Summary
Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor het monitoren van darmverzuring in Drosophila melanogaster met optimale output. We gebruiken dit protocol eerst voor darmverzuringsmonitoring bij Drosophila melanogaster en demonstreren vervolgens het gebruik ervan in niet-model Drosophila-soorten .
Abstract
De fruitvlieg midgut bestaat uit meerdere regio's, die elk zijn samengesteld uit cellen die unieke fysiologische functies uitvoeren die nodig zijn voor de goede werking van de darm. Een dergelijk gebied, het kopercelgebied (CCR), is gelokaliseerd in het middelste middengut en bestaat gedeeltelijk uit een groep cellen die bekend staat als kopercellen. Kopercellen zijn betrokken bij maagzuursecretie, een evolutionair geconserveerd proces waarvan de precieze rol slecht wordt begrepen. Dit artikel beschrijft verbeteringen in het huidige protocol dat wordt gebruikt om te testen op verzuring van de volwassen Drosophila melanogaster-darm en toont aan dat het kan worden gebruikt op andere soorten vliegen. In het bijzonder toont dit artikel aan dat darmverzuring afhankelijk is van de voedingsstatus van de vlieg en presenteert een protocol op basis van deze nieuwe bevinding. Over het algemeen toont dit protocol het potentiële nut aan van het bestuderen van Drosophila-kopercellen om algemene principes te ontdekken die ten grondslag liggen aan de mechanismen van darmverzuring.
Introduction
In de insectendarm delen kopercellen cellulaire en functionele overeenkomsten met de zuurproducerende maagpariëtale cellen (ook bekend als oxyntisch) van de zoogdiermaag. Deze groep cellen geeft zuur af in het darmlumen. De functie van zuursecretie en anatomie is evolutionair geconserveerd. De belangrijkste componenten van het geloosde zuur zijn zoutzuur en kaliumchloride. Het chemische mechanisme van zuurvorming in de cellen is afhankelijk van koolzuuranhydrase. Dit enzym genereert een bicarbonaation uit CO2 en water, dat een hydroxylion vrijmaakt dat vervolgens via een protonpomp in het lumen wordt afgevoerd in ruil voor kalium. Chloride- en kaliumionen worden via geleidingskanalen in het lumen getransporteerd, wat resulteert in de vorming van zoutzuur en kaliumchloride, het hoofdbestanddeel van maagsap1,2,3,4.
Hoewel de mechanismen van zuurvorming goed worden begrepen, is er veel minder bekend over de fysiologische mechanismen die de zuursecretie reguleren. Het doel van het ontwikkelen van deze methode is om de cellulaire routes die zuurvorming en secretie coördineren beter af te bakenen en de rol van zuur bij het bemiddelen van darmfysiologie en homeostase te bepalen. De reden achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om een consistente en betrouwbare methode te bieden om het proces van darmverzuring in Drosophila en niet-modelorganismen te bestuderen. Hoewel er momenteel een standaardprotocol bestaat voor het bepalen van Drosophila midgut-verzuring2,5,6, werd een significante variabiliteit waargenomen in de mate van verzuring bij wildtype (WT) vliegen tijdens het gebruik van dit protocol voor het bestuderen van de kopercelfunctie. Om de basis voor deze waargenomen variabiliteit te begrijpen en consistente resultaten te verkrijgen, werden verschillende aspecten van het standaardprotocol geoptimaliseerd zoals hieronder beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De standaard laboratoriumlijn Oregon R werd gebruikt als een WT-besturing. Alle vliegen werden gekweekt op standaard maïsmeel-melasse medium (met melasse, agar, gist, maïsmeel, tegosept, propionzuur en water) bij kamertemperatuur met 12/12 uur licht / donker circadiaans ritme.
1. Voorbereiding op de test
- Verzamel vrouwelijke vliegen (0-2 dagen oud, niet-maagdelijk) onder CO2-anesthesie en laat ze minstens 3 dagen vóór experimenten herstellen op standaard maïsmeelvoer.
- Honger de vliegen gedurende ~ 24 uur bij kamertemperatuur (~ 23 ° C) uit in injectieflacons met een laboratoriumdoekje weefsel gedrenkt in ~ 2 ml gedeïoniseerd water.
- Bereid het vliegenvoer met broomfenolblauw (BPB) als volgt:
- Smelt het vliegenvoer in een magnetron en laat het vervolgens afkoelen tot het lauw is.
- Voeg 1 ml 4% BPB toe aan 1 ml lauw voedsel en meng goed.
- Voeg met behulp van een pipet het vliegenvoer met BPB toe aan een enkele stip (~ 200 μL) in het midden van een petrischaal.
2. Controletest voor darmverzuring
- Breng uitgehongerde vliegen over in een petrischaaltje met enkele stippen (200 μL) vliegenvoer aangevuld met 2% broomfenolblauw (BPB). Laat de vliegen 4 uur foerageren bij kamertemperatuur terwijl ze worden blootgesteld aan licht.
- Na 4 uur, verzamel de vliegen en verdoof ze op ijs; chirurgisch isoleren van hun ingewanden.
- Voer de operatie uit in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met een tang onder een stereomicroscoop (zie de tabel met materialen). Isoleer de darm door de thorax met een tang vast te houden en de buik met een tweede paar naar beneden te trekken totdat de CCR van de darm zichtbaar is, waarbij u ervoor zorgt dat de darm aan beide uiteinden vast blijft zitten.
- Bepaal de verzuring van de darm door de kleur van de CCR van de darm te onderzoeken (figuur 1C; geel duidt op aangezuurd en blauw geeft aan dat het niet verzuurd is).
- Tel alleen die vliegen die robuuste BPB-vlekken in hun ingewanden vertonen.
- Bereken het percentage met behulp van de volgende vergelijking:
Percentage vliegen met aangezuurde ingewanden = aantal aangezuurde vliegen × 100 / (aantal aangezuurde vliegen + aantal vliegen niet-aangezuurd)
OPMERKING: Een percentage van 0 geeft aan dat geen vliegen hun darm hebben aangezuurd, terwijl een percentage van 100 aangeeft dat alle vliegen hun darm hebben aangezuurd.
3. Montage en beeldverwerving
OPMERKING: Deze stap is aanvullend om afbeeldingen te verkrijgen en te verwerken voor de respectieve omstandigheden voor verdere analyses, omdat de monsters niet lang kunnen worden bewaard. Deze beelden worden niet gebruikt voor enige darmzuurgraadkwantificering.
- Monteer na dissectie de monsters in PBS op een glazen dia.
- Verkrijg de beelden onder een microscoop met behulp van cellSens Entry-software (zie de tabel met materialen).
- Plaats het voorbereide glaasje onder de microscoop en pas het monster aan met behulp van het oculair.
- Schakel het oculair uit om de sluiter voor de camera te openen.
- Open de software op de aangesloten computer.
- Kies de juiste objectieflenzen, klik op de live-knop en selecteer de standaardinstelling met aanpassing van de belichtingstijd.
- Focus op de CCR-regio en maak de momentopname.
- Klik met de rechtermuisknop op het snapshot-afbeeldingsvenster en sla het op als een .tif bestand.
- Lijn en verwerk de afbeeldingen verder met behulp van Fiji-software.
- Importeer het .tif-bestand in Fiji-software en wis de niet-gerelateerde achtergrond.
- Pas de intensiteit en het contrast aan om de CCR en andere darmgebieden te optimaliseren.
- Voeg de schaalbalk toe en sla deze op als een .tif bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hongerden Oregon R vrouwelijke vliegen meer dan 20 uur uit en voerden ze vervolgens voedsel aangevuld met BPB (2%) gedurende ~ 12 uur, zoals eerder beschreven7,8,9,10,11. Broomfenolblauw (BPB) is een pH-sensing kleurstof. Het verandert van geel bij pH 3,0 tot blauw bij pH 4,6 en hoger. Na darmdissectie, zoals eerder gemeld, bleken sommige vliegen zuur te produceren zoals aangegeven door gele kleur in de CCR van de darm (figuur 1B). Verrassend genoeg, in tegenstelling tot gepubliceerde resultaten, waren de darmen van sommige vliegen blauw, wat suggereert dat ze hun ingewanden niet hadden verzuurd. Deze inconsistente resultaten gaven aan dat het protocol moest worden aangepast om te optimaliseren voor consistente en interpreteerbare resultaten.
Om het BPB-protocol te optimaliseren, werden twee nieuwe wijzigingen aangebracht. Eerst, om het begin van het voeren beter te beheersen, werden vliegen uitgehongerd en vervolgens op plekken van voedsel met BPB in het midden van een bord geplaatst (figuur 1A). Ten tweede begonnen we te testen op darmverzuring op tijdstippen dichter bij het begin van de voeding. Vrouwelijke vliegen werden uitgehongerd voor >20 uur, voorzagen vliegenvoer van BPB in een kleine Petri-plaatarena (zie figuur 1A) en mochten zich gedurende verschillende tijdstippen voeden tot 4 uur terwijl ze ingewanden met intervallen van 1 uur ontleedden. Het aantal aangezuurde darmen (gele kleur) en niet-aangezuurde darmen (blauwe kleur) werd bepaald en het percentage vliegen met darmverzuring werd berekend voor elk tijdstip (figuur 1B). Binnen 30 minuten had ~ 20% van de vliegen hun darm verzuurd. Na een uur vertoonde ~ 40% van de darmen tekenen van verzuring, terwijl na 2 uur en 3 uur voeden het percentage aangezuurde darmen steeg tot respectievelijk ~ 60% en ~ 70% (figuur 1B). Dit geeft aan dat er met de tijd een toename is van het percentage vliegen dat darmverzuring vertoont. Bijna 90-95% van de ingewanden werd aangezuurd wanneer vliegen gedurende 4 uur werden gevoerd (figuur 1B). We gebruikten dit geoptimaliseerde protocol van 4 uur voeding voor volgende experimenten.
Naast het effect van voeding werd het effect van de temperatuur waarbij vliegen werden grootgebracht op darmverzuring onderzocht. Vliegen werden gekweekt bij 23 °C en 30 °C, en vrouwelijke vliegen werden uitgehongerd gedurende ~ 20 uur. Vliegen kregen vervolgens vliegenvoer aangevuld met BPB gedurende 4 uur en het percentage darmverzuring werd bepaald zoals hierboven beschreven. We zagen geen verschil in darmverzuring voor deze twee temperaturen (figuur 1C), wat suggereert dat temperatuur, in tegenstelling tot voeding, geen invloed heeft op darmverzuring.
Demonstratie van het darmverzuringsprotocol voor niet-modelorganismen
Drosophilae soorten zijn gedurende miljoenen jaren fylogenetisch gescheiden (zie figuur 2A). Gedurende deze enorme periode hebben ze zich aangepast aan verschillende habitats en diëten12, waardoor de mogelijkheid bestaat dat sommige soorten hun darm niet op dezelfde manier verzuren als D. melanogaster. We gebruikten D. melanogaster (fruit), D. sechecllia (morindavrucht), D. erecta (pandanusvrucht), D. pseudoosubcura & D. virilis (plantensap ) en D. mojavensis (cactusvruchten) (figuur 2B). Om aan te tonen dat dit protocol voor andere Drosophila-soorten kon worden gebruikt, werden deze soorten gedurende 4 uur gevoed met vliegenvoeding aangevuld met BPB en werd het percentage darmverzuring bepaald zoals hierboven beschreven. Robuuste darmverzuring werd waargenomen voor alle geteste soorten (figuur 2B). Dit resultaat suggereert dat verzuring van de darm evolutionair geconserveerd is bij diverse Drosophila-soorten en dat dit protocol gemakkelijk kan worden geïmplementeerd voor andere organismen.
Figuur 1: Monitoring van de darmverzuring. (A) Schematische tekening van de voederarena. De blauwe stip staat voor vliegenvoer met broomfenolblauw (een pH-aanduidende kleurstof). Andere vlekken vertegenwoordigen fruitvliegen. (B) Grafische weergave van het percentage vliegen met darmverzuring gedurende verschillende perioden gedurende 4 uur. Representatieve darmbeelden van een verzuurde darm en een niet-verzuurde darm. De rode pijl geeft zure afgifte aan in het kopercelgebied van het midgut. n = 4 experimenten, 25-30 vrouwelijke vliegen per experiment. Schaalbalk = 500 μm elk. Sterretjes wijzen op significante verschillen met de controlegroep (eenrichtings-ANOVA, gevolgd door een Bonferroni-test) *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,0001. (C) Vliegen kregen vliegenvoer met BPB gedurende 4 uur bij 23 °C of 30 °C. Percentage (%) vliegen dat darmverzuring vertoont. n = 4 experimenten, 25-30 vrouwelijke vliegen per experiment (ongepaarde t-test gevolgd door niet-parametrische Mann-Whitney U-test en Wilcoxon rank-sum test. Afkorting: ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fylogenie van darmverzuringsfenomeen. (A) Fylogenetische relatie van Drosophila-soorten samen met hun voedingsgewoonte en habitat. 1 mm staaf geeft 1 miljoen jaar aan. (B) Percentage vliegen (Drosophila-soorten ) met darmverzuring, gevoed vliegvoer met BPB gedurende 4 uur n = 4 experimenten, 25-30 vrouwelijke vliegen per experiment (eenrichtingsverkeer ANOVA, gevolgd door een Bonferroni-test). Afkorting: ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciale stap in dit protocol is de juiste dissectie van de darm om de CCR voor het verzuringsfenotype te visualiseren. Het zuur dat vrijkomt uit de kopercellen is beperkt tot de CCR wanneer de darm intact is. Tijdens dissectie kan lekkage veroorzaakt door scheuring van de darm echter leiden tot diffusie van zuur uit de CCR en resulteren in een darm die ten onrechte als negatief wordt gescoord voor verzuring. Bovendien vervaagt de gele kleur die wijst op verzuring binnen 5-10 minuten na dissectie, wat het belang onderstreept van het scoren van darmen voor het verzuringsfenotype kort na isolatie. Ten slotte zijn de huidige protocollen7,8,9,10,11 die de toestand van verzuring in de vliegendarm testen, afhankelijk van suppletie van vliegenvoer met BPB, zonder rekening te houden met de voedingsstatus van de dieren. Tijdens onze studies ontdekten we echter dat verzuring van de darm niet constitutief was, maar eerder afhankelijk van voeding na eerdere uithongering. Als zodanig vereist een nauwkeurige evaluatie van de zuurtoestand van de darm met behulp van BPB als indicator van de pH van de darm rekening houden met de voedingsstatus van de vlieg, samen met eventuele andere variabelen die worden overwogen.
Verzuring van de darm wordt geconserveerd van lagere meercellige naar hogere organismen. Er is echter weinig bekend over de functie ervan bij de meeste dieren en de volledige omvang van de moleculaire en cellulaire routes die het reguleren. Bij mensen wordt gebrek aan darmverzuring geassocieerd met de malabsorptie van voedingsstoffen, terwijl overtollig zuur in de darm kan leiden tot darmzweren13. Inzichten uit onderzoek naar darmverzuring zullen dus waarschijnlijk nieuwe inzichten opleveren in de behandeling en genezing van darmziekten veroorzaakt door defecten in de regulatie van zuursecretie.
Drosophila is onlangs naar voren gekomen als een krachtig model voor de studie van darmverzuring2,5,6. Genetische studies hebben genen geïdentificeerd die nodig zijn voor de vestiging van zuurafscheidende cellen en de machines die betrokken zijn bij de productie van zuur. Er zijn ook geneesmiddelenstudies uitgevoerd. Verzuring van de darm wordt bijvoorbeeld voorkomen wanneer vliegen acetazolamide krijgen, een koolzuuranhydrase (CAH) -remmer7, in overeenstemming met de centrale rol die CAH speelt bij de productie van protonen die nodig zijn voor de zuurproductie. We verwachten dat dit protocol onderzoekers zal helpen om snel en kosteneffectief medicijnremmers of activatoren van darmzuurgraad te ontdekken. Bovendien zal de toepassing van deze methode in combinatie met genetische en biochemische benaderingen helpen bij het blootleggen van de cellulaire routes die betrokken zijn bij zuursecretie en de rol van darmverzuring in intestinale en organismale homeostase vaststellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dat ondersteuning voor werk in het laboratorium van de auteur wordt geboden door een HHMI Faculty Scholar Award en start-upfondsen van het Children's Research Institute aan het UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend,, et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, Pt 11 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell,, et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
