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Biology

एक ट्रिपल कल्चर सेल सिस्टम मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा मॉडलिंग

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63134
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 3, 2, 1, 1, 1
1Univ. Artois, UR 2465, Laboratoire de la Barrière Hémato-Encéphalique (LBHE), 2Queen Mary University of London, Department of Chemistry, 3Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Department of Neurology and Clinical Neuroscience
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल विट्रो मॉडल में मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) स्थापित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट को एक सम्मिलित फिल्टर (रक्त डिब्बे) के प्रत्येक तरफ बीज दिया जाता है, और एस्ट्रोसाइट्स को नीचे के कुएं (मस्तिष्क डिब्बे) में बीज दिया जाता है। विशेषता वाले मॉडल का उपयोग नैनोकणों परिवहन प्रयोगों के लिए किया गया था।

Abstract

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के अत्यधिक विशिष्ट और प्रतिबंधात्मक गुणों के कारण मस्तिष्क को दवाओं का वितरण एक चुनौती बना हुआ है, जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा तक पहुंच को नियंत्रित और प्रतिबंधित करता है। हालांकि, नैनो तकनीकों के विकास के साथ, दवा वितरण में सुधार के लिए नए नैनोमैटेरियल्स के बड़े पैनल विकसित किए गए थे, जो प्रीक्लिनिकल परख के फ्रेम में मस्तिष्क प्रवेश की भविष्यवाणी करने के लिए विश्वसनीय इन विट्रो माइक्रोसिस्टम की आवश्यकता पर प्रकाश डालते हैं। यहां केवल मानव कोशिकाओं का उपयोग करके बीबीबी को मॉडल करने के लिए एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम स्थापित करने का एक सीधा तरीका है। इसके विन्यास में, मॉडल में मस्तिष्क जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीएलईसी), पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स सहित एक ट्रिपल कल्चर शामिल है, तीन मुख्य बीबीबी सेलुलर अभिनेता जो यौगिकों को कसने की आवश्यकता के बिना बीबीबी गुणों को अधिक शारीरिक तरीके से प्रेरित और विनियमित करने के लिए आवश्यक हैं। ट्रिपल कल्चर के 6 दिनों के बाद तैयार 12-वेल प्लेट प्रारूप में विकसित मॉडल, भौतिक गुणों, जीन और प्रोटीन अभिव्यक्तियों में विशेषता है और बहुलक नैनोगेल परिवहन माप के लिए उपयोग किया जाता है। मॉडल का उपयोग स्वस्थ और पैथोलॉजिकल स्थितियों में प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है और अणु और कण परिवहन के प्रीक्लिनिकल आकलन के साथ-साथ अंतर-और इंट्रासेल्युलर तस्करी के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

बीबीबी, मस्तिष्क केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) के स्तर पर स्थानीयकृत, मस्तिष्क पैरेन्काइमा तक पहुंच को नियंत्रित और नियंत्रित करता है, जो मस्तिष्क होमियोस्टैसिस और तंत्रिका कोशिकाओंके कार्य को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, मस्तिष्क विकृति के मामले में, मस्तिष्क पैरेन्काइमा तक पहुंच की कमी चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए एक वास्तविक बाधा का प्रतिनिधित्व करती है।

बीबीबी ईसी में टाइट जंक्शन (टीजे) प्रोटीन सहित गुणों का एक जटिल सेट होता है, जो अंतरकोशिकीय स्थान को सील करता है, जो एफ्लक्स पंप, विशिष्ट ट्रांसपोर्टर्स और रिसेप्टर्स की एक प्रणाली से जुड़ा होता है, जो ट्रांससेलुलर मार्ग 1,2,3 को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, इन सभी गुणों को बीबीबी ईसी तहखाने झिल्ली और एस्ट्रोसाइट्स में एम्बेडेड पेरिसाइट के साथ संचार के लिए प्रेरित और बनाए रखा जाता है, जिनके अंत-पैर मस्तिष्क केशिकाओं 1,2,3 को घेरते हैं। इसलिए, बीबीबी इन विट्रो का अध्ययन करना इसकी वास्तुकला की जटिलता और न्यूरोवास्कुलर यूनिट (एनवीयू) 2 का गठन करने वाले विभिन्न सेल प्रकारों के बीच संचार को देखते हुए एक चुनौती है। इसके अलावा, बीबीबी गुणों के प्रेरण और रखरखाव के लिए विभिन्न सेल प्रकार महत्वपूर्ण हैं और परिणामस्वरूप बीबीबी के माध्यम से क्रॉसिंग की भविष्यवाणी को प्रभावित करते हैं। मस्तिष्क को दवा वितरण के लिए विभिन्न रणनीतियों को पहले से ही बीबीबी प्रतिबंधितगुणों को बायपास करने के लिए रणनीति के एक बड़े पैनल का उपयोग करके परीक्षण किया गया था। हाल ही में, नैनोप्रौद्योगिकी की प्रगति के साथ, दवा वाहक 5,6 के रूप में अनुप्रयोगों के लिए नई सामग्री विकसित की जा रही है। उनके उच्च भार, कम विषाक्तता और दवाओं की जैव उपलब्धता में वृद्धि के अलावा, इन नए नैनोमैटेरियल्स को बीबीबी को पार करने और विशेष रूप से पैरेन्काइमा 5,6 में कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए ट्रोजन हॉर्स रणनीति के लिए कार्यात्मक बनाया जा सकता है। मूल्यांकन किए जा रहे विभिन्न प्रकार के नैनोमटेरियल्स में, नैनोगेल ने काफी ध्यान आकर्षित किया है, मुख्य रूप से उनके कोलाइडल गुणों और उत्तेजना-उत्तरदायी गुणों को पेश करने के लिए रासायनिक संरचना को अनुकूलित करने की क्षमता के कारण 7,8,9,10,11,12,13,14,15।

इन विट्रो मॉडल अब दवाओं के मस्तिष्क प्रवेश की भविष्यवाणी करने के लिए मानव कोशिकाओं का उपयोग करके प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए विकसितकिए गए हैं। इन मॉडलों की विभिन्न सेटिंग्स उपलब्ध हैं, मस्तिष्क ईसी के मोनोलेयर से लेकर कई सेल सिस्टम16 तक। बीबीबी प्रेरण और रखरखाव में एनवीयू कोशिकाओं के महत्व और पैथोलॉजिकल वातावरण के लिए समन्वित प्रतिक्रिया को ध्यान में रखते हुए, बीबीबी इन विट्रो मॉडल को भविष्यवाणी 2,17 की प्रासंगिकता में सुधार करने के लिए इन सभी नायकों पर विचार करने की आवश्यकता है।

वर्तमान विधि मानव बीबीबी के विट्रो मॉडल में एक ट्रिपल कल्चर स्थापित करने का वर्णन करती है, जो विशिष्ट सेलुलर और मानव आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए मानव कोशिकाओं के साथ पूरी तरह से विकसित है। शारीरिक रूप से प्रासंगिक होने के लिए, मॉडल में बीबीबी (ईसी, पेरिसाइट और एस्ट्रोसाइट्स) के मुख्य तीन सेलुलर अभिनेता शामिल हैं, जो बीबीबी गुणों को प्रेरित करने और बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं, यौगिकों को कसने के उपयोग के बिना और इन विट्रो बीबीबी मॉडल16,18 के रूप में माना जाने वाले गुणों का एक सेट प्रदर्शित किए बिना। मॉडल को रक्त और मस्तिष्क डिब्बे को सीमांकित करने वाले विन्यास में स्थापित किया गया है, जो मस्तिष्क प्रवेश की भविष्यवाणी करने के लिए दवा और कण परिवहन के प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए उपयुक्त है। मॉडल की उपयोगिता को बहुलक नैनोगेल के परिवहन को मापकर चित्रित किया गया है।

Protocol

प्रोटोकॉल को फ्रांसीसी उच्च शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (संदर्भ: CODECOH DC2011-1321) और स्थानीय जांच समीक्षा बोर्ड (बेथुन मैटरनिटी हॉस्पिटल, बेउवरी, फ्रांस) द्वारा अनुमोदित किया गया था। एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) को प्राप्त करने के लिए, फ्रांसीसी कानून के अनुपालन में गर्भनाल रक्त एकत्र करने के लिए दाता के माता-पिता से लिखित और सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। पेरीसाइट्स प्रोफेसर ताकाशी कांडा (न्यूरोलॉजी और क्लिनिकल न्यूरोसाइंस विभाग, यामागुची यूनिवर्सिटी ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन, उबे, जापान) द्वारा प्रदान किए जाते हैं जिन्हें संदर्भ19 के अनुसार अलग किया गया था। प्राथमिक मानव मस्तिष्क कॉर्टेक्स एस्ट्रोसाइट्स को एक वाणिज्यिक प्रदाता से खरीदा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. सेल संस्कृति

  1. एंडोथेलियल कोशिकाओं का संवर्धन
    नोट: एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) मानव गर्भनाल रक्त से पृथक सीडी 34 + हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं, पेड्रोसो एट अल 20 द्वारा वर्णित विधि के अनुसार। ईसी के एंडोथेलियल फेनोटाइप को पेड्रोसो एट अल.20 में वर्णित किया गया है।
    1. भ्रूण बछड़े के सीरम (एफसीएस) के 5%, जेंटामाइसिन के 0.5% और एंडोथेलियल सेल ग्रोथ सप्लीमेंट (ईसीएम) के 1% के साथ पूरक एंडोथेलियल सेल माध्यम का उपयोग करके मानव ईसी की खेती करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. उप-संवर्धन ईसीएस के लिए, मॉडल की स्थापना से दो दिन पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2% जिलेटिन के 10 एमएल के साथ एक डिश को कोट करें और फिर इसे 20 एमएल गर्म ईसीएम के साथ बदलें। पूर्व-लेपित सेल कल्चर डिश में 1 मिलियन कोशिकाओं वाले ईसी की एक शीशी को पिघलाएं (कोशिकाओं को सेल फ्रीजिंग से पहले चरण 2.3.3 में वर्णित के रूप में मैन्युअल रूप से गिना गया था)।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के बाद, माध्यम को नवीनीकृत करें और कोशिकाओं को तब तक बनाए रखें जब तक कि 5% सीओ2 और 21 % ओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के अंदर एक आर्द्र वातावरण में ट्राइकल्चर की स्थापना नहो।
  2. पेरिसाइट्स की खेती
    नोट: पेरिसाइट्स को शिमिजु एट अल.19 द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार मानव मस्तिष्क से अलग किया जाता है, जिसकी अलगाव प्रक्रिया संशोधनों के साथ कांडा एट अल .21 द्वारा प्रकाशित विधि का अनुसरण करती है।
    1. डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम का उपयोग करके पेरिसाइट्स की खेती करें, जिसमें 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज (डीएमईएम एचजी), एफसीएस का 10%, डी पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन का 1% और एल-ग्लूटामाइन का 1% शामिल है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. पेरिसाइट उप-संवर्धन के लिए, मॉडल की स्थापना से पांच दिन पहले, कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए 0.02 एन एसिटिक एसिड में कोलेजन टाइप 1 समाधान के 8 एमएल / डिश के साथ दो व्यंजनों को कोट करें और फिर आरटी डीएमईएम एचजी के साथ दो बार धोएं। एक शंक्वाकार ट्यूब में 1 मिलियन कोशिकाओं वाले पेरिसाइट्स की एक शीशी को पिघलाएं जिसमें 10 एमएल गर्म माध्यम होता है और 20 डिग्री सेल्सियस पर 190 x g पर 5 मिनट के लिए निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. 15 एमएल गर्म माध्यम/डिश के साथ प्री-लेपित सेल कल्चर व्यंजनों में 10 एमएल गर्म माध्यम और बीज में गोली को फिर से निलंबित करें। माध्यम को 3 दिनों के बाद नवीनीकृत किया जाता है, और कोशिकाओं को 5% सीओ2 और 21% ओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में ट्राइकल्चर की स्थापना तक बनाए रखा जाता है।
  3. एस्ट्रोसाइट्स की खेती
    1. 20% एफसीएस, 1% एस्ट्रोसाइट विकास पूरक, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (एएम) के साथ पूरक एस्ट्रोसाइट्स माध्यम का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट्स की खेती करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एस्ट्रोसाइट्स के उप-संवर्धन के लिए, मॉडल की स्थापना से एक सप्ताह पहले, एक टी 75 सेल कल्चर फ्लास्क को 10 एमएल 2 μg / cm2 पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोट करें और आरटी बाँझ पानी से दो बार धोएं। पूर्व-लेपित टी 75 सेल कल्चर फ्लास्क में 20 एमएल गर्म माध्यम और बीज में 1 मिलियन कोशिकाओं वाले एस्ट्रोसाइट्स की एक शीशी पिघलाएं।
      नोट: व्यावसायिक रूप से प्राप्त सेल शीशियां ~ 1 मिलियन कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करती हैं, इसलिए कोशिकाओं की गिनती यहां नहीं की गई थी।
    3. 5% सीओ2 और 21% ओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें। माध्यम को 24 घंटे के बाद और फिर हर 2 दिनों में त्रिसंस्कृति की स्थापना तक नवीनीकृत किया जाता है।

2. ट्रिपल संस्कृति मॉडल सेटिंग

नोट: तीन सेल प्रकारों की असेंबली एक ही दिन की जाती है। ट्राइकल्चर की स्थापना से एक दिन पहले, प्रत्यावर्तित सम्मिलित फिल्टर पर कोलेजन प्रकार 1 कोटिंग करें ( सामग्री की तालिका देखें) और 12-वेल प्लेट के पीएलएल-प्रीकोटेड कुओं में एस्ट्रोसाइट्स को बीज दें।

  1. कुओं में एस्ट्रोसाइट्स की सीडिंग
    1. चरण 1.3.2 में वर्णित 2 μg/cm2 PLL समाधान के 500 μL के साथ कुओं को कोट करें।
    2. गर्म फॉस्फेट बफर खारा - कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त 1एक्स (1एक्स पीबीएस-सीएमएफ) (तालिका 1) के साथ कोशिकाओं को एक बार धोएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 10 एमएल गर्म 20% ट्रिप्सिन / ईडीटीए (टी / ई) समाधान के साथ इनक्यूबेट करें और यांत्रिक रूप से फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करें। निलंबन को एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल गर्म गैर-पतला एफसीएस होता है।
      नोट: प्रदाता के प्रोटोकॉल22 के अनुसार, एस्ट्रोसाइट्स के संग्रह को फ्लास्क को 1 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखकर और टुकड़ी को पूरा करने में मदद करने के लिए फ्लास्क को टैप करके अनुकूलित किया जा सकता है। शेष कोशिकाओं को टी / ई न्यूट्रलाइजेशन समाधान के 5 एमएल के साथ एकत्र किया जाना चाहिए और एफसीएस युक्त शंक्वाकार ट्यूब में रखा जाना चाहिए।
    3. 190 x g पर 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सेल पेलेट को 5 एमएल गर्म एएम में पुन: निलंबित करें। माइक्रोस्कोप के तहत एक मैनुअल गिनती कक्ष का उपयोग करके 1एक्स पीबीएस-सीएमएफ के 80 μL में सेल निलंबन के 20 μL को पतला करके कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक पीएलएल-प्रीकोटेड वेल में लगभग 40,000 कोशिकाओं / सेमी2 को 1.5 एमएल गर्म एएम की मात्रा में प्लेट करें।
  2. प्रत्यावर्तित सम्मिलित फिल्टर पर पेरिसाइट की सीडिंग
    1. बाँझ चिमटी का उपयोग करके कवर किए गए 25 मिमी उच्च डिश ( सामग्री की तालिका देखें) की परिधि पर रखे गए प्रत्यावर्तित सम्मिलित फिल्टर पर कोलेजन टाइप 1 समाधान (100 μg / mL) के 250 μL जोड़ें। बाँझ परिस्थितियों में आरटी पर 1 घंटे के लिए कोटिंग छोड़ दें।
      नोट: इस्तेमाल किए गए पकवान को हुड के बाहर बाँझपन के रखरखाव को सुनिश्चित करने और प्रत्यावर्तित फिल्टर और डिश के कवर पर समाधान के बीच संपर्क से बचने के लिए पर्याप्त उच्च होना चाहिए।
    2. एस्पिरेटिंग सिस्टम से जुड़े ग्लास पिपेट के साथ कोलेजन टाइप 1 समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। आरटी डीएमईएम एचजी के 250 μL के साथ दो बार धोएं और फिर इंसर्ट फिल्टर से सभी समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। कोशिकाओं के बीजारोपण तक बाँझ परिस्थितियों में आरटी पर लेपित सम्मिलित फिल्टर छोड़ दें।
      नोट: कोटिंग प्रक्रिया के दौरान, झिल्ली क्षति से बचने के लिए फिल्टर को छूने से बचने के लिए सावधान रहें। एक बार कोलेजन टाइप 1 के साथ लेपित होने के बाद, इंसर्ट फिल्टर को आरटी में रात भर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. ट्राइकल्चर सेटिंग के दिन, पेरिसाइट्स को 10 एमएल गर्म 1एक्स पीबीएस-सीएमएफ के साथ दो बार धोएं और कोशिकाओं को 2 एमएल गर्म ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को देखकर ट्रिप्सिन की कार्रवाई की निगरानी करें। एक बार जब कोशिकाएं अलग होना शुरू कर देती हैं, तो ट्रिप्सिन को हटा दें और यांत्रिक पृथक्करण से पहले 5 एमएल गर्म ईसीएम जोड़ें।
    4. माइक्रोस्कोप के तहत एक मैनुअल गिनती कक्ष का उपयोग करके 1X PBS-CMF के 80 μL में सेल निलंबन के 20 μL को पतला करके कोशिकाओं की गणना करें, और पूर्व-लेपित प्रत्यावर्तित सम्मिलितफिल्टर पर 44,500 कोशिकाओं /सेमी 2 को 250 μL की मात्रा में बीज दें। 5% CO2 और 21% O 2 के तहत 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में सम्मिलित फिल्टर डालें।
    5. 1.5 एमएल गर्म ईसीएम / वेल वाले 12-वेल प्लेट में बाँझ चिमटी का उपयोग करके सम्मिलित फिल्टर को सावधानीपूर्वक वापस करें। सम्मिलित फिल्टर अब दूसरी तरफ लेपित होने के लिए तैयार हैं।
  3. सम्मिलित फिल्टर पर एंडोथेलियल कोशिकाओं की सीडिंग
    1. बाह्य मैट्रिक्स-आधारित हाइड्रोगेल (1/48 वी / वी) के 500 μL के साथ सम्मिलित फिल्टर के ऊपरी हिस्से को कोट करें (सामग्री की तालिका देखें)। 1 घंटे के बाद, 5% सीओ2 और 21% ओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में, आरटी डीएमईएम एचजी के 500 μL के साथ एक बार धो लें।
    2. गर्म 1X PBS-CMF के 10 एमएल के साथ एक बार धो लें और कोशिकाओं को 2 एमएल गर्म ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेट करें। एक बार जब कोशिकाएं अलग होना शुरू कर देती हैं, तो ट्रिप्सिन को हटा दें और यांत्रिक पृथक्करण से पहले 5 एमएल गर्म ईसीएम जोड़ें।
    3. माइक्रोस्कोप के तहत एक मैनुअल गिनती कक्ष का उपयोग करके 1एक्स पीबीएस-सीएमएफ के 80 μL में सेल निलंबन के 20 μL को पतला करके कोशिकाओं की गणना करें और गर्म ईसीएम के 500 μL की मात्रा में पूर्व-लेपित सम्मिलित फिल्टर पर 71,500 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर ईसी को बीज दें।
    4. एएम को 1.5 एमएल गर्म ईसीएम / वेल के साथ बदलें और फिर एस्ट्रोसाइट्स युक्त कुओं पर बीज वाले सम्मिलित फिल्टर (ईसी + पेरिसाइट) को स्थानांतरित करें।
    5. ट्राइकल्चर सेल सिस्टम को 5% सीओ2 और 21% ओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखें।
  4. बीबीबी गुणों के प्रेरण के लिए ट्रिपल सेल संस्कृति का रखरखाव
    नोट: ईसी में बीबीबी गुणों के प्रेरण के लिए, ट्रिपल कल्चर के 6 दिन आवश्यक हैं।
    1. 6 वें दिन तक हर दूसरे दिन माध्यम को नवीनीकृत करें, एक आकांक्षा प्रणाली से जुड़े ग्लास पिपेट का उपयोग करके ऊपरी और नीचे के डिब्बे से माध्यम को सावधानीपूर्वक उतारें।
    2. जल्दी से ऊपरी डिब्बे में 500 μL और नीचे के डिब्बे में 1.5 mL की मात्रा में गर्म ईसीएम के साथ बदलें, और कोशिकाओं को 5% CO2 और 21% O2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में वापसरखें।

3. बीबीबी फेनोटाइप सत्यापन

नोट: ट्रिपल कल्चर के 6 दिनों के बाद, ईसी में बीबीबी फेनोटाइप को प्रेरित करने के लिए आवश्यक समय, मानव बीबीबी मॉडल प्रयोगों के लिए तैयार है। मस्तिष्क जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीएलईसी) की शारीरिक अखंडता बीबीबी अखंडता मार्करों के लिए पारगम्यता परख का उपयोग करके मूल्यांकन किए गए टीजे प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा कल्पना की जाती है। बीबीबी फेनोटाइप सत्यापन में डेलिग्ने एट अल में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार जीन / प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और एफ्लक्स पंप कार्यक्षमता भी शामिल है। पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स को डेलिग्ने एट अल में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार संबंधित धुंधला मार्करों द्वारा देखा जाता है। 202023.

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. एसीटोन (50/50 वी / वी) में सम्मिलित फिल्टर और एस्ट्रोसाइट्स को 1 मिनट के लिए ठीक करें और आरटी 1 एक्स पीबीएस-सीएमएफ के साथ दो बार धोएं।
    2. स्केलपेल का उपयोग करके झिल्ली को काटकर फिल्टर को इंसर्ट से सावधानीपूर्वक अलग करें। डेलिग्ने एट अल.23 के अनुसार झिल्ली और निचले कुओं पर इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन करें।
      नोट: ब्लॉकिंग चरण के लिए, आरटी पर 30 मिनट के लिए एसईए ब्लॉक ब्लॉकिंग बफर ( सामग्री की तालिका देखें) के 250 μL का उपयोग करें।
  2. बीबीबी अखंडता परख
    1. सोडियम फ्लोरेसिन (एनएएफ) और 20 केडीए डेक्सट्रान (एफडी 20) जैसे विभिन्न आणविक भार के साथ बीबीबी अखंडता मार्करों का उपयोग करके पारगम्यता परख द्वारा बीएलईसी की भौतिक अखंडता का आकलन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: प्रयोग डेलिग्ने एट अल .23 में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार किया जा सकता है।
  3. एफ्लक्स पंप कार्यक्षमता
    1. एलाक्रिडार, पी-जीपी और बीसीआरपी अवरोधक के साथ और बिना रोडामाइन 123 (आर 123) के इंट्रासेल्युलर संचय को मापकर पी-ग्लाइकोप्रोटीन (पी-जीपी) और स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन (बीसीआरपी) की कार्यक्षमता का आकलन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: प्रयोग डेलिग्ने एट अल .23 में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार किया जा सकता है।
  4. जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति
    1. कोशिकाओं के ठंडे रिंगर एचईपीईएस (आरएच) (तालिका 1) के साथ त्वरित धोने के बाद बर्फ पर जीन और प्रोटीन नमूना संग्रह करें। ईसी नमूना संग्रह से पहले, उल्टे सम्मिलित फिल्टर20 से पेरिसाइट्स को स्क्रैप करें।

4. नैनोगेल परिवहन

नोट: ट्राइकल्चर बीएलईसी मॉडल के ल्यूमिनल से एब्ल्यूमिनल डिब्बे तक पॉलिमरिक नैनोगेल्स (एनजी) के पारित होने का अनुमान लगाने के लिए, 24 घंटे के लिए ल्यूमिनल डिब्बे पर 6 दिन में 0.1 मिलीग्राम / एमएल एनजी समाधान जोड़ा गया था। अध्ययन किए गए एनजी को फ्लोरोसेंटली टैग किया गया था एन-आइसोप्रोपिलाक्रिलामाइड (एनआईपीएएम) आधारित हाइड्रोगेल 8-10 एनएम के औसत आकार के साथ ( सामग्री की तालिका देखें)।

  1. नैनोजेल पाउडर का वजन करें और इसे ईसीएम में 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर घुलनशील करें। 10 मिनट के लिए समाधान को सोनोकेट करें और 0.2 μm PTFE फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
    नोट: प्रयोग के दिन एक ताजा एनजी समाधान तैयार करें।
  2. ल्यूमिनल डिब्बे में माध्यम को बदलें और 0.1 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए ऊपरी डिब्बे में 50 μL NGs घोल जोड़ें।
    नोट: मूल समाधान से 1:10 का कमजोर पड़ना करें।
  3. इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, ल्यूमिनल (20 μL) और abluminal (200 μL) डिब्बों से एलिकोट एकत्र करें और उन्हें एक काले 96-वेल प्लेट में रखें।
  4. 477/540 एनएम पर उत्तेजना /उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य की स्थापना का उपयोग करके एक काले 96-वेल प्लेट के साथ फ्लोरोसेंट मल्टीप्लेट रीडर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति की मात्रा निर्धारित करें। समय पर जोड़े गए प्रारंभिक कार्य समाधान को संदर्भित क्रॉसिंग के प्रतिशत की गणना करें = 0 घंटे (टी0)6,15।
    नोट: प्रतिदीप्ति माप के लिए 96-वेल प्लेट तैयार करने के लिए, एब्ल्यूमिनल डिब्बे से 200 μL समाधान जोड़ें और ल्यूमिनल डिब्बे से 20 μL समाधान जोड़ें और t0 तैयारी (200 μL की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए ईसीएम का 180 μL जोड़ें)। रीडिंग प्लेट में एक अंशांकन वक्र और एक रिक्त स्थान भी शामिल करें। वाद्य पैरामीटर: डिटेक्शन विधि - फ्लोरेसेंस, ऑप्टिकल स्थिति - शीर्ष, पढ़ें प्रकार - समापन बिंदु, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य - 477 एनएम, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य - 540 एनएम, संवेदनशीलता - 100, शेक - डबल ऑर्बिटल 5 सेकंड के लिए।

Representative Results

मानव ट्रिपल कल्चर बीबीबी मॉडल की स्थापना
मानव बीबीबी इन विट्रो मॉडल की स्थापना के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल चित्रा 1 में वर्णित है और इसमें क्रमिक चरण शामिल हैं जिनके आदेश का सख्ती से सम्मान किया जाना चाहिए। सबसे पहले, तीन सेल प्रकारों को एक सम्मिलित फिल्टर सिस्टम में इकट्ठा करने से पहले सेल कल्चर व्यंजन (चित्रा 1 ए) में व्यक्तिगत रूप से खेती की जाती है। ट्रिपल कल्चर सेटिंग पहले सेल प्रकार, एस्ट्रोसाइट्स को पूर्व-लेपित नीचे के कुएं में सीडिंग के साथ शुरू होती है। अगले दिन, पेरिसाइट्स और ईसी को क्रमशः इंसर्ट फिल्टर के पूर्व-लेपित एब्ल्यूमिनल और ल्यूमिनल सतहों पर बीज दिया जाता है। सम्मिलित फ़िल्टर को तब एस्ट्रोसाइट्स पर स्थानांतरित किया जाता है। मॉडल को 6 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जाता है, ईसीएस में बीबीबी गुणों को प्रेरित करने के लिए आवश्यक समय, पेटेंट किए गए सह-संस्कृति मॉडल24 के अनुसार हर दूसरे दिन माध्यम के नवीकरण के साथ। ईसी को फिर BLECs (चित्रा 1 बी) के रूप में नाम दिया जाता है।

मानव बीबीबी मॉडल का लक्षण वर्णन
ट्रिपल सेल कल्चर मॉडल को बीबीबी-विशिष्ट गुणों के एक सेट की उपस्थिति के लिए विशेषता दी गई है। सबसे पहले, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री डेटा ने पारंपरिक मार्करों जैसे प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर β (पीडीजीएफआर-β)25,26 और एस्ट्रोसाइट्स के लिए पेरिसाइट्स और ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) 26 के लिए डेसमिन की अभिव्यक्ति की पुष्टि की (चित्रा 2 ए)। इसलिए, पेरिसाइट और एस्ट्रोसाइट्स के साथ 6 दिनों की संस्कृति के बाद, वीई-कैडरिन के अनुयायी जंक्शन धुंधला होने के साथ कल्पना की गई बीएलईसी का मोनोलेयर, सेल सीमाओं पर टीजे प्रोटीन, क्लाउडिन -5 और जेडओ -1 का निरंतर स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है (चित्रा 2 ए)। टीजे की स्थापना कम आणविक भार के बीबीबी अखंडता मार्करों का उपयोग करके मापा गया कम पैरासेल्युलर पारगम्यता गुणांक के साथ सहसंबद्ध है, अर्थात, एनएएफ (376 डीए) 16,27 और उच्च आणविक भार, यानी, एफडी 20 (20 केडीए)27, जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। मापा गया मान ईसी23,24,28 के सटीक स्रोत का उपयोग करके मान्य बीबीबी इन विट्रो मॉडल के साथ तुलनीय हैं। कुल मिलाकर, ये परिणाम ट्रिपल कल्चर बीएलईसी मोनोलेयर की कम पैरासेलुलर पारगम्यता को उजागर करते हैं, जो विवो बीबीबी की विशेषता है। इसके अतिरिक्त, बीएलईसी में आर 123 इंट्रासेल्युलर संचय ने इसकी अनुपस्थिति के साथ नियंत्रण स्थिति की तुलना में एफ्लक्स पंप अवरोधक एलाक्रीडर 23,24 की उपस्थिति में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया (चित्रा 2 सी)। यह बीएलईसी में सक्रिय एफ्लक्स पंप अणुओं, अर्थात् पी-जीपी और बीसीआरपी की उपस्थिति को इंगित करता है।

बीएलईसी को और चिह्नित करने के लिए, प्रमुख बीबीबी विशेषताओं के जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्तर का अध्ययन किया गया (चित्रा 3)। ट्रिपल कल्चर मॉडल के साथ प्राप्त डेटा की तुलना मान्य और पेटेंट किए गए सह-संस्कृति मॉडल के साथ की गई थी जिसमें नियंत्रण मॉडल के रूप में उपयोग किए जाने वाले ईसी और पेरीसाइट्स24 शामिल थे। एस्ट्रोसाइट्स ट्रिपल कल्चर मॉडल में प्रारंभिक सह-संस्कृति मॉडल में जोड़े गए तीसरे सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसलिए, सह-संस्कृति बीएलईसी की तुलना में ट्रिपल कल्चर बीएलईसी के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (चित्रा 3 ए) ने टीजे प्रोटीन (क्लाउडिन -5 और ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स -1) और एफ्लक्स पंप (पी-जीपी और बीसीआरपी) जैसे प्रमुख बीबीबी विशेषताओं की अभिव्यक्ति के रखरखाव को दिखाया, और अधिकांश अध्ययन किए गए बीबीबी ट्रांसपोर्टर्स (ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 1) और रिसेप्टर्स (ट्रांसफरिन रिसेप्टर) के अपरेग्यूलेशन को दिखाया। प्रोटीन परिमाणीकरण डेटा (चित्रा 3 बी) ट्रांसक्रिप्शनल परिणामों के अनुरूप पाया गया। कुल मिलाकर, ये डेटा मान्य सह-संस्कृति मॉडल के समान ट्रिपल कल्चर बीएलसी परत में बीबीबी गुणों के सकारात्मक प्रेरण का समर्थन करते हैं। कुल मिलाकर, ट्रिपल कल्चर मॉडल बीबीबी को मॉडल करने के लिए इन विट्रो माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम के लिए आवश्यक भौतिक और चयापचय गुणों को प्रदर्शित करता है।

दवा वितरण रणनीतियों के लिए प्रयोज्यता - नैनोगेल परिवहन का माप
नई मस्तिष्क वितरण रणनीतियों का अध्ययन करने के लिए ट्रिपल कल्चर मॉडल का उपयोग करने की संभावना का आकलन करने के लिए, फ्लोरोसेंटली-टैग किए गए एनआईपीएएम-आधारित तटस्थ एनजी के परिवहन का मूल्यांकन 6,15 किया गया था। समय 0 पर, एनजी को ल्यूमिनल डिब्बे में 0.1 मिलीग्राम / एमएल (चित्रा 4 ए) की एकाग्रता पर रखा गया था। इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, 5.82% एनजी एब्ल्यूमिनल डिब्बे (चित्रा 4 बी) में पाए गए, जो बीएलईसी को पार करने की उनकी क्षमता को साबित करते हैं।

परिणाम छोटे और बड़े यौगिकों की पारगम्यता को मापने के लिए मॉडल की उपयुक्तता को प्रदर्शित करते हैं, जैसा कि अखंडता मार्करों के साथ वर्णित है, और बहुलक एनजी जैसे नैनोमैटेरियल्स के परिवहन का मूल्यांकन करते हैं।

Figure 1
(ए) बीबीबी मॉडल के तीन सेल घटकों की चरण-कंट्रास्ट छवियां: एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी), पेरिसाइट्स (पीसी), और एस्ट्रोसाइट्स (एसी)। स्केल बार = 250 μm. (B) ट्रिपल कल्चर मानव बीबीबी इन विट्रो मॉडल की स्थापना के लिए योजनाबद्ध और उदाहरणात्मक समयरेखा। हाइलाइट किया गया बॉक्स उल्टे सम्मिलित फ़िल्टर के लिए कोटिंग प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) बीएलईसी (क्लाउडिन -5: सीएलडी 5, ज़ोना ऑक्लुडेन्स -1: जेडओ 1 और वीई-कैडरिन: वीई-कैड), पेरिसाइट (प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर -β: पीडीजीएफआर-β और डेसमिन), और एस्ट्रोसाइट्स (ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन: जीएफएपी) के लिए विशिष्ट मार्करों की प्रतिनिधि इम्यूनोस्टेनिंग छवियां। स्केल बार = 10 μm. (B) फ्लोरोसेंट बीबीबी अखंडता मार्करों के लिए BLECs की पैरासेलुलर पारगम्यता, सोडियम फ्लोरेसिन (NaF, 376 Da, Pe: 0.61 ± 0.062) और FITC-Dextran (FD20, 20 kDA, Pe: 0.04 ± 0.005)। एन = 3; n = 9. (सी) ईसीएस में औसत ± एसईएम और बीसीआरपी कार्यक्षमता का मूल्यांकन इंट्रासेल्युलर आर 123 को (124.2% ± 3.39%) और बिना (100% ± 8.79%) एलाक्रिडार के साथ निर्धारित करके किया गया था। एन = 4; n = 12. औसत ± SEM. p = 0.017 एक अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग करके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(A) तंग जंक्शन प्रोटीन की जीन अभिव्यक्ति (क्लाउडिन -5: CLD5, और Zona Occludens-1: ZO1), ट्रांसपोर्टर्स (ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर -1: GLUT1, P-ग्लाइकोप्रोटीन: PGP, और स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन: BCRP), और बड़े अणु-रिसेप्टर्स (ट्रांसफरिन रिसेप्टर: TRFR), RPLP0 की अभिव्यक्ति द्वारा सामान्यीकृत। एन = 3; n = 9. (बी) तंग जंक्शन प्रोटीन (सीएलडी 5 और जेडओ 1), ट्रांसपोर्टर्स (ग्लूट 1, पीजीपी और बीसीआरपी), और बड़े अणु-रिसेप्टर्स (टीआरएफआर) का प्रोटीन स्तर, β-एक्टिन की अभिव्यक्ति द्वारा सामान्यीकृत। एन = 3; n = 9. एसईएम ± मतलब। (ए) और (बी) के लिए, मान>1 ट्रिपल कल्चर मॉडल में उच्च जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन के स्तर के अनुरूप हैं। लाल रेखा 1 के मान से मेल खाती है जहां दो मॉडलों का अभिव्यक्ति स्तर (जीन या प्रोटीन) बराबर होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रिपल कल्चर मॉडल में नैनोगेल परिवहन को मापना। (ए) नैनोगेल परिवहन परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) ट्रिपल कल्चर मॉडल में इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद नैनोगेल परिवहन का प्रतिशत (5.82% ± 0.09%)। एन = 2; n = 6. SEM ± है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफर का नाम संयोजन नोट
आणविक भार
फॉस्फेट बफर खारा, कैल्शियम मैग्नीशियम नि: शुल्क पीबीएस-सीएमएफ NaCl 8 g/L 58.4 बाँझ पानी में सभी यौगिक जोड़ें और पूर्ण घुलनशीलता की प्रतीक्षा करें। प्राप्त समाधान का पीएच 7.3-7.4 की सीमा में होना चाहिए। 0.22 μm झिल्ली का उपयोग करके घोल को छान लें और बाँझ घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
KCl 0.2 g/L 74.55
केएच2पीओ4 0.2 g/L 136.09
NaHPO4-12 H2O 2.87 g/L 358.14
पानी
रिंगर HEPES आरएच NaCl 8.8 g/L 58.4 बाँझ पानी में सभी यौगिक जोड़ें और पूर्ण घुलनशीलता की प्रतीक्षा करें। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें (समाधान पीएच 6.8 के आसपास शुरू करना)। 0.22 μm झिल्ली का उपयोग करके घोल को छान लें और बाँझ घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
KCl 0.387 g/L 74.55
CaCl2 0.244 g/L 110.99
MgCl2 6H2O 0.0406 g/L 203.3
NaHCO3 0.504 g/L 84.1
HEPES 1.19 g/L 238.3
ग्लूकोज़ 0.504 g/L 180.16
पानी

तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न बफर की संरचना।

Discussion

मस्तिष्क रोगों का उपचार मस्तिष्क पैरेन्काइमा में अपने सेलुलर और आणविक लक्ष्यों तक पहुंचने के लिए बीबीबी पर बाधा डालने के लिए दवाओं की कठिनाई को देखते हुए एक चुनौती बना हुआ है।

मस्तिष्क रोगों के लिए दवा विकास वर्तमान में कम सफलता दर प्रदर्शित करता है क्योंकि प्रीक्लिनिकल मॉडल में आशाजनक परिणाम प्रदर्शित करने वाली अधिकांश दवाएं क्लिनिक में उपयोग किए जाने पर कोई लाभ दिखाने में विफल रहीं। "3 आर नियम" के बाद, जिसका उद्देश्य प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करना है, बीबीबी के इन विट्रो मॉडल मस्तिष्क विकृति का अध्ययन करने और दवाओं के मस्तिष्क प्रवेश की भविष्यवाणी करने के लिए विकसितकिए गए हैं। बीबीबी के इन विट्रो मॉडल मुख्य रूप से पशु कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित किए गए हैं और प्राप्त परिणामों की प्रासंगिकता में सुधार करने के लिए अधिक परिष्कृत हो गएहैं। मानव कोशिकाओं के उपयोग में महत्वपूर्ण प्रगति में से एक, जो मानव रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए सेलुलर और आणविक स्तरों पर निर्विवाद नई अंतर्दृष्टि और अधिक विशिष्टता लाताहै। हालांकि, प्रासंगिक मॉडल के विकास के लिए बीबीबी इन विट्रो मॉडल सेटिंग्स के सुधार और पशु मॉडल के लिए धन्यवाद उत्पन्न होने वाले ज्ञान पर विचार करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, इसे बीबीबी वास्तुकला की जटिलता और शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत बीबीबी का अध्ययन करने के लिए सेल-सेल संचार के महत्व पर विचार करने की आवश्यकताहै।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मस्तिष्क के ऊतकों तक पहुंच की सीमा के बिना बीबीबी के तीन मुख्य सेल प्रकारों को शामिल करते हुए एक पूर्ण मानव बीबीबी इन विट्रो मॉडल स्थापित करने की एक विधि का वर्णन करता है। एक एकाधिक सेल प्रणाली के रूप में, बीबीबी गुणों का प्रेरण और रखरखाव, कसने वाले यौगिकों के कृत्रिम उपयोग के बिना, लेकिन इसके बजाय सेल-सेल संचार द्वारा प्रेरित अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और बीबीबी गुणोंके विवो प्रेरण के अनुरूप है। इसलिए, प्रोटोकॉल की सफलता के लिए प्रोटोकॉल के कालक्रम का सम्मान महत्व का प्रमुख है। इसके अलावा, ट्रिपल कल्चर की स्थापना के दौरान इनक्यूबेशन बार और एक बार तीन सेल प्रकार इकट्ठे होने के बाद प्रोटोकॉल के मुख्य महत्वपूर्ण चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

ईसी में बीबीबी गुण पेरिसाइट्स के साथ सह-संस्कृति द्वारा प्रेरित होते हैं, जैसा कि सह-संस्कृति मॉडल24 के लिए वर्णित है। इसलिए, सम्मिलित फिल्टर के पीछे की ओर पेरिसाइट की संस्कृति सबसे महत्वपूर्ण बिंदु है और बीबीबी गुणों के प्रेरण के लिए पर्याप्त पेरिसाइट नहीं होने के जोखिम पर प्रोटोकॉल का सख्ती से पालन करने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, कोटिंग प्रक्रिया और सेल सीडिंग के दौरान, ध्यान दिया जाना चाहिए कि पेट्री डिश का कवर कोटिंग के संपर्क में न रखें और एक बार कोशिकाओं को फ़िल्टर की अच्छी कोटिंग सुनिश्चित करने और कोशिकाओं को खोने के लिए बीज ति करने के लिए माध्यम भी न हो (चरण 2.2.1 और 2.2.4)। इसके अलावा, एक बार पेरिसाइट्स को बीज दिए जाने के बाद, दूसरी तरफ ईसीएस की कोटिंग और सीडिंग के लिए सम्मिलित फिल्टर को वापस करने से पहले पेरिसाइट्स (चरण 2.2.4) के लगाव के लिए संकेतित समय की प्रतीक्षा करना आवश्यक है (चरण 2.2.5 और 2.3)। एक बार बीज होने के बाद, सेल-सेल संचार (चरण 2.4) के माध्यम से बीबीबी गुणों को प्रेरित करने के लिए छह दिनों की आवश्यकता होती है।

मॉडल को प्रतिबंधित पारगम्यता (तंग जंक्शनों की स्थापना से जुड़ा) के संदर्भ में मान्य किया जाता है क्योंकि ट्रिपल कल्चर मॉडल के ईसी मान्य सह-संस्कृति मॉडल के समान बीबीबी अखंडता मार्करों के लिए पारगम्यता मूल्य प्रदर्शित करते हैं और मान्य पशु या मानव मॉडल 16,27,32 में भी मापा जाता है। इसके अलावा, एक इन विट्रो बीबीबी मॉडल के सत्यापन के लिए, प्रतिबंधित पारगम्यता के अलावा, एनवीयू के अन्य सेल प्रकारों के प्रति जवाबदेही और कार्यात्मक रिसेप्टर्स औरट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, मॉडल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और सेल सॉर्टिंग विधि की आवश्यकता के बिना प्रत्येक सेल प्रकार पर अलग से कई विश्लेषण (जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति, फ्लोरोसेंट धुंधला, विषाक्तता परीक्षण) करने के लिए कई सम्मिलित फिल्टर और कुओं का उत्पादन करता है।

मॉडल को 0.4 μm छिद्र आकार फिल्टर का उपयोग करके विकसित किया गया था ताकि सम्मिलित फ़िल्टर के प्रत्येक तरफ एक सेल प्रकार हो। सम्मिलित फ़िल्टर प्रणाली ने अच्छी तरह से युक्त एस्ट्रोसाइट्स पर स्थानांतरित करके शारीरिक स्थितियों में सेल-सेल संचार के अध्ययन की अनुमति दी। सिस्टम में एस्ट्रोसाइट्स की उपस्थिति विट्रो मॉडल24 में प्रारंभिक सह-संस्कृति की तुलना में प्लस मूल्य का प्रतिनिधित्व करती है। दरअसल, बीबीबी के शरीर विज्ञान में एस्ट्रोसाइट्स के महत्व को ध्यान में रखते हुए, यह तीसरा सेल प्रकार बीबीबी के भीतर सेल-सेल संचार की और समझ की अनुमति देता है। इसके अलावा, ट्रिपल सेल कल्चर सिस्टम का अध्ययन स्ट्रोक जैसी पैथोलॉजिकल स्थितियों में भी किया जा सकता है, जिसमें एस्ट्रोसाइट्स एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं 33,34,35। इसके अलावा, इंसर्ट फिल्टर के दोनों किनारों पर बीएलईसी / पेरिसाइट के डिजाइन को आसानी से मस्तिष्क कैंसर जैसी रोग स्थितियों की नकल करने के लिए अन्य सेलप्रकारों पर रखा जा सकता है।

सम्मिलित फ़िल्टर का छिद्र आकार कुछ प्रयोगों के साथ सीमाएं ला सकता है, जैसे कि बीबीबी में सेल ट्रांसमाइग्रेशन। हालांकि, एक बड़े छिद्र आकार के साथ मॉडल के विकास के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन की आवश्यकता होती है ताकि ईसी के एक शारीरिक मोनोलेयर के गठन को सुनिश्चित किया जा सके, न कि कई परतों, जो बीबीबी36 की नकल करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक नहीं है।

मॉडल की प्रयोज्यता को एनजी परिवहन प्रयोग का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है जो एक बहुकोशिकीय प्रणाली का उपयोग करके परिवहन प्रयोग करने की संभावना प्रदर्शित करता है। फिर भी, किसी को परिवहन प्रयोग के लिए एक नियंत्रण यौगिक या अणु रखने में कठिनाइयों के बारे में पता होना चाहिए, एनजी के साथ तुलनीय गुणों को साझा करना क्योंकि प्रत्येक नैनोस्ट्रक्चर गुणों (आणविक भार, चार्ज, आकार, भौतिक गुण, प्रोटीन कोरोना गठन) का एक अनूठा सेट प्रदर्शित करता है।

मॉडल की एक सीमा कतरनी तनाव की अनुपस्थिति है, जिसे ईसी के भेदभाव और टीजे प्रोटीन37 की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए प्रदर्शित किया गया था। हालांकि, मस्तिष्क केशिका की नकल करने वाली एक तरल प्रणाली विकसित करना एक तरल भाग को जोड़ने की जटिलता को देखते हुए चुनौतीपूर्ण है, जिसमें कई सेल सिस्टम में एक विशिष्ट उपकरण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, विशेष उपकरण आमतौर पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं होता है और कई प्रतिकृतियों की अनुमति नहीं देता है, इस प्रकार द्रव प्रणालियों को उच्च-थ्रूपुट उपयोग के लिए कम अनुकूलित किया जाता है।

सारांश में, मानव कोशिकाओं से युक्त यह ट्रिपल कल्चर सिस्टम बीबीबी की वास्तुकला को पुन: पेश करता है। यह कई इंसर्ट की पीढ़ी की अनुमति देता है जिसका उपयोग यौगिकों की व्यापक स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा अनुदान समझौते नो 764958 के तहत, नैनोस्टेम परियोजना के हिस्से के रूप में, मैरी स्कोडोव्स्का-क्यूरी इनोवेटिव ट्रेनिंग नेटवर्क (आईटीएन) (फैलोशिप एलोनोरा रिज्जी) द्वारा प्रदान किया जाता है। यह अध्ययन 'कॉन्सिल रेजियोनल डु नॉर्ड-पास-डी-कैलाइस' (फेलोशिप टू क्लेमेंस डेलिग्ने), "सोसाइटे फ्रैंकाइज़ डी ल्यूट ्स डे ल्यूट कॉन्ट्रेस कैंसर एट एल'एडोलसेंट" (एसएफसीई), एसोसिएशन "एल'एटोइल डी मार्टिन" और एसोसिएशन "कैसंड्रा कॉन्ट्रे ला ल ल्यूसेमी" द्वारा प्रदान किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Astocyte Medium (AM) ScienCell  1801
Astrocyte Growth Supplement ScienCell  1852 Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set.
Cell culture dish 100 mm Corning  430293 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting
Cell culture dish 150 mm Corning  430599 The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model.
Collagen I  Corning 354236 Rat tail 
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 31600-083 Powder
Endothelial Cell Growth Supplement ScienCell  1051 Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set.
Endothelial Cell Medium (ECM) ScienCell  1001
Fetal Calf Serum  Sigma F7524
Gelatin Sigma G2500 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF
Gentamicin BiochromA6 A-2712
Glucose Sigma G6152 Powder
Glutamine Merck 1002891000
Human Brain Cortex Astrocytes ScienCell  1800-SC
Malassez cell counting chamber vWR HECH40453702 The count was performed manually.
Matrigel Corning 354230 Extracellular matrix-based hydrogel
Penicillin/Streptomycin ScienCell  0503 Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets.
Poly-L-lysine ScienCell  0413
Steritop Millipore System SCGPT0SRE 0.22 µm pore size
Transwell insert  Corning 3401 0.4 µm pore polycarbonate filter 
Trypsin/EDTA neutralization solution ScienCell  0113
Trypsin/EDTA solution ScienCell  0103
Immunocytochemistry
SEA BLOCK blocking buffer ThermoScientific 37527
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody Thermofisher A11031 Dilution 1:500
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody Thermofisher A11036 Dilution 1:500
Anti-Claudin-5 primary antibody InVitrogen 34-1600 Dilution 1:100
Anti-Desmin primary antibody Abcam ab6322 Dilution 1:200
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody Dako Z0334 Dilution 1:500
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody Abcam ab51090 Dilution 1:200
Anti-VE-cadherin primary antibody Abcam ab207732 Dilution 1:200
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody InVitrogen 61-7300 Dilution 1:200
Normal Goat Serum Sigma G6767
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen  P36962
Gene expression
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit Macherey-Nagel 740,933,250
96 multiplate well Biorad HSP9601
iSCRIPT Biorad 1708841
Sealer sheet  Biorad MSB1001
SsoFast EvaGreen Supermix Biorad 172-5201
Protein expression
2x Laemli Sample Buffer Biorad 161-0737 Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay.
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody Abcam ab207732 Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Claudin-5 primary antibody Abcam ab15106 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody Millipore 07-1401 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Mouse secondary antibody Dako P0447 Dilution 1:5000 in TBS-Tween
Anti-P-glycoprotein primary antibody Genetex GTX23364 Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT
Anti-Rabbit secondary antibody Dako P0448 Dilution 1:8000 in TBS-Tween
Anti-Transferrin Receptor primary antibody Abcam ab84036 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Zona occludens-1 primary antibody Abcam ab216880 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Criterion TGX Gel  Biorad 5678083
ECL Prime Solution Amersham  RPN2236 Revelation solution to keep in the dark
Phospatase inhibitor cocktail 2 Sigma P5726
Phospatase inhibitor cocktail 3 Sigma P0044
Protease Inhibitor Sigma P8340
Protein Standards Biorad 161-0373 Molecular weight markers
RIPA 10x Millipore 20-188
TBS 10x Biorad 1706435
TRIS-Glycine Biorad 1610771
Tween Biorad 1706531
BBB integrity assay
Sodium Fluorescein Ampresco 0681 λex= 490 nm; λem= 525 nm  
Elacridar Sigma SML0486 GF120918
FITC-Dextran 20 kDa Sigma FD-20S λex= 490 nm; λem=  525 nm  
Rhodamine 123 Sigma R8004 λex= 501 nm; λem= 538 nm  
SynergyTM H1  BioTek Instruments Fluorescent multiplate reader
Nanogel Transport
Syringe Terumo SS+01T1 1 mL syringe 
Filter FisherScientific 15161499 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels   The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. 

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References

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जीव विज्ञान अंक 177
एक ट्रिपल कल्चर सेल सिस्टम मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा मॉडलिंग
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Rizzi, E., Deligne, C., Dehouck, L., Bilardo, R., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Resmini, M., Gosselet, F., Dehouck, M. P., Mysiorek, C. A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (177), e63134, doi:10.3791/63134 (2021).

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