Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Et trippelkulturcellesystem som modellerer den menneskelige blod-hjernebarrieren

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63134
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 3, 2, 1, 1, 1
1Univ. Artois, UR 2465, Laboratoire de la Barrière Hémato-Encéphalique (LBHE), 2Queen Mary University of London, Department of Chemistry, 3Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Department of Neurology and Clinical Neuroscience
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å etablere en human blod-hjernebarriere (BBB) in vitro-modell . Endotelceller og pericytter blir sådd på hver side av et innsatsfilter (blodrom), og astrocytter blir sådd i bunnbrønnen (hjernekammeret). Den karakteriserte modellen ble brukt til nanopartikler transporteksperimenter.

Abstract

Levering av medisiner til hjernen er fortsatt en utfordring på grunn av blod-hjernebarrierens (BBB) svært spesifikke og restriktive egenskaper, som kontrollerer og begrenser tilgangen til hjernens parenkym. Men med utviklingen av nanoteknologi ble store paneler av nye nanomaterialer utviklet for å forbedre legemiddellevering, og fremhever behovet for pålitelige in vitro mikrosystemer for å forutsi hjernepenetrasjon i rammen av prekliniske analyser. Her er en enkel metode for å sette opp et mikrofysiologisk system for å modellere BBB ved hjelp av utelukkende menneskelige celler. I sin konfigurasjon består modellen av en trippelkultur inkludert hjernelignende endotelceller (BLAC), pericytter og astrocytter, de tre viktigste BBB-cellulære aktørene som er nødvendige for å indusere og regulere BBB-egenskapene på en mer fysiologisk måte uten krav om strammeforbindelser. Modellen utviklet i et 12-brønns plateformat, klar etter 6 dager med trippelkultur, karakteriseres i fysiske egenskaper, gen og proteinuttrykk og brukes til polymer nanogeltransportmåling. Modellen kan brukes til et omfattende spekter av eksperimenter i friske og patologiske tilstander og representerer et verdifullt verktøy for prekliniske vurderinger av molekyl- og partikkeltransport, samt inter- og intracellulær handel.

Introduction

BBB, lokalisert på nivå med hjernens kapillære endotelceller (ECs), kontrollerer og regulerer tilgangen til hjernens parenchyma, noe som er avgjørende for å opprettholde hjernehomeostase og funksjonen til nevrale celler 1,2. Men når det gjelder hjernepatologi, representerer mangelen på tilgang til hjernens parenchyma et reelt hinder for å utvikle terapeutiske strategier.

BBB ECs har et komplekst sett med egenskaper, inkludert tette kryssproteiner (TJ), som forsegler det intercellulære rommet, assosiert med et system med efflukspumper, spesifikke transportører og reseptorer, som styrer den transcellulære banen 1,2,3. Videre er alle disse egenskapene indusert og vedlikeholdt, takket være kommunikasjon med pericytter innebygd i BBB EC kjellermembranen og astrocytter, hvis endeføtter omgir hjernekapillærene 1,2,3. Derfor er det en utfordring å studere BBB in vitro med tanke på kompleksiteten i arkitekturen og kommunikasjonen mellom de forskjellige celletypene som utgjør den nevrovaskulære enheten (NVU)2. Videre er de forskjellige celletypene avgjørende for induksjon og vedlikehold av BBB-egenskaper og følgelig påvirker prediksjonen av krysset gjennom BBB. Ulike strategier for legemiddellevering til hjernen ble allerede testet ved hjelp av et stort panel av taktikker for å omgå BBB-begrensede egenskaper4. Mer nylig, med utviklingen av nanoteknologi, utvikles nye materialer for applikasjoner som legemiddelbærere 5,6. I tillegg til høyere belastning, redusert toksisitet og økt biotilgjengelighet av legemidler, kan disse nye nanomaterialene funksjonaliseres for en trojansk hestestrategi for å krysse BBB og spesifikt målrette celler i parenchyma 5,6. Blant de forskjellige typer nanomaterialer som evalueres, har nanogeler tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet, hovedsakelig på grunn av deres kolloidale egenskaper og evne til å skreddersy den kjemiske strukturen for å introdusere stimuli-responsive egenskaper 7,8,9,10,11,12,13,14,15.

In vitro-modeller er nå utviklet for prekliniske studier ved bruk av humane celler for å forutsi hjernepenetrasjon av legemidler16. Ulike innstillinger av disse modellene er tilgjengelige, fra monolayers av hjerne-ECs til flere cellesystemer16. Med tanke på betydningen av NVU-cellene i BBB-induksjon og vedlikehold og koordinert respons på det patologiske miljøet, må BBB in vitro-modeller vurdere alle disse hovedpersonene for å forbedre relevansen av prediksjonen 2,17.

Den nåværende metoden beskriver å sette opp en trippelkultur in vitro-modell av den menneskelige BBB, som er fullt utviklet med humane celler for å studere spesifikke cellulære og humane molekylære mekanismer. For å være fysiologisk relevant består modellen av de tre viktigste cellulære aktørene til BBB (ECs, pericytter og astrocytter) som er nødvendige for å indusere og opprettholde BBB-egenskapene, uten bruk av strammeforbindelser og viser et sett med egenskaper som kreves for å bli betraktet som en in vitro BBB modell16,18. Modellen er satt opp i en konfigurasjon som avgrenser blodet og hjernerommet, egnet for prekliniske studier av legemiddel- og partikkeltransport for å forutsi hjernepenetrasjon. Nytten av modellen illustreres ved å måle transporten av polymere nanogeler.

Protocol

Protokollen ble godkjent av det franske departementet for høyere utdanning og forskning (referanse: CODECOH DC2011-1321) og av det lokale undersøkelsesstyret (Béthune Maternity Hospital, Beuvry, Frankrike). For å skaffe endotelceller (ECs), ble skriftlig og informert samtykke fra giverens foreldre innhentet for å samle navlestrengsblod, i samsvar med den franske lovgivningen. Pericytter er levert av professor Takashi Kanda (Institutt for nevrologi og klinisk nevrovitenskap, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Japan) som ble isolert i henhold til referanse19. Primære menneskelige hjernebarkastrocytter kjøpes fra en kommersiell leverandør (se Materialtabell).

1. Cellekultur

  1. Dyrking av endotelceller
    MERK: Endotelceller (ECs) er avledet fra CD34+ hematopoietiske stamceller isolert fra humant navlestrengsblod, i henhold til metoden beskrevet av Pedroso et al.20. Endotelfenotypen av ECs er beskrevet i Pedroso et al.20.
    1. Dyrk humane ECs ved hjelp av endotelcellemedium supplert med 5% av føtalt kalvserum (FCS), 0,5% av gentamicin og 1% av endotelcelleveksttilskudd (ECM) (se tabell over materialer).
    2. For subdyrking av ECs, to dager før innstillingen av modellen, belegg en tallerken med 10 ml 2% gelatin i 15 minutter ved 37 ° C og erstatt den deretter med 20 ml varm ECM. Tine ett hetteglass med ECs inneholdende 1 million celler (celler ble manuelt talt som beskrevet i trinn 2.3.3 før cellefrysing) i den forhåndsbelagte cellekulturskålen.
    3. Etter 3 timer ved 37 °C, forny mediet og oppretthold cellene til trikulturen settes i en fuktet atmosfære inne i en inkubator ved 37 °C under 5 % CO 2 og 21 % O2.
  2. Dyrking av pericytter
    MERK: Pericytter er isolert fra den menneskelige hjerne i henhold til protokollen publisert av Shimizu et al.19, hvis isolasjonsprosedyre følger metoden publisert av Kanda et al.21 med modifikasjoner.
    1. Dyrk pericytter ved hjelp av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium supplert med 4,5 g / L glukose (DMEM HG), 10% av FCS, 1% de penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin (se materialtabell).
    2. For pericyt-subdyrking, fem dager før innstillingen av modellen, belegg to retter med 8 ml / tallerken på 100 μg / ml kollagen type I-løsning i 0,02 N eddiksyre i 1 time ved romtemperatur (RT) og vask deretter to ganger med RT DMEM HG. Tine ett hetteglass med pericytter inneholdende 1 million celler i et konisk rør inneholdende 10 ml varmt medium og sentrifugere suspensjonen i 5 minutter ved 190 x g ved 20 °C.
    3. Resuspender pelleten i 10 ml varmt medium og frø i de forhåndsbelagte cellekulturrettene som er forhåndsfylt med 15 ml varmt medium/fat. Mediet fornyes etter 3 dager, og cellene opprettholdes til trikulturens innstilling i en fuktet inkubator ved 37 ° C under 5% CO 2 og 21% O2.
  3. Dyrking av astrocytter
    1. Dyrk astrocytter ved hjelp av et astrocyttmedium supplert med 20% av FCS, 1% av astrocyttveksttilskudd og 1% av penicillin / streptomycinoppløsning (AM) (se Materialtabell).
    2. For subdyrking av astrocytter, en uke før innstillingen av modellen, belegg en T75 cellekulturflaske med 10 ml 2 μg / cm2 poly-L-lysin (PLL) i 1 time ved 37 ° C og vask to ganger med RT sterilt vann. Tine ett hetteglass med astrocytter som inneholder 1 million celler i 20 ml varmt medium og frø i den forhåndsbelagte T75-cellekulturflasken.
      MERK: De kommersielt oppnådde cellehetteglassene bekrefter tilstedeværelsen av ~ 1 million celler, så tellingen av celler ble ikke utført her.
    3. Oppretthold cellene i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO 2 og 21 % O2. Mediet fornyes etter 24 timer og deretter hver 2. dag til innstillingen av trikulturen.

2. Trippel kultur modell innstilling

MERK: Monteringen av de tre celletypene utføres samme dag. Dagen før innstillingen av trikulturen, utfør kollagen type I-belegget på de tilbakestilte innsatsfiltrene (se Materialtabell) og frø astrocytter i PLL-precoated brønner av en 12-brønns plate.

  1. Såing av astrocytter i brønnene
    1. Belegge brønnene med 500 μL 2 μg/cm 2 PLL-løsning som beskrevet i trinn 1.3.2.
    2. Vask cellene en gang med 10 ml varm fosfatbuffer saltvann - kalsium- og magnesiumfri 1X (1X PBS-CMF) (tabell 1) før du inkuberer i 3 minutter ved 37 ° C med 10 ml varm 20% trypsin / EDTA (T / E) løsning og mekanisk løsne cellene fra kolben. Overfør suspensjonen til et konisk rør som inneholder 5 ml varm, ikke-fortynnet FCS.
      MERK: I henhold til leverandørens protokoll22 kan samlingen av astrocytter optimaliseres ved å plassere kolben i inkubatoren i 1 minutt og trykke på kolben for å fullføre løsningen. De resterende cellene skal samles med 5 ml T/E-nøytraliseringsløsning og plasseres i det FCS-holdige koniske røret.
    3. Sentrifuge suspensjonen i 5 minutter ved 20 °C ved 190 x g.
    4. Resuspender cellepelleten i 5 ml varm AM. Tell cellene ved å fortynne 20 μL av cellesuspensjonen i 80 μL 1X PBS-CMF ved hjelp av et manuelt tellekammer under et mikroskop (se Materialtabell). Plate rundt 40 000 celler / cm2 i hver PLL-precoated brønn i et volum på 1,5 ml varm AM.
  2. Såing av pericytter på de tilbakestilte innsettingsfiltrene
    1. Tilsett 250 μL kollagen type I-løsning (100 μg / ml) på de tilbakestilte innsatsfiltrene, plassert i periferien av en dekket 25 mm høy tallerken (se materialtabell) ved hjelp av steril pinsett. La belegget stå i 1 time ved RT under sterile forhold.
      MERK: Den brukte parabolen må være høy nok til å sikre vedlikehold av sterilitet når den er utenfor hetten og unngå kontakt mellom løsningene på det tilbakestilte filteret og dekselet på parabolen.
    2. Fjern forsiktig kollagen type I-oppløsningen med en glasspipette koblet til et aspirasjonssystem. Vask to ganger med 250 μL RT DMEM HG og fjern deretter all løsningen forsiktig fra innsatsfiltrene. La de belagte innsatsfiltrene være på RT under sterile forhold til såing av cellene.
      MERK: Vær forsiktig så du ikke berører filteret under beleggprosedyren for å unngå membranskader. Når de er belagt med kollagen type I, kan innsatsfiltrene lagres over natten på RT.
    3. På dagen for trikulturinnstillingen, vask pericyttene to ganger med 10 ml varm 1X PBS-CMF og inkuber cellene med 2 ml varmt trypsin. Overvåk virkningen av trypsinet ved å observere cellene under mikroskopet. Når cellene begynner å løsne, fjern trypsinet og tilsett 5 ml varm ECM før mekanisk dissosiasjon.
    4. Tell cellene ved å fortynne 20 μL av cellesuspensjonen i 80 μL 1X PBS-CMF ved hjelp av et manuelt tellekammer under et mikroskop, og frø 44 500 celler / cm 2 på de forhåndsbelagte tilbakestilte innsatsfiltrene i et volum på 250 μL. Hold innsatsfiltrene i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 3 timer under 5% CO 2 og 21% O2.
    5. Tilbakestill innsatsfiltrene forsiktig ved hjelp av steril pinsett i en 12-brønns plate som inneholder 1,5 ml varm ECM / brønn. Innsettingsfiltrene er nå klare til å belegges på den andre siden.
  3. Såing av endotelceller på innsettingsfiltrene
    1. Belagt oversiden av innsatsfiltrene med 500 μL ekstracellulær matriksbasert hydrogel (1/48 v/v) (se materialfortegnelse). Etter 1 time, i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5% CO 2 og 21% O2, vask en gang med 500 μL RT DMEM HG.
    2. Vask en gang med 10 ml varm 1X PBS-CMF og inkuber cellene med 2 ml varm trypsin. Når cellene begynner å løsne, fjern trypsinet og tilsett 5 ml varm ECM før mekanisk dissosiasjon.
    3. Tell cellene ved å fortynne 20 μL av cellesuspensjonen i 80 μL 1X PBS-CMF ved hjelp av et manuelt tellekammer under mikroskop og frø ECs med en tetthet på 71 500 celler / cm2 på de forhåndsbelagte innsatsfiltrene i et volum på 500 μL varm ECM.
    4. Bytt ut AM med 1,5 ml varm ECM/brønn og overfør deretter de sådde innsatsfiltrene (ECs + pericytter) på brønnene som inneholder astrocytter.
    5. Plasser trikulturcellesystemene i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO 2 og 21 % O2.
  4. Vedlikehold av trippelcellekulturen for induksjon av BBB-egenskapene
    MERK: For induksjon av BBB-egenskapene i ECene er det nødvendig med 6 dager med trippelkultur.
    1. Forny mediet annenhver dag frem til dag 6, og fjern forsiktig mediet fra det øvre og nederste rommet ved hjelp av en glasspipette koblet til et aspirasjonssystem.
    2. Bytt raskt ut med varm ECM i et volum på 500 μL i det øvre rommet og 1,5 ml i underrommet, og sett cellene tilbake i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO 2 og 21 % O2.

3. BBB fenotype validering

MERK: Etter 6 dager med trippelkultur, tiden som er nødvendig for å indusere BBB-fenotypen i ECs, er den menneskelige BBB-modellen klar for eksperimenter. Den fysiske integriteten til de hjernelignende endotelcellene (BLECs) visualiseres ved immunfluorescensfarging av TJ-proteiner evaluert ved hjelp av permeabilitetsanalyse til BBB-integritetsmarkører. BBB-fenotypevalideringen inkluderer også gener/proteinuttrykksanalyse og efflukspumpers funksjonalitet i henhold til prosedyren beskrevet i Deligne et al.,23. Pericytter og astrocytter visualiseres av respektive fargemarkører i henhold til prosedyren beskrevet i Deligne et al. 202023.

  1. Immunfluorescensfarging
    1. Fest innsatsfiltrene og astrocytter i iskald metanol/aceton (50/50 v/v) i 1 min og vask to ganger med RT 1X PBS-CMF.
    2. Skill filteret forsiktig fra innsatsen ved å kutte membranen ved hjelp av en skalpell. Utfør immuncytokjemi på membran- og bunnbrønnene i henhold til Deligne et al.23.
      MERK: For blokkeringstrinnet, bruk 250 μL SEA BLOCK Block-buffer (se Materialfortegnelse) i 30 minutter ved RT.
  2. BBB integritet analyse
    1. Vurder den fysiske integriteten til BLAC-ene ved en permeabilitetsanalyse ved bruk av BBB-integritetsmarkører med forskjellige molekylvekter, som natriumfluorescein (NaF) og 20 kDa Dextran (FD20) (se materialtabell).
      MERK: Eksperimentet kan utføres i henhold til prosedyren beskrevet i Deligne et al.23.
  3. Efflux pumpe funksjonalitet
    1. Vurder funksjonaliteten til P-glykoprotein (P-gp) og brystkreftresistensprotein (BCRP) ved å måle intracellulær akkumulering av Rhodamin 123 (R123) med og uten Elacridar, en P-gp og BCRP-hemmer (se tabell over materialer).
      MERK: Eksperimentet kan utføres i henhold til prosedyren beskrevet i Deligne et al.23.
  4. Gen- og proteinuttrykk
    1. Utføre gen- og proteinprøvetaking på is etter en rask vask med kald Ringer HEPES (RH) (tabell 1) av cellene. Før EC-prøveinnsamling, skrap av pericyttene fra de inverterte innsatsfiltrene20.

4. Nanogel transport

MERK: For å estimere passasjen av polymere nanogeler (NGs) fra luminal til abluminalrommet i trikulturen BEC-modellen, ble 0,1 mg / ml NG-løsning tilsatt på dag 6 på luminalrommet i 24 timer. Studerte NGer var fluorescerende merket N-isopropylakrylamid (NIPAM)-baserte hydrogeler med en gjennomsnittlig størrelse på 8-10 nm (se materialtabell).

  1. Vei nanogelpulveret og oppløselig det i ECM i en konsentrasjon på 1 mg / ml. Sonicate løsningen i 10 min og filtrer med et 0,2 μm PTFE-filter.
    MERK: Forbered en ny NG-løsning dagen for eksperimentet.
  2. Bytt medium i luminalrommet og tilsett 50 μL NGs løsning i det øvre rommet for en endelig konsentrasjon på 0,1 mg/ml.
    MERK: Utfør en fortynning på 1:10 fra den opprinnelige løsningen.
  3. Etter 24 timers inkubasjon, samle aliquots fra luminal (20 μL) og abluminal (200 μL) rom og legg dem i en svart 96-brønnplate.
  4. Kvantifiser fluorescensen ved hjelp av en fluorescerende flerplateleser (se materialtabell) med en svart 96-brønnplate ved å bruke innstillingen av eksitasjons- / utslippsbølgelengder ved 477/540 nm. Beregn prosentandelen av krysset referert til den opprinnelige arbeidsløsningen lagt til på tidspunktet = 0 t (t0) 6,15.
    MERK: For å klargjøre 96-brønnsplaten for fluorescensmåling, tilsett 200 μL oppløsning fra abluminalrommet og 20 μL oppløsning fra luminalrommet og t0-preparatet (tilsett 180 μL ECM for å nå et endelig volum på 200 μL). Inkluder også en kalibreringskurve og et emne til leseplaten. Instrumentale parametere: Deteksjonsmetode - Fluorescens, Optisk posisjon - Topp, Lesetype - Endepunkt, Eksitasjonsbølgelengde - 477 nm, Emisjonsbølgelengde - 540 nm, Følsomhet - 100, Rist - Dobbel orbital for 5 s.

Representative Results

Innstilling av den menneskelige trippelkulturen BBB-modellen
Protokollen som kreves for innstillingen av den menneskelige BBB in vitro-modellen er beskrevet i figur 1 og inkluderer påfølgende trinn hvis rekkefølge må respekteres strengt. Først dyrkes de tre celletypene individuelt i cellekulturskåler (figur 1A) før de settes sammen i et innsatsfiltersystem. Trippelkulturinnstillingen begynner med såing av den første celletypen, astrocytter, i den forhåndsbelagte bunnbrønnen. Dagen etter sås pericytter og ECer på innsatsfilterets forhåndsbelagte abluminale og luminale overflater. Innsatsfilteret overføres deretter over astrocytter. Modellen opprettholdes i kultur i 6 dager, tiden som er nødvendig for å indusere BBB-egenskapene i ECs, med fornyelse av medium annenhver dag i henhold til den patenterte samkulturmodellen24. ECene blir deretter omdøpt til BLECs (figur 1B).

Karakterisering av den menneskelige BBB-modellen
Trippelcellekulturmodellen har blitt karakterisert for tilstedeværelsen av et sett med BBB-spesifikke egenskaper. Først og fremst bekreftet immuncytokjemidata uttrykket av konvensjonelle markører som blodplateavledet vekstfaktorreseptor β (PDGFR-β)25,26 og desmin for pericytter og gliafibrillært surt protein (GFAP)26 for astrocytter (figur 2A). Derfor, etter de 6 dagene med kultur med pericytter og astrocytter, viser monolaget av BLECs, visualisert med den tilhørende kryssfargingen av VE-Cadherin, en kontinuerlig lokalisering av TJ-proteiner, Claudin-5 og ZO-1, ved cellegrensene (figur 2A). Oppsettet av TJs er korrelert med lave paracellulære permeabilitetskoeffisienter målt ved bruk av BBB-integritetsmarkører med lav molekylvekt, dvs. NaF (376 Da) 16,27 og høy molekylvekt, dvs. FD20 (20 kDa) 27, som vist i figur 2B. Verdiene som måles er sammenlignbare med validerte BBB in vitro-modeller ved bruk av den nøyaktige kilden til ECs23,24,28. Til sammen fremhever disse resultatene den lave paracellulære permeabiliteten til trippelkulturen BEC-monolag, som er karakteristisk for in vivo BBB. I tillegg viste R123 intracellulær akkumulering i BLEC en signifikant økning i tilstedeværelsen av efflukspumpehemmeren Elacridar 23,24 sammenlignet med kontrolltilstanden med fravær (figur 2C). Dette indikerer tilstedeværelsen av aktive efflukspumpemolekyler, nemlig P-gp og BCRP, i BLAC-ene.

For ytterligere å karakterisere BLAC-ene ble genuttrykk og proteinnivå av viktige BBB-funksjoner studert (figur 3). Dataene oppnådd med trippelkulturmodellen ble sammenlignet med den validerte og patenterte kokulturmodellen bestående av ECs og pericytes24 brukt som kontrollmodell. Astrocytter representerer den tredje celletypen som er lagt til i den opprinnelige samkulturmodellen i trippelkulturmodellen. Derfor viste genuttrykksanalysen (figur 3A) av trippelkultur BLECs, sammenlignet med co-culture BLECs, vedlikehold av ekspresjon av viktige BBB-funksjoner som TJ-proteiner (claudin-5 og zonula occludens-1) og efflukspumper (P-gp og BCRP), og oppregulering av mest studerte BBB-transportører (glukosetransportør 1) og reseptorer (transferrinreseptor). Proteinkvantifiseringsdata (figur 3B) ble funnet å være i tråd med transkripsjonsresultatene. Samlet sett støtter disse dataene den positive induksjonen av BBB-egenskaper i trippelkulturens BEC-lag som ligner på den validerte samkulturmodellen. Til sammen viser trippelkulturmodellen de nødvendige fysiske og metabolske egenskapene for et in vitro mikrofysiologisk system for å modellere BBB.

Anvendbarhet til legemiddelleveringsstrategier - måling av nanogeltransport
For å vurdere muligheten for å bruke trippelkulturmodellen til å studere nye hjerneleveringsstrategier, ble transporten av fluorescerende merkede NIPAM-baserte nøytrale NG-er evaluert 6,15. Ved tidspunkt 0 ble NGs plassert i luminalrommet i en konsentrasjon på 0,1 mg/ml (figur 4A). Etter 24 timers inkubasjon ble 5,82% av NG-ene funnet i abluminalrommet (figur 4B), noe som viste deres evne til å krysse BLAC-ene.

Resultatene viser modellens egnethet til å måle permeabiliteten til små og større forbindelser, som beskrevet med integritetsmarkørene, og evaluere transporten av nanomaterialer som polymere NG-er.

Figure 1
Figur 1: Representasjon av kritiske trinn for innstillingen av trippelkulturen in vitro-modellen til den menneskelige BBB. (A) Fasekontrastbilder av de tre cellekomponentene i BBB-modellen: endotelceller (EC), pericytter (PC) og astrocytter (AC). Skala bar = 250 μm. (B) Skjematisk og illustrerende tidslinje for innstillingen av trippelkulturen menneskelig BBB in vitro modell. Den uthevede boksen representerer beleggprosedyren for det omvendte innsatsfilteret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Vurdering av egenskapene til trippelkulturen BBB-modellen. (A) Representative immunostaining-bilder av de karakteristiske markørene for BLEC (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 og VE-Cadherin: Ve-Cadh), pericytter (Platelet-Derived Growth Factor Receptor-β: PDGFR-β og desmin), og astrocytter (Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP). Skala bar = 10 μm. (B) Paracellulær permeabilitet av BLEC til fluorescerende BBB-integritetsmarkører, natriumfluorescein (NaF, 376 Da, Pe: 0,61 ± 0,062) og FITC-Dextran (FD20, 20 kDa, Pe: 0,04 ± 0,005). N = 3; n = 9. Gjennomsnittlig ± SEM. (C) P-gp- og BCRP-funksjonalitet i ECs ble vurdert ved å kvantifisere intracellulær R123 med (124,2 % ± 3,39 %) og uten (100 % ± 8,79 %) Elacridar. N = 4; n = 12. Gjennomsnittlig ± SEM. p = 0,017 ved bruk av uparret t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Evaluering av BEC-genuttrykk og proteinnivå av distinkte markører i trippelkulturmodellen sammenlignet med den kokulturelle BBB-modellen. (A) Genuttrykk av tette kryssproteiner (Claudin-5: CLD5 og Zona Occludens-1: ZO1), transportører (glukosetransportør-1: GLUT1, P-glykoprotein: PGP og brystkreftresistensprotein: BCRP) og store molekylreseptorer (Transferrinreseptor: TRFR), normalisert ved ekspresjon av RPLP0. N = 3; n = 9. (B) Proteinnivå av tette kryssproteiner (CLD5 og ZO1), transportører (GLUT1, PGP og BCRP) og store molekylreseptorer (TRFR), normalisert ved ekspresjon av β-aktin. N = 3; n = 9. Gjennomsnittlig ± SEM. For (A) og (B) tilsvarer verdier>1 høyere genuttrykk eller proteinnivåer i trippelkulturmodellen. Den røde linjen tilsvarer en verdi på 1 der ekspresjonsnivået (gener eller proteiner) i de to modellene er ekvivalent. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Måling av nanogeltransport i trippelkulturmodellen. (A) Skjematisk fremstilling av nanogeltransportanalysen. (B) Prosentandel av nanogeltransport etter 24 timers inkubasjon i trippelkulturmodellen (5,82% ± 0,09%). N = 2; n = 6. Gjennomsnittlig ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn på bufferen Komposisjon Notat
Molecular Vekt
Fosfatbuffer saltvann, fri for kalsiummagnesium PBS-CMF NaCl 8 g/l 58.4 Tilsett all forbindelsen i sterilt vann og vent på fullstendig oppløselighet. PH i den oppnådde løsningen må ligge i området 7,3-7,4. Filtrer oppløsningen ved hjelp av en 0,22 μm membran og oppbevar den sterile oppløsningen ved 4 °C.
KCl 0,2 g/l 74.55
KH2PO4 0,2 g/l 136.09
NaHPO4-12 T2O 2,87 g/l 358.14
Vann
Ringer HEPES RH NaCl 8,8 g/l 58.4 Tilsett alt forbindelsen i sterilt vann og vent på fullstendig oppløsning. Juster pH til 7,4 (startløsning pH rundt 6,8). Filtrer oppløsningen ved hjelp av en 0,22 μm membran og oppbevar den sterile oppløsningen ved 4 °C.
KCl 0,387 g/l 74.55
CaCl2 0,244 g/l 110.99
MgCl 2 6T2 O 0,0406 g/l 203.3
NaHCO3 0,504 g/l 84.1
HEPES 1,19 g/l 238.3
Glukose 0,504 g/l 180.16
Vann

Tabell 1: Sammensetning av de ulike bufferne som brukes i protokollen.

Discussion

Behandling av hjernesykdommer er fortsatt en utfordring med tanke på vanskeligheten av stoffene å hindre over BBB for å nå sine cellulære og molekylære mål i hjernen parenchyma.

Narkotikautvikling for hjernesykdommer viser for tiden en lav suksessrate siden de fleste legemidler som viser lovende resultater i prekliniske modeller, ikke viste noen fordel når de brukes i klinikken. Etter "3R-regelen", som tar sikte på å redusere antall dyr som brukes til eksperimentering, utvikles in vitro-modeller av BBB for å studere hjernepatologier og for å forutsi hjernepenetrasjon av legemidler29. In vitro-modeller av BBB har hovedsakelig blitt utviklet ved hjelp av dyreceller og har blitt mer sofistikerte for å forbedre relevansen av de oppnådde resultatene16. En av de betydelige fremskrittene i bruken av humane celler, som gir ubestridelig ny innsikt og mer spesifisitet, på cellulært og molekylært nivå, for å studere menneskelige sykdomsmekanismer16. Utviklingen av relevante modeller krever imidlertid å vurdere forbedringen av BBB in vitro-modellinnstillingene og kunnskapen som oppstår, takket være dyremodeller. Derfor må den vurdere kompleksiteten til BBB-arkitekturen og betydningen av celle-cellekommunikasjonen for å studere BBB under fysiologiske og patologiske forhold30.

Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å sette opp en full human BBB in vitro-modell som består av de tre hovedcelletypene til BBB, uten begrensning av tilgang til hjernevev. Som et flercellesystem er induksjon og vedlikehold av BBB-egenskaper, uten kunstig bruk av strammeforbindelser, men i stedet indusert av celle-cellekommunikasjon, mer fysiologisk relevant og i tråd med in vivo-induksjonen av BBB-egenskapene31. Derfor er respekten for kronologien til protokollen av største betydning for protokollens suksess. Videre representerer inkubasjonstidene under innstillingen av trippelkulturen og når de tre celletypene er samlet, de viktigste kritiske trinnene i protokollen.

BBB-egenskapene i ECs induseres av samkulturen med pericytter, som beskrevet for samkulturmodellen24. Derfor er kulturen av pericytter på baksiden av innsatsfilteret det mest kritiske punktet og krever strengt å følge protokollen med risiko for ikke å ha nok pericytter for induksjon av BBB-egenskapene. Først av alt, under beleggprosedyren og også cellesåing, må det tas hensyn til ikke å ha dekselet til petriskålen i kontakt med belegget og også mediet når cellene er sådd for å sikre et godt belegg av filteret og ikke å miste celler (trinn 2.2.1 og 2.2.4). Videre, når pericytter er sådd, er det viktig å vente den angitte tiden for vedlegg av pericyttene (trinn 2.2.4) før du tilbakestiller innsatsfilteret for belegg og såing av ECs på den andre siden (trinn 2.2.5 og 2.3). Når det er sådd, kreves det seks dager for å indusere BBB-egenskapene gjennom celle-cellekommunikasjon (trinn 2.4).

Modellen er validert når det gjelder begrenset permeabilitet (knyttet til innstillingen av de tette kryssene) siden EC-ene i trippelkulturmodellen viser permeabilitetsverdier til BBB-integritetsmarkører som ligner på den validerte samkulturmodellen og også målt i validerte dyre- eller menneskemodeller 16,27,32. Videre krever valideringen av en in vitro BBB-modell, i tillegg til den begrensede permeabiliteten, responsen til andre celletyper av NVU og uttrykket av funksjonelle reseptorer og transportører16. I tillegg er modellen reproduserbar og produserer flere innsatsfiltre og brønner for å utføre mange analyser (gen- og proteinuttrykk, fluorescerende farging, toksisitetstester) på hver celletype separat uten å kreve en cellesorteringsmetode.

Modellen ble utviklet ved hjelp av et 0,4 μm porestørrelsesfilter for å ha en celletype på hver side av innsatsfilteret. Innsatsfiltersystemet tillot studier av celle-cellekommunikasjon under fysiologiske forhold ved å overføre det på godt inneholdende astrocytter. Tilstedeværelsen av astrocytter i systemet representerer en merverdi sammenlignet med den opprinnelige samkulturen in vitro modell24. Faktisk, med tanke på betydningen av astrocytter i BBBs fysiologi, tillater denne tredje celletypen ytterligere forståelse av celle-cellekommunikasjonen i BBB. Videre kan trippelcellekultursystemet også studeres under patologiske forhold som slag, hvor astrocytter spiller en viktig rolle33,34,35. I tillegg kan utformingen av BLAC/pericytter på begge sider av innsatsfilteret enkelt plasseres på andre celletyper for å etterligne patologiske tilstander som hjernekreft23.

Porestørrelsen på innsatsfilteret kan gi begrensninger med noen eksperimenter, for eksempel celletransmigrasjon over BBB. Utviklingen av modellen med større porestørrelse krever imidlertid tilpasning av protokollen for å sikre dannelsen av et fysiologisk monolag av ECs og ikke flere lag, noe som ikke er fysiologisk relevant for å etterligne BBB36.

Modellens anvendelighet har blitt demonstrert ved hjelp av NGs transporteksperiment som viser muligheten til å gjøre transporteksperiment ved hjelp av et flercellet system. Likevel bør man være klar over vanskelighetene med å ha en kontrollforbindelse eller et molekyl for transporteksperimentet, og dele sammenlignbare egenskaper med NGs siden hver nanostruktur utviser et unikt sett med egenskaper (molekylvekt, ladning, form, fysiske egenskaper, proteinkoronadannelse).

En begrensning av modellen er fraværet av skjærspenning, som ble vist å påvirke differensieringen av ECs og uttrykket av TJ-proteiner37. Imidlertid er det utfordrende å utvikle et fluidisk system som etterligner hjernekapillæren med tanke på kompleksiteten ved å legge til en fluidisk del, som krever en bestemt enhet, i et flercellesystem. Videre er den spesielle enheten vanligvis ikke kommersielt tilgjengelig og tillater ikke mange repliker, noe som gjør fluidiske systemer mindre tilpasset for bruk med høy gjennomstrømning.

Oppsummert reproduserer dette trippelkultursystemet bestående av menneskelige celler in vitro arkitekturen til BBB. Det tillater generering av mange innlegg som kan brukes til omfattende screening av forbindelser.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet er gitt av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale No 764958, som en del av NANOSTEM-prosjektet, et Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Denne studien er gitt av 'Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais' (Fellowship to Clémence Deligne), "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent" (SFCE), Association "l'étoile de Martin" og Association "Cassandra contre la leucémie".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
Astocyte Medium (AM) ScienCell  1801
Astrocyte Growth Supplement ScienCell  1852 Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set.
Cell culture dish 100 mm Corning  430293 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting
Cell culture dish 150 mm Corning  430599 The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model.
Collagen I  Corning 354236 Rat tail 
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 31600-083 Powder
Endothelial Cell Growth Supplement ScienCell  1051 Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set.
Endothelial Cell Medium (ECM) ScienCell  1001
Fetal Calf Serum  Sigma F7524
Gelatin Sigma G2500 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF
Gentamicin BiochromA6 A-2712
Glucose Sigma G6152 Powder
Glutamine Merck 1002891000
Human Brain Cortex Astrocytes ScienCell  1800-SC
Malassez cell counting chamber vWR HECH40453702 The count was performed manually.
Matrigel Corning 354230 Extracellular matrix-based hydrogel
Penicillin/Streptomycin ScienCell  0503 Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets.
Poly-L-lysine ScienCell  0413
Steritop Millipore System SCGPT0SRE 0.22 µm pore size
Transwell insert  Corning 3401 0.4 µm pore polycarbonate filter 
Trypsin/EDTA neutralization solution ScienCell  0113
Trypsin/EDTA solution ScienCell  0103
Immunocytochemistry
SEA BLOCK blocking buffer ThermoScientific 37527
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody Thermofisher A11031 Dilution 1:500
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody Thermofisher A11036 Dilution 1:500
Anti-Claudin-5 primary antibody InVitrogen 34-1600 Dilution 1:100
Anti-Desmin primary antibody Abcam ab6322 Dilution 1:200
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody Dako Z0334 Dilution 1:500
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody Abcam ab51090 Dilution 1:200
Anti-VE-cadherin primary antibody Abcam ab207732 Dilution 1:200
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody InVitrogen 61-7300 Dilution 1:200
Normal Goat Serum Sigma G6767
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen  P36962
Gene expression
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit Macherey-Nagel 740,933,250
96 multiplate well Biorad HSP9601
iSCRIPT Biorad 1708841
Sealer sheet  Biorad MSB1001
SsoFast EvaGreen Supermix Biorad 172-5201
Protein expression
2x Laemli Sample Buffer Biorad 161-0737 Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay.
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody Abcam ab207732 Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Claudin-5 primary antibody Abcam ab15106 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody Millipore 07-1401 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Mouse secondary antibody Dako P0447 Dilution 1:5000 in TBS-Tween
Anti-P-glycoprotein primary antibody Genetex GTX23364 Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT
Anti-Rabbit secondary antibody Dako P0448 Dilution 1:8000 in TBS-Tween
Anti-Transferrin Receptor primary antibody Abcam ab84036 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Zona occludens-1 primary antibody Abcam ab216880 Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Criterion TGX Gel  Biorad 5678083
ECL Prime Solution Amersham  RPN2236 Revelation solution to keep in the dark
Phospatase inhibitor cocktail 2 Sigma P5726
Phospatase inhibitor cocktail 3 Sigma P0044
Protease Inhibitor Sigma P8340
Protein Standards Biorad 161-0373 Molecular weight markers
RIPA 10x Millipore 20-188
TBS 10x Biorad 1706435
TRIS-Glycine Biorad 1610771
Tween Biorad 1706531
BBB integrity assay
Sodium Fluorescein Ampresco 0681 λex= 490 nm; λem= 525 nm  
Elacridar Sigma SML0486 GF120918
FITC-Dextran 20 kDa Sigma FD-20S λex= 490 nm; λem=  525 nm  
Rhodamine 123 Sigma R8004 λex= 501 nm; λem= 538 nm  
SynergyTM H1  BioTek Instruments Fluorescent multiplate reader
Nanogel Transport
Syringe Terumo SS+01T1 1 mL syringe 
Filter FisherScientific 15161499 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels   The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).
  2. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062 (2020).
  3. Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).
  4. Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).
  5. Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. L.Advanced science. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937 (2021).
  6. Vashist, A., et al. Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery. Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).
  7. Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design. Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).
  8. Bernardo-Castro, S., et al. Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke. Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482 (2021).
  9. Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle. Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).
  10. Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure. Polymers. 11 (2), 353 (2019).
  11. Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. ”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics. ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).
  12. Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).
  13. Basso, J., et al. Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors. Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62 (2018).
  14. Harilal, S., et al. Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules. Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).
  15. Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation. Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).
  16. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  18. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies. Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).
  19. Shimizu, F., et al. Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors. Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).
  20. Pedroso, D. C., et al. Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells. PLoS One. 6 (1), 16114 (2011).
  21. Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin. Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).
  22. Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources (2021).
  23. Deligne, C., et al. Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37 (2020).
  24. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), 99733 (2014).
  25. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  26. Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
  27. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  28. Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells. Fluids Barriers CNS. 17, 48 (2020).
  29. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
  30. Neuhaus, W. In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier. Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).
  31. Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).
  32. Drolez, A., et al. Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines. PloS One. 11 (3), 0151155 (2016).
  33. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  34. Mysiorek, C., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier. Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).
  35. Culot, M., et al. Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study. Brain Research. 1294, 144-152 (2009).
  36. Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration. Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).
  37. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12, 40 (2011).

Tags

Biologi utgave 177
Et trippelkulturcellesystem som modellerer den menneskelige blod-hjernebarrieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rizzi, E., Deligne, C., Dehouck, L., … More

Rizzi, E., Deligne, C., Dehouck, L., Bilardo, R., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Resmini, M., Gosselet, F., Dehouck, M. P., Mysiorek, C. A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (177), e63134, doi:10.3791/63134 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter