Denne artikkelen presenterer en metode for romlig analyse av mobil, enkeltmolekyl Förster resonans energioverføring (smFRET)-baserte sonder ved hjelp av widefield fluorescensmikroskopi. Det nyutviklede programvareverktøysettet gjør det mulig å bestemme smFRET-tidsspor for bevegelige sonder, inkludert riktig FRET-effektivitet og molekylære posisjoner, som tidsfunksjoner.
Single-molekyl Förster resonans energioverføring (smFRET) er en allsidig teknikk som rapporterer om avstander i sub-nanometeret til nanometerområdet. Det har blitt brukt i et bredt spekter av biofysiske og molekylære biologiske eksperimenter, inkludert måling av molekylære krefter, karakterisering av konformasjonsdynamikk av biomolekyler, observasjon av intracellulær kolokalisering av proteiner og bestemmelse av reseptor-ligand interaksjonstider. I en widefield mikroskopikonfigurasjon utføres eksperimenter vanligvis ved hjelp av overflate-immobiliserte sonder. Her presenteres en metode som kombinerer sporing av enkeltmolekyler med vekslende eksitasjonseksitasjon (ALEX) smFRET-eksperimenter, som tillater oppkjøp av smFRET-tidsspor av overflatebundne, men mobile sonder i plasmamembraner eller glassstøttede lipid-bilayers. For analyse av registrerte data ble det utviklet en automatisert programvaresamling med åpen kildekode som støtter (i) lokalisering av fluorescerende signaler, (ii) enkeltpartikkelsporing, (iii) bestemmelse av FRET-relaterte mengder, inkludert korreksjonsfaktorer, (iv) streng verifisering av smFRET-spor og (v) intuitiv presentasjon av resultatene. De genererte dataene kan enkelt brukes som innspill til videre utforskning via spesialisert programvare, for eksempel for vurdering av sondenes diffusjonsadferd eller undersøkelse av FRET-overganger.
Förster resonans energioverføring (FRET) har vært en stor driver i molekylær biologisk og biofysisk forskning, da det tillater undersøkelse av prosesser ved sub-nanometeroppløsning. Ettersom effektiviteten av energioverføring mellom donor og akseptorfluoreforer sterkt avhenger av interfargeavstanden i sub-nanometeret til nanometerområdet, har det effektivt blitt brukt som en spektroskopisk hersker for å utforske statisk og dynamisk konformasjon av biomolekyler1,2,3,4. I tillegg har FRET-fenomenet blitt mye brukt til colokaliseringsstudier av membranrelaterte og intracellulære proteiner på et bulknivå5,6. I løpet av de siste to tiårene ble metoden tilpasset overvåking av smFRET-hendelser7, noe som bidro til å øke tidsmessig og romlig oppløsning betydelig og løste selv sjeldne subpopulasjoner i heterogene prøver. Utstyrt med disse teknikkene ble det oppnådd unik innsikt i dynamikken i molekylære maskiner som transkripsjonsbehandlingshastigheten til RNA polymerase II8, replikeringshastigheten til DNA-polymeraser9,10, nukleossomtranslokasjonshastighet11, transkripsjonsspleise og stalling rate av monterte skjøteosomer12, aktiviteten til ribosomale underbefolkninger13, og ganghastigheten til kinesinmotorer14 , for å nevne noen. Reseptor-ligand interaksjon varigheter15 og molekylære krefter16 har blitt kvantifisert.
Intensitetsbaserte smFRET-studier er vanligvis avhengige av sensibilisert utslipp for å måle FRET-effektivitet: En strålesplitter i utslippsbanen skiller lys som stammer fra donor- og akseptorfluoforer ved donoreksitasjon, noe som muliggjør kvantifisering av individuelle fluorescensintensiteter. Effektiviteten kan deretter beregnes som brøkdelen av fotoner som slippes ut av akseptoren med hensyn til det totale fotontallet17. I tillegg tillater akseptoreksitasjon etter donoreksitasjon (ALEX) måling av stoichiometrien til FRET-hendelsene, noe som bidrar til diskriminering mellom ekte lave FRET-signaler fra signaler som oppstår, for eksempel fra sonder med fotobleached acceptor fluorophore18.
Ettmolekyls FRET-eksperimenter utføres vanligvis på en av to måter. For det første lyser en liten region i prøvevolumet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Enkelt sondemolekyler i løsning er begeistret når de tilfeldigvis diffuserer innenfor brennvidden. Med denne teknikken kan raske fotontellingsdetektorer brukes, noe som muliggjør tidsoppløsning under mikrosekund. For det andre er sonder spesielt immobilisert på overflater og overvåket via widefield mikroskopi, ofte ved hjelp av total intern refleksjon (TIR) konfigurasjon for å minimere bakgrunnsfluorescens. Sonde immobilisering gir mye lengre opptakstider enn å bruke den første tilnærmingen. I tillegg tillater det større synsfeltet overvåking av flere sonder parallelt. Behovet for et kamera gjør denne metoden treg sammenlignet med den som er beskrevet ovenfor. Tidsoppløsningen er begrenset til millisekunder til andre område.
Hvis det kreves lange tidsspor, for eksempel for å studere dynamiske prosesser på en millisekunder til andre tidsskala, er den første metoden ikke anvendelig, da fluorescensutbruddene vanligvis er for korte. Den andre tilnærmingen mislykkes når immobilisering ikke er mulig, for eksempel i live-celle eksperimenter med sonder som sprer seg i cellemembranen. Videre har det blitt observert at biologiske modellsystemer kan variere responsen dramatisk avhengig av mobiliteten til den kontaktede overflaten16.
Mens kombinerte smFRET- og enkeltpartikkelsporingseksperimenter som registrerer mobile FRET-sonder har blitt utført i løpet av de siste 19, er det ingen offentlig tilgjengelig programvare for evaluering av dataene. Dette førte til utviklingen av en ny analyseplattform, som muliggjør bestemmelse av flere egenskaper til mobile fluorescerende sonder, inkludert smFRET effektivitet og stoichiometri, posisjoner med underpikselnøyaktighet og fluorescensintensiteter som tidsfunksjoner. Metoder for filtrering av de resulterende sporene ved å undersøke trinnvis blekingsadferd, nærmeste naboavstander, utslippsintensiteter og andre egenskaper ble etablert for utelukkende å velge riktig syntetiserte og funksjonelle enkeltsondemolekyler. Programvaren støtter også eksperimentelle og analytiske teknikker som nylig ble avtalt i en multilaboratorisk studie for å produsere pålitelige, kvantitative smFRET-data17. Spesielt overholder implementeringen de validerte prosedyrene for beregning av FRET-effektivitet og stoichiometri. Fluorescensintensiteter ved donoreksitasjon i donorutslippskanalen IDD og akseptorutslippskanalen IDA brukes til beregning av den tilsynelatende FRET-effektiviteten Eapp ved hjelp av Eq (1).
(1)
Ved hjelp av fluorescensintensiteten i akseptorutslippskanalen ved akseptoreksitasjon IAA beregnes den tilsynelatende stoichiometrien ved hjelp av Eq (2).
(2)
FRET effektivitet E og stoichiometri S kan avledes fra Eapp og Sapp ved å vurdere fire korreksjonsfaktorer.
α beskriver lekkasjen av donorfluorescens inn i akseptorutslippskanalen og kan bestemmes ved hjelp av en prøve som bare inneholder donorfluoriforer eller ved å analysere deler av baner der akseptoren har blitt bleket. δ korrigerer for direkte eksitasjon av akseptoren av donoreksitasjonslyskilden og kan måles ved hjelp av en prøve med bare akseptorfluoforer eller ved å analysere deler av baner der donoren har blitt bleket.
.
γ skalerer IDD for å rette opp avvikende deteksjonseffektivitet i donor- og akseptorutslippskanaler og forskjellige kvanteeffektiviteter hos fluoroforene. Faktoren kan beregnes ved å analysere økningen i donorintensitet ved akseptorbleking i baner med høy FRET-effektivitet20 eller ved å studere et utvalg med flere diskrete FRET-tilstander.
β skalerer IAA for å korrigere for ulik effektivitet av donor- og akseptoreksitasjon. Hvis γ ble bestemt via akseptorblekingsanalyse, kunne β beregnes ut fra et utvalg av kjent donor-til-akseptor ratio21. Ellers gir FRET-utvalget med flere tilstander også β.
Sammen tillater rettelsene beregningen av den korrigerte FRET-effektiviteten ved hjelp av Eq (3).
(3)
og riktig stoichiometri ved hjelp av Eq (4).
(4)
Ideelt sett gir korrigert stoichiometri for et 1: 1 donor-til-akseptorforhold S = 0,5. I praksis gir et redusert signal-til-støy-forhold en spredning av de målte verdiene til S, noe som hemmer diskrimineringen fra donorsignaler (S = 1) og akseptor-bare signaler (S = 0). De resulterende tidssporene kan brukes som inngang for en mer detaljert analyse av enkeltmolekylets baner for å skaffe informasjon som romlige kraftprofiler16, mobiliteten til enkeltmolekylhendelsene22, eller overgangskinetikk mellom forskjellige tilstander1.
Følgende protokoll beskriver eksperimentelle parametere og prosedyrer for smFRET-sporingseksperimenter, samt arbeidsprinsippet bak dataanalyse ved hjelp av den nyutviklede programvarepakken. For innsamling av eksperimentelle data anbefales det å bruke et mikroskopioppsett som oppfyller følgende krav: i) evne til å oppdage utslipp av enkeltfargemolekyler; ii) widefield belysning: spesielt for live-celle eksperimenter, total intern refleksjon (TIR23,24,25) konfigurasjon anbefales; iii) romlig separasjon av utslippslys i henhold til bølgelengde slik at donor og akseptorfluorescens projiseres på forskjellige regioner i samme kamerabrikke25 eller forskjellige kameraer; iv) modulering av lyskilder for donor- og akseptoreksitasjon med millisekundpresisjon, for eksempel ved bruk av direkte modulatable lasere eller modulering via acoustooptiske modulatorer. Dette tillater stroboskopisk belysning for å minimere fotobleaching av fluoroforer samt vekslende eksitasjon for å bestemme stoichiometries; v) utgang av en fil per innspilt bildesekvens i et format som kan leses av PIMS Python-pakken26. Spesielt støttes TIFF-filer med flere sider.
Denne artikkelen beskriver en rørledning for automatiserte opptak og kvantitativ analyse av smFRET-data som stammer fra mobile, men overflatetildelte sondemolekyler. Det kompletterer de to dominerende tilnærmingene til smFRET-eksperimenter, som involverer enten overflate-immobiliserte sonder eller sonder som sprer seg i løsning inn og ut av et konfokalt eksitasjonsvolum17. Det gir riktig FRET-effektivitet og molekylære posisjoner som en funksjon av tid. Det kan derfor brukes som inndata for spesialiserte analyseprogrammer, for eksempel for å kvantifisere overgangskinetikk1, FRET histogrammer39 eller todimensjonal diffusjon22.
Programvaren er utgitt under en gratis og åpen kildekode-lisens godkjent av Open Source Initiative som gir brukeren den evigvarende retten til fri bruk, endring og videredistribusjon. Github ble valgt som en utviklings- og distribusjonsplattform for å gjøre det så enkelt som mulig å skaffe programvaren og delta i utviklingsprosessen ved å rapportere feil eller bidra med kode40. Programvaren er skrevet i Python, og er ikke avhengig av proprietære komponenter. Valget av Jupyter bærbare PC-er som brukergrensesnitt forenkler inspeksjon av data på hvert analysetrinn og gjør det mulig å skreddersy og utvide rørledningen spesielt for det eksperimentelle systemet. Sdt-python-biblioteket32 fungerer som grunnlag og implementerer funksjonalitet for å evaluere fluorescensmikroskopidata, for eksempel enkeltmolekyl lokalisering, diffusjonsanalyse, fluorescensintensitetsanalyse, fargekanalregistrering, colokaliseringsanalyse og ROI-håndtering.
I prinsippet kan enkeltpartikkelsporing utføres i en-, to- eller tredimensjonale systemer. Her ble analyserørledningen for enkeltmolekyler skreddersydd for studiet av 2D-mobile systemer. Dette valget gjenspeiler tilgjengeligheten av enkle systemer, for eksempel planar-støttede lipid-bilayers (SLD-er), for å presentere mobile fluorescerende sonder. Slike lipidbilayersystemer består vanligvis av to eller flere fosfolipider moieties, hvor bulkfraksjonen bestemmer de viktigste fysisk-kjemiske parametrene til SLB (for eksempel fase og viskositet), og den mindre fraksjonen gir vedleggssteder for biomolekyler. Disse festestedene kan være biotinylerte fosfolipider for avidin- eller streptavidinbaserte proteinplattformer eller nikkel-NTA konjugerte fosfolipider for proteinplattformer med histidinmerker41. Valget av riktig plattform for å koble proteiner til SLB avhenger av det vitenskapelige spørsmålet. Leserne kan henvise til litteraturen16,38,42 for eksempler på vellykkede anvendte strategier. Tettheten av sonder i prøven bør være tilstrekkelig lav for å unngå overlappende punktspredningsfunksjoner; vanligvis anbefales mindre enn 0,1 molekyler per μm2. Se avsnittet om representative resultater (spesielt figur 6) for et eksempel som viser en passende sondetetthet. Analysemetoden gjelder også for enkelt fluorescerende merkede proteinmolekyler som sprer seg i plasmamembranen til levende celler.
Et kritisk aspekt ved smFRET-eksperimenter er produksjon og karakterisering av FRET-sondene selv. Når du velger fluoroforer for et FRET-par, bør Förster-radiusen samsvare med de forventede mellomfargede avstandene43. Fargestoffer som er motstandsdyktige mot fotobleaching, foretrekkes da de gir lange tidsspor. Men for forhøyede blekingshastigheter kan en fluoroforart brukes til å gjenkjenne multiemitterhendelser som stammer fra colokaliserte molekyler via trinnvis fotobleaching analyse; se trinn 8.1.4 i protokolldelen. Fluoroforpar bør være stedsspesifikke og kovalente festet til molekylene av interesse, og danner intra- eller intermolekylære FRET-par.
Kombinere smFRET med andre lett tilgjengelige teknikker kan øke sin romlige oppløsning utover diffraksjonsgrensen (via STED44). SmFRET-sporingsalgoritmen som presenteres her, utvider tilnærmingens anvendbarhet til nye eksperimentelle innstillinger og modellsystemer. Dette inkluderer studier av (i) kinetiske endringer i stoichiometri av mobile biomolekyler, (ii) dynamisk forening av mobile biomolekyler, (iii) frekvensen av enzymatiske reaksjoner av fritt diffuserende reaktanter, og (iv) kinetikken til konformasjonsendringer av mobile biomolekyler. De to første eksemplene krever at modellsystemer som viser intermolekylære FRET, det vil si donor og akseptor, blir konjugert for å skille biomolekylære enheter av interesse. De sistnevnte eksemplene kan gjøre bruk av biosensorer som bærer donor og akseptor innenfor samme molekylære enhet (intramolekylær FRET).
Intramolekylære FRET-baserte sensorer kan gi innsikt i iboende konformasjonsendringer av biomolekyler1,2,3,4, konformasjonsendringer forårsaket av endogen eller ekstern kraftbelastning (molekylær kraftsensorer16), eller ionkonsentrasjoner i nanomiljøet som kalsium45 og pH46 . Avhengig av modellsystemet og den foretrukne forankringsplattformen, kan slike smFRET-hendelser enten spores i 2D eller 3D: (i) planarsporing av smFRET-hendelser kan brukes til kvantifisering av reseptor-ligand interaksjonstider i en plasmamembran, foreningen av membranforankret signalforsterkning kaskader, og stoichiometriendringer av overflatereseptorer; (ii) volumsporing av smFRET-hendelser kan brukes til intra- eller intermolekylære FRET-sonder i levende celler eller i in vitro-rekonstituerte systemer.
SmFRET-sporingsmetoden ble utviklet hovedsakelig med tanke på intramolekylære FRET-sonder. Disse sondene har et fast og velkjent antall fluorescerende etiketter, et faktum som ble utnyttet til å avvise data fra agglomererte og feil syntetiserte (f.eks. ufullstendig merkede) molekyler, samt fra sonder der en av fluoroforene har blitt fotoblekert. Ved å justere filtreringstrinnene kan imidlertid metoden også brukes på intermolekylære FRET-sonder. For eksempel, i stedet for å akseptere bare molekyler med en enkelt donor og en enkelt akseptor fluorofor, kunne man undersøke de romlige banene til donor- og akseptorfargestoffer og velge for eksempel for co-diffuserende donor-akseptorbaner.
Ettersom 3D-DAOSTORM-algoritmen har støtte for å bestemme et signals posisjon langs den optiske aksen via astigmatismen på grunn av en sylindrisk linse i utslippsstrålebanen, kan 3D-eksperimenter enkelt integreres i analyserørledningen. I dette tilfellet vil akseptorsignalet ved akseptoreksitasjon tjene til å bestemme stoichiometrien og den aksiale posisjonen. Analyseprogramvaren kan også brukes til å evaluere data fra eksperimenter med immobiliserte sonder ved å bruke sin store grad av automatisering og filtreringsordninger. Faktisk ble smFRET effektivitetsdatasett fra Holliday-veikryss immobilisert på gelfase bilayers38 analysert ved hjelp av en tidlig versjon av programvaren.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Det østerrikske vitenskapsfondet (FWF) prosjektene P30214-N36, P32307-B, og av Vienna Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS) | Avanti Polar Lipids | 790404P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective | Zeiss | 000000-1084-514 | |
Axio Observer microscope body | Zeiss | ||
Bandpass filter | Chroma Technology Corp | ET570/60m | donor emission filter |
Bandpass filter | Chroma Technology Corp | ET675/50m | acceptor emission filter |
conda-forge | conda-forge community | community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda | |
Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5 | MENZEL | ||
Dichroic mirror | Semrock Inc | FF640-FDi01-25×36 | separation of donor and acceptor emission |
Dichroic mirror (quad band) | Semrock Inc | Di01-R405/488/532/635-25×36 | separation of excitation and emission light |
DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | for imaging buffer |
fret-analysis | Schütz group at TU Wien | Python package for smFRET data analysis; version 3 | |
Fura-2 AM | Thermo Fisher Scientific | 11524766 | |
HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | for imaging buffer |
iBeam Smart 405-S 405 nm laser | Toptica Photonics AG | ||
iXon Ultra 897 EMCCD camera | Andor Technology Ltd | ||
Lab-Tek chambers (8 wells) | Thermo Fisher Scientific | 177402PK | for sample preparation and imaging |
Millenia Prime 532 nm laser | Spectra Physics | ||
miniconda | Anaconda Inc. | Python 3 distribution. Min. version: 3.7 | |
Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression) | Addgene | 20860 & 20859 | |
OBIS 640 nm laser | Coherent Inc | 1185055 | |
Optosplit II | Cairn Research | ||
Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5253 | for imaging buffer |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
sdt-python | Schütz group at TU Wien | Python library for data analysis; version 17 | |
TetraSpek bead size kit | Thermo Fisher Scientific | T14792 | Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration |
USC500TH Ultrasound bath | VWR | for SUV formation |