Summary
Neste protocolo, descrevemos como injetar a cavidade amniótica do camundongo no E7.5 com lentivírus, levando à transdução uniforme de toda a placa neural, com efeitos mínimos prejudiciais sobre a sobrevivência ou desenvolvimento embrionário.
Abstract
Manipular a expressão genética no cérebro do camundongo em desenvolvimento no útero tem grande potencial para estudos genéticos funcionais. No entanto, anteriormente, ela tem sido restrita em grande parte à manipulação de estágios embrionários pós-neurulação. Um protocolo foi desenvolvido para injetar a cavidade amniótica no dia embrionário (E)7.5 e fornecer lentivírus, codificação cDNA ou shRNA, visando >95% das células de placa neural e crista neural, contribuindo para o futuro cérebro, medula espinhal e sistema nervoso periférico. Este protocolo descreve as etapas necessárias para alcançar a transdução bem sucedida, incluindo a moagem das agulhas capilares de vidro, verificação da gravidez, estadiamento do desenvolvimento usando imagens de ultrassom e volumes de injeção ideais combinados com estágios embrionários.
Seguindo este protocolo, é possível alcançar a transdução de >95% do cérebro em desenvolvimento com lentivírus de alta titer e, assim, realizar manipulação genética de cérebro inteiro. Em contraste, é possível alcançar a transdução de mosaico usando títulos virais mais baixos, permitindo o rastreamento genético ou rastreamento de linhagem. A injeção no E7.5 também tem como alvo o ectoderme e a crista neural contribuindo para compartimentos distintos do olho, língua e sistema nervoso periférico. Esta técnica oferece, assim, a possibilidade de manipular a expressão genética em tecidos derivados de placa neural e ectoderme de camundongos a partir de estágios de pré-loção, com o benefício de reduzir o número de camundongos usados em experimentos.
Introduction
O cérebro e a medula espinhal estão entre os primeiros órgãos a iniciar a formação durante a embriogênese 1,2. Embora os genes associados a distúrbios neurodesenvolvimentos estejam sendo identificados, o interrogatório funcional de variantes genéticas ficou para trás 3,4. Como a geração de camundongos knockout condicional pode levar meses ou anos, uma técnica alternativa para investigar rapidamente a função genética no cérebro em desenvolvimento é de interesse. Em embriões de camundongos, a neurulação - o processo morfogenético pelo qual a placa neural se transforma no tubo neural para dar origem ao sistema nervoso central (SNC) - ocorre entre os dias 8 e 10 pós-concepção5. Antes do início da neurulação, a placa neural, como parte do ectoderme, consiste em uma única camada de células colunares que se proliferarão e se diferenciarão nos numerosos tipos de células neuronais e gliais dentro do CNS 6,7. Portanto, induzir experimentalmente alterações duradouras à expressão genética no SNC, direcionar a placa neural oferece vantagens óbvias, incluindo a acessibilidade de todas as células progenitoras.
Na neurociência, na eletroporação ovo 8,9 e transdução viral de embriões de camundongos têm sido usados para manipular a expressão genética cns embrionária. O embrião de pintinho em desenvolvimento tem sido um modelo de escolha para estudar a função genética durante o desenvolvimento da medula espinhal devido à acessibilidade do embrião pintinho no ovo e à facilidade resultante de manipular a expressão genética. Em particular, em ovo plasmid a eletroporação gera condições experimentais e de controle em cada medula espinhal do pintinho. A eletroporação causa permeabilização da membrana celular e direciona o DNA carregado negativamente para longe do cátodo (negativo) em direção ao ânodo (positivo) aplicando um pulso elétrico através de dois eletrodos no embrião. Em camundongos, a eletroporação uterônica tem sido geralmente limitada a estágios embrionários nos quais a neurulação foi concluída, e o cérebro ou medula espinhal já consiste em várias camadas celulares, resultando em baixa eficiência de eletroporação10. A eletroporação plasmida resulta em expressão genética transitória e geralmente tem como alvo poucas células.
O ultrassom orientado na microinjeção uteronômada tem sido usado para manipular diferentes estruturas embrionárias, como a pele e o cérebro 11,12,13,14. No entanto, as injeções direcionadas ao cns murino em desenvolvimento mostraram baixa eficácia ou impactaram negativamente a sobrevida embrionária 12,13,14. Assim, foi desenvolvido um protocolo aprimorado para a entrega de lentivírus de alta titer na cavidade amniótica (AC) em E7.5, que foi apelidado de NEPTUNE para neural p targeting com em uteronano-injection15. As injeções resultaram em uma eficácia de alvo duradoura de >95% de todo o cérebro em E13,5. Além disso, uma etapa de encenação foi introduzida durante a verificação do ultrassom da gravidez para classificar fêmeas e gestações por estágio de desenvolvimento para minimizar procedimentos desnecessários em animais de pesquisa e maximizar o sucesso da injeção. A eficiência da injeção e a sobrevivência estão fortemente ligadas ao aumento do tamanho do CA. Portanto, este artigo descreve como medir o tamanho do CA antes da injeção para fornecer um volume adequado ao AC que não causará resorção do embrião. O NETUNO é uma alternativa robusta à corrente em abordagens uteronômidas e pode ser adaptado para vários usos, incluindo, mas não se limitando a, ganho e perda de estudos de função, rastreamento de linhagem ou triagem15,16.
Protocol
Os ratos do tipo selvagem CD1 foram alojados de acordo com as regulamentações europeias, com um ciclo padrão diurno e noturno com comida e ad libitum de água. As fêmeas cd1 foram acasaladas com homens CD1 durante a noite, e os plugues vaginais foram verificados pela manhã (E0.3). Apenas fêmeas grávidas foram usadas para a injeção. A aprovação ética para todos os experimentos aqui descritos foi concedida pelo Conselho Sueco de Agricultura (Jordbruksverket).
1. Preparação de agulhas de vidro: agulhas puxando e moendo
NOTA: Embora as agulhas de pré-solo possam ser compradas, puxar agulhas internamente permite ajustes fáceis de comprimento da agulha, furo e ângulo de bisel.
- Monte um capilar de vidro no puxador micropipette/capilar. Utilize as seguintes configurações utilizando o equipamento especificado (ver a Tabela de Materiais): calor de 580 unidades; velocidade de 140 unidades; tempo de 200 unidades; pressão 500-800 unidades.
NOTA: As unidades de diferentes parâmetros são definidas pelo puxador capilar. As unidades podem variar para diferentes equipamentos. - Pressione Puxe para separar o capilar produzindo dois capilares de vidro com extremidades afiladas.
NOTA: Após puxar, as pontas dos dois capilares de vidro são fundidas devido à alta temperatura do puxador de micropipette. - Corte a ponta com uma tesoura cirúrgica para obter um comprimento de agulha de ~7 mm (medido a partir de onde a agulha começa a afunilar) (Figura 1A).
NOTA: Para as injeções E7.5, uma agulha longa e fina é crítica, pois a região da injeção é muito pequena e delicada. Agulhas curtas e largas resultarão em mortes embrionárias. - Triture a ponta da agulha cortada para criar um bisel afiado (Figura 1C-F).
- Triture a agulha em um ângulo de 20° em velocidade máxima por pelo menos 30-45 min.
NOTA: A água ultrauso é adicionada à placa de moagem para atuar como lubrificante, reduzir o atrito/temperatura e lavar partículas de vidro (Figura 1B). No entanto, o excesso de líquido pode retardar o moedor. - Certifique-se de que a ponta da agulha (Figura 1C) toque na superfície da placa de moagem (Figura 1D) mas não dobre (Figura 1E).
NOTA: A moagem dobrada resulta em uma ponta longa e frágil da agulha de um ângulo de bisel incorreto, que pode facilmente quebrar durante a injeção. Quebrar agulhas pode prejudicar o embrião e deve ser substituído por uma agulha intacta. Uma ponta de terra corretamente é mostrada na Figura 1F,G. Após a moagem, espera-se que o furo da agulha resultante tenha um diâmetro interno (ID) de ~15 μm e um diâmetro externo (OD) de ~35 μm (Figura 1G).
- Triture a agulha em um ângulo de 20° em velocidade máxima por pelo menos 30-45 min.
- Encha uma seringa de 1 mL com óleo mineral e conecte uma agulha de 27 G.
- Remova a tampa da agulha e insira a agulha da seringa no capilar de vidro recém-moído. Injete óleo mineral até que o óleo escorre da ponta capilar. Continue injetando enquanto retira a agulha de 27 G até que a agulha capilar esteja cheia de óleo mineral, após a qual a agulha de seringa pode ser removida.
- Armazene agulhas recheadas de óleo em um ambiente fechado para evitar danos e acúmulo de poeira. Para armazenamento, insira dois rolos de argila de modelagem em uma placa de Petri regular para servir como titulares (Figura 1H). Delicadamente empoleira as agulhas na argila e espaça-as distantes para fácil recuperação das agulhas.
NOTA: Como a preparação da agulha é demorada, é melhor preparar agulhas pelo menos um dia antes das injeções. Descarte as agulhas depois de duas ninhadas no máximo, pois elas se tornarão cegas. Prepare sempre agulhas de backup em caso de dano à agulha durante a preparação ou injeção.
Figura 1: Preparação da agulha para injeções de cavidade amniótica E7.5. (A) Exemplos representativos de uma agulha capilar de vidro puxada, mas sem cortes (esquerda), uma agulha capilar cortada no comprimento ideal para injeções E7.5 (meio) e um corte capilar muito curto (à direita). (B) O moedor com cobertura uniforme de água, que está pronto para moagem de agulhas. (C-F) Exemplos representativos de diferentes pontas de agulha. (C) Corte, mas unground agulha ponta montada no moedor; (D) posição ideal de moagem com a ponta da agulha apenas tocando o moedor; (E) agulha abaixada muito longe e dobrando durante o processo de moagem; (F) uma ponta de agulha moída ideal para injeções E7.5 AC. (G) Uma ponta de agulha moída mostrando o furo com um diâmetro interno de ~15 μm e um diâmetro externo de ~35 μm, que é adequado para injeção E7.5 AC. O furo da agulha é mostrado como linhas tracejadas. Diâmetro externo denotado com pontas de flechas vermelhas; diâmetro interno denotado com pontas de flecha azul. (H) Armazenamento de agulhas: placa de petri cheia de agulhas puxadas e moídas. Duas fileiras de argila de modelagem servem como titulares. NOTA: Para o micrômetro ocular em C, F, G, 1 cm é dividido em 100 arremessos; o objetivo é 3x; portanto, 1 arremesso= 10.000 μm/(100 × 3) ≈ 33,4 μm. Abreviaturas: AC = cavidade amniótica; ID = diâmetro interno; OD = diâmetro externo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Dia antes da injeção: prepare banco para verificação de ultrassom da gravidez
NOTA: Todo o trabalho deve ser realizado em um banco de Biossegurança Ventilado Nível 2 (BSL 2) ao trabalhar com lentivírus. A verificação do ultrassom da gravidez pode ser realizada em um banco ventilado.
- Ligue a máquina de ultrassom, a mesa de aquecimento e o fornecimento O2 para a bomba isoflurane (pode variar entre os equipamentos).
NOTA: Verifique o sistema isoflurane para garantir que não haja vazamento de isoflurane no ar. - Coloque um saco de lixo vazio (colado na parede interna para fácil acesso), creme para depilação, cotonetes de algodão embalados estéreis, água, papel de tecido e fita cirúrgica dentro do banco BSL 2.
- Prepare quatro pedaços de fita cirúrgica (~7 cm de comprimento) para fixar os membros do rato durante a verificação do ultrassom da gravidez.
3. Verificação de ultrassom para confirmar gravidez
NOTA: Esta etapa pode ser realizada um dia antes das injeções E7.5, em E6.5. Veja a discussão para obter detalhes sobre o cheque para a idade gestacional.
- Coloque o rato fêmea acasalado no quarto de indução.
- Ligue o fluxo de gás com um fluxo de oxigênio de ~2,1 LPM e uma dose inicial de 3-4% de isoflurane para induzir anestesia.
- Verifique se a fêmea está completamente anestesiada verificando o reflexo da pata. Se o reflexo da pata estiver ausente, menor isoflurane para 1,5-2%.
NOTA: Leva aproximadamente 3 minutos para induzir anestesia. - Mude o fluxo de gás da câmara de indução para o cone do nariz da mesa de aquecimento.
- Coloque a fêmea anestesiada em uma posição supina (abdômen para cima) sobre a mesa de aquecimento e coloque o focinho no cone do nariz preso para garantir a manutenção da anestesia durante a verificação do ultrassom da gravidez.
- Fixe todas as quatro patas à mesa com as peças preparadas de fita cirúrgica sem esticar o corpo da fêmea ou prender os bigodes.
- Aplique uma quantidade do tamanho de ervilha de creme de depilação no abdômen inferior. Usando um cotonete, distribua o creme sobre o abdômen inferior (a ~ 3 x 3 cm quadrados) e massageie-o suavemente rolando o cotonete para frente e para trás.
- Uma vez que a pele começa a se desprender da pele, umedeça um papel de tecido e remova o creme e a pele. Limpe a área de pele com papel de tecido úmido até que todo o creme e cabelo se foram. Seque a pele.
- Aplique uma quantidade do tamanho de uma ameixa de gel de ultrassom na área raspada e prossiga para identificar o útero usando ultrassom por qualquer uma das três abordagens seguintes.
- Para fazer isso manualmente, segure a sonda de ultrassom no gel de ultrassom e mova a sonda para encontrar o útero.
- Para a abordagem semimanual nº 1, posicione a sonda de ultrassom (anexada ao sistema de corrimão) acima do abdômen feminino, afrouxando e movendo parte do trilho ao longo do x-plano. Abaixe a sonda de ultrassom no gel (z-plane) e escaneie através do abdômen inferior (y-plane) (Figura 2A).
- Para a abordagem semimanual #2, baixe a sonda de ultrassom (presa ao sistema de corrimão) no gel para a imagem do abdômen inferior. Mantenha a sonda de ultrassom estacionária durante o processo e mova a mesa de aquecimento com as rodas acopladas ao longo de x e/ou y-planes (Figura 2B).
NOTA: Nestes estágios embrionários iniciais, órgãos internos, por exemplo, o intestino, podem parecer semelhantes ao útero em imagens de ultrassom. No entanto, enquanto embriões e decidua aparecem como uma sequência de esferas (semelhante a contas ao longo de um colar), o intestino tem a aparência de um tubo contínuo. A conectividade de espaços luminosos (esferas separadas versus um tubo contínuo) pode ser avaliada através da varredura para frente e para trás através da estrutura de interesse para determinar se a estrutura é uma esfera discreta (embrião/decidua) (Figura 2C) ou um tubo contínuo (intestino) (Figura 2D). Nesta fase, não é necessário registrar o número de embriões; é suficiente para confirmar sua presença ou ausência.
- Uma vez determinado o estado da gravidez, levante a sonda de ultrassom para longe do abdômen e limpe o abdômen inferior limpo com papel de tecido úmido para remover o gel de ultrassom.
- Desligue a bomba de isoflurano e remova a fita cirúrgica para soltar as patas.
- Coloque a fêmea na posição propensa (barriga para baixo) em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento de 40 °C. Mantenha a fêmea sob observação próxima até que ela recupere a consciência, que leva de 2-6 minutos.
NOTA: Certifique-se de que a verificação de ultrassom de uma fêmea é <10 min para minimizar a exposição à isoflurane. - Remova todos os materiais e resíduos e limpe todas as superfícies com 70% de etanol. Limpe qualquer gel de ultrassom restante da sonda de ultrassom com um tecido de papel seco, macio e sem fiapos. Desligue a máquina de ultrassom, banco ventilado/ banco BSL2, mesa de aquecimento e alimentação O2 .
4. Verificação de ultrassom para estadiamento de embriões
NOTA: Esta etapa é realizada antes da cirurgia e serve para estratificar as fêmeas grávidas de acordo com seus tamanhos de AC. Esta etapa é crucial para o E7.5 quando o objetivo é atingir o CNS em desenvolvimento. Nesta fase inicial de desenvolvimento, uma diferença de algumas horas em desenvolvimento influencia significativamente o tamanho do AC e a progressão da neurulação.
- Anestesiar o primeiro rato fêmea grávida seguindo os passos nas etapas 3.1-3.5.
- Coloque e fixe a fêmea na mesa conforme descrito na etapa 3.6.
- Aplique uma quantidade do tamanho de ameixa de gel de ultrassom no abdômen raspado e baixe a sonda de ultrassom para visualizar o abdômen inferior da fêmea.
NOTA: Esta etapa pressupõe que a fêmea foi inspecionada por ultrassom no dia anterior para a gravidez e já teve pele no abdômen removida. Se este não for o caso, a pele deve ser removida antes da adição de gel de ultrassom seguindo as etapas 3.7-3.8. Na E7.5, o útero e as deciduas são maiores e mais fáceis de distinguir dos órgãos internos. Além disso, o AC é maior e pode ser distinguido da cavidade exocelomia (ExC). - Escaneie através dos chifres uterinos esquerdo e direito o mais completamente possível.
NOTA: Alguns embriões estão mais profundos dentro do corpo da fêmea e podem ser perdidos. - Regissuas ções e estágios dos embriões. Anote o número de cavidades amnióticas de tamanho ideal, cavidades aceitáveis e decústicas sem cavidade (Figura 2E-G).
- Encenou todas as gestações e classifica-as de acordo.
- Injete as fêmeas com a maioria dos ACs de tamanho ideal imediatamente após a verificação do ultrassom (etapa 4.4) seguindo instruções nas etapas 4.5-4.7.
- Para fêmeas com a maioria aceitável (em que as cavidades exotomicas e amnióticas ainda não estão claramente divididas em duas cavidades) ou sem cavidades, adie a injeção e as encenou novamente após algumas horas. Se a maioria das cavidades ainda são muito pequenas, adie as injeções em 10-12 h.
Figura 2: Inspeção e estadiamento de cavidades amnióticas durante a verificação do ultrassom. (A) Visão geral do sistema ferroviário com sonda de ultrassom anexada, nanoinjetor e mesa de aquecimento. A sonda de ultrassom pode ser movida em x, y e z-planes para obter um alinhamento ideal com o abdômen feminino ou os ACs. (B) A mesa de aquecimento pode ser movida através de duas rodas em x-e/ou y-planes para permitir a varredura precisa e avaliação dos ACs, enquanto a sonda de ultrassom pode permanecer estática. (C) Imagens representativas de ultrassom de E6.5 decideuas dentro do abdômen feminino durante a verificação de ultrassom para confirmar a gravidez (contornos pontilhados brancos). Nenhuma cavidade se formou neste momento; no entanto, às vezes, o cone ectoplacental (asteriscos brancos) é visível. As deciduas podem ser reconhecidas por sua forma esférica e distinguidas do intestino, que aparece como um tubo contínuo. (D) Sequência de imagem representativa do intestino delgado (contornos pontilhados a branqueados), que é contínua na varredura através do abdômen inferior. (E-G) Imagens representativas do ultrassom durante o estadiamento da cavidade antes das injeções de E7.5. As cavidades amnióticas e exotómicas formaram-se e são separadas pelo amnion. O cone ectoplacental serve como o principal suprimento sanguíneo e aparece como um ponto brilhante no ultrassom. O AC é mais distal do cone ectoplacental. (E) Os ACs de tamanho ideal parecem maiores que a cavidade exocelomia, enquanto as cavidades de tamanho médio parecem menores (F). Se nenhuma cavidade é visível (G), isso significa que o embrião é resorculto ou ainda não atingiu o E7.5. Barras de escala = 1 mm. Abreviaturas: A = Amnion; AC = Cavidade Amniótica; ExC = Cavidade Exotolômica; EC = Cone Ectoplacental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Dia da injeção: prepare o banco BSL2 para cirurgia
- Cole um pedaço de membrana elástica à rodada, abertura central de uma placa de Petri comercialmente disponível e modificada. Certifique-se de que a membrana está bem presa à placa de Petri para evitar vazamentos.
NOTA: Se o prato ficar com vazamento ou não estiver bem colado, as bordas da membrana elástica podem ser ainda mais presas com fita adesiva. - Faça uma incisão de 1-1,5 cm de comprimento no centro da membrana elástica.
- Ligue a máquina de ultrassom, banco BSL2, placa de aquecimento, fornecimento O2 para a bomba de isoflurane e esterilizador de contas de vidro (definido a 300 °C).
- Dentro do banco BSL2, coloque um saco de lixo vazio (colado na parede interna para fácil acesso); cotonetes de algodão embalados estéreis (use um novo para cada cirurgia/cada fêmea); ferramentas cirúrgicas (tesoura, pinças, clipes, sutura) e fita cirúrgica; uma garrafa cheia de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), uma garrafa vazia para coleta de resíduos e uma pipeta de 25 mL; uma placa de Petri com membrana elástica para cirurgia; a tampa da placa de Petri com um pedaço de parafilme 2 x 2-3 x 3 cm fixado na tampa com uma gota de água; argila de modelagem: 4 bolas ou cubos maiores (~3 x 3 x 3 cm3 ) e uma peça cilíndrica (~4 x 1 cm); uma seringa com analgésico (por exemplo, buprenorfina, 0,05-0,1 mg/kg de peso corporal) e gelNOTE: As bolas (ou cubos) de argila de modelagem servirão como "pés" ou suportes/suportes para a placa de Petri uma vez que a placa é colocada em cima do abdômen da fêmea. O pedaço cilíndrico de argila segura os embriões dentro do prato. Se mais de uma solução for injetada, ou a agulha precisar ser reabastecida durante as injeções, o mesmo pedaço de parafilme pode ser usado se as soluções puderem ser espaçadas.
6. Carregamento de agulha
- Limpe qualquer excesso de óleo mineral com papel de tecido para uma melhor aderência.
NOTA: Limpe sempre a ponta para evitar danos ou ferimentos. - Certifique-se de que todos os componentes (um anel O de vedação, um espaçador e uma junta dianteira alojada sob o collet, Figura 3A) estejam instalados na orientação correta (Figura 3B, collet removido para visualização) para segurar a agulha capilar no lugar e criar uma conexão hermética, evitando a formação de bolhas ao avançar ou retrair o êmbolo metálico dentro da agulha.
- Certifique-se de que o êmbolo metálico do nanoinjetor esteja totalmente retraído. Verifique pressionando Encha e aguarde um bipe duplo que indique que o êmbolo está totalmente retraído.
- Com o collet preso, mas ligeiramente solto (desparafusado 45-90 graus), deslize a agulha de vidro sobre o êmbolo metálico e empurre a agulha capilar junto com o êmbolo metálico através da junta dianteira até atingir o espaçador (Figura 3C,D, collet removido para visualização).
NOTA: Alguma resistência aparece quando o êmbolo passa pela junta e diminui quando atinge o espaçador. Certifique-se de que a agulha capilar está firmemente inserida no espaçador para criar uma conexão hermética (Figura 3D). - Fixar a agulha apertando a collet do nanoinjetor (parafuso de volta com segurança).
NOTA: Não aperte demais, pois isso pode esmagar a agulha. - Pressione esvaziar para empurrar o êmbolo na agulha e expulsar o óleo da ponta da agulha. Se a agulha de vidro se mover, retraia o êmbolo, retire a agulha e recarregue. Se isso causar a formação de bolhas de ar, remova a agulha e rechee com óleo mineral.
NOTA: Uma agulha devidamente presa não deve se mover com o êmbolo. - Coloque uma gota do vírus (~ 6 μL) ou outra solução de injeção em um pedaço de parafilme1 (Figura 3E; O corante azul evans é usado para fins de visualização).
NOTA: O volume máximo do nanoinjetor é de ~5 μL. - Pressione o preenchimento para criar uma bolha de ar para servir como divisor entre o óleo e a solução (Figura 3F).
NOTA: Este também serve como um marcador de posicionamento ao encher ou esvaziar a agulha. - Abaixe a agulha, mergulhe a ponta na solução e pressione Fill (Figura 3F,G).
- Observe o nível do fluido enquanto a solução é carregada após a bolha de ar. Empurre esvaziar para expulsar o entupimento e recarregar pressionando Encha se a bolha de ar ficar alongada sem o fluido entrar na agulha. Se isso não resolver o problema, troque a agulha.
- Quando a agulha estiver totalmente carregada (Figura 3H), levante a agulha no z-plano e aspire um pequeno volume de ar na ponta para evitar a evaporação da solução na ponta da agulha e entupimento da agulha.
- Gire o nanoinjetor com a agulha presa longe do operador, em direção à parte de trás do banco, para evitar qualquer dano ou ferimento acidental.
Figura 3: Anexar a agulha ao nanoinjetor e ao carregamento da solução. (A) Posição inicial antes que a agulha seja montada no nanoinjetor: êmbolo metálico completamente retraído e collet ligado. (B) Sob a collet, todos os três componentes para segurar e fixar a agulha são mostrados na ordem correta (da esquerda para a direita): selar o anel O (fino e preto), espaçador (branco), O-ring (preto) com grande furo (que a agulha deve passar). Para garantir uma conexão hermética, a agulha de vidro é deslizada sobre o êmbolo metálico (C) e empurrada através da abertura do anel O dianteiro até chegar ao espaçador (D). (E-H) Carregando a solução na agulha. (E) Uma gota de solução é colocada em um pedaço de parafilme em uma tampa de placa. (F) Crie uma bolha de ar pressionando Encha antes de carregar a solução e mergulhe a ponta da agulha na solução. (G) A solução está carregando na agulha. (H) A solução é carregada na agulha. NOTA: O collet foi removido em (B-D) para visualização, mas deve permanecer anexado durante os experimentos. O passo final para fixar a agulha é apertar a collet. O corante azul evans é usado para visualização em E-H. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
7. Injeções
NOTA: Todos os instrumentos utilizados neste procedimento são esterilizados antes da cirurgia e entre cada rato.
- Anestesiar a primeira fêmea com cavidades de tamanho ideal (ver seção 4).
- Coloque e fixe a fêmea na mesa, conforme descrito nas etapas 3.1-3.6.
- Aplique gel ocular nos olhos para evitar a profanação da córnea e injete o analgésico subcutâneamente.
NOTA: Analgésicos recomendados: Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg de peso corporal) ou Flunixin (2,5 mg/kg) ou similar de acordo com as normas locais de bem-estar animal. A analgesia perioperatória multimodal é mantida com analgésicos injetados e isoflurano. - Prepare aseticamente o abdômen inferior limpando com um pano encharcado com solução de clorexidina de 0,5 mg/mL (ou similar) e seque a pele. Use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão vertical de pele de 1,5-2,0 cm no abdômen inferior.
NOTA: Prepare a área cirúrgica seguindo rotinas de desinfecção aprovadas localmente. - Levante a pele suavemente e liberte a pele da camada muscular subjacente, aproximadamente 1cm ao redor do ponto de incisão, para facilitar a sutura após a cirurgia.
- Faça uma incisão vertical de 1 cm na camada muscular.
- Com um par de fórceps, levante um lado da pele e camada muscular e com o outro par, procure os chifres uterinos.
NOTA: As deciduas são organizadas como contas em um colar, enquanto o intestino é um tubo longo e contínuo (Figura 4A). - Com fórceps, puxe cuidadosamente os dois chifres uterinos do abdômen. Segure o tecido entre embriões; não espremê-los diretamente (Figura 4B).
NOTA: O útero é ligado ao corpo no colo do útero, e os dois ovários/ovidutos são anexados através de ligamentos. Não puxe/desprender o útero desses pontos de ancoragem. - Conte e anote o número de embriões nos lados esquerdo e direito.
- Numerar os embriões do ovário ao colo uterino ou do colo do útero ao ovário.
NOTA: Isso é especialmente importante se os embriões injetados forem coletados em estágios embrionários. - Com um cotonete úmido, empurre suavemente todos os embriões de volta para a cavidade abdominal, exceto os três primeiros a serem injetados.
- Coloque uma gota de PBS sobre o elástico na placa de Petri e segure-o imediatamente acima dos embriões.
- Insira fórceps fechados na incisão do elástico e solte os fórceps para abrir a incisão elástica para que o líquido caia sobre os embriões.
NOTA: Isso garante a reidratação dos embriões e que a membrana elástica adere à pele úmida da fêmea, impedindo o vazamento de PBS nos próximos passos. - Puxe uma seção do útero, correspondente a três embriões, através do elástico com fórceps, e coloque suavemente a placa de Petri no abdômen da fêmea.
- Com as fórceps e um cotonete úmido, ajuste o posicionamento do útero e o elástico para garantir que o elástico seja selado à pele da fêmea para evitar o vazamento de PBS.
- Use os quatro pés de argila para fixar e fixar a placa de Petri imediatamente acima do abdômen, reduzindo a pressão sobre a fêmea e a sensibilidade da imagem para a respiração e batimentos cardíacos da fêmea.
- Pressione o cilindro de argila de modelagem para baixo à direita dos embriões/útero para fixar o útero (Figura 4C).
NOTA: Esta instrução de orientação pressupõe que a agulha está à esquerda da fêmea e que os embriões do chifre uterino esquerdo da fêmea estão expostos. O lado do útero (chifre uterino esquerdo ou direito) é crucial, pois o AC ou enfrenta a agulha (chifre esquerdo; Figura 4D) ou enfrenta o cilindro de argila estabilizador (buzina direita; Figura 4E). - Para injetar embriões a partir do chifre uterino direito, coloque o cilindro de argila no lado esquerdo dos embriões (Figura 4F) e gire a mesa de aquecimento 180° (Figura 4G) para obter a orientação correta. Se a agulha puder ser movida, adapte-se conforme apropriado para a configuração relevante.
- Adicione PBS à placa de Petri até que os embriões e o útero esteja coberto com PBS.
- Abaixe a sonda de ultrassom no PBS e ajuste a tabela do mouse/cirurgia para que o primeiro embrião esteja alinhado com a sonda de ultrassom para facilitar o registro das injeções.
NOTA: "Primeiro" refere-se à numeração de embriões do ovário ao colo uterino. - Escaneie os três embriões e inspecione os ACs. Determine o volume de injeção da seguinte forma:
- Meça o diâmetro do AC com a máquina de ultrassom. Injete 69 nL se o diâmetro ca estiver ≤0,2 mm; injetar 2 x 69 nL (= 138 nL) se o diâmetro ca estiver >0,2 mm e ≤0,29 mm; e injetar 3 x 69 nL (= 207 nL) se o diâmetro ca > 0,29 mm (Figura 4H).
NOTA: Experimentos anteriores mostraram que até 207 volumes de injeção de nL são bem tolerados em E7.515. Injeções bem sucedidas com impacto mínimo na sobrevivência são alcançadas quando o aumento relativo do volume do AC não excede 90%15. A variação do tamanho de CA entre os companheiros de lixo ou cepas do mouse é comum e pode exigir maior otimização.
- Meça o diâmetro do AC com a máquina de ultrassom. Injete 69 nL se o diâmetro ca estiver ≤0,2 mm; injetar 2 x 69 nL (= 138 nL) se o diâmetro ca estiver >0,2 mm e ≤0,29 mm; e injetar 3 x 69 nL (= 207 nL) se o diâmetro ca > 0,29 mm (Figura 4H).
- Ajuste os volumes de injeção com o controlador de injeção.
- Defina a velocidade de injeção para diminuir com uma taxa de injeção de 23 nL/s.
NOTA: Diferentes modelos de equipamento podem resultar em diferentes forças de injeção. - Abaixe a agulha no PBS usando as rodas principais do sistema ferroviário (x- e z-planes, Figura 4I) e pressione Esvaziar no controlador nanoinjetor até que o líquido atinja a ponta da agulha.
NOTA: Se a agulha estiver entupida, pressionar vazio pode dissolver o entupimento e/ou expulsar o entupimento. - Levante a agulha para fora do PBS e pressione Inject. Verifique se uma gota do volume aproximado desejado está descarregada.
- Abaixe a agulha no PBS e alinhe-a com a sonda de ultrassom e o embrião movendo o nanoinjetor com a roda do plano Y no micromanipulador (Figura 4J).
NOTA: A ponta da agulha está perfeitamente alinhada quando aparece como um ponto brilhante na imagem do ultrassom (Figura 4K,L). A agulha pode ser movida em todos os três planos de direção com o micromanipulador. - Ajuste o ângulo da agulha com a roda de ângulo de injeção para garantir um ângulo quase perpendicular de injeção em relação à parede uterina. Insira a agulha no AC em um movimento usando a roda de injeção no micromanipulador (Figura 4J-M). Fique de olho no brilho da ponta da agulha. Se a ponta da agulha desaparecer da imagem do ultrassom, mova a sonda de ultrassom para frente ou para trás para trazer a agulha de volta ao foco.
NOTA: Uma vez que a agulha esteja dentro do AC, pequenas modificações na posição e foco da agulha podem ser feitas sem prejudicar o embrião (ajustes dentro de ~0,3 mm). Não ajuste mais a posição da agulha do que isso. - Pressione Inject (para 207 nL, defina o volume em 69 nL e injete três vezes). Após a injeção, espere por mais 5-10 s antes de retrair a agulha em um movimento suave.
Figura 4: Tamanho ideal e orientação da cavidade amniótica para injeções bem sucedidas. (A) Chifre uterino com múltiplas deciduas E7.5, em forma de uma sequência de esferas (inferior) em comparação com intestino grosso (superior). (B) Segure o tecido uterino (linhas pontilhadas brancas) entre as deciduas. Evite apertar as deciduas (pontas de flechabrabra) diretamente com fórceps como deciduas e embriões em desenvolvimento são frágeis neste estágio inicial e propensos a resorção sobre força externa excessiva. (C) Fêmea em posição supina com deciduas expostas em uma placa de Petri cheia de PBS e montada em quatro pés de argila modeladora. As deciduas são estabilizadas por uma peça adicional de argila de modelagem, em forma de cilindro. (D, E) A orientação do AC é influenciada pelo lado do chifre uterino que está exposto. Se forem usadas as deciduas do chifre uterino esquerdo, o AC enfrentará o estabilizador de argila e será facilmente acessível à agulha à esquerda (D). No entanto, se o chifre uterino direito for usado, o cone ectoplacental irá, em vez disso, enfrentar a agulha, tornando mais difícil o acesso ao AC (E). Portanto, ao injetar no chifre uterino direito, o estabilizador de argila é colocado em direção ao lado voltado para agulhas (F), e toda a mesa de aquecimento é girada 180° (G). (H) Volumes de injeção recomendados de acordo com os tamanhos de CA. Em geral, cavidades com diâmetro ≤ 0,2 mm podem ser injetadas com um máximo de 69 nL. Diâmetros > 0,2 mm e ≤ 0,29 mm toleram volumes de até 2 x 69 nL (138 nL) e cavidades > 0,29 mm podem ser injetadas com 3 x 69 nL (207 nL). Barras de escala = 1 mm. (I, J) Nanoinjetor é anexado ao sistema ferroviário e pode ser movido em x- e/ou z-planes. O ângulo da agulha pode ser ajustado com a roda de ângulo de injeção . (K, L) A ponta da agulha (ponta de flecha branca) está alinhada com o AC quando aparece mais brilhante no ultrassom (L). (M) Imagem de ultrassom mostrando o processo de injeção, em que a ponta da agulha está no AC e bem alinhada (ponta de flecha branca). Abreviaturas: A = Amnion; AC = Cavidade Amniótica; ExC = Cavidade Exotolômica; EC = Cone Ectoplacental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Mova o palco para o próximo embrião e repita os passos 7.22-7.26 para os outros dois embriões se eles tiverem tamanhos CA adequados.
- Levante a sonda de ultrassom e a agulha do PBS usando o micromanipulador. Vire a agulha para longe do operador para evitar danos e ferimentos.
- Com fórceps, direcione os embriões1º e 2º de volta para o abdômen da fêmea, empurrando-os suavemente através do elástico. Segure suavemente o tecido adjacente ao3º embrião e puxe o útero para a extremidade superior da incisão elástica. Puxe suavementeos embriões 4-6 com fórceps e permita que o3º embrião reentre no abdômen.
NOTA: Esta etapa pode ser feita sem alterar o PBS ou a remoção da placa de Petri. - Repita conforme necessário até que todos os embriões com ACs ótimos tenham sido injetados ou o prazo tenha sido atingido.
- Empurre suavemente os embriões/útero de volta para o abdômen da fêmea.
- Aspire o PBS e remova a placa de Petri. Se um vírus foi usado, manuseie como lixo infeccioso.
- Costurem a camada muscular com Vicryl (USP 6-0, comprimento da agulha 13 mm, 3/8 Círculo) em suturas simples contínuas ou interrompidas e fechem a pele com clipes de 1-2 (veja a Tabela de Materiais).
- Desligue a bomba de isoflurane.
- Retire a fita cirúrgica e coloque a fêmea na posição propensa (barriga para baixo) em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento de 40 °C.
NOTA: Espera-se que a fêmea recupere a consciência e seja móvel dentro de 10 minutos. Certifique-se de que o procedimento seja concluído dentro de 30 minutos. O histórico genético, a idade e o peso da fêmea podem influenciar a sensibilidade à anestesia. Monitore os camundongos durante a cirurgia para sinais de respiração lenta (respiração lenta significa que a anestesia é muito profunda) ou movimento (anestesia é muito leve). Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg de peso corporal) ou Flunixin (2,5 mg/kg) ou similar de acordo com as normas locais de bem-estar animal, podem ser fornecidas 8 horas após a primeira injeção, se necessário. - Se outra fêmea for injetada, prepare a área cirúrgica enquanto monitora o despertar do primeiro.
- Limpe as ferramentas cirúrgicas com 70% de etanol para remover qualquer sangue ou tecido residual e esterilizá-las no esterilizador de contas de vidro pré-aquecido por 10 s. Descarte os cotonetes de algodão e o papel de tecido usado. Limpe a placa de Petri e peças de argila secam com papel de tecido.
- Repetir os passos 7.1-7.35 até que todas as fêmeas tenham sido injetadas.
- Esvazie e descarte a agulha.
- Se houver uma solução de vírus ou injeção deixada na agulha, pressione esvaziar o nanoinjetor e esvazie o conteúdo da agulha em papel de tecido.
- Retire o êmbolo metálico completamente pressionando Encha até que haja um bipe duplo do controlador, o que indica que o êmbolo está completamente retraído.
- Solte a collet e deslize a agulha para fora do êmbolo metálico. Descarte a agulha no recipiente de resíduos afiados.
- Limpe o banco BSL-2.
- Se um vírus foi usado, pulverize todo o campo cirúrgico com desinfetante (ver a Tabela de Materiais). Depois de 15 min, limpe o desinfetante e limpe todo o campo cirúrgico com 70% de etanol. Se nenhum vírus foi usado, limpe todas as superfícies com 70% de etanol.
- Limpe qualquer PBS restante da sonda de ultrassom com papel de tecido seco, macio e sem fiapos.
- Descartar resíduos de acordo com as diretrizes de biossegurança.
- Desligue a máquina de ultrassom, a mesa de aquecimento, o banco BSL2 e o fornecimento de O2 .
Representative Results
Embriões injetados no E7.5 com lentivírus hPGK-H2B-GFP 11,12 foram coletados em E13,5 e examinados sob o microscópio de dissecção fluorescente (Figura 5A). A transdução bem sucedida da placa neural resulta em embriões com forte expressão de um repórter fluorescente no cérebro principalmente e em outros tecidos derivados do ectoderme, por exemplo, a pele (Figura 5A,B). A injeção de um volume excessivamente alto (maior do que os volumes recomendados aqui, por exemplo, ≥500 nL) aumenta a pressão no AC e pode resultar em resorção completa (dados não mostrados) ou defeitos do tubo neural, como exencefalia (Figura 5A). As injeções bem sucedidas no E7.5 resultam em transdução uniforme do cérebro para o cérebro traseiro (Figura 5C-J).
Os títulos lentivirais em torno de 2 ×10 10 unidades infecciosas (IFU) atingem mais de 95% de segmentação, enquanto os títulos de ~1 × 109 IFU atingem 15% de eficiência de segmentação15. Além disso, também são alvo estruturas que antes eram difíceis de atingir usando eletroporação, como o plexo coroide17,18, (Figura 5 E,F). A eficácia da transdução pode ser modificada ajustando o título viral entregue no AC. Injeções de baixo título resultam na transdução de clones unicelulares (Figura 5C, Figura 5E e Figura 5G,H) enquanto o uso de vírus de alto título transduge quase 100% de todo o cérebro (Figura 5D, Figura 5F, Figura 5H e Figura 5J ). Portanto, o NETUNO pode ser usado para transdução clonal, rastreamento de linhagem e abordagens de triagem genética ou estudar os efeitos globais da superexpressão genética ou da baixa regulação em todo o cérebro.
O desenvolvimento dos olhos dos mamíferos é o resultado da comunicação bem organizada entre três derivados do ectoderme embrionário: a retina neural (NR) e o epitélio pigmento da retina (RPE) são derivados do neuroepithelium do cérebro ventral, enquanto o ectoderme superficial dá origem à lente futura e ao epitélio da córnea. No entanto, o estroma central e o endotélio posterior, as outras duas camadas da córnea, são derivados de células de crista neural do mesenquime periocular19,20. Seções coronais através de embriões E13.5, injetados no E7.5 com lentivírus de alta titulação mostraram, semelhante ao cérebro, transdução alta e uniforme do tecido neural do olho, bem como a lente, córnea e mesenchyme (Figura 5K). À medida que a neurulação progride, as injeções em E8.5 e E9.5 resultam na continuação da mira da lente e do epítrio córnea (Figura 5L e Figura 5N), enquanto a transdução dos tecidos derivados do neuroectoderm do olho é menos eficiente em E8.5 (Figura 5L,M) ou não visada em E9.5 (Figura 5N).
Enquanto a maioria das partículas virais infectam os tecidos expostos após a injeção, algumas partículas transduem tecidos derivados não ectodérmicos que se desenvolvem mais tarde (Figura 6A). Glândulas salivares e dutos desenvolvem-se em torno de E11,5 a partir do epitélio oral21 e são direcionados com NEPTUNE (Figura 6B). Após injeções no E9.5, o epitélio lingual da língua é bem transduzido; no entanto, o mesenquima subjacente é negativo (Figura 6C; suportes denotam células transduzidas; asteriscos denotam sinal de autofluorescência não células transduzidas). Além disso, há aglomerados positivos dentro do epitélio lingual, separados por seções negativas (Figura 6C, pontas de flechabra), sugerindo transdução da superfície da papila. As células da crista neural foram descritas na mesenquime da língua subjacente e dentro do epitélio lingual, onde estão envolvidas no desenvolvimento de papilas gustativas de sabor e papilasgustativas 22. De fato, as injeções no E7.5 resultam em transdução generalizada da língua mesenquime em E13.5 (Figura 6D), sugerindo que as injeções precoces visam células de crista neural, contribuindo para o mesenquime na língua.
Em vertebrados, os gânglios de raiz dorsal (DRGs) são um componente central do sistema nervoso periférico (PNS), pois toda a entrada somatosensorial da periferia do corpo (temperatura, dor, pressão) é transmitida ao cérebro através da ativação dos neurônios DRG23. Ambos os neurônios e células gliais do DRG são derivados das células da crista neural do tronco24. A injeção lentiviral, na qual o onipresente promotor de hPGK controla a expressão do repórter fluorescente, leva a um alvo generalizado do sistema nervoso central e periférico (Figura 7A), transduzindo neurônios e progenitores na medula espinhal (Figura 7B), bem como o DRG (Figura 7C). O uso de um MiniPromoter para doublecortin25 permite limitar a expressão GFP apenas aos neurônios (15 e Figura 7D,E).
Figura 5: Alta eficiência ou transdução clonal com NEPTUNE. (A) Embriões E13,5 sob um microscópio de dissecção iluminado com iluminação padrão (painel esquerdo) e mesmos embriões iluminados para GFP (painel direito). Embrião não injetado na extrema esquerda, injetou embrião com sucesso na extrema direita, produzindo sinal positivo no cérebro (embrião mais à direita). Embrião exencefálico devido ao excesso de volume injetado (embrião médio). (B) Mirar a pele e o cérebro com injeção de E7.5. Barra de escala = 50 μm. (C, D) Imagens confocal de cérebro com baixa transdução clonal (C) ou transdução de alta eficiência (D). (C, E, G, I) Transdução clonal de diferentes regiões do cérebro. (D, F, H, J) Transdução de alta eficiência de diferentes regiões do cérebro. Barras de escala = 200 μm. Diferentes eficácias de transdução são representativas de outras áreas do CNS. (E, F) Miramento de Plexus choroide, clonal (E) ou com alta eficiência (F). Barras de escala = 200 μm. (G, H) Segmentação clonal (G) e alta eficiência (H) de cérebro traseiro, ampliada em (I, J). Barras de escala = 200 μm. (K) GFP expressão repórter em olho em E13.5 depois na injeção de útero em E7.5 (L, M) GFP expressão repórter no olho em E15.5 depois na injeção de útero em E8.5 (L), região encaixotado ampliada em (M), ou em E9.5 (N). Vasos sanguíneos autofluorescentes são marcados com estrelas brancas. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: NEPTUNE = neural plate targeting com in utero nano-injection; C = Córnea; LE = Lente Epitélio; LF = Fibras da lente; M = Mesenchyme; NR = Retina Neural; ON = Nervo Óptico; RPE = Epitélio pigmento de retina; GFP = proteína fluorescente verde; CNS = sistema nervoso central. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Na transdução utero de tecidos não neurais. (A) Imagem confocal da cavidade oral E15.5. Embrião foi injetado com lentivírus repórter fluorescente na E9.5. Barra de escala = 200 μm. (B, C) (B) Ampliação do painel de entrada; epitélio do ducto salivar transduzido com vírus. (C) Ampliação do painel de entrada; epitélio lingual dorsal transduzido com vírus repórter GFP (suporte branco). O mesenquima subjacente derivado das células da crista neural é negativo. Pontas de flechas brancas indicam papilas com células de crista neural negativas cercadas por células epiteliais transduzidas por vírus (glóbulos/vasos autofluorescentes são marcados com estrelas brancas). Barras de escala = 50 μm. (D) Imagem esquemática e confocal de E13,5 língua mesenchyme após injeções com vírus repórter fluorescente em E7.5. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: D = Dorsal; M = Mesenchyme; N = Nasofaringe; SLD = Duto Sublingual; DSM = Duto Submandibular; T = Língua; V = Ventral; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: A transdução de células gânglios de raiz dorsal derivadas da crista neural. (A) O alvo neptune em E7.5 permite o direcionamento tanto do CNS quanto do PNS. (B) Imagem confocal da medula espinhal E13.5 e DRGs injetados com lentivírus repórter hPGK-H2B-GFP na E7.5 mostra a transdução de progenitores neurais SOX2+ e neurônios NeuN+ . Barra de escala = 100 μm. (C) Região encaixotado de B mostrando o DRG com expressão GFP em populações celulares SOX2+ (setas brancas) e NeuN+ (pontas de flechabrabrabra branca). Barra de escala = 20 μm. (D) Imagem confocal da medula espinhal E13,5 e DRG injetada com lentivírus DCX-H2B-GFP em E7.5, visando apenas células DCX+ . Barra de escala = 100 μm. (E) Região encaixotada de D mostrando DRG com expressão GFP restrita aos neurônios DCX+ (pontas de flecha branca). DCX- as células são negativas para GFP (setas brancas). Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: NEPTUNE = neural plate targeting com in utero nano-injection; CNS = sistema nervoso central; PNS = sistema nervoso periférico; DRGs = gânglio raiz dorsal; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Existem vários passos neste protocolo que influenciam a sobrevivência embrionária, a qualidade das injeções e a leitura. A idade gestacional dos embriões é definida como E0.5 ao meio-dia do plugue vaginal após o acasalamento durante a noite. A realização da verificação de ultrassom para gravidez no E6.5 no final da tarde/noite garante que os embriões sejam desenvolvidos o suficiente para serem identificados pelo ultrassom. A verificação (1) permite a pré-triagem de quantos camundongos plug-positivos estão realmente grávidas, (2) garante que nenhum vírus seja descongelado desnecessariamente e desperdiçado no caso de camundongos plug-positivos não estarem grávidas, e (3) reduz intervenções desnecessárias em camundongos (evita cirurgia em fêmeas não grávidas).
Na E7.5, os embriões são sensíveis às forças externas e devem ser tratados com cuidado. Por exemplo, puxar os chifres uterinos ou apertar as deciduas pode levar à resorção de embriões. O tecido uterino deve ser sempre mantido úmido quando fora do abdômen feminino para evitar que o tecido seque. A maioria das deciduas deve permanecer dentro do abdômen feminino, com apenas 3-4 expostos para injeções. A nitidez da agulha é outro determinante crucial para injeções bem sucedidas. Pontas de agulhas cegas ou quebradas resultam em cutucamento repetido de deciduas ou compressão contra a argila de modelagem antes de entrar no AC, o que pode aumentar a taxa de resorção. Portanto, agulhas bem moídas e afiadas devem ser sempre armazenadas com segurança e substituídas após um máximo de 2 fêmeas.
Este protocolo descreve como atingir a placa neural com uma única injeção de lentivírus. Além disso, mostra como a eficácia da transdução pode ser adaptada de clones unicelulares para todo o cérebro. No entanto, outros tecidos não neurais, incluindo a pele e o epitélio oral, também são alvos. Além disso, todos os tipos de células (progenitores e células diferenciadas) são transduzidos, tornando essa abordagem eficiente, mas não específica. O uso de MiniPromoters na construção viral leva à expressão específica do transgene em neurônios ou astrócitos15. Isso tem a vantagem de evitar o uso de animais cre transgênicos dedicados e, portanto, reduz a quantidade de mão-de-obra (manutenção de tensão e genotipagem) e os custos.
As limitações do NETUNO incluem sua dificuldade técnica, desafios na obtenção de gestantes a uma taxa previsível e consistente e os custos de aquisição de instrumentação especializada. Além disso, o direcionamento não seletivo de células por lentivírus pode ser visto como um benefício e uma limitação da técnica. A injeção de volumes maiores no AC resulta em exencefalia13, embora malformações cerebrais e exencefalia sejam evitadas com os volumes descritos aqui15. Um impacto negativo no desenvolvimento cerebral é, portanto, um risco com injeções nano-injeções uterinas que devem ser cuidadosamente evitadas injetando volumes corretos adaptados ao estágio embrionário e ao tamanho de AC.
Futuras adaptações da técnica podem se concentrar no tropismo viral. Os vírus associados ao Adeno (AAVs) possuem diferentes sorotipos, que têm sido mostrados para atingir robustamente diferentes tipos de células no CNS17,26. No entanto, os AAVs não se integram ao genoma da célula hospedeira e, portanto, podem ser perdidos em células com uma alta taxa de divisão. Embora existam várias maneiras de aumentar a especificidade do NETUNO, os animais transgênicos ainda são o padrão-ouro quando se trata de manipulação genética in vivo. Os camundongos Cas9 e o lentivírus de codificação de sgRNA têm sido usados para triagem genética na epiderme embrionária27 e também podem ser adaptados ao CNS em desenvolvimento.
As injeções no AC em E7.5 visam eficientemente as células do neuroectoderme antes do início da neurulação e visam o cérebro em desenvolvimento de forma mais eficiente do que na eletroporação uterina . Isso permite o estudo de pistas genéticas importantes para o desenvolvimento cerebral a partir de um ponto de tempo anterior. Em contraste com os modelos clássicos de camundongos genéticos, o NETUNO oferece uma abordagem flexível para realizar a análise genética funcional. Fenótipos após superexpressão ou exclusão genética podem ser estudados dentro de dias a semanas em comparação com meses ou anos. As injeções de múltiplas construções virais permitem a manipulação de vários genes dentro de um embrião e evitam a geração de animais duplos ou triplos. Portanto, o NETUNO não só economiza tempo como também pode reduzir o número de animais utilizados na pesquisa.
Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Bettina Semsch e Jia Sun (Infinigene) pelo cuidado especializado com ratos; Florian Salomons e Göran Månsson do Biomedicum Imaging Core (BIC) para assistência com aquisição e consulta de imagens. Financiamento: Agradecemos aos seguintes financiadores pelo apoio deste projeto: O Conselho sueco de Pesquisa, o Instituto Karolinska (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID funding, and SFO StratNeuro funding, the Center of Innovative Medicine), The Ollie and Elof Ericssons Foundation, a Tornspiran Foundation, a Jeansssons Foundation, Sven e Ebba-Christina Hagbergs Prize e research Grant, Knut e Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik e Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation, e as Fundações Suecas Starting Grant to ERA. A Figura 4D,E foi criada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD Bioscience | 309628 | |
| 27 G Needle | BD Bioscience | 300635 | |
| 3.5 inches capillaries | Drummond Scientific | 3000203G/X | Were used to pull in house needles |
| 70 MHz MS Series transducer | Visual Sonics | MS700 | |
| Aquasonic clear ultrasound gel | Parker Laboratories | Mar-50 | |
| Autoclip Applier 9 mm | Angthos | 12020-09 | |
| CD1 mice | Charles River, Germany | Crl:CD1(ICR) | Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old |
| Cotton Swab | OneMed Sverige AB | 120788 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Dressing forceps delicate straight 13 cm | Agnthos | 08-032-130 | |
| EG-400 Narishige Micropipette Grinder | Narishige | NA | |
| EZ clips 9 mm | Angthos | 59027 | clips |
| Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm | Agnthos | 307-336-090 | |
| Isofluorane | Baxter Medical AB | EAN: 50085412586613 | Purchased from Swedish Pharmacy |
| Kimwipes | Kimberly Clarke | 7557 | |
| Membrane Tape | Visual Sonics | SA-11053 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Modeling Clay | Sense AB | 10209 | |
| Mouse Handling Table | Visual Sonics | 50249 | |
| Nanoject II Auto Injector Kit | Drummond | 3-000-205A | |
| Parafilm | Bemis | HS234526C | |
| Petri dish with central opening (low wall) | Visual Sonics | SA-11620 | |
| Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Rely+On Virkon | DuPont | 130000132037 | disinfectant |
| Silicone membrane | Visual Sonics | SA-11054 | |
| Steri 250, hot bead sterilizer | Angthos | 31100 | |
| Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m) | Medicarrier | 67034 | |
| Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System | Visual Sonics | VS-12055 | |
| Vevo Imaging Station 2 | Visual Sonics | VS-11983 | |
| Vevo2100 | Visual Sonics | VS-20047 | |
| Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament | Agnthos | J384H |
References
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