Summary
Взрослые мухи Drosophila melanogaster широко использовались в качестве модельных организмов для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе врожденных иммунных реакций хозяина противомикробных препаратов и стратегий микробной инфекции. Для продвижения стадии личинки D. melanogaster в качестве дополнительной или альтернативной модельной системы описана методика личиночного впрыска.
Abstract
Использование нетрадиционных моделей для изучения врожденного иммунитета и вирулентности патогенов обеспечивает ценную альтернативу моделям млекопитающих, которые могут быть дорогостоящими и поднимать этические вопросы. Нетрадиционные модели, как известно, дешевы, просты в обращении и культуре, и не занимают много места. Они генетически поддаются и обладают полными последовательностями генома, и их использование не представляет никаких этических соображений. Плодовая муха Drosophila melanogaster, например, дала отличное представление о различных исследованиях поведения, развития, метаболизма и иммунитета. Более конкретно, взрослые мухи и личинки D. melanogaster обладают несколькими врожденными защитными реакциями, которые разделяются с позвоночными животными. Механизмы, регулирующие иммунные реакции, были в основном выявлены с помощью генетических и молекулярных исследований в модели D. melanogaster . Здесь представлен новый метод инъекции личинок, который будет способствовать дальнейшим исследованиям врожденных иммунных процессов у личинок D. melanogaster и изучению патогенеза широкого спектра микробных инфекций.
Introduction
Drosophila melanogaster широко используется в биологических и биомедицинских исследованиях в течение нескольких десятилетий, поскольку сложный набор генетических и молекулярных инструментов неуклонно развивался для анализа широкого спектра исследований1,2,3,4. Эволюционно сохраненные аспекты развития, гомеостаза и врожденного иммунитета у D. melanogaster сделали его ценным модельным организмом для изучения различных заболеваний человека и насекомых5,6. Примечательно, что фундаментальная роль модели D. melanogaster для изучения иммунитета была в значительной степени проиллюстрирована в исследованиях взрослых мух. Тем не менее, исследования личинок D. melanogaster также внесли свой вклад в современные знания и в основном изучили клеточные иммунные реакции, особенно на инфекции ос и нематод, которые происходят через кутикулу насекомых7,8,9,10. Личинки Drosophila melanogaster обладают тремя различными типами клеток крови, которые в совокупности называются гемоцитами: плазматоциты, кристаллические клетки и ламелоциты11,12,13. Эти клетки могут устанавливать множество иммунных реакций, когда личинки D. melanogaster заражены патогенами, такими как бактерии, грибки, вирусы и паразиты14,15,16. Клеточные иммунные реакции включают прямое поглощение (фагоцитоз) малых молекул или бактерий, меланизацию, инкапсуляцию более крупных патогенов, таких как паразитоидные яйца, и производство активных форм кислорода (АФК) и синтаз оксида азота (NOS)17,18,19.
Напротив, было опубликовано меньше исследований по использованию модели личинок D. melanogaster для анализа гуморальных иммунных реакций. Это в основном связано с применением кормовых анализов на оральную инфекцию личинок D. melanogaster и несколькими проблемами, связанными с микроинъекцией личинок, включая точное обращение с личинками и правильное использование микроиглы, особенно во время проникновения20,21. Таким образом, ограниченные знания о личиночной инфекции и технические трудности (т.е. высокая смертность) часто затрудняли использование модели личинок D. melanogaster. Личиночная модель будет иметь потенциал для выявления новых молекулярных механизмов, которые обеспечат дальнейшее понимание взаимодействий хозяина и патогена и индукции специфических врожденных иммунных реакций хозяина против патогенных инфекций.
Здесь подробно описан простой и эффективный протокол, который можно использовать для введения личинкам D. melanogaster различных патогенов, таких как бактерии. В частности, личинки D. melanogaster используются для инъекций с человеческим возбудителем Photorhabdus asymbiotica и непатогенными бактериями Escherichia coli. Этот метод может быть использован для манипуляций и анализа иммунных реакций D. melanogaster на различные микробные инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выращивание мух
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизненный цикл D. melanogaster делится на четыре стадии: эмбрион, личинка, куколка и взрослая особь. Время генерации при оптимальных условиях выращивания в лаборатории (~25 °C, влажность 60% и достаточная пища) составляет примерно 10 дней от оплодотворенной яйцеклетки до эклозированной взрослой особи. Самки откладывают ~100 эмбрионов в день, а эмбриогенез длится около 24 ч22. Личинки проходят три стадии развития (instars; L1-L3) через ~4 дня (L1 и L2: 24 ч, и L3: 48 ч). Первые личинки начинают питаться сразу на поверхности среды. Личинки второй звезды зарываются в среду, в то время как личинки третьей звезды покидают среду и бродят по стенкам флаконов, ища место для окукливания в течение 24-48 ч. Линия D. melanogaster , используемая для этого протокола, - Oregon R (FBsn0000276).
- Добавьте сухой корм, содержащий диету на основе кукурузной муки и сои, в узкий флакон из полистирола (25 мм х 95 мм) до объема от 1/5 до 2/5. Затем добавьте 9 мл воды и дайте флакону постоять в течение 1 минуты, пока диета полностью не увлажнится.
- Добавьте во флакон около 10 гранул сухих пекарских дрожжей и поместите смесь не менее 20 недавно появившихся самцов и самок взрослых мух.
- Инкубируйте флакон при 25 °C при 12:12-часовом свете: темном фотопериодическом цикле.
- Чтобы обеспечить прогрессирование жизненного цикла, ежедневно проверяйте флаконы с мухами и записывайте начальные стадии развития.
2. Отбор личинок на инфекцию
- Отбирайте личинок тонкой кистью (лучше всего волосы верблюда), как только они достигнут блуждающей третьей стадии в день заражения (рисунок 1).
- Вымойте выбранных личинок раствором Рингера (100 мМ NaCl, 1,8 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 5 мМ HEPES pH 6,9) в небольшой чашке Петри (60 мм х 15 мм) после извлечения из их первоначального флакона23.
- Поместите личинки на фильтровальную бумагу (диаметр 150 мм), которая слегка смочена примерно 5 мл раствора Рингера, в чашку Петри (100 мм х 15 мм) (рисунок 2А).
- Добавляйте ~ 1 мл раствора Рингера ежедневно в фильтровальную бумагу по мере необходимости, чтобы избежать сухости и высыхания личинок.
3. Бактериальный препарат
- Культивирование бактерий P. asymbiotica на агаровой среде Luria Bertani (LB) при 28 °C в течение 48 ч.
- Используйте шкаф уровня биобезопасности 2 для переноса одной колонии P. asymbiotica для инокуляции жидкой культуры в 10 мл среды LB.
- Инкубируйте жидкую культуру P. asymbiotica в течение ночи при 28 °C во вращающемся шейкере, установленном на 220 оборотов в минуту.
- Культивируют бактерии E. coli аналогичным образом, но осуществляют начальный рост на агаровой среде и инкубацию жидких культур при 37 °C в течение ночи.
- Центрифугируйте каждую ночную бактериальную культуру в течение 3 мин при 13 000 х г и 4 °C.
- Выбросьте супернатант и трижды промыть полученные бактериальные гранулы 10 мл стерильного PBS.
- Снова центрифугируйте гранулы в течение 3 мин при 13 000 х г и 4 °C.
- Разбавляют каждую гранулу стерильным PBS для регулировки бактериальных концентраций до оптической плотности (600 нм) 0,25 для P. asymbiotica и 0,015 для E. coli, которые соответствуют 100-300 колониеобразующим единицам на личинку каждого бактериального препарата, используя спектрофотометр.
4. Подготовка инжектора
- Подготовьте капилляры, используя 3,5-дюймовые стеклянные капиллярные трубки и съемник микропипетки. Установите прибор следующим образом: нагрев: 580; тяга: 143; скорость: 25; задержка: 1; давление: 500.
- Используйте прямые зазубренные среднеточечные щипцы, чтобы открыть стеклянный капилляр до такой степени, которая позволит доставить экспериментальные обработки, нанося при этом минимальный ущерб личинкам (рисунок 2B). Чтобы оптимизировать эту процедуру во время практики инъекций, используйте раствор Trypan Blue (разбавьте запас на 0,4% с PBS до 0,2%), чтобы легко отслеживать утечку во время инъекции и выживание синих личинок.
- Наполните капилляр минеральным маслом с помощью пластикового, одноразового шприца 20 мл с подкожной иглой (22 г, длина 25 мм).
- Установите нанолитровый инжектор и вытолкните масло из капилляра (рисунок 2C).
- Наполните капилляр нужным бактериальным препаратом для инъекций. Принимают раствор из капли (~20 мкл), которая помещается на парапленку. В этом протоколе вводили 50,2 нл двух бактериальных запасов.
5. Инъекции личинок
- Обезболивайте личинок D. melanogaster с использованием углекислого газа в течение ~ 2 мин до процедуры.
- Аккуратно переложите обезболенные личинки на фильтровальную бумагу, смоченную в растворе Рингера при подготовке к инъекции под стереомикроскопом. Личинки будут вялыми или пассивными в этот момент.
- Чтобы ввести личинок, нанесите сильное давление на дорсальную сторону заднего конца (дыхальца трахеи видны на заднем конце по сравнению с черными частями рта на переднем конце) с помощью щипцов (рисунок 2D).
- Вставьте иглу горизонтально к заднему концу личинок, около кутикулы. Успешная инъекция не приведет к утечке введенного раствора из личинок (рисунок 3).
- Удалите щипцы, которые использовались для оказания давления на хвост личинок, прежде чем вынимать иглу. Если не удалить сначала, щипцы могут вытеснить гемолимфу и / или кишечник из личинок из места раны.
- Заразить соответствующее количество личинок для проводимого исследования. В этом конкретном протоколе было введено 20 личинок для каждого экспериментального состояния.
- Используя щипцы, аккуратно перенесите введенные личинки в отдельную влажную фильтровальную бумагу в чашку Петри (10 личинок на чашку) или флакон с пищей (в зависимости от цели эксперимента), чтобы обеспечить восстановление.
- Поместите чашки Петри или флаконы с пищей в инкубатор при температуре 25 °C. Если личинки содержатся в чашке Петри, добавьте раствор Рингера по мере необходимости, чтобы предотвратить высыхание.
6. Регистрация выживаемости/смертности
- Регистрируйте количество мертвых и живых личинок D. melanogaster в соответствии с установленными экспериментальными временными точками. Живые личинки будут продолжать развиваться в куколок и взрослых особей.
- Используйте статистические программы, такие как Prism, для ввода необработанных данных о выживаемости / смертности, анализа их с помощью теста log-rank (Mantel-Cox) и представления результатов в цифрах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При правильном выполнении инъекции личинок D. melanogaster показывают бактериально-специфический эффект. Данные о выживаемости были собраны в несколько временных точек после заражения P. asymbiotica (штамм ATCC43943), E. coli (штамм K12) и PBS (рисунок 4). В то время как личинки D. melanogaster восприимчивы к P. asymbiotica, что быстро ставит под угрозу выживание, личинки, введенные с контролем E. coli или PBS, демонстрируют длительную выживаемость24,25,26. В частности, по сравнению с личинками, инфицированными P. asymbiotica, которые демонстрируют 57% выживаемость через 24 ч после инъекции, личинки, введенные с кишечной палочкой, показывают 85% выживаемость в тот же момент времени.
Рисунок 1: Отбор личинок Drosophila melanogaster для инъекций. Жизненный цикл Drosophila melanogaster, от оплодотворения яйцеклеток до взрослой жизни, занимает примерно 10 дней. Во время роста личинок личинки питаются до тех пор, пока не будут готовы окукливаться и превращаться во взрослых особей. С целью инъекционных экспериментов отбираются личинки третьей звезды, которые покидают культуральную среду и блуждают по стенкам флакона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображение процедуры инъекции личинок Drosophila melanogaster . (A) Блуждающих личинок третьей звезды отбирают, промывают раствором Рингера и помещают на фильтровальную бумагу в чашку Петри при подготовке к инъекции. (B) С помощью щипцов стеклянный капилляр разбивается, чтобы обеспечить проведение экспериментальных обработок. (C) Программируемый нанолитровый инжектор устанавливается при подготовке к инъекции под стереомикроскопом. (D) Для инъекции личинок давление оказывается на спинную сторону хвоста личинок с помощью щипцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Иллюстрация доставки бактериальных клеток в личинки Drosophila melanogaster посредством микроинъекции. Спинная сторона заднего конца стабилизируется с помощью щипцов. Затем капилляр вставляют горизонтально к заднему концу личинок, около кутикулы. После инъекции щипцы удаляются, прежде чем осторожно вывести капилляр, чтобы предотвратить утечку гемолимфы из места раны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Выживание личинок Drosophila melanogaster после инъекции патогенных и непатогенных бактерий. Орегонским R личинкам D. melanogaster вводили 50,2 нл Photorhabdus asymbiotica (ATCC43943), Escherichia coli (K12) или PBS. В то время как контроль PBS и E. coli не показал никакого значения в соотношении выживаемости, инъекции P. asymbiotica быстро поставили под угрозу выживание мух. Каждая кривая выживаемости состоит из измерений трех независимых испытаний, каждое из которых включало 20 личинок (*** p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster является одной из наиболее ценных, экспериментально манипулируемых моделей, используемых для исследований врожденного иммунитета и патогенеза различных микробных инфекций. Это связано с его простым и быстрым жизненным циклом, простым обслуживанием в лаборатории, хорошо зарекомендовавшей себя эволюционной генетикой и разнообразным генетическим инструментарием. Предыдущие методы инъекций личинок D. melanogaster, такие как использование гибридного микрофлюидного устройства или микроманипулятора Narishige, требуют узкоспециализированного оборудования и могут быть дорогостоящими21,27. В текущем протоколе, чтобы расширить использование D. melanogaster, изложена простая инъекционная техника, которая представляет собой эффективный и быстрый метод доставки бактерий в гемокоэль личинок D. melanogaster. Существенной частью описанной здесь методики является фактическая инъекция нужного возбудителя или других жидких веществ с помощью микроинъектора. В дополнение к описанию этой важной операции, мы также описываем вспомогательные методы, такие как выращивание и культивирование бактерий и обработка материалов.
Основным преимуществом этого метода является то, что игла удерживается примерно параллельно личинке, а удержание осуществляется с очень небольшим давлением на личинку, тем самым уменьшая возможность утечки гемолимфы, смертельной травмы или неадекватной доставки желаемого вещества. Затем игла вводится к заднему концу личинки для завершения инъекции. Точный способ удержания личинки, способ введения иглы, скорость, с которой вводится желаемое вещество, и направление вывода иглы - все это вопросы, которые лучше всего могут быть улучшены практикой. Самым сложным шагом для преодоления является извлечение иглы из личинки без какой-либо утечки необходимых органов. Однако, с точностью и опытом, трудности, возникающие на этом этапе, становятся меньше.
Этот метод также является отличным инструментом в нескольких приложениях для введения различных веществ единообразным образом, который может повторяться несколько раз, что позволяет получать последовательные результаты. Быстрая смертность, наблюдаемая у личинок, инфицированных P. asymbiotica, отражает высокую вирулентность этого бактериального штамма для насекомых24,25,26. P. asymbiotica хорошо документирован для экспрессии генов вирулентности во время инфекции, которые увеличивают бактериальную выживаемость и патогенность против насекомых-хозяев путем ингибирования миграции гемоцитов и фагоцитоза24,25. Также ожидаемо, что личинки устойчивы к инъекциям с непатогенными бактериальными штаммами E. coli, а также к инъекциям PBS, что подтверждает предыдущие результаты в этой области исследований26. Следовательно, микроинъекция достигается без какого-либо неблагоприятного влияния на жизнеспособность животных, что позволяет использовать ее в молекулярных и иммунологических исследованиях для изучения патогенеза широкого спектра микробных инфекций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим сотрудников Департамента биологических наук Университета Джорджа Вашингтона (GWU) за критическое прочтение рукописи. GT была поддержана через летнюю стипендию Harlan от GWU. Все графические рисунки были сделаны с помощью BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
