Summary
In dit protocol beschrijven we hoe de vruchtwaterholte van de muis op E7.5 kan worden geïnjecteerd met lentivirus, wat leidt tot uniforme transductie van de gehele neurale plaat, met minimale schadelijke effecten op overleving of embryonale ontwikkeling.
Abstract
Het manipuleren van genexpressie in het zich ontwikkelende muizenbrein in de baarmoeder heeft een groot potentieel voor functionele geneticastudies. Het is echter eerder grotendeels beperkt gebleven tot de manipulatie van embryonale stadia na de neurulatie. Er werd een protocol ontwikkeld om de vruchtwaterholte op embryonale dag (E) 7.5 te injecteren en lentivirus af te leveren, coderend voor cDNA of shRNA, gericht op >95% van de neurale plaat en neurale crestcellen, wat bijdraagt aan de toekomstige hersenen, het ruggenmerg en het perifere zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om succesvolle transductie te bereiken, waaronder het slijpen van de glazen capillaire naalden, zwangerschapsverificatie, ontwikkelingsstadiëring met behulp van ultrasone beeldvorming en optimale injectievolumes afgestemd op embryonale stadia.
Volgens dit protocol is het mogelijk om transductie van >95% van de zich ontwikkelende hersenen te bereiken met high-titer lentivirus en zo genetische manipulatie van de hele hersenen uit te voeren. Daarentegen is het mogelijk om mozaïektransductie te bereiken met behulp van lagere virale titers, waardoor genetische screening of afstammingstracering mogelijk is. Injectie bij E7.5 richt zich ook op ectoderm en neurale crest die bijdragen aan verschillende compartimenten van het oog, de tong en het perifere zenuwstelsel. Deze techniek biedt dus de mogelijkheid om genexpressie te manipuleren in neurale plaat- en ectoderm-afgeleide weefsels van muizen uit preneurulatiestadia, met het voordeel van het verminderen van het aantal muizen dat in experimenten wordt gebruikt.
Introduction
De hersenen en het ruggenmerg behoren tot de eerste organen die de vorming tijdens embryogenese in gang zetten 1,2. Hoewel de genen geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen worden geïdentificeerd, is de functionele ondervraging van genetische varianten achtergebleven bij 3,4. Omdat het genereren van voorwaardelijke knock-out muizen maanden of jaren kan duren, is een alternatieve techniek om snel de genfunctie in de zich ontwikkelende hersenen te onderzoeken van belang. Bij muizenembryo's vindt neurulatie - het morfogenetische proces waarbij de neurale plaat transformeert in de neurale buis om het centrale zenuwstelsel (CZS) te veroorzaken - plaats tussen dag 8 en 10 na de conceptie5. Voorafgaand aan het begin van de neurulatie bestaat de neurale plaat, als onderdeel van het ectoderm, uit een enkele laag zuilcellen die zich zullen vermenigvuldigen en differentiëren in de talrijke neuronale en gliaceltypen binnen het CZS 6,7. Daarom, om experimenteel langdurige veranderingen in genexpressie in het CZS te induceren, biedt het richten op de neurale plaat duidelijke voordelen, waaronder de toegankelijkheid van alle voorlopercellen.
In de neurowetenschappen zijn in ovo-elektroporatie 8,9 en virale transductie van muizenembryo's gebruikt om embryonale CZS-genexpressie te manipuleren. Het zich ontwikkelende kuikenembryo is een model bij uitstek geweest voor het bestuderen van de genfunctie tijdens de ontwikkeling van het ruggenmerg vanwege de toegankelijkheid van het kuikenembryo in het ei en het resulterende gemak van het manipuleren van genexpressie. In het bijzonder genereert plasmide-elektroporatie in ovo experimentele en controleomstandigheden in elk ruggenmerg van het kuiken. Elektroporatie veroorzaakt celmembraanpermeabilisatie en leidt negatief geladen DNA weg van de (negatieve) kathode naar de (positieve) anode door een elektrische puls via twee elektroden op het embryo aan te brengen. Bij muizen is elektroporatie in utero over het algemeen beperkt tot embryonale stadia waarin de neurulatie is voltooid, en de hersenen of het ruggenmerg bestaan al uit verschillende cellagen, wat resulteert in een lage elektroporatie-efficiëntie10. Plasmide-elektroporatie resulteert in voorbijgaande genexpressie en richt zich over het algemeen op weinig cellen.
Echogeleide micro-injectie in utero is gebruikt om verschillende embryonale structuren zoals de huid en de hersenen te manipuleren 11,12,13,14. Injecties gericht op het zich ontwikkelende murine CZS hebben echter een lage werkzaamheid aangetoond of hebben een negatieve invloed gehad op de embryonale overleving 12,13,14. Daarom werd een verbeterd protocol ontwikkeld voor de toediening van lentivirus met een hoog titergehalte in de vruchtwaterholte (AC) bij E7.5, dat NEPTUNE werd genoemd voor neural plate targueting with in uteronano-injection15. Injecties resulteerden in een langdurige doelgerichte werkzaamheid van >95% van de hele hersenen op E13,5. Bovendien werd een faseringsstap geïntroduceerd tijdens echografieverificatie van zwangerschap om vrouwtjes en zwangerschappen te sorteren op ontwikkelingsfase om onnodige procedures op proefdieren te minimaliseren en het injectiesucces te maximaliseren. Injectie-efficiëntie en overleving zijn nauw verbonden met de toename van ac-grootte. Daarom beschrijft dit artikel hoe de AC-grootte voorafgaand aan de injectie kan worden gemeten om een geschikt volume aan de AC te leveren dat geen resorptie van het embryo veroorzaakt. NEPTUNE is een robuust alternatief voor de huidige in utero-benaderingen en kan worden aangepast voor verschillende toepassingen, waaronder, maar niet beperkt tot, gain and loss of function studies, lineage tracing of screening15,16.
Protocol
CD1 wild-type muizen werden gehuisvest volgens de Europese regelgeving, met een standaard dag- en nachtcyclus met voedsel en water ad libitum. CD1-vrouwtjes werden 's nachts gepaard met CD1-mannetjes en vaginale pluggen werden 's ochtends gecontroleerd (E0.3). Alleen zwangere vrouwen werden gebruikt voor de injectie. Ethische goedkeuring voor alle hier beschreven experimenten werd verleend door de Zweedse Raad van Landbouw (Jordbruksverket).
1. Bereiding van glazen naalden: naaldtrekken en malen
OPMERKING: Hoewel voorgemalen naalden kunnen worden gekocht, maakt het trekken van naalden in eigen huis eenvoudige aanpassingen van naaldlengte, boring en schuine hoek mogelijk.
- Monteer een glazen capillair in de micropipette/capillaire trekker. Gebruik de volgende instellingen met behulp van de opgegeven apparatuur (zie de tabel met materialen): warmte 580 eenheden; snelheid 140 eenheden; tijd 200 eenheden; druk 500-800 eenheden.
OPMERKING: De eenheden van verschillende parameters worden gedefinieerd door de capillaire trekker. Eenheden kunnen variëren voor verschillende apparatuur. - Druk op Pull om het capillair uit elkaar te trekken en twee glazen haarvaten met taps toelopende uiteinden te produceren.
OPMERKING: Na het trekken zijn de uiteinden van de twee glazen haarvaten dichtgesmolten vanwege de hoge temperatuur van de micropipettetrekker. - Knip de punt met een chirurgische schaar om een naaldlengte van ~ 7 mm te verkrijgen (gemeten vanaf waar de naald begint taps toe te lopen) (figuur 1A).
OPMERKING: Voor E7.5-injecties is een lange en fijne naald van cruciaal belang, omdat het injectiegebied erg klein en delicaat is. Korte en breedborende naalden zullen leiden tot embryonale sterfgevallen. - Maal de punt van de gesneden naald tot een scherpe schuine kant (figuur 1C-F).
- Maal de naald onder een hoek van 20° bij maximale snelheid gedurende ten minste 30-45 minuten.
OPMERKING: Ultrapuur water wordt toegevoegd aan de slijpplaat om als smeermiddel te fungeren, wrijving / temperatuur te verminderen en glasdeeltjes weg te spoelen (figuur 1B). Overtollige vloeistof kan de molen echter vertragen. - Zorg ervoor dat de punt van de naald (figuur 1C) het oppervlak van de slijpplaat raakt (figuur 1D) maar niet buigt (figuur 1E).
OPMERKING: Gebogen slijpen resulteert in een lange en fragiele naaldpunt met een onjuiste schuine hoek, die gemakkelijk kan breken tijdens injectie. Brekende naalden kunnen het embryo beschadigen en moeten worden vervangen door een intacte naald. Een correct geslepen punt is weergegeven in figuur 1F,G. Na het slijpen zal de resulterende naaldboring naar verwachting een binnendiameter (ID) van ~ 15 μm en een buitendiameter (OD) van ~ 35 μm hebben (figuur 1G).
- Maal de naald onder een hoek van 20° bij maximale snelheid gedurende ten minste 30-45 minuten.
- Vul een spuit van 1 ml met minerale olie en bevestig een naald van 27 G.
- Verwijder de naalddop en steek de naald van de spuit in het nieuw gemalen glazen capillair. Injecteer minerale olie totdat de olie uit de capillaire punt druipt. Blijf injecteren terwijl u de naald van 27 G optrekt totdat de capillaire naald is gevuld met minerale olie, waarna de naald van de spuit kan worden verwijderd.
- Bewaar met grond en minerale olie gevulde naalden in een gesloten omgeving om schade en stofophoping te voorkomen. Plaats voor opslag twee rollen modelleerklei in een gewone petrischaal om als houders te dienen (figuur 1H). Plaats de naalden voorzichtig op de klei en plaats ze ver uit elkaar voor het gemakkelijk ophalen van de naalden.
OPMERKING: Omdat naaldbereiding tijdrovend is, is het het beste om naalden ten minste één dag voorafgaand aan injecties te bereiden. Gooi de naalden na maximaal twee nesten weg, omdat ze bot worden. Bereid altijd back-up naalden voor in geval van naaldbeschadiging tijdens de bereiding of injectie.
Figuur 1: Naaldvoorbereiding voor E7.5 amniotische holte-injecties. (A) Representatieve voorbeelden van een getrokken maar ongesneden glazen capillaire naald (links), een capillaire naald gesneden op de optimale lengte voor E7.5-injecties (midden) en een capillaire snede te kort (rechts). (B) De molen met gelijkmatige dekking van water, die klaar is voor naaldslijpen. (C-F) Representatieve voorbeelden van verschillende naaldpunten. C) gesneden maar ongemalen naaldpunt gemonteerd in een molen; D) ideale slijppositie waarbij de punt van de naald de molen net raakt; E) naald te ver neergelaten en gebogen tijdens het maalproces; (F) een ideale geslepen naaldpunt voor E7.5 AC-injecties. (G) Een geslepen naaldpunt met de boring met een binnendiameter van ~ 15 μm en een buitendiameter van ~ 35 μm, die geschikt is voor E7.5 AC-injectie. De naaldboring wordt weergegeven als stippellijnen. Buitendiameter aangeduid met rode pijlpunten; binnendiameter aangeduid met blauwe pijlpunten. (H) Naaldopslag: Petrischaal gevuld met getrokken en gemalen naalden. Twee rijen boetseerklei dienen als houders. OPMERKING: Voor de oculaire micrometer in C, F, G is 1 cm verdeeld in 100 toonhoogten; het doel is 3x; daarom 1 pek= 10.000 μm/(100 × 3) ≈ 33,4 μm. Afkortingen: AC = vruchtwaterholte; ID = inwendige diameter; OD = buitendiameter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Dag voor injectie: bereid de bank voor op echografie-verificatie van de zwangerschap
OPMERKING: Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een geventileerde Biosafety Level 2 (BSL 2) bank bij het werken met lentivirus. Echografie-verificatie van zwangerschap kan worden uitgevoerd op een geventileerde bank.
- Schakel het echoapparaat, de verwarmingstafel en de O2-voeding voor de isofluraanpomp in (kan per apparaat verschillen).
OPMERKING: Controleer het isofluraansysteem om er zeker van te zijn dat er geen isofluraan in de lucht lekt. - Plaats een lege afvalzak (vastgeplakt aan de binnenwand voor gemakkelijke toegang), ontharingscrème, steriel verpakte wattenstaafjes, water, tissuepapier en chirurgische tape in de BSL 2-bank.
- Bereid vier stukken chirurgische tape (~ 7 cm lang) voor om de ledematen van de muis vast te zetten tijdens de echografie van de zwangerschap.
3. Echografie om de zwangerschap te bevestigen
OPMERKING: Deze stap kan de dag vóór E7.5-injecties worden uitgevoerd, op E6.5. Zie de discussie voor meer informatie over de controle op de zwangerschapsduur.
- Plaats de tijdgebonden vrouwelijke muis in de inductiekamer.
- Schakel de gasstroom in met een zuurstofstroom van ~ 2,1 LPM en een initiële dosis van 3-4% isofluraan om anesthesie te induceren.
- Controleer of het vrouwtje volledig verdoofd is door de pootreflex te controleren. Als de pootreflex afwezig is, verlaag dan isofluraan tot 1,5-2%.
OPMERKING: Het duurt ongeveer 3 minuten om anesthesie te induceren. - Schakel de gasstroom van de inductiekamer naar de neuskegel van de verwarmingstafel.
- Plaats het verdoofde vrouwtje in rugligging (buik omhoog) op de verwarmingstafel en plaats de snuit in de bevestigde neuskegel om te zorgen voor behoud van anesthesie tijdens de echografie van de zwangerschap.
- Bevestig alle vier de poten aan de tafel met de voorbereide stukjes chirurgische tape zonder het lichaam van de vrouw uit te rekken of de snorharen te vangen.
- Breng een hoeveelheid ontharingscrème ter grootte van een erwt aan op de onderbuik. Verdeel met een wattenstaafje de crème over de onderbuik (een vierkant van ~ 3 x 3 cm) en masseer het zachtjes in door het wattenstaafje heen en weer te rollen.
- Zodra de vacht begint los te komen van de huid, bevochtig je een tissuepapier en verwijder je de crème en de vacht. Reinig het ontbonte gebied met vochtig vloeipapier totdat alle crème en haar weg zijn. Droog de huid.
- Breng een hoeveelheid ultrasone gel ter grootte van een pruim aan op het geschoren gebied en ga verder met het identificeren van de baarmoeder met behulp van echografie door een van de volgende drie benaderingen.
- Om dit handmatig te doen, houdt u de ultrasone sonde in de ultrasone gel en verplaatst u de sonde om de baarmoeder te vinden.
- Voor semimanuele benadering # 1 plaatst u de ultrasone sonde (bevestigd aan het relingsysteem) boven de vrouwelijke buik door een deel van de rail langs het x-vlak los te maken en te verplaatsen. Laat de ultrasone sonde in de gel zakken (z-plane) en scan door de onderbuik (y-plane) (figuur 2A).
- Voor semimanuele benadering # 2, laat u de ultrasone sonde (bevestigd aan het relingsysteem) in de gel zakken om de onderbuik in beeld te brengen. Houd de ultrasone sonde stationair tijdens het proces en verplaats de verwarmingstafel met de bevestigde wielen langs x- en/of y-vlakken (figuur 2B).
OPMERKING: In deze vroege embryonale stadia kunnen inwendige organen, bijvoorbeeld de darm, lijken op de baarmoeder in echografie. Hoewel embryo's en decidua verschijnen als een opeenvolging van bollen (vergelijkbaar met kralen langs een ketting), heeft de darm het uiterlijk van een doorlopende buis. De connectiviteit van luminale ruimten (afzonderlijke bollen versus een continue buis) kan worden beoordeeld door heen en weer te scannen door de structuur van belang om te bepalen of de structuur een discrete bol (embryo / decidua) (figuur 2C) of een continue buis (darm) is (figuur 2D). In dit stadium is het niet nodig om het aantal embryo's te registreren; het volstaat om hun aan- of afwezigheid te bevestigen.
- Zodra de zwangerschapsstatus is bepaald, tilt u de ultrasone sonde weg van de buik en veegt u de onderbuik schoon met vochtig tissuepapier om de ultrasone gel te verwijderen.
- Schakel de isofluraanpomp uit en verwijder de chirurgische tape om de poten los te maken.
- Plaats het vrouwtje in buikligging (buik naar beneden) in een schone kooi op een verwarmingsplaat van 40 °C. Houd het vrouwtje nauwlettend in de gaten totdat ze weer bij bewustzijn komt, wat 2-6 minuten duurt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de echografiecontrole voor één vrouw <10 minuten is om de blootstelling aan isofluraan te minimaliseren. - Verwijder alle materialen en afval en reinig alle oppervlakken met 70% ethanol. Veeg alle overgebleven ultrasone gel van de ultrasone sonde af met een droog, zacht en pluisvrij papieren zakdoekje. Schakel het echoapparaat, de geventileerde bank / BSL2-bank, de verwarmingstafel en de O2-voeding uit.
4. Echografiecontrole voor embryostadiëring
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd vóór de operatie en dient om de zwangere vrouwen te stratificeren op basis van hun AC-maten. Deze stap is cruciaal op E7.5 wanneer het doel is om het zich ontwikkelende CZS te richten. In dit vroege stadium van ontwikkeling heeft een verschil van enkele uren in ontwikkeling een aanzienlijke invloed op de grootte van de AC en de progressie van neurulatie.
- Verdoof de eerste zwangere vrouwelijke muis volgens de stappen in stap 3.1-3.5.
- Plaats en fixeer het vrouwtje op de tafel zoals beschreven in stap 3.6.
- Breng een hoeveelheid ultrasone gel ter grootte van een pruim aan op de geschoren buik en laat de ultrasone sonde zakken om de onderbuik van het vrouwtje in beeld te brengen.
OPMERKING: Deze stap gaat ervan uit dat het vrouwtje de vorige dag door echografie is geïnspecteerd voor zwangerschap en al vacht op de buik heeft laten verwijderen. Als dit niet het geval is, moet de vacht worden verwijderd voordat de ultrasone gel wordt toegevoegd volgens de stappen 3.7-3.8. Bij E7.5 zijn de baarmoeder en deciduas groter en gemakkelijker te onderscheiden van inwendige organen. Bovendien is de AC groter en kan worden onderscheiden van de exocelomische holte (ExC). - Scan de linker- en rechterhoorntjes van de baarmoeder zo volledig mogelijk.
OPMERKING: Sommige embryo's liggen dieper in het lichaam van het vrouwtje en kunnen worden gemist. - Noteer het aantal en de stadia van de embryo's. Noteer het aantal vruchtwaterholtes van ideale grootte, aanvaardbare holtes en deciduas zonder holte (figuur 2E-G).
- Ensceneer alle zwangerschappen en rangschik ze dienovereenkomstig.
- Injecteer vrouwen met een meerderheid van de ideale grootte AC's onmiddellijk na de echografiecontrole (stap 4.4) volgens de instructies in stap 4.5-4.7.
- Voor vrouwen met een meerderheid van acceptabele (waarbij de exocelomische en vruchtwaterholtes nog niet duidelijk in twee holtes zijn verdeeld) of afwezige holtes, stel de injectie uit en voer ze na een paar uur opnieuw in scène. Als de meeste holtes nog steeds te klein zijn, stel de injecties dan 10-12 uur uit.
Figuur 2: Inspectie en stadiëring van vruchtwaterholtes tijdens echografie-controle. (A) Overzicht van het railsysteem met bijgevoegde ultrasone sonde, nano-injector en verwarmingstafel. De ultrasone sonde kan worden verplaatst in x-, y- en z-vlakken om een optimale uitlijning met de vrouwelijke buik of de AC's te bereiken. (B) Verwarmingstafel kan via twee wielen in x- en/of y-vlakken worden verplaatst om nauwkeurig scannen en beoordelen van de AC's mogelijk te maken, terwijl de ultrasone sonde statisch kan blijven. (C) Representatieve echografiebeelden van E6.5 deciduas in de vrouwelijke buik tijdens echografiecontrole om de zwangerschap te bevestigen (witte stippelvormige contouren). Er hebben zich op dit punt geen holtes gevormd; soms is echter de ectoplacentale kegel (witte sterretjes) zichtbaar. Deciduas zijn te herkennen aan hun bolvorm en onderscheiden van de darm, die verschijnt als één doorlopende buis. (D) Representatieve beeldsequentie van de dunne darm (wit gestippelde contouren), die continu door de onderbuik wordt gescand. (E-G) Representatieve echografiebeelden tijdens caviteitsstadiëring voorafgaand aan E7.5-injecties. De vruchtwater- en exocelomische holtes hebben zich gevormd en worden gescheiden door het amnion. De ectoplacentale kegel dient als de belangrijkste bloedtoevoer en verschijnt als een lichtpuntje in de echografie. De AC is het meest distal van de ectoplacentale kegel. (E) Ideale ACs lijken groter dan de exocelomische holte, terwijl middelgrote holtes kleiner lijken (F). Als er geen gaatjes zichtbaar zijn (G), betekent dit dat het embryo is geresorbeerd of nog niet E7.5 heeft bereikt. Schaalstaven = 1 mm. Afkortingen: A = Amnion; AC = vruchtwaterholte; ExC = Exocelomische Holte; EC = Ectoplacentale kegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Dag van injectie: bereid de BSL2-bank voor op een operatie
- Lijm een stuk elastisch membraan op de ronde, centrale opening van een in de handel verkrijgbare, aangepaste petrischaal. Zorg ervoor dat het membraan goed is bevestigd aan de petrischaal om lekkage te voorkomen.
OPMERKING: Als de schaal lek raakt of niet goed is gelijmd, kunnen de randen van het elastische membraan verder worden vastgezet met ducttape. - Maak een 1-1,5 cm lange incisie in het midden van het elastische membraan.
- Schakel het ultrageluidsapparaat, de BSL2-bank, de verwarmingsplaat, de O2-voeding voor de isofluraanpomp en de glazen kraalsterilisator (ingesteld op 300 °C) in.
- Plaats in de BSL2-bank een lege afvalzak (vastgeplakt aan de binnenmuur voor gemakkelijke toegang); steriel verpakte wattenstaafjes (gebruik een nieuwe voor elke operatie / elke vrouw); chirurgische hulpmiddelen (schaar, pincet, clips, hechting) en chirurgische tape; een volle fles fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op kamertemperatuur, een lege fles voor afvalinzameling en een pipet van 25 ml; een petrischaal met elastisch membraan voor chirurgie; het deksel van de petrischaal met een stuk parafilm van 2 x 2-3 x 3 cm dat met een druppel water aan het deksel is bevestigd; modelleerklei: 4 grotere ballen of kubussen (~ 3 x 3 x 3 cm3) en een cilindrisch stuk (~ 4 x 1 cm); een spuit met pijnstillend middel (bijv. buprenorfine, 0,05-0,1 mg/kg lichaamsgewicht) en ooggelNOOT: De ballen (of blokjes) van modelleerklei dienen als "voeten" of standaards/houders voor de petrischaal zodra de schaal bovenop de buik van het vrouwtje is geplaatst. Het cilindrische stuk klei zet de embryo's in de schaal vast. Als er meer dan één oplossing wordt geïnjecteerd of als de naald tijdens injecties moet worden bijgevuld, kan hetzelfde stuk parafilm worden gebruikt als oplossingen uit elkaar kunnen worden geplaatst.
6. Naald laden
- Veeg overtollige minerale olie af met tissuepapier voor een betere grip.
OPMERKING: Reinig altijd uit de buurt van de punt om schade of letsel te voorkomen. - Zorg ervoor dat alle componenten (één afdichtende O-ring, één afstandhouder en één pakking aan de voorkant die zich onder de spantang bevindt, figuur 3A) in de juiste richting zijn geïnstalleerd (figuur 3B, spantang verwijderd voor visualisatie) om de capillaire naald op zijn plaats te houden en een luchtdichte verbinding te creëren, waardoor bellenvorming wordt vermeden bij het opschuiven of intrekken van de metalen zuiger in de naald.
- Zorg ervoor dat de metalen zuiger van de nanoinjector volledig is ingetrokken. Controleer dit door op Fill te drukken en wacht op een dubbele pieptoon die aangeeft dat de zuiger volledig is ingetrokken.
- Met de spantang bevestigd maar iets losgemaakt (45-90 graden losgeschroefd), schuift u de glazen naald op de metalen zuiger en duwt u de capillaire naald samen met de metalen zuiger door de voorste pakking totdat deze de afstandhouder bereikt (figuur 3C, D, spantang verwijderd voor visualisatie).
OPMERKING: Enige weerstand treedt op wanneer de zuiger door de pakking gaat en neemt af wanneer deze de afstandhouder bereikt. Zorg ervoor dat de capillaire naald stevig in de afstandhouder is gestoken om een luchtdichte verbinding te maken (figuur 3D). - Zet de naald vast door de spantang van de nanoinjector vast te draaien (schroef deze stevig terug).
OPMERKING: Niet te strak aandraaien, omdat dit de naald kan verpletteren. - Druk op Leeg om de zuiger in de naald te duwen en de olie uit de naaldpunt te verwijderen. Als de glazen naald beweegt, trekt u de zuiger in, verwijdert u de naald en laadt u deze opnieuw. Als dit ertoe leidt dat er luchtbellen ontstaan, verwijder dan de naald en vul deze opnieuw met minerale olie.
OPMERKING: Een goed beveiligde naald mag niet bewegen met de zuiger. - Plaats een druppel van het virus (~ 6 μL) of een andere injectieoplossing op een stuk parafilm1 (figuur 3E; Evans blauwe kleurstof wordt gebruikt voor visualisatiedoeleinden).
OPMERKING: Het maximale volume van de nanoinjector is ~5 μL. - Druk op Fill om een luchtbel te creëren die als scheidingswand tussen de olie en de oplossing dient (figuur 3F).
OPMERKING: Dit dient ook als een positioneringsmarker bij het vullen of legen van de naald. - Laat de naald zakken, dompel de punt onder in de oplossing en druk op Fill (figuur 3F,G).
- Let op het vloeistofniveau terwijl de oplossing na de luchtbel wordt geladen. Druk op Leeg om de klomp te verdrijven en herlaad door op Fill te drukken als de luchtbel langwerpig wordt zonder dat de vloeistof de naald binnendringt. Als dit het probleem niet oplost, vervang dan de naald.
- Wanneer de naald volledig is geladen (figuur 3H), tilt u de naald op in het z-vlak en zuigt u een klein volume lucht aan de punt aan om verdamping van de oplossing aan de punt van de naald en verstopping van de naald te voorkomen.
- Draai de nanoinjector met de bevestigde naald weg van de operator, naar de achterkant van de bank, om onopzettelijke schade of letsel te voorkomen.
Figuur 3: De naald bevestigen aan de nanoinjector en het laden van de oplossing. (A) Uitgangspositie voordat de naald op de nanoinjector wordt gemonteerd: metalen plunjer volledig ingetrokken en spantang bevestigd. (B) Onder de spantang worden alle drie de componenten voor het vasthouden en vastzetten van de naald in de juiste volgorde weergegeven (van links naar rechts): afdichtende O-ring (dun en zwart), afstandhouder (wit), O-ring (zwart) met groot gat (waar de naald doorheen moet). Om een luchtdichte verbinding te garanderen, wordt de glazen naald over de metalen zuiger (C) geschoven en door de opening van de voorste O-ring geduwd totdat deze de afstandhouder (D) bereikt. (E-H) Laden van de oplossing in de naald. (E) Eén druppel oplossing wordt op een stuk parafilm op een plaatdeksel geplaatst. (F) Creëer een luchtbel door op Fill te drukken voordat de oplossing wordt geladen en dompel de naaldpunt onder in de oplossing. (G) Oplossing wordt in de naald geladen. (H) Oplossing wordt in de naald geladen. OPMERKING: De spantang is verwijderd in (B-D) voor visualisatie, maar moet tijdens experimenten bevestigd blijven. De laatste stap van het vastzetten van de naald is het aanspannen van de spantang. Evans blauwe kleurstof wordt gebruikt voor visualisatie in E-H. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Injecties
OPMERKING: Alle instrumenten die bij deze procedure worden gebruikt, worden vóór de operatie en tussen elke muis gesteriliseerd.
- Verdoof het eerste vrouwtje met holtes van ideale grootte (zie rubriek 4).
- Plaats en fixeer het vrouwtje op de tafel, zoals beschreven in stap 3.1-3.6.
- Breng ooggel aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en injecteer pijnstiller subcutaan.
OPMERKING: Aanbevolen pijnstillers: Buprenorfine (0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht) of Flunixin (2,5 mg / kg) of vergelijkbaar in overeenstemming met de lokale dierenwelzijnsvoorschriften. Multimodale perioperatieve analgesie wordt gehandhaafd met geïnjecteerde analgetica en isofluraan. - Bereid aseptisch de onderbuik voor door af te vegen met een doek gedrenkt in 0,5 mg / ml chloorhexidine-oplossing (of vergelijkbaar) en droog de huid. Gebruik een chirurgische schaar om een 1,5-2,0 cm verticale midline huidincisie in de onderbuik te maken.
OPMERKING: Bereid het chirurgische gebied voor volgens lokaal goedgekeurde desinfectieroutines. - Til de huid voorzichtig op en bevrijd de huid van de onderliggende spierlaag, ongeveer 1 cm rond het incisiepunt, om het hechten na de operatie te vergemakkelijken.
- Maak een 1 cm verticale middellijnincisie in de spierlaag.
- Til met een tang de ene kant van de huid- en spierlaag op en zoek met het andere paar naar de baarmoederhoorns.
OPMERKING: De deciduas zijn gerangschikt als kralen aan een ketting, terwijl de darm één lange, doorlopende buis is (figuur 4A). - Trek met een tang voorzichtig beide baarmoederhoorns uit de buik. Houd het weefsel tussen embryo's; knijp ze niet direct (figuur 4B).
OPMERKING: De baarmoeder is bevestigd aan het lichaam bij de baarmoederhals en de twee eierstokken / eileiders zijn bevestigd via ligamenten. Trek/maak de baarmoeder niet los van deze ankerpunten. - Tel en noteer het aantal embryo's aan de linker- en rechterkant.
- Nummer de embryo's van de eierstok tot de baarmoederhals of van de baarmoederhals tot de eierstok.
OPMERKING: Dit is vooral belangrijk als geïnjecteerde embryo's in embryonale stadia worden verzameld. - Duw met een vochtig wattenstaafje alle embryo's voorzichtig terug in de buikholte, behalve de eerste drie die moeten worden geïnjecteerd.
- Plaats een druppel PBS op het elastiek in de petrischaal en houd deze direct boven de embryo's.
- Steek een gesloten tang in de incisie van het elastiek en laat de tang los om de elastische incisie te openen, zodat de vloeistof op de embryo's valt.
OPMERKING: Dit zorgt voor rehydratatie van de embryo's en dat het elastische membraan zich hecht aan de natte huid van het vrouwtje, waardoor lekkage van PBS in de volgende stappen wordt voorkomen. - Trek een deel van de baarmoeder, overeenkomend met drie embryo's, door het elastiek met een tang en plaats voorzichtig de petrischaal op de buik van het vrouwtje.
- Pas met de tang en een vochtig wattenstaafje de positionering van de baarmoeder en het elastiek aan om ervoor te zorgen dat het elastiek op de huid van het vrouwtje wordt afgedicht om PBS-lekkage te voorkomen.
- Gebruik de vier kleivoeten om de petrischaal direct boven de buik vast te zetten en vast te maken, waardoor de druk op de vrouw en de gevoeligheid van beeldvorming voor de ademhaling en hartslag van de vrouw worden verminderd.
- Druk de modelleerkleicilinder rechts van de embryo's/baarmoeder naar beneden om de baarmoeder te fixeren (figuur 4C).
OPMERKING: Deze oriëntatie-instructie gaat ervan uit dat de naald zich links van het vrouwtje bevindt en dat de embryo's van de linker baarmoederhoorn van het vrouwtje worden blootgesteld. De zijkant van de baarmoeder (linker of rechter baarmoederhoorn) is cruciaal omdat de AC naar de naald kijkt (linkerhoorn; Figuur 4D) of kijkt naar de stabiliserende kleicilinder (rechterhoorn; Figuur 4E). - Om embryo's uit de rechter baarmoederhoorn te injecteren, plaatst u de kleicilinder aan de linkerkant van de embryo's (figuur 4F) en draait u de verwarmingstafel 180 ° (figuur 4G) om de juiste oriëntatie te bereiken. Als de naald in plaats daarvan kan worden verplaatst, pas deze dan zo nodig aan de relevante opstelling aan.
- Voeg PBS toe aan de petrischaal totdat de embryo's en baarmoeder bedekt zijn met PBS.
- Laat de ultrasone sonde in de PBS zakken en pas de muis / chirurgische tafel aan zodat het eerste embryo is uitgelijnd met de ultrasone sonde om de opname van de injecties te vergemakkelijken.
OPMERKING: "Eerste" verwijst naar de nummering van embryo's van de eierstok tot de baarmoederhals. - Scan alle drie de embryo's en inspecteer de AC's. Bepaal het injectievolume als volgt:
- Meet de diameter van de AC met het echoapparaat. Injecteer 69 nL als de AC-diameter ≤0,2 mm is; injecteer 2 x 69 nL (= 138 nL) als de AC-diameter >0,2 mm en ≤0,29 mm is; en injecteer 3 x 69 nL (= 207 nL) als de AC-diameter > 0,29 mm (figuur 4H).
OPMERKING: Eerdere experimenten hebben aangetoond dat tot 207 nL injectievolumes goed worden verdragen bij E7.515. Succesvolle injecties met minimale impact op de overleving worden bereikt wanneer de relatieve volumetoename van de AC niet hoger is dan 90%15. Variatie in AC-grootte tussen nestgenoten of muizenstammen komt vaak voor en kan verdere optimalisatie vereisen.
- Meet de diameter van de AC met het echoapparaat. Injecteer 69 nL als de AC-diameter ≤0,2 mm is; injecteer 2 x 69 nL (= 138 nL) als de AC-diameter >0,2 mm en ≤0,29 mm is; en injecteer 3 x 69 nL (= 207 nL) als de AC-diameter > 0,29 mm (figuur 4H).
- Stel de injectievolumes in met de injectieregelaar.
- Stel de injectiesnelheid in op langzaam met een injectiesnelheid van 23 nL/s.
OPMERKING: Verschillende apparatuurmodellen kunnen resulteren in verschillende injectiekrachten. - Laat de naald in de PBS zakken met behulp van de hoofdwielen op het railsysteem (x- en z-vlakken, figuur 4I) en druk op Leeg op de nanoinjectorcontroller totdat de vloeistof de punt van de naald bereikt.
OPMERKING: Als de naald verstopt is, kan het drukken op Leeg de verstopping oplossen en/of de verstopping verdrijven. - Til de naald uit de PBS en druk op Injecteren. Controleer of een druppel van het geschatte gewenste volume is ontladen.
- Laat de naald in de PBS zakken en lijn deze uit met de ultrasone sonde en het embryo door de nanoinjector te bewegen met het y-plane wiel op de micromanipulator (figuur 4J).
OPMERKING: De punt van de naald is perfect uitgelijnd wanneer deze als een lichtpuntje op het echografiebeeld verschijnt (figuur 4K, L). De naald kan in alle drie de richtingsvlakken worden bewogen met de micromanipulator. - Pas de naaldhoek aan met het injectiehoekwiel om een bijna loodrechte injectiehoek ten opzichte van de baarmoederwand te garanderen. Steek de naald in één beweging in de ac met behulp van het injectiewiel op de micromanipulator (figuur 4J-M). Houd de helderheid van de naaldpunt in de gaten. Als de punt van de naald uit het echografiebeeld verdwijnt, beweegt u de ultrasone sonde naar voren of naar achteren om de naald weer scherp te stellen.
OPMERKING: Zodra de naald zich in de AC bevindt, kunnen kleine wijzigingen in de positie en focus van de naald worden aangebracht zonder het embryo te schaden (aanpassingen binnen ~ 0,3 mm). Pas de positie van de naald niet meer aan dan dit. - Druk op Injecteren (voor 207 nL, stel het volume in op 69 nL en injecteer drie keer). Wacht na injectie nog eens 5-10 s voordat u de naald in één zachte beweging intrekt.
Figuur 4: Optimale grootte en oriëntatie van de vruchtwaterholte voor succesvolle injecties. (A) Baarmoederhoorn met meerdere E7,5-deciduas, in de vorm van een reeks bollen (onder) in vergelijking met dikke darm (boven). (B) Grijp baarmoederweefsel (witte stippellijnen) tussen deciduas. Vermijd het knijpen van de deciduas (witte pijlpunten) direct met een tang, omdat deciduas en zich ontwikkelende embryo's in dit vroege stadium kwetsbaar zijn en vatbaar voor resorptie bij overmatige externe kracht. (C) Vrouw in rugligging met deciduas blootgesteld in een petrischaal gevuld met PBS en gemonteerd op vier voet modelleerklei. De deciduas worden gestabiliseerd door een extra stuk modelleerklei, in de vorm van een cilinder. (D, E) Oriëntatie van de AC wordt beïnvloed door de zijkant van de baarmoederhoorn die wordt blootgesteld. Als deciduas van de linker baarmoederhoorn worden gebruikt, zal de AC weg van de kleistabilisator kijken en gemakkelijk toegankelijk zijn voor de naald aan de linkerkant (D). Als echter de rechter baarmoederhoorn wordt gebruikt, zal de ectoplacentale kegel in plaats daarvan naar de naald gericht zijn, waardoor het moeilijker wordt om toegang te krijgen tot de AC (E). Daarom wordt bij het injecteren in de rechter baarmoederhoorn de kleistabilisator naar de naaldgerichte kant (F) geplaatst en wordt de hele verwarmingstafel 180 ° (G) gedraaid. (H) Aanbevolen injectievolumes volgens AC-maten. Over het algemeen kunnen holtes met een diameter ≤ 0,2 mm worden geïnjecteerd met een maximum van 69 nL. Diameters > 0,2 mm en ≤ 0,29 mm verdragen volumes tot 2 x 69 nL (138 nL) en holtes > 0,29 mm kunnen worden geïnjecteerd met 3 x 69 nL (207 nL). Schaalstaven = 1 mm. (I, J) Nanoinjector is bevestigd aan het railsysteem en kan in x- en/of z-vlakken worden verplaatst. De hoek van de naald kan worden aangepast met het injectiehoekwiel . (K, L) De punt van de naald (witte pijlpunt) is uitgelijnd met de AC wanneer deze het helderst lijkt in de echografie (L). (M) Echografie afbeelding van het injectieproces, waarbij de naaldpunt zich in de AC bevindt en goed is uitgelijnd (witte pijlpunt). Afkortingen: A = Amnion; AC = vruchtwaterholte; ExC = Exocelomische Holte; EC = Ectoplacentale kegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verplaats het stadium naar het volgende embryo en herhaal stap 7.22-7.26 voor de andere twee embryo's als ze geschikte AC-maten hebben.
- Til de ultrasone sonde en naald uit de PBS met behulp van de micromanipulator. Draai de naald weg van de operator om schade en letsel te voorkomen.
- Richt met een tang de1e en2e embryo's terug in de buik van het vrouwtje door ze voorzichtig door het elastiek te duwen. Pak voorzichtig het weefsel naast het3e embryo vast en trek de baarmoeder naar het bovenste uiteinde van de elastische incisie. Trek de4e-6e embryo's voorzichtig met een tang omhoog en laat het3e embryo opnieuw in de buik komen.
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd zonder de PBS te vervangen of de petrischaal te verwijderen. - Herhaal indien nodig totdat alle embryo's met optimale AC's zijn geïnjecteerd of de tijdslimiet is bereikt.
- Duw de embryo's/baarmoeder voorzichtig terug in de buik van het vrouwtje.
- Adem de PBS op en verwijder de petrischaal. Als een virus is gebruikt, behandel het dan als besmettelijk afval.
- Naai de spierlaag samen met Vicryl (USP 6-0, naaldlengte 13 mm, 3/8 Cirkel) in eenvoudige continue of onderbroken hechtingen en sluit de huid met 1-2 clips (zie de Tabel van Materialen).
- Schakel de isofluraanpomp uit.
- Verwijder de operatietape en plaats het vrouwtje in buikligging (buik naar beneden) in een schone kooi op een verwarmingsplaat van 40 °C.
OPMERKING: Van het vrouwtje wordt verwacht dat het binnen 10 minuten weer bij bewustzijn komt en mobiel is. Zorg ervoor dat de procedure binnen 30 minuten is voltooid. De genetische achtergrond, leeftijd en het gewicht van de vrouw kunnen de gevoeligheid voor anesthesie beïnvloeden. Controleer de muizen tijdens de operatie op tekenen van langzame ademhaling (langzame ademhaling betekent dat de anesthesie te diep is) of beweging (anesthesie is te licht). Buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg lichaamsgewicht) of Flunixine (2,5 mg/kg) of vergelijkbaar in overeenstemming met de lokale dierenwelzijnsvoorschriften, kan indien nodig 8 uur na de eerste injectie worden verstrekt. - Als een ander vrouwtje moet worden geïnjecteerd, bereidt u het chirurgische gebied voor terwijl u het ontwaken van de eerste bewaakt.
- Veeg de chirurgische hulpmiddelen af met 70% ethanol om achtergebleven bloed of weefsel te verwijderen en steriliseer ze gedurende 10 s in de voorverwarmde glazen kraalsterilisator. Gooi de wattenstaafjes en het gebruikte tissuepapier weg. Veeg de petrischaal en kleistukjes droog met tissuepapier.
- Herhaal stap 7.1-7.35 totdat alle vrouwtjes zijn geïnjecteerd.
- Leeg en gooi de naald weg.
- Als er nog een virus of injectieoplossing in de naald zit, drukt u op Leeg op de nanoinjector en leegt u de inhoud van de naald op tissuepapier.
- Trek de metalen zuiger volledig in door op Fill te drukken totdat er een dubbele pieptoon van de controller is, wat aangeeft dat de zuiger volledig is ingetrokken.
- Maak de spantang los en schuif de naald van de metalen zuiger. Gooi de naald weg in de afvalcontainer van de scherpe naald.
- Maak de BSL-2 bank schoon.
- Als een virus werd gebruikt, besproei dan het hele chirurgische veld met ontsmettingsmiddel (zie de tabel met materialen). Veeg na 15 minuten het ontsmettingsmiddel af en reinig het hele operatieveld met 70% ethanol. Als er geen virus is gebruikt, reinig dan alle oppervlakken met 70% ethanol.
- Veeg alle resterende PBS van de ultrasone sonde af met droog, zacht en pluisvrij tissuepapier.
- Afval weggooien volgens bioveiligheidsrichtlijnen.
- Schakel het echoapparaat, de verwarmingstafel, de BSL2-bank en de O2-voeding uit.
Representative Results
Embryo's geïnjecteerd op E7.5 met hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 werden verzameld op E13.5 en onderzocht onder de fluorescerende dissectiemicroscoop (figuur 5A). Succesvolle transductie van de neurale plaat resulteert in embryo's met een sterke expressie van een fluorescerende reporter in de hersenen, voornamelijk en in andere van ectoderm afgeleide weefsels, bijvoorbeeld de huid (figuur 5A, B). Injectie van een te hoog volume (groter dan de hier aanbevolen volumes, bijvoorbeeld ≥500 nL) verhoogt de druk in de AC en kan resulteren in volledige resorptie (gegevens niet getoond) of neurale buisdefecten zoals exencefalie (figuur 5A). Succesvolle injecties bij E7.5 resulteren in uniforme transductie van de voorhersenen naar de achterhersenen (figuur 5C-J).
Lentivirale titers rond 2 × 1010 infectieuze eenheden (IFU) bereiken meer dan 95% targeting, terwijl titers van ~ 1 × 109 IFU 15% targeting efficiëntiebereiken 15. Daarnaast worden ook structuren geviseerd die voorheen moeilijk te richten waren met behulp van elektroporatie, zoals de plexus 17,18 van het vaat (figuur 5 E,F). De effectiviteit van transductie kan worden gewijzigd door de virale titer aan te passen die in de AC wordt afgeleverd. Injecties van lage titer resulteren in de transductie van eencellige klonen (figuur 5C, figuur 5E en figuur 5G, H), terwijl het gebruik van het high-titervirus bijna 100% van de hele hersenen transduceert (figuur 5D, figuur 5F, figuur 5H en figuur 5J ). Daarom kan NEPTUNE worden gebruikt voor klonale transductie, lineage tracing en genetische screeningsbenaderingen of het bestuderen van de wereldwijde effecten van genoverexpressie of downregulatie in de hele hersenen.
De oogontwikkeling van zoogdieren is het resultaat van goed georganiseerde communicatie tussen drie derivaten van het embryonale ectoderm: het neurale netvlies (NR) en retinaal pigmentepitheel (RPE) zijn afgeleid van het neuro-epitheel van de ventrale voorhersenen, terwijl het oppervlakte-ectoderm aanleiding geeft tot de toekomstige lens en het hoornvliesepitheel. Het centrale stroma en het achterste endotheel, de andere twee lagen van het hoornvlies, zijn echter afgeleid van neurale topcellen van het perioculaire mesenchym19,20. Coronale secties via E13.5 embryo's, geïnjecteerd op E7.5 met high-titer lentivirus toonden, vergelijkbaar met de hersenen, hoge en uniforme transductie van het neurale weefsel van het oog, evenals de lens, het hoornvlies en mesenchym (figuur 5K). Naarmate de neurulatie vordert, resulteren injecties bij E8.5 en E9.5 in de voortdurende targeting van de lens en het cornea-epitheel (figuur 5L en figuur 5N), terwijl transductie van de van neuro-ecctoderm afgeleide weefsels van het oog minder efficiënt is bij E8.5 (figuur 5L,M) of niet gericht op E9.5 (figuur 5N).
Terwijl de meeste virale deeltjes de blootgestelde weefsels infecteren bij injectie, transduceren sommige deeltjes niet-ectodermale weefsels die zich later ontwikkelen (figuur 6A). Speekselklieren en kanalen ontwikkelen zich rond E11.5 uit het orale epitheel21 en zijn gericht op NEPTUNUS (figuur 6B). Na injecties op E9.5 is het linguale epitheel van de tong goed getransduceerd; het onderliggende mesenchym is echter negatief (figuur 6C; haakjes geven getransduceerde cellen aan; asterisken duiden op autofluorescentiesignaal en niet op getransduceerde cellen). Bovendien zijn er positieve clusters in het linguale epitheel, gescheiden door negatieve secties (figuur 6C, witte pijlpunten), wat transductie van het papillaoppervlak suggereert. Neurale crestcellen zijn beschreven in het onderliggende tongmesenchym en in het linguale epitheel, waar ze betrokken zijn bij de ontwikkeling van smaakpapillen en smaakpapillen22. Inderdaad, injecties op E7.5 resulteren in wijdverspreide transductie van het tong mesenchym bij E13.5 (Figuur 6D), wat suggereert dat vroege injecties zich richten op neurale crestcellen, wat bijdraagt aan mesenchym in de tong.
Bij gewervelde dieren zijn de dorsale wortelganglia (DRG's) een centraal onderdeel van het perifere zenuwstelsel (PNS), omdat alle somatosensorische input uit de periferie van het lichaam (temperatuur, pijn, druk) wordt overgedragen aan de hersenen via activering van de DRG-neuronen23. Zowel neuronen als gliacellen van de DRG zijn afgeleid van stamneuraalkamcellen24. Lentivirale injectie, waarbij de alomtegenwoordige hPGK-promotor de expressie van de fluorescerende reporter regelt, leidt tot wijdverspreide targeting van het centrale en perifere zenuwstelsel (figuur 7A), waarbij zowel neuronen als voorlopers in het ruggenmerg worden getransduceerd (figuur 7B), evenals de DRG (figuur 7C). Het gebruik van een MiniPromoter voor doublecortin25 maakt het mogelijk om GFP-expressie te beperken tot alleen neuronen (15 en Figuur 7D, E).
Figuur 5: Hoge efficiëntie of klonale transductie met NEPTUNUS. (A) E13.5 embryo's onder een dissectiemicroscoop verlicht met standaardverlichting (linkerpaneel) en dezelfde embryo's verlicht voor GFP (rechterpaneel). Ongeïnjecteerd embryo helemaal links, succesvol geïnjecteerd embryo uiterst rechts, wat een positief signaal in de hersenen oplevert (meest rechtse embryo). Exencefalisch embryo als gevolg van overtollig volume geïnjecteerd (middelste embryo). (B) Huid- en hersenfocus met E7.5-injectie. Schaalbalk = 50 μm. (C, D) E13.5 confocale beelden van voorhersenen met lage klonale transductie (C) of hoogrenderende transductie (D). (C, E, G, I) Klonale transductie van verschillende regio's in de hersenen. (D, F, H, J) Hoogrenderende transductie van verschillende regio's in de hersenen. Schaalstaven = 200 μm. Verschillende transductie-werkzaamheid is representatief voor andere gebieden van het CZS. (E, F) Choroid Plexus targeting, clonally (E) of met een hoge efficiëntie (F). Schaalstaven = 200 μm. (G, H) Klonale targeting (G) en hoogrenderende (H) targeting van achterhersenen, vergroot in (I, J). Schaalstaven = 200 μm. (K) GFP-reporterexpressie in het oog bij E13,5 na injectie in utero bij E7,5 (L, M) GFP-reporterexpressie in het oog op E15,5 na injectie in utero bij E8,5 (L), in dozen vergroot in (M) of bij E9,5 (N). Autofluorescente bloedvaten zijn gemarkeerd met witte sterren. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: NEPTUNE = neural plate targueeting with in utero nano-injection; C = Hoornvlies; LE = Lens Epitheel; LF = Lensvezels; M = Mesenchym; NR = Neuraal Netvlies; ON = Oogzenuw; RPE = Retinaal Pigment Epitheel; GFP = groen fluorescerend eiwit; CZS = centraal zenuwstelsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: In utero transductie van niet-neurale weefsels. (A) Confocale afbeelding van E15.5 mondholte. Embryo werd geïnjecteerd met fluorescerend reporter lentivirus op E9,5. Schaalbalk = 200 μm. (B, C) (B) Vergroting van het inzetpaneel; speekselkanaalepitheel getransduceerd met virus. (C) Vergroting van het inzetpaneel; dorsaal linguaal epitheel getransduceerd met GFP reporter virus (witte beugel). Het onderliggende mesenchym afgeleid van neurale crest-cellen is negatief. Witte pijlpunten duiden op papillen met negatieve neurale topcellen omgeven door virus-getransduceerde epitheelcellen (autofluorescente bloedcellen / bloedvaten zijn gemarkeerd met witte sterren). Schaalstaven = 50 μm. (D) Schematisch en confocaal beeld van E13,5 tong mesenchym na injecties met fluorescerend reportervirus op E7,5. Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: D = Dorsal; M = Mesenchym; N = Nasofarynx; SLD = Sublinguaal kanaal; SMD = Submandibulair kanaal; T = Tong; V = Ventraal; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Transductie van neurale crest-afgeleide dorsale wortel ganglioncellen. (A) NEPTUNE targeting op E7.5 maakt targeting van zowel CZS als PNS mogelijk. (B) Confocale afbeelding van E13.5 ruggenmerg en DRG's geïnjecteerd met hPGK-H2B-GFP reporter lentivirus op E7.5 toont transductie van zowel SOX2+ neurale voorlopers als NeuN+ neuronen. Schaalbalk = 100 μm. (C) Boxed gebied van B met de DRG met GFP-expressie in SOX2+ (witte pijlen) en NeuN+ (witte pijlpunten) celpopulaties. Schaalbalk = 20 μm. (D) Confocale afbeelding van E13,5 ruggenmerg en DRG geïnjecteerd met DCX-H2B-GFP lentivirus op E7,5, alleen gericht op DCX+ cellen. Schaalbalk = 100 μm. (E) Boxed gebied van D met DRG met GFP-expressie beperkt tot DCX+ neuronen (witte pijlpunten). DCX-cellen zijn negatief voor GFP (witte pijlen). Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: NEPTUNE = neural plate targueeting with in utero nano-injection; CZS = centraal zenuwstelsel; PNS = perifeer zenuwstelsel; DRG's = dorsale wortel ganglia; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Er zijn verschillende stappen in dit protocol die de embryonale overleving, de kwaliteit van de injecties en de uitlezing beïnvloeden. De zwangerschapsduur van embryo's wordt gedefinieerd als E0,5 's middags op de dag van de vaginale plug na een nachtelijke paring. Het uitvoeren van de echografie voor zwangerschap op E6.5 in de late namiddag / avond zorgt ervoor dat de embryo's voldoende ontwikkeld zijn om door echografie te worden geïdentificeerd. De controle (1) maakt het mogelijk om vooraf te screenen hoeveel plug-positieve muizen daadwerkelijk zwanger zijn, (2) zorgt ervoor dat er geen virus onnodig wordt ontdooid en verspild in het geval dat plug-positieve muizen niet zwanger zijn, en (3) vermindert onnodige interventies op muizen (vermijdt chirurgie bij niet-zwangere vrouwen).
Bij E7.5 zijn embryo's gevoelig voor externe krachten en moeten ze met zorg worden behandeld. Het trekken aan de baarmoederhoorns of het knijpen in de deciduas kan bijvoorbeeld leiden tot embryoresorptie. Het baarmoederweefsel moet altijd vochtig worden gehouden wanneer het zich buiten de vrouwelijke buik bevindt om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. De meerderheid van de deciduas moet in de vrouwelijke buik blijven, met slechts 3-4 blootgesteld voor injecties. Naaldscherpte is een andere cruciale determinant voor succesvolle injecties. Stompe of gebroken naaldpunten resulteren in herhaalde prikken van deciduas of compressie tegen de modelleerklei voordat de AC wordt binnengegaan, wat de resorptiesnelheid kan verhogen. Daarom moeten goed gemalen en scherpe naalden altijd veilig worden opgeslagen en vervangen na maximaal 2 vrouwtjes.
Dit protocol beschrijft hoe de neurale plaat te richten met één enkele injectie van lentivirus. Bovendien laat het zien hoe de transductie-efficiëntie kan worden aangepast van eencellige klonen naar de hele hersenen. Andere niet-neurale weefsels, waaronder de huid en het orale epitheel, zijn echter ook gericht. Bovendien worden alle celtypen (voorlopers en gedifferentieerde cellen) getransduceerd, waardoor deze aanpak efficiënt maar niet-specifiek is. Het gebruik van MiniPromoters in het virale construct leidt tot de specifieke expressie van het transgen in neuronen of astrocyten15. Dit heeft het voordeel dat het gebruik van speciale transgene Cre-dieren wordt vermeden en vermindert daarom de hoeveelheid arbeid (stamonderhoud en genotypering) en kosten.
De beperkingen van NEPTUNE omvatten de technische moeilijkheid, uitdagingen bij het verkrijgen van zwangere vrouwen in een voorspelbaar en consistent tempo, en de kosten van het verwerven van gespecialiseerde instrumentatie. Bovendien kan niet-selectieve targeting van cellen door lentivirus worden gezien als zowel een voordeel als een beperking van de techniek. Injectie van grotere volumes in de AC resulteert in exencefalie13, hoewel hersenmisvormingen en exencefalie worden vermeden met de hier beschreven volumes15. Een negatieve impact op de ontwikkeling van de hersenen is dus een risico met in utero nano-injecties die zorgvuldig moeten worden vermeden door het injecteren van de juiste volumes aangepast aan het embryonale stadium en de AC-grootte.
Toekomstige aanpassingen van de techniek kunnen zich richten op viraal tropisme. Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) hebben verschillende serotypen, waarvan is aangetoond dat ze zich robuust richten op verschillende celtypen in het CZS17,26. AAV's integreren echter niet in het genoom van de gastheercel en kunnen daarom verloren gaan in cellen met een hoge delingssnelheid. Hoewel er verschillende manieren zijn om de specificiteit van NEPTUNE te vergroten, zijn transgene dieren nog steeds de gouden standaard als het gaat om genmanipulatie in vivo. Cas9-muizen en sgRNA-coderend lentivirus zijn gebruikt voor genetische screening in de embryonale epidermis27 en kunnen ook worden aangepast aan het zich ontwikkelende CZS.
Injecties in de AC op E7.5 richten zich efficiënt op cellen van het neuro-elektro-emtrofme vóór de start van de neurulatie en richten zich efficiënter op de zich ontwikkelende hersenen dan bij utero-elektroporatie . Dit maakt de studie mogelijk van genetische signalen die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van de hersenen vanaf een eerder tijdstip. In tegenstelling tot klassieke genetische muismodellen biedt NEPTUNE een flexibele aanpak om functionele genanalyse uit te voeren. Fenotypen na overexpressie of gendeletie kunnen binnen dagen tot weken worden bestudeerd in vergelijking met maanden of jaren. Injecties van meerdere virale constructies maken de manipulatie van verschillende genen binnen één embryo mogelijk en voorkomen de generatie van dubbele of drievoudige knock-out dieren. Daarom bespaart NEPTUNE niet alleen tijd, maar kan het ook het aantal dieren dat in onderzoek wordt gebruikt verminderen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Bettina Semsch en Jia Sun (Infinigene) voor de deskundige verzorging van muizen; Florian Salomons en Göran Månsson van Biomedicum Imaging Core (BIC) voor hulp bij beeldacquisitie en consultatie. Financiering: We bedanken de volgende financiers voor hun steun aan dit project: de Zweedse onderzoeksraad, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID-financiering en SFO StratNeuro-financiering, het Center of Innovative Medicine), The Ollie and Elof Ericssons Foundation, de Tornspiran Foundation, de Jeansssons Foundation, Sven en Ebba-Christina Hagbergs Prize en research Grant, Knut en Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik en Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation en de Swedish Foundations Starting Grant to ERA. Figuur 4D,E zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD Bioscience | 309628 | |
| 27 G Needle | BD Bioscience | 300635 | |
| 3.5 inches capillaries | Drummond Scientific | 3000203G/X | Were used to pull in house needles |
| 70 MHz MS Series transducer | Visual Sonics | MS700 | |
| Aquasonic clear ultrasound gel | Parker Laboratories | Mar-50 | |
| Autoclip Applier 9 mm | Angthos | 12020-09 | |
| CD1 mice | Charles River, Germany | Crl:CD1(ICR) | Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old |
| Cotton Swab | OneMed Sverige AB | 120788 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Dressing forceps delicate straight 13 cm | Agnthos | 08-032-130 | |
| EG-400 Narishige Micropipette Grinder | Narishige | NA | |
| EZ clips 9 mm | Angthos | 59027 | clips |
| Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm | Agnthos | 307-336-090 | |
| Isofluorane | Baxter Medical AB | EAN: 50085412586613 | Purchased from Swedish Pharmacy |
| Kimwipes | Kimberly Clarke | 7557 | |
| Membrane Tape | Visual Sonics | SA-11053 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Modeling Clay | Sense AB | 10209 | |
| Mouse Handling Table | Visual Sonics | 50249 | |
| Nanoject II Auto Injector Kit | Drummond | 3-000-205A | |
| Parafilm | Bemis | HS234526C | |
| Petri dish with central opening (low wall) | Visual Sonics | SA-11620 | |
| Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Rely+On Virkon | DuPont | 130000132037 | disinfectant |
| Silicone membrane | Visual Sonics | SA-11054 | |
| Steri 250, hot bead sterilizer | Angthos | 31100 | |
| Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m) | Medicarrier | 67034 | |
| Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System | Visual Sonics | VS-12055 | |
| Vevo Imaging Station 2 | Visual Sonics | VS-11983 | |
| Vevo2100 | Visual Sonics | VS-20047 | |
| Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament | Agnthos | J384H |
References
- Theiler, K. The House mouse. Atlas of embryonic development. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).
- Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).
- Taylor, J. C., et al. Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders. Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).
- Pizzo, L., et al. Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants. Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).
- Sakai, Y. Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure. The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).
- Schoenwolf, G. C. Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses. Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).
- Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate. Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).
- Slevin, J. C., et al. High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice. BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).
- Mangold, K., et al. Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE. Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).
- Kameneva, P., et al. Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin. Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).
- Heavner, W., Pevny, L. Eye development and retinogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop. Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).
- Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds. Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).
- Marmigère, F., Ernfors, P. Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).
- Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).
- Portales-Casamar, E., et al. A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
