Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att etablera en human blod-hjärnbarriär (BBB) in vitro-modell . Endotelcellerna och pericyterna är sådda på varje sida av ett insatsfilter (blodfack) och astrocyter sås i bottenbrunnen (hjärnfacket). Den karakteriserade modellen användes för nanopartiklar transportexperiment.
Abstract
Leveransen av läkemedel till hjärnan är fortfarande en utmaning på grund av blod-hjärnbarriärens (BBB) mycket specifika och restriktiva egenskaper, som styr och begränsar tillgången till hjärnans parenkym. Men med utvecklingen av nanoteknik utvecklades stora paneler av nya nanomaterial för att förbättra läkemedelsleveransen, vilket belyser behovet av tillförlitliga in vitro-mikrosystem för att förutsäga hjärnans penetration inom ramen för prekliniska analyser. Här är en enkel metod för att skapa ett mikrofysiologiskt system för att modellera BBB med enbart mänskliga celler. I sin konfiguration består modellen av en trippelkultur inklusive hjärnliknande endotelceller (BLC), pericyter och astrocyter, de tre huvudsakliga BBB-cellulära aktörerna som är nödvändiga för att inducera och reglera BBB-egenskaperna på ett mer fysiologiskt sätt utan krav på åtdragningsföreningar. Modellen som utvecklats i ett 12-brunnsplattformat, redo efter 6 dagars trippelkultur, kännetecknas av fysikaliska egenskaper, gen- och proteinuttryck och används för polymer nanogeltransportmätning. Modellen kan användas för ett omfattande spektrum av experiment i friska och patologiska tillstånd och utgör ett värdefullt verktyg för prekliniska bedömningar av molekyl- och partikeltransport, samt inter- och intracellulär handel.
Introduction
BBB, lokaliserad på nivån av hjärnkapillärendotelceller (ECs), kontrollerar och reglerar tillgången till hjärnparenkymen, vilket är avgörande för att upprätthålla hjärnans homeostas och neurala cellers funktion 1,2. Men när det gäller hjärnpatologi representerar bristen på tillgång till hjärnparenkymen ett verkligt hinder för att utveckla terapeutiska strategier.
BBB ECs har en komplex uppsättning egenskaper, inklusive proteiner med tät korsning (TJ), som tätar det intercellulära utrymmet, associerat med ett system av effluxpumpar, specifika transportörer och receptorer, som styr den transcellulära vägen 1,2,3. Dessutom induceras och upprätthålls alla dessa egenskaper tack vare kommunikation med pericyterna inbäddade i BBB EC-källarmembranet och astrocyterna, vars ändfötter omger hjärnkapillärerna 1,2,3. Därför är det en utmaning att studera BBB in vitro med tanke på komplexiteten i dess arkitektur och kommunikationen mellan de olika celltyperna som utgör den neurovaskulära enheten (NVU)2. Dessutom är de olika celltyperna avgörande för induktion och underhåll av BBB-egenskaper och påverkar följaktligen förutsägelsen av korsningen genom BBB. Olika strategier för läkemedelsleverans till hjärnan testades redan med hjälp av en stor panel av taktik för att kringgå BBB-begränsade egenskaper4. På senare tid, med utvecklingen av nanoteknik, utvecklas nya material för applikationer som läkemedelsbärare 5,6. Förutom deras högre belastning, minskad toxicitet och ökade läkemedels biotillgänglighet kan dessa nya nanomaterial funktionaliseras för en trojansk häststrategi för att korsa BBB och specifikt rikta in sig på celler i parenkymen 5,6. Bland de olika typer av nanomaterial som utvärderas har nanogeler väckt stor uppmärksamhet, främst på grund av deras kolloidala egenskaper och förmåga att skräddarsy den kemiska strukturen för att införa stimuliresponsiva egenskaper 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
In vitro-modeller utvecklas nu för prekliniska studier med humana celler för att förutsäga hjärnans penetration av läkemedel16. Olika inställningar av dessa modeller finns tillgängliga, från monolager av hjärn-ECs till flera cellsystem16. Med tanke på vikten av NVU-cellerna i BBB-induktionen och underhållet och det samordnade svaret på den patologiska miljön måste BBB in vitro-modeller överväga alla dessa huvudpersoner för att förbättra relevansen av förutsägelsen 2,17.
Den nuvarande metoden beskriver att man sätter upp en trippelodlings in vitro-modell av den humana BBB, som är fullt utvecklad med mänskliga celler för att studera specifika cellulära och humana molekylära mekanismer. För att vara fysiologiskt relevant består modellen av de tre viktigaste cellulära aktörerna i BBB (ECs, pericyter och astrocyter) som är nödvändiga för att inducera och bibehålla BBB-egenskaperna, utan användning av åtdragningsföreningar och uppvisar en uppsättning egenskaper som krävs för att betraktas som en in vitro BBB-modell16,18. Modellen är uppbyggd i en konfiguration som avgränsar blod- och hjärnfacket, lämplig för prekliniska studier av läkemedels- och partikeltransport för att förutsäga hjärnpenetration. Modellens användbarhet illustreras genom att mäta transporten av polymera nanogeler.
Protocol
Protokollet godkändes av det franska ministeriet för högre utbildning och forskning (referens: CODECOH DC2011-1321) och av den lokala undersökningsgranskningsnämnden (Béthune Maternity Hospital, Beuvry, Frankrike). För att erhålla endotelcellerna (ECs) erhölls skriftligt och informerat samtycke från givarens föräldrar för att samla navelsträngsblod, i enlighet med den franska lagstiftningen. Pericyterna tillhandahålls av professor Takashi Kanda (Institutionen för neurologi och klinisk neurovetenskap, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Japan) som isolerades enligt referens19. Primära mänskliga hjärnbark astrocyter köps från en kommersiell leverantör (se Materialförteckning).
1. Cellodling
- Odling av endotelceller
OBS: Endotelceller (ECs) härrör från CD34 + hematopoetiska stamceller isolerade från humant navelsträngsblod, enligt metoden som beskrivs av Pedroso et al.20. Endotelfenotypen hos ECs beskrivs i Pedroso et al.20.- Odla humana ECs med endotelcellmedium kompletterat med 5% av fostrets kalvserum (FCS), 0.5% av gentamicin och 1% av endotelcellstillväxttillskott (ECM) (se materialförteckning).
- För subodling av ECs, två dagar före inställningen av modellen, täck en skål med 10 ml 2% gelatin i 15 min vid 37 ° C och ersätt den sedan med 20 ml varm ECM. Tina en injektionsflaska med ECs som innehåller 1 miljon celler (cellerna räknades manuellt enligt beskrivningen i steg 2.3.3 före cellfrysning) i den förbelagda cellodlingsskålen.
- Efter 3 timmar vid 37 °C förnya mediet och behåll cellerna tills trikulturen sätts in i en fuktad atmosfär inuti en inkubator vid 37 °C under 5 % CO2 och 21 %O2.
- Odling av pericyter
OBS: Pericyterna isoleras från den mänskliga hjärnan enligt protokollet publicerat av Shimizu et al.19, vars isoleringsförfarande följer metoden publicerad av Kanda et al.21 med modifieringar.- Odla pericyterna med Dulbeccos modifierade Eagle-medium kompletterat med 4,5 g / L glukos (DMEM HG), 10% FCS, 1% de penicillin / streptomycin och 1% L-glutamin (se materialtabell).
- För pericytsubodling, fem dagar före modellens inställning, täck två diskar med 8 ml/skål med 100 μg/ml kollagen typ I-lösning i 0,02 N ättiksyra i 1 timme vid rumstemperatur (RT) och tvätta sedan två gånger med RT DMEM HG. Tina en injektionsflaska med pericyter som innehåller 1 miljon celler i ett koniskt rör som innehåller 10 ml varmt medium och centrifugera suspensionen i 5 minuter vid 190 x g vid 20 °C.
- Återsuspendera pelleten i 10 ml varmt medium och frö i de förbelagda cellodlingsskålarna förfyllda med 15 ml varmt medium/skål. Mediet förnyas efter 3 dagar och cellerna bibehålls tills trikulturen sätts i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5% CO2 och 21%O2.
- Odling av astrocyter
- Odla astrocyterna med hjälp av ett astrocytmedium kompletterat med 20% av FCS, 1% av astrocyttillväxttillskottet och 1% av penicillin / streptomycinlösning (AM) (se materialtabell).
- För subodling av astrocyterna, en vecka före modellinställningen, täck en T75-cellodlingskolv med 10 ml 2 μg/cm2 poly-L-lysin (PLL) i 1 timme vid 37 °C och tvätta två gånger med RT sterilt vatten. Tina en injektionsflaska med astrocyter som innehåller 1 miljon celler i 20 ml varmt medium och frö i den förbelagda T75-cellodlingskolven.
OBS: De kommersiellt erhållna cellflaskorna bekräftar närvaron av ~ 1 miljon celler, så räkningen av celler utfördes inte här. - Håll cellerna i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5% CO2 och 21%O2. Mediet förnyas efter 24 timmar och sedan var 2: e dag tills trikulturen sätts in.
2. Trippel kulturmodellinställning
OBS: Sammansättningen av de tre celltyperna utförs samma dag. Dagen före inställningen av trikulturen, utför kollagen typ I-beläggningen på de återställda insatsfiltren (se materialtabell) och frö astrocyterna i de PLL-förbelagda brunnarna på en 12-brunnsplatta.
- Sädning av astrocyter i brunnarna
- Täck brunnarna med 500 μl 2 μg/cm2 PLL-lösning enligt beskrivningen i steg 1.3.2.
- Tvätta cellerna en gång med 10 ml varm fosfatbuffert saltlösning - kalcium- och magnesiumfri 1X (1X PBS-CMF) (tabell 1) innan du inkuberar i 3 min vid 37 °C med 10 ml varm 20% trypsin/EDTA (T/E)-lösning och lossa cellerna mekaniskt från kolven. Överför suspensionen till ett koniskt rör som innehåller 5 ml varm, icke-utspädd FCS.
OBS: Enligt leverantörens protokoll22 kan samlingen av astrocyter optimeras genom att placera kolven i inkubatorn i 1 min och knacka på kolven för att slutföra lossningen. De återstående cellerna ska samlas upp med 5 ml T/E-neutralisationslösning och placeras i det FCS-innehållande koniska röret. - Centrifugera suspensionen i 5 minuter vid 20 °C vid 190 x g.
- Återsuspendera cellpelleten i 5 ml varm AM. Räkna cellerna genom att späda ut 20 μL av cellsuspensionen i 80 μl 1X PBS-CMF med hjälp av en manuell räknekammare i mikroskop (se Materialförteckning). Platta cirka 40 000 celler/cm2 i varje PLL-förbelagd brunn i en volym av 1,5 ml varm AM.
- Sådd av pericyter på de återställda insatsfiltren
- Tillsätt 250 μl kollagen typ I-lösning (100 μg/ml) på filtren för den återställda insatsen, placerad i periferin av en täckt 25 mm hög skål (se materialtabell) med steril pincett. Lämna beläggningen i 1 h vid RT under sterila förhållanden.
OBS: Den använda skålen måste vara tillräckligt hög för att säkerställa upprätthållandet av sterilitet när den är utanför huven och undvika kontakt mellan lösningarna på det återställda filtret och skålens lock. - Ta försiktigt bort kollagen typ I-lösningen med en glaspipett ansluten till ett aspireringssystem. Tvätta två gånger med 250 μl RT DMEM HG och ta sedan försiktigt bort all lösning från insatsfiltren. Lämna de belagda insatsfiltren vid RT under sterila förhållanden tills cellerna såts.
OBS: Under beläggningsproceduren, var försiktig så att du inte vidrör filtret för att undvika membranskador. När de är belagda med kollagen typ I kan insatsfiltren förvaras över natten vid RT. - På dagen för trikulturinställningen, tvätta pericyterna två gånger med 10 ml varm 1X PBS-CMF och inkubera cellerna med 2 ml varmt trypsin. Övervaka trypsinets verkan genom att observera cellerna under mikroskopet. När cellerna börjar lossna, ta bort trypsin och tillsätt 5 ml varm ECM före mekanisk dissociation.
- Räkna cellerna genom att späda ut 20 μL av cellsuspensionen i 80 μl 1X PBS-CMF med hjälp av en manuell räknekammare under ett mikroskop och frö 44 500 celler/cm2 på de förbelagda återförda insatsfiltren i en volym av 250 μl. Förvara insatsfiltren i en fuktad inkubator vid 37 °C i 3 timmar under 5 % CO2 och 21 %O2.
- Sätt försiktigt tillbaka insatsfiltren med steril pincett i en 12-brunnsplatta som innehåller 1,5 ml varm ECM/brunn. Insatsfiltren är nu redo att beläggas på andra sidan.
- Tillsätt 250 μl kollagen typ I-lösning (100 μg/ml) på filtren för den återställda insatsen, placerad i periferin av en täckt 25 mm hög skål (se materialtabell) med steril pincett. Lämna beläggningen i 1 h vid RT under sterila förhållanden.
- Såning av endotelceller på infogningsfiltren
- Täck insatsfiltrens ovansida med 500 μl extracellulär matrisbaserad hydrogel (1/48 v/v) (se materialförteckning). Tvätta en gång en gång med 500 μl RT DMEM HG I en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2 och 21 %O2.
- Tvätta en gång med 10 ml varm 1X PBS-CMF och inkubera cellerna med 2 ml varmt trypsin. När cellerna börjar lossna, ta bort trypsin och tillsätt 5 ml varm ECM före mekanisk dissociation.
- Räkna cellerna genom att späda ut 20 μL av cellsuspensionen i 80 μl 1X PBS-CMF med hjälp av en manuell räknekammare under mikroskop och så ECs med en densitet av 71 500 celler/cm2 på de förbelagda insatsfiltren i en volym av 500 μL varm ECM.
- Byt ut AM mot 1,5 ml varm ECM/brunn och överför sedan de sådda insatsfiltren (ECs + pericyter) på brunnarna som innehåller astrocyterna.
- Placera trekulturcellsystemen i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2 och 21 %O2.
- Underhåll av trippelcellkulturen för induktion av BBB-egenskaperna
OBS: För induktion av BBB-egenskaperna i ECs är 6 dagars trippelkultur nödvändig.- Förnya mediet varannan dag fram till dag 6, ta försiktigt av mediet från det övre och nedre facket med en glaspipett ansluten till ett aspirationssystem.
- Byt snabbt ut med varm ECM i en volym på 500 μL i det övre facket och 1,5 ml i det nedre facket och sätt tillbaka cellerna i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5%CO2 och 21% O2.
3. BBB-fenotypvalidering
OBS: Efter 6 dagars trippelkultur, den tid som krävs för att inducera BBB-fenotypen i ECs, är den mänskliga BBB-modellen redo för experiment. Den fysiska integriteten hos de hjärnliknande endotelcellerna (BLC) visualiseras genom immunofluorescensfärgning av TJ-proteiner utvärderade med hjälp av permeabilitetsanalys till BBB-integritetsmarkörer. BBB-fenotypvalideringen inkluderar också gen- / proteinuttrycksanalys och effluxpumpfunktionalitet enligt proceduren som beskrivs i Deligne et al.,23. Pericyter och astrocyter visualiseras av respektive färgningsmarkörer enligt proceduren som beskrivs i Deligne et al. 202023.
- Immunofluorescens färgning
- Fäst insatsfiltren och astrocyterna i iskall metanol/aceton (50/50 v/v) i 1 min och tvätta två gånger med RT 1X PBS-CMF.
- Separera försiktigt filtret från insatsen genom att klippa membranet med en skalpell. Utför immunocytokemi på membranet och bottenbrunnarna enligt Deligne et al.23.
OBS: För blockeringssteget, använd 250 μL SEA BLOCK Blocking buffer (se materialtabell) i 30 minuter vid RT.
- BBB-integritetsanalys
- Bedöm BLC: s fysiska integritet genom en permeabilitetsanalys med hjälp av BBB-integritetsmarkörer med olika molekylvikter, som natriumfluorescein (NaF) och 20 kDa Dextran (FD20) (se materialtabell).
OBS: Experimentet kan utföras enligt proceduren som beskrivs i Deligne et al.23.
- Bedöm BLC: s fysiska integritet genom en permeabilitetsanalys med hjälp av BBB-integritetsmarkörer med olika molekylvikter, som natriumfluorescein (NaF) och 20 kDa Dextran (FD20) (se materialtabell).
- Efflux pumpens funktionalitet
- Bedöma funktionaliteten hos P-glykoprotein (P-gp) och bröstcancerresistensprotein (BCRP) genom att mäta den intracellulära ackumuleringen av Rhodamine 123 (R123) med och utan Elacridar, en P-gp och BCRP-hämmare (se Materialförteckning).
OBS: Experimentet kan utföras enligt proceduren som beskrivs i Deligne et al.23.
- Bedöma funktionaliteten hos P-glykoprotein (P-gp) och bröstcancerresistensprotein (BCRP) genom att mäta den intracellulära ackumuleringen av Rhodamine 123 (R123) med och utan Elacridar, en P-gp och BCRP-hämmare (se Materialförteckning).
- Gen- och proteinuttryck
- Utför gen- och proteinprovsinsamling på is efter en snabb tvätt med kall Ringer HEPES (RH) (tabell 1) av cellerna. Före provtagning från EC skrapa bort pericyterna från de inverterade insatsfiltren20.
4. Transport av nanogel
OBS: För att uppskatta passagen av polymera nanogeler (NG) från luminal till abluminalfacket i triculture BLC-modellen, tillsattes 0,1 mg / ml NG-lösning vid dag 6 på luminalfacket i 24 timmar. Studerade NGs var fluorescerande märkta N-isopropylakrylamid (NIPAM)-baserade hydrogeler med en genomsnittlig storlek på 8-10 nm (se Materialförteckning).
- Väg nanogelpulvret och solubilisera det i ECM i en koncentration av 1 mg/ml. Sonicate lösningen i 10 min och filtrera med ett 0,2 μm PTFE-filter.
OBS: Förbered en ny NG-lösning dagen för experimentet. - Byt medium i luminalfacket och tillsätt 50 μl NGs-lösning i det övre facket för en slutlig koncentration på 0,1 mg/ml.
OBS: Utför en utspädning på 1:10 från den ursprungliga lösningen. - Efter 24 timmars inkubation, samla alikvoter från luminala (20 μL) och abluminala (200 μL) fack och placera dem i en svart 96-brunnsplatta.
- Kvantifiera fluorescensen med hjälp av en fluorescerande flerplattläsare (se materialtabell) med en svart 96-brunnsplatta med hjälp av inställningen av excitations-/emissionsvåglängder vid 477/540 nm. Beräkna den procentuella korsning som avses med den ursprungliga arbetslösningen som tillsatts vid tiden = 0 h (t0)6,15.
OBS: För att förbereda 96-brunnsplattan för fluorescensmätningen, tillsätt 200 μl lösning från det abluminala facket och 20 μl lösning från luminalfacket och t0-preparatet (tillsätt 180 μL ECM för att nå en slutlig volym på 200 μl). Inkludera också en kalibreringskurva och ett ämne på läsplattan. Instrumentparametrar: Detektionsmetod - Fluorescens, Optisk position - Top, Read Type - Endpoint, Excitation våglängd - 477 nm, Emissionsvåglängd - 540 nm, Känslighet - 100, Skaka - Dubbel orbital i 5 s.
Representative Results
Inställning av den mänskliga trippelkulturen BBB-modellen
Det protokoll som krävs för att fastställa den humana in vitro-modellen för BBB beskrivs i figur 1 och innehåller successiva steg vars ordning måste respekteras strikt. Först odlas de tre celltyperna individuellt i cellodlingsskålar (figur 1A) innan de monteras i ett insatsfiltersystem. Den tredubbla odlingsinställningen börjar med sådd av den första celltypen, astrocyter, i den förbelagda bottenbrunnen. Följande dag sås pericyter och ECs på insatsfiltrets förbelagda abluminala respektive luminala ytor. Insatsfiltret överförs sedan över astrocyterna. Modellen upprätthålls i kultur i 6 dagar, den tid som krävs för att inducera BBB-egenskaperna i ECs, med en förnyelse av medium varannan dag enligt den patenterade samkulturmodellen24. ECs döps sedan om till BLEC (figur 1B).
Karakterisering av den mänskliga BBB-modellen
Trippelcellodlingsmodellen har karakteriserats för närvaron av en uppsättning BBB-specifika egenskaper. Först och främst bekräftade immunocytokemidata uttrycket av konventionella markörer såsom trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor β (PDGFR-β)25,26 och desmin för pericyter och glialfibrillärt surt protein (GFAP)26 för astrocyter (Figur 2A). Därför, efter de 6 dagarna av odling med pericyterna och astrocyterna, visar monoskiktet av BLC, visualiserat med den vidhäftande korsningsfärgningen av VE-Cadherin, en kontinuerlig lokalisering av TJ-proteiner, Claudin-5 och ZO-1, vid cellgränserna (Figur 2A). Inställningen av TJs är korrelerad med låga paracellulära permeabilitetskoefficienter uppmätta med BBB-integritetsmarkörer med låg molekylvikt, dvs. NaF (376 Da)16,27 och hög molekylvikt, dvs. FD20 (20 kDa)27, som visas i figur 2B. De uppmätta värdena är jämförbara med validerade BBB in vitro-modeller med den exakta källan till ECs23,24,28. Sammantaget belyser dessa resultat den låga paracellulära permeabiliteten hos trippelkulturens BLEC-monolager, vilket är karakteristiskt för in vivo BBB. Dessutom uppvisade R123 intracellulär ackumulering i BLEC en signifikant ökning av närvaron av effluxpumphämmaren Elacridar 23,24 jämfört med kontrolltillståndet med dess frånvaro (figur 2C). Detta indikerar närvaron av aktiva effluxpumpmolekyler, nämligen P-gp och BCRP, i BLC: erna.
För att ytterligare karakterisera BLC: erna studerades genuttryck och proteinnivå för viktiga BBB-funktioner (figur 3). De data som erhölls med trippelkulturmodellen jämfördes med den validerade och patenterade samodlingsmodellen bestående av ECs och pericyter24 som användes som kontrollmodell. Astrocyterna representerar den tredje celltypen som läggs till i den ursprungliga samodlingsmodellen i trippelodlingsmodellen. Därför visade genuttrycksanalysen (figur 3A) av trippelodlings-BLC: er, jämfört med co-culture BLECs, upprätthållandet av uttryck av viktiga BBB-funktioner såsom TJ-proteiner (claudin-5 och zonula occludens-1) och effluxpumpar (P-gp och BCRP), och uppregleringen av de flesta studerade BBB-transportörer (glukostransportör 1) och receptorer (transferrinreceptor). Proteinkvantifieringsdata (figur 3B) visade sig vara i linje med transkriptionsresultaten. Sammantaget stöder dessa data den positiva induktionen av BBB-egenskaper i BLEC-skiktet med trippelkultur som liknar den validerade samkulturmodellen. Sammantaget visar trippelkulturmodellen de fysikaliska och metaboliska egenskaper som krävs för ett in vitro-mikrofysiologiskt system för att modellera BBB.
Tillämplighet på drug delivery-strategier - mätning av nanogeltransport
För att bedöma möjligheten att använda trippelkulturmodellen för att studera nya hjärnleveransstrategier utvärderades transporten av fluorescerande taggade NIPAM-baserade neutrala NG 6,15. Vid tiden 0 placerades NG i luminalfacket i en koncentration av 0,1 mg/ml (figur 4A). Efter 24 timmars inkubation hittades 5,82% av NG: erna i det abluminala facket (figur 4B), vilket bevisade deras förmåga att korsa BLEC: erna.
Resultaten visar modellens lämplighet att mäta permeabiliteten hos små och större föreningar, som beskrivs med integritetsmarkörerna, och utvärdera transporten av nanomaterial såsom polymera NG.
Figur 1: Representation av kritiska steg för inställningen av den tredubbla in vitro-modellen för humant BBB. (A) Faskontrastbilder av de tre cellkomponenterna i BBB-modellen: endotelceller (EC), pericyter (PC) och astrocyter (AC). Skalstreck = 250 μm. (B) Schematisk och illustrativ tidslinje för inställningen av den tredubbla humana BBB in vitro-modellen. Den markerade rutan representerar beläggningsproceduren för det inverterade insatsfiltret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bedömning av egenskaperna hos BBB-modellen med trippelkultur. (A) Representativa immunfärgningsbilder av de distinkta markörerna för BLEC (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 och VE-Cadherin: Ve-Cadh), pericyter (trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor-β: PDGFR-β och desmin) och astrocyter (glialfibrillärt surt protein: GFAP). Skalstreck = 10 μm. (B) Paracellulär permeabilitet hos BLEC till fluorescerande BBB-integritetsmarkörer, natriumfluorescein (NaF, 376 Da, Pe: 0,61 ± 0,062) och FITC-Dextran (FD20, 20 kDa, Pe: 0,04 ± 0,005). N = 3; n = 9. ±(C) P-gp- och BCRP-funktionalitet i ECs utvärderades genom att kvantifiera intracellulär R123 med (124,2% ± 3,39%) och utan (100% ± 8,79%) Elacridar. N = 4; n = 12. Medelvärde ± SEM. p = 0,017 med hjälp av ett oparat t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Utvärdering av BLC-genuttryck och proteinnivå för distinkta markörer i trippelodlingsmodellen jämfört med samkulturens BBB-modell. (A) Genuttryck av täta korsningsproteiner (Claudin-5: CLD5 och Zona Occludens-1: ZO1), transportörer (glukostransportör-1: GLUT1, P-glykoprotein: PGP och bröstcancerresistensprotein: BCRP) och stora molekylreceptorer (Transferrinreceptor: TRFR), normaliserade genom uttrycket av RPLP0. N = 3; n = 9. (B) Proteinnivå av täta korsningsproteiner (CLD5 och ZO1), transportörer (GLUT1, PGP och BCRP) och stora molekylreceptorer (TRFR), normaliserade genom uttrycket av β-aktin. N = 3; n = 9. Medel ± SEM. För (A) och (B) motsvarar värden>1 högre genuttryck eller proteinnivåer i trippelodlingsmodellen. Den röda linjen motsvarar värdet 1 där uttrycksnivån (gener eller proteiner) för de två modellerna är ekvivalent. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mätning av nanogeltransport i trippelkulturmodellen. (A) Schematisk representation av nanogeltransportanalysen. (B) Procentandel nanogeltransport efter 24 timmars inkubation i trippelodlingsmodellen (5,82 % ± 0,09 %). N = 2; n = 6. Medel ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffertens namn | Sammansättning | Not | ||||
| Molekylvikt | ||||||
| Fosfatbuffert saltlösning, kalciummagnesiumfri | PBS-CMF | NaCl | 8 g/l | 58.4 | Tillsätt hela föreningen till sterilt vatten och vänta på fullständig solubilisering. PH för den erhållna lösningen måste ligga i intervallet 7,3-7,4. Filtrera lösningen med ett membran på 0,22 μm och förvara den sterila lösningen vid 4 °C. | |
| KCl | 0,2 g/l | 74.55 | ||||
| KH2PO4 | 0,2 g/l | 136.09 | ||||
| NaHPO4-12 H2O | 2,87 g/l | 358.14 | ||||
| Vatten | ||||||
| Ringer HEPES | RH | NaCl | 8,8 g/l | 58.4 | Tillsätt hela föreningen till sterilt vatten och vänta på fullständig lösning. Justera pH-värdet till 7,4 (startlösningens pH runt 6,8). Filtrera lösningen med ett membran på 0,22 μm och förvara den sterila lösningen vid 4 °C. | |
| KCl | 0,387 g/l | 74.55 | ||||
| CaCl2 | 0,244 g/l | 110.99 | ||||
| MgCl 2 6H2 O | 0,0406 g/l | 203.3 | ||||
| NaHCO3 | 0,504 g/l | 84.1 | ||||
| HEPES | 1,19 g/l | 238.3 | ||||
| Glukos | 0,504 g/l | 180.16 | ||||
| Vatten | ||||||
Tabell 1: Sammansättning av de olika buffertar som används i protokollet.
Discussion
Behandling av hjärnsjukdomar är fortfarande en utmaning med tanke på läkemedlens svårighet att hindra BBB att nå sina cellulära och molekylära mål i hjärnparenkymen.
Läkemedelsutveckling för hjärnsjukdomar uppvisar för närvarande en låg framgångsgrad eftersom de flesta läkemedel som visar lovande resultat i prekliniska modeller inte kunde visa någon nytta när de användes i kliniken. Efter "3R-regeln", som syftar till att minska antalet djur som används för experiment, utvecklas in vitro-modeller av BBB för att studera hjärnpatologier och för att förutsäga hjärnpenetration av läkemedel29. In vitro-modeller av BBB har huvudsakligen utvecklats med hjälp av djurceller och har blivit mer sofistikerade för att förbättra relevansen av de erhållna resultaten16. Ett av de betydande framstegen i användningen av mänskliga celler, vilket ger obestridlig ny insikt och mer specificitet, på cellulär och molekylär nivå, för att studera mänskliga sjukdomsmekanismer16. Utvecklingen av relevanta modeller kräver dock att man överväger förbättringen av BBB in vitro-modellinställningarna och den kunskap som uppstår tack vare djurmodeller. Därför måste den ta hänsyn till komplexiteten i BBB-arkitekturen och vikten av cell-cellkommunikationen för att studera BBB under fysiologiska och patologiska förhållanden30.
Protokollet som presenteras här beskriver en metod för att inrätta en fullständig human BBB in vitro-modell som omfattar de tre huvudcelltyperna i BBB, utan begränsning av tillgången till hjärnvävnad. Som ett flercellssystem är induktionen och upprätthållandet av BBB-egenskaper, utan artificiell användning av åtdragningsföreningar, utan istället inducerad av cell-cellkommunikation, mer fysiologiskt relevant och i linje med in vivo-induktionen av BBB-egenskaperna31. Därför är respekten för protokollets kronologi av största vikt för protokollets framgång. Dessutom representerar inkubationstiderna under inställningen av trippelkulturen och när de tre celltyperna är monterade de viktigaste kritiska stegen i protokollet.
BBB-egenskaperna i ECs induceras av samkulturen med pericyter, som beskrivs för samkulturmodellen24. Därför är kulturen av pericyter på baksidan av skärfiltret den mest kritiska punkten och kräver strikt att protokollet följs med risk för att inte ha tillräckligt med pericyter för induktion av BBB-egenskaperna. Först och främst, under beläggningsförfarandet och även cellsådd, måste man vara uppmärksam på att inte ha locket på petriskålen i kontakt med beläggningen och även mediet när cellerna är sådda för att säkerställa en bra beläggning av filtret och inte förlora celler (steg 2.2.1 och 2.2.4). När pericyterna är sådda är det dessutom viktigt att vänta den angivna tiden för fastsättning av pericyterna (steg 2.2.4) innan man återställer insatsfiltret för beläggning och sådd av ECs på andra sidan (steg 2.2.5 och 2.3). När de är sådda krävs sex dagar för att inducera BBB-egenskaperna genom cell-cellkommunikation (steg 2.4).
Modellen valideras i termer av begränsad permeabilitet (associerad med inställningen av de snäva korsningarna) eftersom ECs i trippelkulturmodellen visar permeabilitetsvärden för BBB-integritetsmarkörer som liknar den validerade samodlingsmodellen och även mäts i validerade djur- eller människomodeller 16,27,32. Dessutom kräver valideringen av en in vitro BBB-modell, förutom den begränsade permeabiliteten, lyhördhet för andra celltyper i NVU och uttryck av funktionella receptorer och transportörer16. Dessutom är modellen reproducerbar och producerar flera skärfilter och brunnar för att utföra många analyser (gen- och proteinuttryck, fluorescerande färgning, toxicitetstester) på varje celltyp separat utan att kräva en cellsorteringsmetod.
Modellen utvecklades med hjälp av ett 0,4 μm porstorleksfilter för att ha en celltyp på varje sida av insatsfiltret. Insatsfiltersystemet möjliggjorde studier av cell-cellkommunikation under fysiologiska förhållanden genom att överföra det vid välinnehållande astrocyter. Förekomsten av astrocyter i systemet representerar ett plusvärde jämfört med den initiala samkulturen in vitro-modell 24. Med tanke på vikten av astrocyter i BBB: s fysiologi möjliggör denna tredje celltyp ytterligare förståelse för cellcellkommunikationen inom BBB. Dessutom kan trippelcellodlingssystemet också studeras vid patologiska tillstånd såsom stroke, där astrocyterna spelar en viktig roll33,34,35. Dessutom kan utformningen av BLC/ pericyter på båda sidor av insatsfiltret enkelt placeras på andra celltyper för att efterlikna patologiska tillstånd som hjärncancer23.
Inläggsfiltrets porstorlek kan medföra begränsningar med vissa experiment, till exempel celltransmigration över BBB. Utvecklingen av modellen med en större porstorlek kräver emellertid anpassning av protokollet för att säkerställa bildandet av ett fysiologiskt monolager av ECs och inte flera lager, vilket inte är fysiologiskt relevant för att efterlikna BBB36.
Modellens tillämplighet har demonstrerats med hjälp av NGs transportexperiment som visar möjligheten att göra transportexperiment med hjälp av ett flercelligt system. Ändå bör man vara medveten om svårigheterna med att ha en kontrollförening eller molekyl för transportexperimentet och dela jämförbara egenskaper med NG eftersom varje nanostruktur uppvisar en unik uppsättning egenskaper (molekylvikt, laddning, form, fysikaliska egenskaper, proteinkoronabildning).
En begränsning av modellen är frånvaron av skjuvspänning, vilket visade sig påverka differentieringen av ECs och uttrycket av TJ-proteiner37. Att utveckla ett fluidiskt system som efterliknar hjärnkapillären är dock utmanande med tanke på komplexiteten i att lägga till en flytande del, som kräver en specifik enhet, i ett flercellssystem. Dessutom är den specifika produkten vanligtvis inte kommersiellt tillgänglig och tillåter inte många replikat, vilket gör fluidiska system mindre anpassade för användning med hög genomströmning.
Sammanfattningsvis reproducerar detta trippelodlingssystem bestående av mänskliga celler in vitro BBB: s arkitektur. Det möjliggör generering av många insatser som kan användas för omfattande screening av föreningar.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete beviljas av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 764958, som en del av NANOSTEM-projektet, ett Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Denna studie beviljas av "Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais" (Fellowship to Clémence Deligne), "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent" (SFCE), föreningen "l'étoile de Martin" och föreningen "Cassandra contre la leucémie".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
| Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
| Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
| Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
| Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
| Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
| Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
| Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
| Glutamine | Merck | 1002891000 | |
| Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
| Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
| Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
| Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
| Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
| Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
| Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
| Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
| Immunocytochemistry | |||
| SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
| Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
| Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
| Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
| Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
| Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
| Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
| Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
| Gene expression | |||
| NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
| 96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
| iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
| Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
| Protein expression | |||
| 2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
| Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
| Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
| Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
| Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
| Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
| ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
| Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
| Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
| Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
| RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
| TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
| TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
| Tween | Biorad | 1706531 | |
| BBB integrity assay | |||
| Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
| Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
| FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
| Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
| SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
| Nanogel Transport | |||
| Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
| Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
| N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062 (2020).
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).
- Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. L.Advanced science. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937 (2021).
- Vashist, A., et al. Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery. Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).
- Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design. Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).
- Bernardo-Castro, S., et al. Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke. Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482 (2021).
- Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle. Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).
- Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure. Polymers. 11 (2), 353 (2019).
- Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. ”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics. ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).
- Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).
- Basso, J., et al. Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors. Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62 (2018).
- Harilal, S., et al. Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules. Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).
- Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation. Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
- Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies. Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).
- Shimizu, F., et al. Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors. Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).
- Pedroso, D. C., et al. Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells. PLoS One. 6 (1), 16114 (2011).
- Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin. Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).
- Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources (2021).
- Deligne, C., et al. Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37 (2020).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), 99733 (2014).
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
- Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
- Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells. Fluids Barriers CNS. 17, 48 (2020).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Neuhaus, W. In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier. Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).
- Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).
- Drolez, A., et al. Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines. PloS One. 11 (3), 0151155 (2016).
- Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
- Mysiorek, C., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier. Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).
- Culot, M., et al. Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study. Brain Research. 1294, 144-152 (2009).
- Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration. Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).
- Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12, 40 (2011).
