Summary
在这里，我们提出了一种标准化的方案，用于监测 黑腹果蝇 的肠道酸化，并具有最佳输出。我们首先将此方案用于 黑色果蝇 的肠道酸化监测，然后证明其在非模型 果蝇 物种中的使用。
Abstract
果蝇中肠由多个区域组成，每个区域都由执行肠道正常功能所需的独特生理功能的细胞组成。一个这样的区域，铜细胞区域（CCR），定位于中肠中部，部分由一组称为铜电池的细胞组成。铜细胞参与胃酸分泌，这是一种进化保守的过程，其确切的作用知之甚少。本文描述了目前用于测定成年 果蝇 肠道酸化的方案的改进，并证明它可以用于其他种类的苍蝇。特别是，本文表明肠道酸化取决于苍蝇的营养状况，并提出了基于这一新发现的方案。总体而言，该协议证明了研究 果蝇 铜细胞的潜在有用性，以揭示肠道酸化机制背后的一般原理。
Introduction
在昆虫肠道中，铜细胞与哺乳动物胃的产酸胃壁细胞（也称为oxyntic）具有细胞和功能相似性。这组细胞将酸释放到肠腔中。酸分泌和解剖学的功能在进化上是保守的。排放的酸的主要成分是盐酸和氯化钾。细胞中酸形成的化学机制取决于碳酸酐酶。这种酶从CO2 和水中产生碳酸氢根离子，释放出一个羟基离子，然后通过质子泵排入腔内以换取钾。氯离子和钾离子通过电导通道输送到管腔中，形成盐酸和氯化钾，氯化钾是胃液的主要成分1，2，3，4。
虽然酸形成的机制已经很清楚了，但对调节酸分泌的生理机制知之甚少。开发这种方法的目的是帮助更好地描绘协调酸形成和分泌的细胞途径，并确定酸在介导肠道生理学和稳态中的作用。开发和使用该技术背后的基本原理是提供一种一致且可靠的方法来研究 果蝇 和非模型生物的肠道酸化过程。虽然目前存在用于测定 果蝇 中谷酸化的标准方案2，5，6，但在使用该方案研究铜细胞功能时，观察到野生型（WT）苍蝇酸化程度的显着变异性。为了理解这种观察到的变异性的基础并获得一致的结果，如下所述优化了标准协议的几个方面。
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Protocol
注：标准实验室线俄勒冈R被用作WT对照。所有苍蝇在标准玉米粉 - 糖蜜培养基（含有糖蜜，琼脂，酵母，玉米粉，癡脂，丙酸和水）下在室温下以12/12小时的浅/暗昼夜节律饲养。
1. 检测准备
- 在CO2 麻醉下收集雌性苍蝇（0-2天大，非处女），并让它们在实验前至少在标准玉米粉食物中恢复3天。
- 在室温（〜23°C）下将苍蝇饿死在含有用〜2mL去离子水浸泡的实验室擦拭组织的小瓶中约24小时。
- 用溴酚蓝（BPB）准备苍蝇食物如下：
- 将苍蝇食物放入微波炉中融化，然后让它冷却，直到它不温不热。
- 将 1 mL 4% BPB 加入 1 mL 温热食物中，搅拌均匀。
- 使用移液器，将含有BPB的苍蝇食物加入培养皿中心的单个点（〜200μL）中。
2. 肠道酸化监测测定
- 将饥饿的苍蝇转移到含有单点（200μL）的苍蝇食品的培养皿中，并补充有2%溴酚蓝（BPB）。让苍蝇在室温下觅食4小时，同时暴露在光线下。
- 4小时后，收集苍蝇并在冰上麻醉它们;手术隔离他们的内脏。
- 在立体显微镜下用镊子在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行手术（见 材料表）。用一对镊子固定胸部并用第二对镊子拉下腹部，直到肠道的CCR可见，从而隔离肠道，注意确保肠道在两端保持连接。
- 通过检查肠道CCR的颜色来确定肠道的酸化（图1C;黄色表示酸化，蓝色表示未酸化）。
- 只数那些肠道中表现出强烈BPB染色的苍蝇。
- 使用以下等式计算百分比：
内脏酸化的苍蝇百分比=酸化的苍蝇数量×100/（酸化的苍蝇数量+未酸化的苍蝇数量）
注意：百分比为0表示没有苍蝇酸化其肠道，而百分比为100表示所有苍蝇的肠道酸化。
3. 安装和图像采集
注：此步骤是额外的，用于获取和处理相应条件的图像以进行进一步分析，因为样品不能长时间保存。这些图像不用于任何肠道酸度定量。
- 解剖后，将PBS中的样品安装到载玻片上。
- 使用cellSens Entry软件在显微镜下采集图像（参见 材料表）。
- 将准备好的载玻片置于显微镜下，并使用目镜调整样品。
- 关闭目镜以打开相机的快门。
- 在连接的计算机上打开软件。
- 选择正确的物镜，单击 实时 按钮，然后选择带有曝光时间调整的标准设置。
- 将焦点放在 CCR 区域并拍摄快照。
- 右键单击快照图像窗口，并将其另存为.tif文件。
- 使用斐济软件进一步对齐和处理图像。
- 在斐济软件中导入.tif文件并清除不相关的背景。
- 调整强度和对比度以优化CCR和其他肠道区域。
- 添加比例尺并另存为.tif文件。
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Representative Results
我们使俄勒冈R雌性苍蝇挨饿超过20小时，然后喂它们补充了BPB（2%）的食物约12小时，如前所述7，8，9，10，11。溴酚蓝（BPB）是一种pH传感染料。它在pH 3.0时从黄色变为pH 4.6及以上时变为蓝色。如前所述，在肠道解剖后，发现一些苍蝇产生酸，如肠道CCR中的黄色所示（图1B）。令人惊讶的是，与已发表的结果相反，一些苍蝇的肠道是蓝色的，这表明它们未能酸化肠道。这些不一致的结果表明，需要对协议进行修改，以优化一致且可解释的结果。
为了优化 BPB 协议，合并了两项新的修改。首先，为了更好地控制进食的开始，将苍蝇饿死，然后用BPB放在盘子中心的食物点上（图1A）。其次，我们开始在更接近喂养开始的时间点测定肠道酸化。雌性苍蝇被饥饿>20小时，在一个小的培养皿中用BPB提供苍蝇食物（见 图1A），并允许喂食不同的时间点，直到4小时，同时以1小时的间隔解剖内脏。测定酸化内脏（黄色）和非酸化内脏（蓝色）的数量，并计算每个时间点显示肠道酸化的苍蝇的百分比（图1B）。在30分钟内，约20%的苍蝇已经酸化了肠道。一小时后，〜40%的肠道显示出酸化的证据，而在喂养2小时和3小时后，酸化内脏的百分比分别增加到〜60%和〜70%（图1B）。这表明随着时间的推移，显示肠道酸化的苍蝇的百分比有所增加。当苍蝇喂食4小时时，几乎90-95%的内脏被酸化（图1B）。我们使用这种优化的4小时喂养方案进行后续实验。
除了喂食的影响外，还检查了苍蝇升高的温度对肠道酸化的影响。将苍蝇在23°C和30°C下饲养，雌性苍蝇挨饿约20小时。然后将苍蝇喂食补充BPB的苍蝇食物4小时，并如上所述确定肠道酸化的百分比。我们观察到这两种温度的肠道酸化没有差异（图1C），这表明温度与喂养不同，不会影响肠道酸化。
非模式生物的肠道酸化方案演示
Drosophilae 物种在系统发育上分离了数百万年（见 图2A）。在这段漫长的时期内，它们已经适应了不同的栖息地和饮食12，增加了某些物种可能不会以与 D. melanogaster相同的方式酸化肠道的可能性。我们使用 D. melanogaster （水果）， D. sechecllia （morinda水果）， D. erecta （露兜树果实）， D. pseudoosubcura 和 D. virilis （植物汁液）和 D. mojavensis （仙人掌果实）（图2B）。为了证明该协议可用于其他 果蝇 物种，这些物种喂食补充了BPB的苍蝇食物4小时，并如上所述确定了肠道酸化的百分比。对于所有测试物种，观察到强烈的肠道酸化（图2B）。这一结果表明，肠道的酸化在进化上在不同的 果蝇 物种中是保守的，并且该协议可以很容易地用于其他生物体。
图1：肠道酸化监测。 （A）喂养场示意图。蓝点代表含有溴酚蓝（一种指示pH值的染料）的苍蝇食物。其他斑点代表果蝇。（B）显示肠道酸化的苍蝇百分比的图形表示，在4小时内喂养不同持续时间。酸化肠道和非酸化肠道的代表性肠道图像。红色箭头表示中肠铜细胞区域的酸性释放。 n = 4个实验，每个实验25-30只雌性苍蝇。比例尺 = 每个 500 μm。星号表示与对照组的显着差异（单因子方差分析，然后是Bonferroni检验）*P<0.05;**P < 0.01;P < 0.0001。（C）将苍蝇喂食BPB在23°C或30°C下4小时。 显示肠道酸化的苍蝇的百分比（%）。 n = 4 个实验，每个实验 25-30 只雌蝇（未配对 的 t 检验，然后是非参数的 Mann-Whitney U 检验和 Wilcoxon 秩和检验。缩写：ns = 不显著。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：肠道酸化现象的系统发育（A）果蝇物种的系统发育关系及其摄食习性和栖息地。1 mm 条表示 100 万年。（B）显示肠道酸化的苍蝇（果蝇物种）的百分比，用BPB喂养苍蝇食物4小时n = 4个实验，每个实验25-30只雌性苍蝇（单因子方差分析，然后进行Bonferroni测试）。缩写：ns = 不显著。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
该协议中的一个关键步骤是正确解剖肠道，以可视化酸化表型的CCR。当肠道完好无损时，从铜细胞释放的酸被限制在CCR中。然而，在解剖过程中，由肠道破裂引起的泄漏可导致酸从CCR扩散，并导致肠道被错误地评为酸化阴性。此外，指示酸化的黄色在解剖后5-10分钟内褪色，强调了分离后不久对肠道酸化表型进行评分的重要性。最后，目前的方案7，8，9，10，11 测定苍蝇肠道中的酸化状态依赖于用BPB补充苍蝇食物，而不考虑动物的喂养状态。然而，在我们的研究中，我们发现肠道酸化不是构成性的，而是依赖于先前饥饿后的喂养。因此，使用BPB作为肠道pH值指标准确评估肠道酸状态需要考虑苍蝇的营养状况以及任何其他变量。
肠道的酸化从较低的多细胞到较高的生物体是保守的。然而，人们对它在大多数动物中的功能以及调节它的分子和细胞途径的全部程度知之甚少。在人类中，缺乏肠道酸化与营养物质吸收不良有关，而肠道中过量的酸会导致肠道溃疡13。因此，从肠道酸化研究中获得的见解可能会为治疗和治愈由酸分泌调节缺陷引起的肠道疾病提供新的见解。
果蝇 最近成为研究肠道酸化的强大模型2，5，6。遗传学研究已经确定了建立酸分泌细胞所需的基因和参与酸生产机制。还进行了药物研究。例如，当给苍蝇喂食乙酰唑胺（一种碳酸酐酶（CAH）抑制剂7）时，可以防止肠道酸化，这与CAH在产生酸所必需的质子中起的核心作用一致。我们希望该协议能够帮助研究人员快速且经济高效地发现肠道酸度的药物抑制剂或激活剂。此外，该方法与遗传和生化方法相结合的应用将有助于揭示参与酸分泌的细胞途径，并确定肠道酸化在肠道和生物体稳态中的作用。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者承认，对作者实验室工作的支持由HHMI教师学者奖和UT西南医学中心儿童研究所的启动资金提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
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