CD1 villtype mus ble plassert i henhold til europeiske forskrifter, med en standard dag og natt syklus med mat og vann ad libitum. CD1-hunner ble parret med CD1-hanner over natten, og skjedeplugger ble sjekket om morgenen (E0.3). Bare gravide kvinner ble brukt til injeksjonen. Etisk godkjenning for alle forsøkene som er beskrevet her, ble gitt av Jordbruksverket. 1. Klargjøring av glassnåler: nåletrekking og sliping MERK: Selv om preground nåler kan kjøpes, trekke nåler in-house gjør det enkelt å justere nål lengde, bore, og skrå vinkel. Monter en glasskapillær i mikropipetten/kapillærtrekkeren. Bruk følgende innstillinger ved hjelp av det angitte utstyret (se materialtabellen): varme 580 enheter; hastighet 140 enheter; tid 200 enheter; trykk 500-800 enheter.MERK: Enhetene med forskjellige parametere er definert av kapillærtrekkeren. Enhetene kan variere for forskjellig utstyr. Trykk på Trekk for å trekke fra hverandre kapillæren og produsere to glasskapillærer med koniske ender.MERK: Etter trekking er spissene på de to glasskapillærene smeltet lukket på grunn av den høye temperaturen på mikropipettetrekkeren. Klipp spissen med kirurgisk saks for å få en nållengde på ~ 7 mm (målt hvor nålen begynner å avta) (figur 1A).MERK: For injeksjoner med E7.5 er en lang og fin nål kritisk, da injeksjonsområdet er svært lite og delikat. Korte og brede nåler vil resultere i embryonale dødsfall. Slip den kuttede nålespissen for å lage en skarp skråkant (figur 1C-F).Slip nålen i en vinkel på 20° ved maksimal hastighet i minst 30-45 min.MERK: Ultrarent vann tilsettes slipeplaten for å fungere som smøremiddel, redusere friksjon/temperatur og vaske bort glasspartikler (figur 1B). Imidlertid kan overflødig væske bremse kvernen. Forsikre deg om at nålespissen (figur 1C) berører slipeplateoverflaten (figur 1D), men ikke bøyes (figur 1E).MERK: Bøyd sliping resulterer i en lang og skjør nålespiss med feil skråvinkel, som lett kan gå i stykker under injeksjonen. Knusing av nåler kan skade embryoet og må erstattes med en intakt nål. En korrekt jordet spiss er vist i figur 1F,G. Etter sliping forventes den resulterende nåleboringen å ha en innvendig diameter (ID) på ~ 15 μm og en utvendig diameter (OD) på ~ 35 μm (figur 1G). Fyll en 1 ml sprøyte med mineralolje og fest en 27 G kanyle. Fjern kanylehetten og stikk sprøytekanylen inn i den nymalte glasskapillæren. Injiser mineralolje til olje drypper fra kapillærspissen. Fortsett å injisere mens du trekker opp 27 G nålen til kapillærnålen er fylt med mineralolje, hvoretter sprøytekanylen kan fjernes. Oppbevar jord- og mineraloljefylte nåler i et lukket miljø for å forhindre skade og støvakkumulering. For lagring, sett inn to ruller med modelleringsleire i en vanlig petriskål for å tjene som holdere (figur 1H). Legg nålene forsiktig på leiren og plasser dem langt fra hverandre for enkel henting av nålene.MERK: Siden forberedelse av kanylen er tidkrevende, er det best å tilberede kanyler minst én dag før injeksjoner. Kast nålene etter to kull maksimalt, da de blir stumpe. Klargjør alltid reservekanyler i tilfelle kanyleskader under tilberedning eller injeksjon. Figur 1: Klargjøring av kanyle til E7.5 fosterhuleinjeksjoner. (A) Representative eksempler på en trukket men uklippet kapillærnål i glass (venstre), en kapillærnål kuttet i optimal lengde for E7.5-injeksjoner (midten) og et kapillærsnitt for kort (høyre). (B) Kvernen med jevn dekning av vann, som er klar for nålesliping. (C-F) Representative eksempler på ulike nålespisser. (C) Kutt, men ujordet nålespiss montert i kvern; (D) ideell slipeposisjon med nålespissen som bare berører kvernen; (E) nål senket for langt og bøyes under slipeprosessen; (F) en ideell kanylespiss for AC-injeksjoner med E7.5. (G) En kanylespiss som viser boringen med en innvendig diameter på ~15 μm og en utvendig diameter på ~35 μm, som er egnet for E7.5 AC-injeksjon. Nåleboringen vises som stiplede linjer. Ytre diameter betegnet med røde pilspisser; indre diameter betegnet med blå pilspisser. (H) Oppbevaring av kanyle: Ildfast form fylt med trukket og malte nåler. To rader med modelleringsleire tjener som holdere. MERK: For det okulære mikrometeret i C, F, G er 1 cm delt inn i 100 plasser; målet er 3x; derfor ≈ 10 000 μm/(100 × 3) 33,4 μm. Forkortelser: AC = fosterhule; ID = intern diameter; OD = ytre diameter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 2. Dag før injeksjon: klargjør benk for ultralyd-verifisering av graviditet MERK: Alt arbeid skal utføres i en ventilert biosikkerhetsnivå 2 (BSL 2) benk ved arbeid med lentivirus. Ultralyd-verifisering av graviditet kan utføres på en ventilert benk. Slå på ultralydmaskinen, varmebordet og O 2-tilførselen til isofluranpumpen (kan variere fra utstyr til utstyr).MERK: Kontroller isofluransystemet for å sikre at isofluran ikke lekker ut i luften. Plasser en tom avfallspose (teipet til innsiden av veggen for enkel tilgang), hårfjerningskrem, sterile pakkede bomullspinner, vann, silkepapir og kirurgisk tape inne i BSL 2-benken. Forbered fire stykker kirurgisk tape (~ 7 cm lang) for å sikre muselemmene under ultralydkontrollen av graviditeten. 3. Ultralydkontroll for å bekrefte graviditet MERK: Dette trinnet kan utføres dagen før E7.5 injeksjoner, ved E6.5. Se diskusjonen for detaljer om sjekken for svangerskapsalder. Plasser den tidsparrede hunnmusen i induksjonskammeret. Slå på gasstrømmen med en oksygenstrøm på ~2,1 LPM og en startdose på 3-4 % isofluran for å indusere anestesi. Kontroller at kvinnen er fullstendig bedøvet ved å sjekke poterefleksen. Hvis poterefleksen er fraværende, senk isofluran til 1,5-2%.MERK: Det tar omtrent 3 minutter å indusere anestesi. Bytt gasstrømmen fra induksjonskammeret til nesekjeglen på varmebordet. Plasser den bedøvede kvinnen i en liggende stilling (magen opp) på varmebordet og plasser snuten i den vedlagte nesekeglen for å sikre vedlikehold av anestesi under ultralydkontrollen av svangerskapet. Fest alle fire potene til bordet med de forberedte delene av kirurgisk tape uten å strekke kvinnens kropp eller fange whiskers. Påfør en mengde hårfjerningskrem på størrelse med en ert på underlivet. Bruk en bomullspinne til å spre kremen over underlivet (en ~ 3 x 3 cm firkant) og masser den forsiktig inn ved å rulle bomullspinnen frem og tilbake. Når pelsen begynner å løsne fra huden, fukt et silkepapir og fjern krem og pels. Rengjør det de-furred området med fuktig silkepapir til all krem og hår er borte. Tørk huden. Påfør en plommestørrelse mengde ultralydgel til det barberte området og fortsett å identifisere livmoren ved hjelp av ultralyd ved hjelp av en av følgende tre tilnærminger.For å gjøre dette manuelt, hold ultralydssonden i ultralydgelen og flytt sonden for å finne livmoren. For semimanuell tilnærming #1, plasser ultralydssonden (festet til rekkverksystemet) over den kvinnelige buken ved å løsne og flytte en del av skinnen langs x-planet. Senk ultralydproben ned i gelen (z-plan) og skann gjennom underlivet (y-plan) (figur 2A). For semimanuell tilnærming # 2, senk ultralydssonden (festet til rekkverksystemet) inn i gelen for å avbilde underlivet. Hold ultralydproben stasjonær under prosessen, og flytt varmebordet med de vedlagte hjulene langs x- og/eller y-plan (figur 2B).MERK: I disse tidlige embryonale stadiene kan indre organer, for eksempel tarmen, se ut som livmoren i ultralydavbildning. Men mens embryoer og decidua vises som en sekvens av kuler (beslektet med perler langs et halskjede), har tarmen utseendet til et kontinuerlig rør. Tilkoblingen av luminale rom (separate kuler vs. et kontinuerlig rør) kan vurderes ved å skanne frem og tilbake gjennom strukturen av interesse for å avgjøre om strukturen er en diskret sfære (embryo / decidua) (figur 2C) eller et kontinuerlig rør (tarm) (figur 2D). På dette stadiet er det ikke nødvendig å registrere antall embryoer; det er tilstrekkelig å bekrefte deres tilstedeværelse eller fravær. Når graviditetsstatusen er bestemt, løft ultralydssonden bort fra magen og tørk underlivet rent med fuktig silkepapir for å fjerne ultralydgelen. Slå av isofluranpumpen og fjern den kirurgiske tapen for å frigjøre potene. Plasser hunnen i mageleie (magen ned) i et rent bur på en varmeplate på 40 °C. Hold kvinnen under nøye observasjon til hun gjenvinner bevisstheten, noe som tar 2-6 minutter.MERK: Sørg for at ultralydkontrollen for en kvinne er <10 minutter for å minimere eksponering for isofluran. Fjern alt materiale og avfall og rengjør alle overflater med 70% etanol. Tørk av eventuell gjenværende ultralydgel fra ultralydssonden med et tørt, mykt og lofritt papirvev. Slå av ultralydmaskinen, ventilert benk / BSL2-benk, varmebord og O2-forsyning . 4. Ultralydkontroll for embryo-iscenesettelse MERK: Dette trinnet utføres før operasjonen og tjener til å stratifisere de gravide kvinnene i henhold til deres AC-størrelser. Dette trinnet er avgjørende på E7.5 når målet er å målrette utviklingen av CNS. På dette tidlige utviklingsstadiet påvirker en forskjell på noen få timer i utviklingen betydelig størrelsen på AC og utviklingen av neurulasjon. Bedøv den første gravide kvinnelige musen ved å følge trinnene i trinn 3.1-3.5. Plasser og fest kvinnen på bordet som beskrevet i trinn 3.6. Påfør en plommestørrelse mengde ultralydgel til den barberte magen og senk ultralydssonden for å avbilde kvinnens underliv.MERK: Dette trinnet forutsetter at kvinnen ble inspisert av ultralyd dagen før for graviditet og allerede har fjernet pels på magen. Hvis dette ikke er tilfelle, må pelsen fjernes før tilsetning av ultralydgel etter trinn 3.7-3.8. Ved E7.5 er livmor og deciduas større og lettere å skille fra indre organer. I tillegg er vekselstrømmen større og kan skilles fra det eksocelomiske hulrommet (ExC). Skann gjennom venstre og høyre livmorhorn så fullstendig som mulig.MERK: Noen embryoer ligger dypere inne i kvinnens kropp og kan gå glipp av. Registrer antall og stadier av embryoene. Noter antall amniotiske hulrom i ideell størrelse, akseptable hulrom og deciduas uten hulrom (figur 2E-G). Stage alle svangerskapene og rangere dem deretter. Injiser kvinner med et flertall av ideell størrelse AC umiddelbart etter ultralydskontrollen (trinn 4.4) etter instruksjonene i trinn 4.5-4.7. For kvinner med et flertall av akseptable (hvor de eksocelomiske og amniotiske hulrommene ennå ikke er tydelig delt inn i to hulrom) eller fraværende hulrom, utsett injeksjonen og iscenesett dem igjen etter et par timer. Hvis de fleste hulrommene fortsatt er for små, utsett injeksjonene med 10-12 timer. Figur 2: Inspeksjon og iscenesettelse av fosterhulrom ved ultralydkontroll. (A) Oversikt over skinnesystemet med vedlagt ultralydsonde, nanoinjektor og varmebord. Ultralydproben kan flyttes i x-, y- og z-plan for å oppnå optimal justering med den kvinnelige magen eller AC-ene. (B) Varmebord kan flyttes via to hjul i x- og / eller y-plan for å muliggjøre presis skanning og vurdering av AC-ene, mens ultralydssonden kan forbli statisk. (C) Representative ultralydbilder av E6.5 deciduas inne i den kvinnelige magen under ultralydkontroll for å bekrefte graviditet (hvite stiplede konturer). Ingen hulrom har dannet seg på dette punktet; Noen ganger er imidlertid den ektoplacentale kjeglen (hvite stjerner) synlig. Deciduas kan gjenkjennes av deres sfæriske form og skille seg fra tarmen, som fremstår som ett kontinuerlig rør. (D) Representativ bildesekvens av tynntarmen (hvite stiplede konturer), som er kontinuerlig i skanning gjennom underlivet. (E-G) Representative ultralydbilder under hulrom iscenesettelse før E7.5 injeksjoner. De fosterformede og eksocelomiske hulrommene har dannet seg og er adskilt av amnion. Den ektoplacentale kjeglen fungerer som hovedblodtilførsel og fremstår som et lyspunkt i ultralydet. AC er mest distal fra ektoplacental kjegle. (E) Ideelle AC-er virker større enn det eksocelomiske hulrommet, mens mellomstore hulrom virker mindre (F). Hvis ingen hulrom er synlige (G), betyr dette enten at embryoet er resorbert eller ikke har nådd E7.5 ennå. Skala barer = 1 mm. Forkortelser: A = Amnion; AC = fosterhulrom; ExC = Eksocelomisk hulrom; EC = Ektoplacental kjegle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 5. Injeksjonsdag: klargjør BSL2-benken for kirurgi Lim ett stykke elastisk membran til den runde, sentrale åpningen av en kommersielt tilgjengelig, modifisert petriskål. Sørg for at membranen er godt festet til petriskålen for å forhindre lekkasje.MERK: Hvis parabolen blir lekk eller ikke er godt limt, kan kantene på den elastiske membranen festes ytterligere med tape. Lag et 1-1,5 cm langt snitt i midten av den elastiske membranen. Slå på ultralydmaskinen, BSL2-benken, varmeplaten,O2-tilførselen til isofluranpumpen og glassperlesterilisatoren (satt til 300 °C). Inne i BSL2-benken, plasser en tom avfallspose (teipet til innsiden av veggen for enkel tilgang); sterile pakkede bomullspinner (bruk en ny for hver operasjon / hver kvinne); kirurgiske verktøy (saks, pinsett, klipp, sutur) og kirurgisk tape; en full flaske romtemperert fosfatbufret saltvann (PBS), en tom flaske for avfallsinnsamling og en 25 ml pipette; en petriskål med elastisk membran for kirurgi; lokket på petriskålen med et 2 x 2-3 x 3 cm stykke parafilm festet til lokket med en dråpe vann; modellering leire: 4 større baller eller terninger (~ 3 x 3 x 3 cm3) og ett sylindrisk stykke (~ 4 x 1 cm); en sprøyte med smertestillende (f.eks. buprenorfin, 0,05-0,1 mg/kg kroppsvekt) og øyegelMERK: Ballene (eller kubene) av modelleringsleire vil fungere som “føtter” eller stativ/holdere for petriskålen når parabolen er plassert på toppen av hunnens underliv. Det sylindriske stykke leire sikrer embryoene inne i parabolen. Dersom mer enn én oppløsning injiseres, eller kanylen må etterfylles under injeksjoner, kan samme parafilm brukes hvis oppløsningen kan holdes atskilt. 6. Kanylebelastning Tørk av overflødig mineralolje med silkepapir for bedre grep.MERK: Rengjør alltid vekk fra tuppen for å unngå skade eller personskade. Forsikre deg om at alle komponenter (en forseglende O-ring, en avstandsstykke og en frontpakning – alt plassert under hylsen, figur 3A) er installert i riktig retning (figur 3B, hylse fjernet for visualisering) for å holde kapillærnålen på plass og skape en lufttett forbindelse, unngå bobledannelse når du går frem eller trekker inn metallstemplet inne i nålen. Forsikre deg om at metallstempelet på nanoinjektoren er trukket helt inn. Kontroller ved å trykke på Fyll og vent på et dobbelt pip som indikerer at stempelet er trukket helt inn. Med hylsen festet, men litt løsnet (skrudd ut 45-90 grader), skyv glassnålen på metallstemplet og skyv kapillærnålen sammen med metallstemplet gjennom den fremre pakningen til den når avstandsstykket (figur 3C, D, hylse fjernet for visualisering).MERK: Noe motstand vises når stempelet passerer gjennom pakningen og avtar når det når avstandsstykket. Forsikre deg om at kapillærnålen er satt godt inn i avstandsstykket for å skape en lufttett forbindelse (figur 3D). Fest nålen ved å stramme hylsen til nanoinjektoren (skru godt på).MERK: Ikke stram for mye, da dette kan knuse kanylen. Trykk på Tøm for å presse stempelet inn i kanylen og fjern oljen fra nålespissen. Hvis kanylen beveger seg, må du trekke inn stempelet, fjerne nålen og fylle på nytt. Hvis dette fører til at det dannes luftbobler, fjern nålen og fyll på med mineralolje.MERK: En godt festet nål skal ikke bevege seg med stempelet. Plasser en dråpe av viruset (~ 6 μL) eller annen injeksjonsoppløsning på et stykke parafilm1 (figur 3E; Evans blå fargestoff brukes til visualiseringsformål).MERK: Maksimalt volum av nanoinjektoren er ~ 5 μL. Trykk på Fyll for å opprette en luftboble som skal fungere som et skille mellom oljen og løsningen (figur 3F).MERK: Dette fungerer også som en plasseringsmarkør når du fyller eller tømmer nålen. Senk kanylen, senk spissen ned i oppløsningen og trykk på Fyll (figur 3F,G). Se væskenivået når løsningen lastes etter luftboblen. Trykk Tøm for å fjerne tilstoppingen og last den på nytt ved å trykke på Fyll hvis luftboblen blir langstrakt uten at væsken kommer inn i kanylen. Hvis dette ikke løser problemet, bytt kanyle. Når nålen er fullastet (figur 3H), løft nålen i z-planet og aspirer et lite volum luft på spissen for å forhindre fordampning av oppløsningen ved nålespissen og tilstopping av nålen. Vri nanoinjektoren med den påmonterte nålen bort fra operatøren, mot baksiden av benken, for å forhindre utilsiktet skade eller personskade. Figur 3: Feste nålen til nanoinjektoren og masseutløse. (A) Startposisjon før nålen monteres på nanoinjektoren: metallstempelet trekkes helt inn og hylser festes. (B) Under hylsen vises alle tre komponentene for å holde og feste nålen i riktig rekkefølge (fra venstre til høyre): forsegling av O-ring (tynn og svart), avstandsstykke (hvit), O-ring (svart) med stort hull (som nålen må passere gjennom). For å sikre en lufttett tilkobling, skyves glassnålen over metallstemplet (C) og skyves gjennom åpningen av den fremre O-ringen til den når avstandsstykket (D). (E-H) Påføring av oppløsningen i kanylen. (E) En dråpe oppløsning er plassert på et stykke parafilm på et platelokk. (F) Lag en luftboble ved å trykke på Fyll før du legger i oppløsningen og senk kanylespissen ned i oppløsningen. (G) Oppløsningen lastes inn i kanylen. (H) Oppløsningen er lagt inn i kanylen. MERK: Hylsen er fjernet i (B-D) for visualisering, men skal forbli festet under eksperimenter. Det siste trinnet for å feste nålen er å stramme hylsen. Evans blå fargestoff brukes til visualisering i E-H. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 7. Injeksjoner MERK: Alle instrumenter som brukes i denne prosedyren steriliseres før kirurgi og mellom hver mus. Bedøv den første hunnen med hulrom i ideell størrelse (se avsnitt 4). Plasser og fikser kvinnen på bordet, som beskrevet i trinn 3.1-3.6. Påfør øyegel på øynene for å forhindre uttørking av hornhinnen og injiser smertestillende subkutant.MERK: Anbefalte analgetika: Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg kroppsvekt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller lignende i henhold til lokale dyrevelferdsforskrifter. Multimodal perioperativ analgesi opprettholdes med injiserte analgetika og isofluran. Forbered underlivet aseptisk ved å tørke av med en klut gjennomvåt med 0,5 mg / ml klorhexidinoppløsning (eller lignende) og tørk huden. Bruk kirurgisk saks for å lage et 1,5-2,0 cm vertikalt midtlinje hudinnsnitt i underlivet.MERK: Forbered operasjonsområdet etter lokalt godkjente desinfiseringsrutiner. Løft huden forsiktig og frigjør huden fra det underliggende muskellaget, ca. 1 cm rundt snittpunktet, for å lette suturering etter operasjonen. Lag et 1 cm vertikalt midtlinjesnitt i muskellaget. Med et par tang, løft den ene siden av huden og muskellaget, og med det andre paret, se etter livmorhornene.MERK: Ciduaene er ordnet som perler på et halskjede, mens tarmen er ett langt, kontinuerlig rør (figur 4A). Med tang, trekk forsiktig ut begge livmorhornene fra magen. Hold vevet mellom embryoer; Ikke klem dem direkte (figur 4B).MERK: Livmoren er festet til kroppen i livmorhalsen, og de to eggstokkene/oviduktene festes via leddbånd. Ikke trekk/løsne livmoren fra disse ankerpunktene. Tell og noter antall embryoer på venstre og høyre side. Nummer embryoene enten fra eggstokken til livmorhalsen eller fra livmorhalsen til eggstokken.MERK: Dette er spesielt viktig hvis injiserte embryoer skal samles inn på embryostadiet. Med en fuktig bomullspinne skyver du forsiktig alle embryoene tilbake i bukhulen, bortsett fra de tre første som skal injiseres. Plasser en dråpe PBS på elastikken i petriskålen og hold den rett over embryoene. Sett lukket tang inn i snittet av elastikken og slipp tangen for å åpne det elastiske snittet slik at væsken faller på embryoene.MERK: Dette sikrer rehydrering av embryoene og at den elastiske membranen fester seg til kvinnens våte hud, og forhindrer lekkasje av PBS i de neste trinnene. Trekk en del av livmoren, som tilsvarer tre embryoer, gjennom elastikken med tang, og legg forsiktig petriskålen på kvinnens underliv. Med tangen og en fuktig bomullspinne, juster livmorens posisjonering og elastikk for å sikre at elastikken er forseglet til kvinnens hud for å forhindre PBS-lekkasje. Bruk de fire leireføttene til å sikre og feste petriskålen rett over magen, noe som reduserer trykket på hunnen og følsomheten for avbildning for kvinnens pust og hjerteslag. Trykk leirsylinderen ned til høyre for embryoene/livmoren for å fikse livmoren (figur 4C).MERK: Denne orienteringsinstruksjonen forutsetter at nålen er til venstre for hunnen og at embryoene til kvinnens venstre livmorhorn blir utsatt. Siden av livmoren (venstre eller høyre livmorhorn) er avgjørende da AC enten vender mot nålen (venstre horn; Figur 4D) eller vender mot den stabiliserende leiresylinderen (høyre horn; Figur 4E). For å injisere embryoer fra høyre livmorhorn, plasser leiresylinderen på venstre side av embryoene (figur 4F) og vri varmebordet 180 ° (figur 4G) for å oppnå riktig orientering. Hvis nålen kan flyttes i stedet, må du tilpasse den etter behov for det aktuelle oppsettet. Legg PBS til petriskålen til embryoene og livmoren er dekket med PBS. Senk ultralydproben inn i PBS og juster musen / operasjonsbordet slik at det første embryoet er justert med ultralydssonden for å lette opptaket av injeksjonene.MERK: “Først” refererer til nummerering av embryoer fra eggstokken til livmorhalsen. Skann gjennom alle tre embryoene og inspiser AC-ene. Bestem injeksjonsvolumet som følger:Mål diameteren på vekselstrømmen med ultralydsmaskinen. Injiser 69 nL hvis AC-diameteren er ≤0,2 mm; injiser 2 x 69 nL (= 138 nL) hvis AC-diameteren er >0,2 mm og ≤0,29 mm; og injiser 3 x 69 nL (= 207 nL) hvis AC-diameteren > 0,29 mm (figur 4H).MERK: Tidligere forsøk har vist at opptil 207 nL injeksjonsvolumer tolereres godt ved E7.515. Vellykkede injeksjoner med minimal innvirkning på overlevelse oppnås når den relative volumøkningen av vekselstrømmen ikke overstiger 90 . Variasjon i vekselstrømstørrelse mellom kullkamerater eller musestammer er vanlig og kan kreve ytterligere optimalisering. Still inn injeksjonsvolumene med injeksjonskontrolleren. Still injeksjonshastigheten til å synke med en injeksjonshastighet på 23 nL/s.MERK: Ulike utstyrsmodeller kan resultere i forskjellige injeksjonskrefter. Senk nålen inn i PBS ved hjelp av hovedhjulene på skinnesystemet (x- og z-plan, figur 4I) og trykk Tøm på nanoinjektorkontrolleren til væsken når nålespissen.MERK: Hvis kanylen har tilstoppet, kan du trykke på Tom for å løse opp treskoen og/eller fjerne tilstoppingen. Løft nålen ut av PBS og trykk på Inject. Kontroller at en dråpe av omtrentlig ønsket volum er utladet. Senk nålen inn i PBS og juster den med ultralydssonden og embryoet ved å bevege nanoinjektoren med y-planhjulet på mikromanipulatoren (figur 4J).MERK: Nålespissen er perfekt justert når den vises som et lyspunkt på ultralydbildet (figur 4K, L). Nålen kan beveges i alle tre retningsplan med mikromanipulatoren. Juster nålvinkelen med injeksjonsvinkelhjulet for å sikre en nær vinkelrett injeksjonsvinkel i forhold til livmorveggen. Stikk nålen inn i vekselstrømmen i én bevegelse ved å bruke injeksjonshjulet på mikromanipulatoren (figur 4J-M). Hold øye med lysstyrken på nålespissen. Hvis nålespissen forsvinner fra ultralydbildet, flytter du ultralydproben fremover eller bakover for å bringe nålen tilbake i fokus.MERK: Når nålen er inne i vekselstrømmen, kan mindre endringer i nålens posisjon og fokus gjøres uten å skade embryoet (justeringer innen ~0,3 mm). Ikke juster kanylens posisjon mer enn dette. Trykk på Inject (for 207 nL, sett volumet på 69 nL og injiser tre ganger). Etter injeksjon, vent til ytterligere 5-10 s før du trekker nålen inn i en forsiktig bevegelse. Figur 4: Optimal størrelse og orientering av fosterhulen for vellykkede injeksjoner . (A) Livmorhorn med flere E7.5 deciduaer, formet som en streng av kuler (nederst) sammenlignet med tykktarmen (øverst). (B) Ta tak i livmorvev (hvite stiplede linjer) mellom deciduaer. Unngå å klemme deciduaene (hvite pilspisser) direkte med tang, da deciduas og utviklende embryoer er skjøre på dette tidlige stadiet og utsatt for resorpsjon ved overdreven ekstern kraft. (C) Kvinne i liggende stilling med deciduas eksponert i en petriskål fylt med PBS og montert på fire fot modelleringsleire. Beslutningene stabiliseres av et ekstra stykke modelleringsleire, formet som en sylinder. (D, E) Orientering av AC påvirkes av siden av livmorhornet som er utsatt. Hvis det brukes deciduas fra venstre livmorhorn, vil AC vende bort fra leirestabilisatoren og vil være lett tilgjengelig for nålen til venstre (D). Men hvis det høyre livmorhornet brukes, vil ektoplacentaglen i stedet vende mot nålen, noe som gjør det vanskeligere å få tilgang til AC (E). Derfor, når du injiserer i høyre livmorhorn, plasseres leirestabilisatoren mot den nålvendte siden (F), og hele varmebordet roteres 180 ° (G). (H) Anbefalte injeksjonsvolumer i henhold til vekselstrømstørrelser. Generelt kan hulrom med diameter ≤ 0,2 mm injiseres med maksimalt 69 nL. Diametere > 0,2 mm og ≤ 0,29 mm tåler volumer opp til 2 x 69 nL (138 nL) og hulrom > 0,29 mm kan injiseres med 3 x 69 nL (207 nL). Skalastenger = 1 mm. (I, J) Nanoinjektor er festet til skinnesystemet og kan flyttes i x- og / eller z-plan. Vinkelen på nålen kan justeres med injeksjonsvinkelhjulet . (K, L) Nålespissen (hvit pilspiss) er justert med vekselstrømmen når den vises sterkest i ultralydet (L). (M) Ultralydbilde som viser injeksjonsprosessen, der nålespissen er i vekselstrømmen og godt justert (hvit pilspiss). Forkortelser: A = Amnion; AC = fosterhulrom; ExC = Eksocelomisk hulrom; EC = Ektoplacental kjegle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Flytt scenen til neste embryo og gjenta trinn 7.22-7.26 for de to andre embryoene hvis de har passende AC-størrelser. Løft ultralydssonden og nålen ut av PBS ved hjelp av mikromanipulatoren. Vri nålen bort fra operatøren for å unngå skade og personskade. Med tang, rett 1st og 2nd embryoene tilbake i kvinnens underliv ved å skyve dem forsiktig gjennom elastikken. Ta forsiktig tak i vevet ved siden av det 3. embryoet og trekk livmoren mot den øvre enden av det elastiske snittet. Trekk forsiktig opp de 4.-6. embryoene med tang og la det 3. embryoet komme inn i magen igjen.MERK: Dette trinnet kan gjøres uten å endre PBS eller fjerning av petriskålen. Gjenta etter behov til alle embryoer med optimal AC er injisert eller tidsgrensen er nådd. Skyv embryoene/livmoren forsiktig tilbake i kvinnens underliv. Aspirer PBS og fjern petriskålen. Hvis et virus har blitt brukt, håndteres som smittsomt avfall. Sy sammen det muskulære laget med Vicryl (USP 6-0, nållengde 13 mm, 3/8 sirkel) i enkle kontinuerlige eller avbrutte suturer og lukk huden med 1-2 klips (se materialtabellen). Slå av isofluranpumpen. Fjern operasjonstapen og plasser hunnen i mageleie (magen ned) i et rent bur på en 40 °C varmeplate.MERK: Hunnen forventes å gjenvinne bevisstheten og være mobil innen 10 minutter. Sørg for at prosedyren er fullført innen 30 minutter. Den genetiske bakgrunnen, alderen og vekten til kvinnen kan påvirke følsomheten for anestesi. Overvåk musene under operasjonen for tegn på langsom pust (langsom pust betyr at anestesi er for dyp) eller bevegelse (anestesi er for lett). Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg kroppsvekt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller lignende i henhold til lokale dyrevelferdsforskrifter, kan gis 8 timer etter første injeksjon om nødvendig. Hvis en annen kvinne skal injiseres, må du forberede det kirurgiske området mens du overvåker oppvåkningen av den første.Tørk de kirurgiske verktøyene med 70% etanol for å fjerne gjenværende blod eller vev og steriliser dem i den forvarmede glassperlesterilisatoren i 10 s. Kast bomullspinnene og brukt silkepapir. Tørk petriskålen og leirebitene tørre med silkepapir. Gjenta trinn 7.1-7.35 til alle hunnene er injisert. Tøm kanylen og kast den.Hvis det er virus eller injeksjonsoppløsning igjen i nålen, trykk Tøm på nanoinjektoren og tøm nålens innhold på silkepapir. Trekk metallstempelet helt inn ved å trykke på Fyll til det kommer et dobbeltpip fra kontrolleren, noe som indikerer at stempelet er helt trukket inn. Løsne hylsen og skyv nålen av metallstempelet. Kast kanylen i avfallsbeholderen for skarpe gjenstander. Rengjør BSL-2-benken.Hvis et virus ble brukt, spray hele det kirurgiske feltet med desinfeksjonsmiddel (se materialtabellen). Etter 15 min, tørk av desinfeksjonsmiddelet og rengjør hele operasjonsfeltet med 70% etanol. Hvis det ikke ble brukt virus, rengjør du alle overflater med 70% etanol. Tørk av eventuelle gjenværende PBS fra ultralydssonden med tørt, mykt og lofritt silkepapir. Kast avfall i henhold til retningslinjer for biosikkerhet. Slå av ultralydmaskinen, varmebordet, BSL2-benken og O 2-forsyningen.