素），则用单个高斯函数进行拟合。
      注意：此设置有助于避免前述明亮信号被错误识别为两个相邻信号的情况。
   6. size range：选择拟合的最小和最大σ值，以剔除由噪声引起的虚假信号检测。
2. 通过相应的用户界面选择 Crocker-Grier 算法以执行质心计算（一种基于Crocker和Grier思想³³的改进算法³¹）。
   注意：该算法即使在低信噪比情况下以及处理具有不同强度范围的信号时也非常稳健，但无法精确拟合点扩散函数重叠的分子。
   1. radius：设置足够大的圆盘半径（以像素为单位），以包含整个点扩散函数。
   2. signal thresh.：为局部强度最大值设置最小振幅（高于估计背景的最亮像素），以决定是否进行分析。
      注意：若设置过低，噪声可能被视为荧光信号；若设置过高，则微弱信号将无法被拟合。
   3. mass thresh.：设置待分析信号的最小总强度（背景校正后像素值之和）。
      注意：上述相同考虑因素同样适用。

5. 软件初始化

1. 下载分析脚本。在 Anaconda 命令行中，使用 cd 命令导航至用于保存分析结果的文件夹，然后执行以下命令：
   git clone https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git 目标文件夹
   1. 将 目标文件夹 替换为具有描述性的名称，例如 2021-06-14_Force-FRET-experiment。
      注意：分析软件将被下载到此文件夹中；请确保该文件夹事先不存在。建议为每次实验单独下载一份分析脚本的副本，以便日后回顾分析过程、查看所用参数并进行修改。
2. 将 Jupyter 笔记本（01. Tracking.ipynb, 02. Analysis.ipynb, 03. Plots.ipynb）复制到新创建的文件夹中（以下简称 根文件夹）。如果这是首次使用该软件，请从 根文件夹 的 notebooks 子文件夹中获取这些文件。
   注意：如果已有类似数据集完成分析，从先前实验中复制笔记本可能更为便捷，因为相关参数可能仅有轻微调整。
3. 在 Anaconda 命令行中执行以下命令，启动 JupyterLab 服务器，打开一个显示 JupyterLab 的网页浏览器窗口：
   jupyter lab
   注意：浏览器仅作为用户界面，实际运算由 Anaconda 命令行中运行的进程完成。因此，关闭浏览器窗口影响较小；可通过访问 http://localhost:8888 恢复会话。但若在命令行中中断 JupyterLab 进程或关闭命令行窗口，则会终止分析，导致未保存的工作丢失。
4. 在 JupyterLab 浏览器窗口中，使用左侧窗格导航至 根文件夹，双击 01. Tracking.ipynb 以启动第一个笔记本。启动后，应出现一个新标签页，其中显示包含 Python 代码的若干方框，即“单元格”。
   注意：所有 Jupyter 笔记本均包含注释，用于说明每个代码单元格的功能。此外，将文本光标置于函数调用左括号 ( 前并按下 Shift+Tab，可查看该方法调用的详细文档。
5. 数据处理流程的概览见 图2。

图2：典型分析流程的概述。 请注意，过滤步骤需根据实验设计进行相应调整。本图改编自¹⁶。缩写：FRET = Förster共振能量转移。 请点击此处查看此图的放大版本。

注意：可用于试用该软件的示例数据可从 https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files 下载

6. 单分子定位、追踪及荧光强度分析（01. Tracking.ipynb）。

1. 使用 01. 跟踪.ipynb 用于单分子荧光信号强度值可靠分析的 Jupyter notebook，专为精确量化设计，尤其适用于 FRET 测量中常见的微弱信号（例如，高 FRET 事件中因供体信号弱或反之所致的信号）。
   注意：为此，将对原始数据中的像素强度进行直接积分，并校正局部背景。有关每一步分析的截图及函数调用参数说明，请参见 补充信息.
   1. 指定照明序列，以从记录的图像序列中选择供体和受体激发帧，以及用于图像分割的帧。
      注意：由于该软件允许处理采用任意照明方案记录的数据，因此必须指明图像序列中的哪一帧是在激发何种类型的荧光染料时采集的；参见 补充信息第1.2节，步骤3。原始图像序列的帧编号被保留。
   2. 描述并加载数据集。可同时分析多个数据集，前提是这些数据集使用相同的照明设置进行记录。为每个数据集分配一个标识符以及与相应图像序列文件名匹配的模式。此外，可定义特定数据集用于特殊用途，例如用于图像配准的基准标记记录、用于平场校正的激发光轮廓，以及可选的仅供体和仅受体样本，以确定校正因子。
   3. 如果使用单个相机记录了两个通道的原始图像，请选择发射通道。为此，使用相应的图形控件选择供体和受体发射的适当区域。
   4. 在两个发射通道中定位基准标记物并进行图像配准。使用提供的用户界面，为供体和受体发射通道的定位算法找到合适的参数。有关支持的定位算法信息，请参见第4节。
      注意：可通过其最近邻点的空间分布，在发射通道间识别随机分布的基准标记图1B）。选择性平面照明显微镜所用算法的自定义实现³⁴ 在 sdt-python 文库会自动将供体发射通道中每个标记物的位置与受体发射通道中的位置进行匹配。一种转换 T 通过仿射变换对标记物位置进行线性最小二乘拟合，确定供体发射通道坐标向受体发射通道坐标的映射关系³⁵RANSAC 用于处理异常值，例如上一步中错误匹配的位置。
   5. 在所有帧中分别通过供体和受体激发对FRET探针进行定位，并将结果合并为一个表格，其中包含原始帧编号、二维坐标以及指向源图像文件的标识符。
      注意：为此，该软件提供了用户界面，用于查找适用于定位算法的适当选项。
      1. 在供体激发下，通过供体发射所获得图像的叠加，对FRET探针进行定位 Im_DD 供体和受体发射 Im_DA，几乎不依赖于FRET效率。有关定位算法选项的详细信息，请参见第4节。
         注意：每幅总和图像是通过变换计算得出的 Im_DD 使用转化方法 T 先前通过图像配准获得，并逐像素相加到 Im_DA.
      2. 在受体发射通道中通过受体激发定位探针 Im_AA （关于定位算法的详细信息，请参见第4节）。
   6. 进行追踪及荧光强度测量。

图3：单分子强度测量。（A）对于位于橙色像素处的荧光团，其未校正强度 I_uncorr 通过将足够大圆盘内所有像素的强度（黄色和橙色像素）求和得到，该圆盘需覆盖所有受信号影响的像素：。局部背景通过计算圆盘周围环形区域（蓝色像素）内像素的平均值获得：，其中 n_ring 为环形区域中的像素数。荧光强度 I 是从未校正强度中减去背景的结果，即 I = I_uncorr - b × n_disk，其中 n_disk 为圆盘中的像素数。圆的半径由追踪方法的 feat_radius 参数指定。环的宽度由 bg_frame 参数确定。如果一个信号的点扩散函数与另一个信号的背景环发生重叠（下方面板），则受影响的像素（红色）将从局部背景分析中排除。如果两个点扩散函数相互重叠，则无法可靠地计算荧光强度，因此这些数据将被舍弃。（B, C）模拟结果表明，在低荧光强度下，应用标准差为1个像素的高斯模糊可使信噪比提高近2倍（B），且几乎不引入误差（轻微低估，小于1%，（C））¹⁶。此外，相对误差（即 (I_meas - I_truth)/I_truth，其中 I_truth 为真实值，I_meas 为分析结果）在整个强度范围内保持恒定，因此在比值型量（如FRET效率和化学计量比）中可相互抵消。所有图表均基于先前发表的研究¹⁶。缩写：SNR = 信噪比；FRET = 奥斯特共振能量转移。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 为用于将FRET探针定位结果连接成轨迹的trackpy³⁶ 算法选择合适的参数选项。具体而言，设置从一帧到下一帧的最大搜索距离，以及信号可能因漂白或定位遗漏而未被检测到的连续帧数。
   注意：这些间隙将通过前后位置之间的插值进行填补。插值得到的位置会被标记，仅用于后续读取强度值，不用于扩散分析。轨迹在受体发射通道的坐标系中进行分析。对于荧光强度分析（步骤6.1.6.2），使用通过图像配准获得的逆变换T^-1，将轨迹额外转换至供体发射通道的坐标系（见步骤6.1.4）。
2. 选择荧光强度计算算法的参数（详见图3A）。指定：i) 以信号位置为中心的圆盘半径，该圆盘应包含受该信号影响的所有像素；ii) 每个圆盘周围用于确定局部背景的环形区域的宽度。
   注意：为降低所获强度测量值中的噪声，对图像应用标准差为1像素的高斯模糊处理（图3B、C）。

7. 使用分析软件功能处理来自图像序列的辅助图像数据。
   1. 提取为便于分割而记录的额外图像（参见步骤 2.2.1，在激发序列中标记为 s 的图像（见补充信息，第 1.2 节，步骤 3））。
   2. 利用在高度标记样本上记录的图像，确定视野范围内供体和受体激发光的光强分布。
      注意：通过计算图像的逐像素平均值来获得光强分布，减去相机基线信号，并使用高斯滤波对图像进行模糊处理，以减少样本杂质带来的影响。最后，将所得图像的每个像素值除以其最大值，从而得到将坐标映射到区间 [0,1] 的分布函数 p(x,y)。

7. FRET 轨迹的可视化（可选）

1. 使用 inspector 应用程序在原始图像数据中显示单分子轨迹，以及相应的荧光强度、表观FRET效率和化学计量比。
   ​注意：此工具可用于评估所选参数的有效性，并手动接受或拒绝单个时间轨迹。有关截图和详细使用信息，请参见 补充信息。

8. 单分子数据分析与过滤（02. Analysis.ipynb）

1. 使用 02. Analysis.ipynb Jupyter 笔记本对通过 01. Tracking.ipynb 笔记本获得的单分子数据进行分析和过滤。典型的分析流程如下所述。
   注意：不同的科学问题和实验设计可能需要调整参数设置。使用 Jupyter 笔记本可以方便地通过省略、重新排列或修改分析步骤来适应需求。如需查看每一步分析的截图以及函数调用参数的说明，请参阅 补充信息。
   1. 执行初步过滤步骤。
      1. 舍弃点扩散函数重叠的信号，因为难以可靠地确定其荧光强度。
      2. 在照明不均匀的情况下，仅接受视野中照明良好区域内的信号，以确保良好的信噪比。
      3. 若研究分子内 FRET，则将分析限制在图像序列开始时即存在的轨迹，以确保所有光漂白步骤均被记录，并可在后续逐步光漂白分析中正确评估。
         注意：在进行涉及分子间 FRET 探针的实验时，若供体和受体荧光团并非预先形成的复合物的一部分，则可能无法将分析限制在初始存在的轨迹上。
   2. 执行平场校正，利用步骤 6.1.7.2 中获得的激发光源分布，消除因照明不均导致的位置依赖性荧光强度变化。
      注意：位于位置 (x,y) 的探针的荧光强度 I(x,y) 通过 进行校正；参见 图 1C,D。
   3. 计算表观 FRET 效率 E_app（即从供体荧光团传递至受体荧光团的能量比例）和表观化学计量比 S_app（即在衍射极限斑点内供体荧光团数量与总荧光团数量之比）。
      注意：通过绘制每个数据点的 E 与 S 关系图，可区分由供体-受体距离变化引起的 FRET 效率改变与由化学计量比变化引起的改变¹⁸。这使得能够区分因染料分离导致的 E = 0 与因缺乏活性受体导致的 E = 0。E-S 图在整个分析过程中用作质量评估工具；示例见 图 4。
   4. 对光漂白进行逐步分析，以区分单分子探针与聚集体。请选择以下任一选项。
      注意：为此，分析软件分别对供体激发下的荧光强度（I_DD + I_DA）和受体激发下的荧光强度（I_AA）应用一种自定义实现的变点检测算法 PELT³⁷³²。
      1. 选择选项 1，即受体荧光团以单步方式漂白，而供体无部分漂白（即不存在漂白至非零强度的步骤）。
         注意：此选项进一步排除供体在受体之前以单步方式漂白的轨迹。当受体光漂白速率较高时，建议优先选择选项 1。
      2. 选择选项 2，即供体荧光团以单步方式漂白，而受体无部分漂白。
         注意：此选项进一步排除供体在受体之后以单步方式漂白的轨迹。当供体光漂白速率较高时，建议优先选择选项 2。
      3. 选择选项 3，即任一荧光团以单步方式漂白，而另一荧光团无部分漂白。
         注意：选项 3 比选项 1 和 2 更具灵活性，建议作为数据分析的首选。
      4. 选择选项 4，即供体和受体荧光团均表现为单步光漂白或完全无光漂白。
         注意：当光漂白速率较低时，建议优先选择选项 4。
   5. 计算供体发射泄漏至受体通道的校正因子 α、直接受体激发的校正因子 δ、探测效率 γ 以及激发效率 β¹⁷。
   6. 利用上述校正因子，由表观效率 E_app 计算 FRET 效率 E，并由表观化学计量比 S_app 计算实际化学计量比 S。
   7. 执行进一步的过滤步骤。仅选择每条轨迹中首次漂白事件之前的数据点。此外，仅保留至少 75% 的数据点满足 0.35 < S < 0.6 的轨迹，以将分析限制在单分子探针范围内（数值可调）。
      注意：应根据目标群体与需排除群体（如仅含供体或仅含受体的群体）的分布情况选择合适的上下限。根据经验，0.35 < S < 0.6 在许多实验条件下已被证明是合理的选择。
   8. 通过对适当的辅助图像（见步骤 2.2.1 和 6.1.7）采用全局或自适应阈值法进行图像分割³⁵，将分析限制在视野内的特定区域。
      ​注意：这允许例如仅对位于细胞-SLB 界面或图案化结构上的探针进行评估。

9. 结果绘图与进一步分析 (03. Plot.ipynb)

注意：Jupyter 笔记本的截图及函数调用参数说明请参见补充信息。

1. 创建 E-S 图以验证已正确识别并去除化学计量比错误的信号。
2. 绘制FRET效率的直方图，以提供FRET效率分布的成熟且清晰的概览。将直方图分组，便于比较不同实验的结果。
3. 在笔记本中利用科学Python库进一步分析数据（例如扩散分析、在使用分子力传感器的实验中将FRET效率转换为作用力，或进行转换分析）。
   注意：数据也可导出为多种文件格式，作为其他分析软件的输入。

结果

根据实验的科学问题，可以从单分子FRET轨迹中提取多种低级和高级信息。本文展示了使用模拟探针和数字探针的分析流程示例：分别为基于肽的分子力传感器¹⁶和具有构象随机切换的DNA探针³⁸。有关这些探针的设计和工作原理，请参见图5。

在按照本方案所述执行定位和追踪算法后，该软件包提供了多种数据可视化工具，用于优化初始参数及后续的过滤步骤：（i）单个单分子FRET事件的可视化，（ii）可选的图像分割功能，用于分析特定感兴趣区域内的数据，（iii）通过FRET效率与化学计量比（E-S）图监控过滤步骤。单分子数据的可视化结果如图6所示。

最后，经过筛选的FRET事件通过E-S图和FRET效率直方图表示（图4）。E-S图是优化上述筛选步骤并分析最终结果的有用工具。部分漂白或标记不完全的FRET探针可通过其化学计量值予以排除。通过在x-y图（图6）或均方位移（MSD）图（图4）中绘制单个轨迹路径，可分析其运动特性。前者特别适用于区分可移动事件与固定事件，而后者用于计算扩散系数。

图 4：典型输出结果。（A）分子力传感器群体在玻璃支撑的脂双层上分布，并受到T细胞牵拉，其FRET效率相对于化学计量比作图（E-S 图）显示于左图。仅可见一个群体云。对应的FRET效率直方图展示了有细胞与无细胞条件下力传感器群体之间的差异（中图）。在T细胞存在时，传感器群体的FRET效率未出现向低值偏移的现象，表明传感器模块几乎未发生依赖于力的拉伸。这些实验条件下的均方位移（MSD）图进一步证实，位于T细胞下方的力传感器群体移动显著慢于未结合状态的对应群体（右图）。（B）相同分析应用于霍利迪交叉DNA传感器，该传感器分布于玻璃支撑的流动脂双层上。E-S 图清晰显示两个群体，这在FRET效率直方图中也明显可见。MSD图表明存在一个快速移动的传感器群体。缩写：FRET = Förster共振能量转移；MSD = 均方位移。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：分子内FRET探针的设计与工作原理。（A）用于量化分子机械力的模拟肽传感器。供体和受体荧光团共价连接在肽骨架的两端。传感器模块位点特异性地连接到特定配体上，该配体继而结合细胞表面的目标受体（此处为特异性识别T细胞受体β链的抗体片段）。在受体-配体结合后，施加力，传感器模块伸展，并在键断裂后最终回缩。此图板修改自¹⁶。（B）用于量化FRET转换的数字DNA传感器。FRET传感器由四条DNA链组成，形成一个Holliday连接结构。供体和受体荧光团共价连接在其中两条链上。Holliday连接结构会根据周围缓冲液条件频繁切换其构象。这些构象的随机切换可通过量化单个探针的FRET效率进行监测。缩写：TCR = T细胞受体；FRET = Förster共振能量转移。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：FRET 探针定位与追踪的示例。（A）通过定量供体荧光团在供体激发下的强度（D → D）、受体荧光团在供体激发下的强度（D → A）以及受体荧光团在受体激发下的强度（A → A），计算单个事件的 FRET 效率和化学计量比。最近邻滤波可防止邻近发射体点扩散函数重叠带来的偏差。图像分割允许用户选择定位于特定区域（例如细胞或微图案）内的单分子 FRET 事件。作为图像分割的示例，T 细胞用 Fura-2 染色（左侧显示），并进行自适应阈值处理以识别细胞边缘（橙色虚线）。比例尺 = 5 µm。（B）使用分子力传感器的单分子 FRET 轨迹。可在 x-y 平面绘制单个轨迹，以可视化其扩散行为和定位（左图）。此外，可将每条轨迹的强度随时间变化绘制成图，以识别 FRET 转换或漂白步骤（中图显示左图中的红色轨迹）。所得的 FRET 效率和化学计量比也可类似地可视化（右图）。（C）使用 Holliday 结构 DNA 传感器的单分子 FRET 轨迹。测量过程中使用 HBSS + 12 mM MgCl₂ 作为缓冲液。除这些示例序列末端附近明显的受体漂白步骤外，还可确定每种传感器的 FRET 转换频率。Holliday 结构频繁发生构象转换，而分子力传感器则不表现出 FRET 转换。该信息可用于调整实验条件（例如帧间延迟），以增加或减少观察到的转换次数。缩写：FRET = Förster 共振能量转移；smFRET = 单分子 FRET；HBSS = Hank's 平衡盐溶液。请点击此处查看该图的放大版本。

补充信息：单分子定位与追踪（01. Tracking.ipynb）。 请点击此处下载该文件。

讨论

This article details a pipeline for the automated recordings and quantitative analysis of smFRET data originating from mobile yet surface-tethered probe molecules. It complements the two predominant approaches to smFRET experiments, involving either surface-immobilized probes or probes diffusing in solution into and out of a confocal excitation volume¹⁷. It provides the correct FRET efficiency and the molecular positions as a function of time. It can therefore be used as input for specialized analysis programs, e.g., to quantify transition kinetics¹, FRET histograms³⁹, or two-dimensional diffusion²².

The software is released under a free and open-source license approved by the Open Source Initiative that grants the user the perpetual right to free usage, modification, and redistribution. Github was chosen as a development and distribution platform to make it as easy as possible to obtain the software and participate in the development process by reporting bugs or contributing code⁴⁰. Written in Python, the software does not depend on proprietary components. The choice of Jupyter notebooks as user interfaces facilitates the inspection of data at every analysis step and allows for tailoring and extending the pipeline specifically for the experimental system at hand. The sdt-python library³² serves as the foundation and implements functionality to evaluate fluorescence microscopy data, such as single-molecule localization, diffusion analysis, fluorescence intensity analysis, color channel registration, colocalization analysis, and ROI handling.

In principle, single-particle tracking can be performed in one-, two- or three-dimensional systems. Here, the single-molecule analysis pipeline was tailored to the study of 2D mobile systems. This choice mirrors the availability of simple systems, such as planar-supported lipid bilayers (SLBs), to present mobile fluorescent probes. Such lipid bilayer systems are typically composed of two or more phospholipids moieties, where the bulk fraction determines the key physicochemical parameters of the SLB (such as phase and viscosity), and the minor fraction provides attachment sites for biomolecules. These attachment sites can be biotinylated phospholipids for avidin- or streptavidin-based protein platforms or nickel-NTA conjugated phospholipids for protein platforms with histidine tags⁴¹. The choice of the appropriate platform for linking proteins to the SLB depends on the scientific question. Readers can refer to the literature^16,38,42 for examples of successfully employed strategies. The density of probes in the sample should be sufficiently low to avoid overlapping point spread functions; typically, less than 0.1 molecules per µm² are recommended. See the representative results section (in particular, Figure 6) for an example showing a suitable probe density. The analysis method is also applicable to single fluorescently labeled protein molecules diffusing in the plasma membrane of live cells.

One critical aspect of smFRET experiments is the production and characterization of the FRET probes themselves. When choosing fluorophores for a FRET pair, their Förster radius should match the expected inter-dye distances⁴³. Dyes resistant to photobleaching are preferred as they yield long time traces. However, for elevated bleaching rates, one fluorophore species can be utilized to recognize multiemitter events originating from colocalized molecules via stepwise photobleaching analysis; see step 8.1.4 in the protocol section. Fluorophore pairs should be site-specifically and covalently attached to the molecules of interest, forming intra- or intermolecular FRET pairs.

Combining smFRET with other readily available techniques can increase its spatial resolution beyond the diffraction limit (via STED⁴⁴). The smFRET tracking algorithm presented here widens the approach's applicability to new experimental settings and model systems. This includes studies of (i) kinetic changes in the stoichiometry of mobile biomolecules, (ii) dynamic association of mobile biomolecules, (iii) the rate of enzymatic reactions of freely diffusing reactants, and (iv) the kinetics of conformational changes of mobile biomolecules. The first two examples require model systems that show intermolecular FRET, i.e., donor and acceptor are conjugated to separate biomolecular entities of interest. The latter examples may make use of biosensors carrying donor and acceptor within the same molecular entity (intramolecular FRET).

Intramolecular FRET-based sensors can provide insight into intrinsic conformational changes of biomolecules^1,2,3,4, conformational changes caused by endogenous or external force load (molecular force sensors¹⁶), or ion concentrations in the nano-environment such as calcium⁴⁵ and pH⁴⁶. Depending on the model system and the preferred anchoring platform, such smFRET events can either be tracked in 2D or 3D: (i) planar tracking of smFRET events can be employed for the quantification of receptor-ligand interaction times within a plasma membrane, the association of membrane-anchored signal amplification cascades, and the stoichiometry changes of surface receptors; (ii) volume tracking of smFRET events can be used for any intra- or intermolecular FRET probes in living cells or in in vitro reconstituted systems.

The smFRET tracking method was developed mainly with intramolecular FRET probes in mind. These probes feature a fixed and well-known number of fluorescent labels, a fact that was exploited to reject data from agglomerated and incorrectly synthesized (e.g., incompletely labeled) molecules, as well as from probes where one of the fluorophores has been photobleached. However, by adjusting the filtering steps, the method can also be applied to intermolecular FRET probes. For instance, instead of accepting only molecules featuring a single donor and a single acceptor fluorophore, one could examine the spatial trajectories of donor and acceptor dyes and select, for example, for co-diffusing donor-acceptor trajectories.

As the 3D-DAOSTORM algorithm has support for determining a signal's position along the optical axis via the astigmatism due to a cylindrical lens in the emission beam path, 3D experiments could be easily integrated into the analysis pipeline. In this case, the acceptor signal upon acceptor excitation would serve to determine the stoichiometry and the axial position. The analysis software can also be employed to evaluate data from experiments featuring immobilized probes by utilizing its large degree of automation and filtering schemes. In fact, smFRET efficiency datasets from Holliday junctions immobilized on gel-phase bilayers³⁸ were analyzed using an early version of the software.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]（镍盐）（Ni-NTA-DOGS）	Avanti Polar Lipids	790404P
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）	Avanti Polar Lipids	850375P
1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）	Avanti Polar Lipids	850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 油镜	Zeiss	000000-1084-514
Axio Observer 显微镜主机	Zeiss
带通滤光片	Chroma Technology Corp	ET570/60m	供体发射滤光片
带通滤光片	Chroma Technology Corp	ET675/50m	受体发射滤光片
conda-forge	conda-forge 社区		Anaconda/miniconda 的社区维护 Python 软件包仓库
盖玻片 60 mm × 24 mm #1.5	MENZEL
二向色镜	Semrock Inc	FF640-FDi01-25×36	分离供体与受体发射光
二向色镜（四通道）	Semrock Inc	Di01-R405/488/532/635-25×36	分离激发光与发射光
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	用于成像缓冲液
fret-analysis	TU Wien 的 Schütz 团队		用于单分子 FRET 数据分析的 Python 软件包；版本 3
Fura-2 AM	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	用于成像缓冲液
iBeam Smart 405-S 405 nm 激光器	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD 相机	Andor Technology Ltd
Lab-Tek 培养板（8 孔）	Thermo Fisher Scientific	177402PK	用于样品制备与成像
Millenia Prime 532 nm 激光器	Spectra Physics
miniconda	Anaconda Inc.		Python 3 发行版，最低版本要求：3.7
单价链霉亲和素（用于细菌表达的质粒）	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 nm 激光器	Coherent Inc	1185055
Optosplit II	Cairn Research
卵清蛋白	Sigma-Aldrich	A5253	用于成像缓冲液
等离子清洗仪	Harrick Plasma	PDC-002
sdt-python	TU Wien 的 Schütz 团队		用于数据分析的 Python 库；版本 17
TetraSpek 微球尺寸试剂盒	Thermo Fisher Scientific	T14792	随机分布且固定的定位标记，用于图像配准
USC500TH 超声波清洗仪	VWR		用于 SUV 的制备