Summary
يصف البروتوكول طريقة مباشرة لاستئصال كبد الفأر السليم للدراسات الأيضية من خلال تروية الوريد البابي.
Abstract
أصبحت الأمراض الأيضية مثل مرض السكري ، وما قبل السكري ، ومرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) شائعة بشكل متزايد. تسمح عمليات تروية الكبد خارج الجسم الحي بإجراء تحليل شامل لعملية التمثيل الغذائي للكبد باستخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، في الظروف الغذائية التي يمكن التحكم فيها بدقة. كما هو الحال في محاكاة سيليكو لا تزال وسيلة نظرية في المقام الأول لتقييم الإجراءات الهرمونية وآثار التدخل الصيدلاني، والكبد perfed لا تزال واحدة من أسرة الاختبار الأكثر قيمة لفهم التمثيل الغذائي الكبدي. نظرا لأن هذه الدراسات توجه الأفكار الأساسية في فسيولوجيا الكبد ، يجب أن تكون النتائج دقيقة وقابلة للتكرار. أكبر عامل في تكرار التروية الكبدية خارج الجسم الحي هو جودة الجراحة. لذلك ، أدخلنا طريقة منظمة ومبسطة لإجراء عمليات تروية كبد الفئران خارج الجسم الحي في سياق تجارب الرنين المغناطيسي النووي في الموقع . كما نصف تطبيقا فريدا ونناقش المشكلات الشائعة التي تمت مواجهتها في هذه الدراسات. الغرض العام هو توفير دليل غير معقد لتقنية قمنا بتحسينها على مدى عدة سنوات والتي نعتبرها المعيار الذهبي للحصول على نتائج قابلة للتكرار في عمليات استئصال الكبد والتروية في سياق تجارب الرنين المغناطيسي النووي في الموقع . المسافة إلى مركز المجال للمغناطيس وكذلك عدم إمكانية وصول الأنسجة إلى التدخل أثناء تجربة الرنين المغناطيسي النووي تجعل أساليبنا جديدة.
Introduction
تعتبر التروية خارج الجسم الحي حاسمة في دراسة التمثيل الغذائي الكبدي ، والتروية من خلال الوريد البابي هو المعيار لهذه الدراسات. من أجل دراسة التمثيل الغذائي الكبدي بمعزل عن الآخرين ، يجب استئصال الكبد من الجسم لتجنب المضاعفات الناشئة عن التمثيل الغذائي في الأعضاء الأخرى (أي التمثيل الغذائي للجسم كله) وممارسة السيطرة على توافر الهرمونات (الأنسولين ، الجلوكاجون ، إلخ). يمكن أن يكون هذا النهج ضروريا لفهم آثار أمراض مثل السكري و NAFLD و NASH على التمثيل الغذائي الكبدي وكذلك آليات عمل الدواء. هذه المقالة بمثابة دليل لاستئصال الكبد والتروية. لقد طورنا إجراء مبسطا لإجراء دراسات الكبد الأيضية هذه بدقة كافية وقابلية للتكرار. إذا لم يتم إجراء الجراحة بشكل صحيح ، فهناك تباين واضح في البيانات الأيضية التي تم الحصول عليها. نحن نصف طريقة منظمة لإجراء قسطرة الوريد البابي واستئصال الكبد في سياق الدراسات الأيضية في الموقع في مطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، كما هو موضح في الأدبيات1،2،3،4،5.
حاليا ، لا توجد أدبيات تصف تروية كبدية خارج الجسم الحي باستخدام عمود زجاجي داخل الرنين المغناطيسي النووي. كما لا يوجد فيديو أو منشور نصي يقدم مثالا واضحا على كيفية تنفيذ الإجراء مع كبد الفأر ، على وجه التحديد ، يوضح كيفية قسطرة الوريد البابي ، واستئصال الكبد ، ونقله ، وتعليقه على عمود زجاجي. نظرا لأن الفأر المعدل وراثيا يستخدم في كل مكان لدراسة استقلاب الكبد ، فهذا إجراء أساسي يستحق وصفا كاملا. جراحات تروية الكبد ليست جديدة ، ولكن هذه المقالة هي طريقة قياسية ذهبية مصحوبة بمقطع فيديو يوضح التميز التقني الموصوف في هذه الورقة لمساعدة جميع المهتمين بهذا الإجراء. من الأفضل تطبيق الطريقة المعروضة هنا على التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي للكشف عن وظيفة ودوران المستقلبات في نماذج الأمراض.
تستخدم هذه الطريقة عمودا زجاجيا مغطى بالماء يبلغ طوله 100 سم ، مما يسمح للكبد بالتعليق في الجزء السفلي من القنية المغلفة بواسطة النفخ داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. يتم استخدام الماء الساخن في السترة الزجاجية للتحكم في درجة حرارة العطر. يتم ضغط الأوكسجين ذو الطبقة الرقيقة بنسبة 95٪ / 5٪ O 2 / CO2 للتحكم في درجة الحموضة. باستخدام ثلاث مضخات منفصلة ، يتم ضبط ارتفاع عمود perfusate ، مما يوفر ضغطا ثابتا على الكبد. لا يتم التحكم في معدلات التدفق خارج نطاق تطبيق الضغط الثابت (الشكل 1). للتأكد من أن الكبد يعمل بشكل مناسب ، يتم أخذ قياسات الأكسجين جنبا إلى جنب مع معدلات التدفق. في أيدينا ، تؤدي هذه المجموعة من الشروط المسبقة إلى تجارب NMR قابلة للتكرار للغاية لتقييم وظيفة التمثيل الغذائي للكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم التعامل مع التجارب التي شملت الفئران وفقا للجنة جامعة فلوريدا المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (رقم البروتوكول #201909320). كانت سلالة الماوس المستخدمة هي C57BL/6J. جميع الفئران كانت من الذكور. تنطبق هذه الطريقة بشكل عام على الدراسات التي تستخدم سلالات الماوس القياسية الأخرى أيضا. يتم إجراء هذه الجراحة على النحو الأمثل من قبل شخصين يعملان معا.
1. الإعداد الأولي
- تنصهر الأكباد مع الفوسات التي تحتوي على الإلكتروليتات كريبس-هينسليت 6 (25 ملليمتر NaHCO3 ، 112 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 4.7 ملم KCl ، 1.2 ملم لكل من MgSO 4 ، KH 2 PO4 ، و 0.5 ملم الصوديوم-EDTA ، 1.25 ملم كاكل 2) ، 6 مللاكتات الصوديوم ،0.6 ملليمتر بيروفات الصوديوم ، 0.2 ملم [U-13 C] بروبيونات الصوديوم ، 10٪ (v / v) D2 O ، و 0.63 مللي متر من الأحماض الدهنية المختلطة (التي تحتوي على حمض البالمتيك (22.1٪ من المجموع) ، وحمض البالميتوليك (5.2٪) ، وحامض دهني (2.7٪) ، وحمض الأوليك (27٪) ، وحمض اللينوليك (37.7٪) ، وحمض γ اللينولينيك (2.4٪) ، وحمض ديكوساهيكسانويك (2.8٪)) إلى جانب 2٪ (ث / v) ألبومين مصل البقر. اضبط الرقم الهيدروجيني النهائي للعطر على 7.3 باستخدام HCl (و NaOH ، إذا لزم الأمر).
2. إعداد ما قبل الجراحة
- قم بتجميع حقنتين سعة 1 مل بإبرة 23G يبلغ طولها 19.05 مم. املأ حقنة واحدة ب 0.01 مل من 1000 وحدة / مل من الهيبارين و 0.19 مل من محلول ملحي (0.9٪ (ث / v) كلوريد الصوديوم في الماء ؛ الجدول 1).
- املأ المحقنة الثانية ب 0.2 مل من ليدوكائين 2٪ و 0.6 مل من محلول ملحي بنسبة 0.9٪ (الجدول 1). في حقنة أخرى سعة 1 مل مع إبرة 27 جم 38.1 مم ، املأ بالعطر وحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
3. إعداد عمود العطر
- ضع الزجاجة الزجاجية التي تحتوي على 500 مل من العطر في الحمام المائي (الشكل 1B). قم بتشغيل الحمام المائي واضبط درجة الحرارة على ~ 42 درجة مئوية. تتيح درجة الحرارة المرتفعة في الحمام المائي الحفاظ على 37 درجة مئوية في عمود التروية.
- بمجرد أن يسخن الماء حتى 42 درجة مئوية ، قم بتشغيل المضختين لتدوير العطر من الزجاجة في جميع أنحاء جهاز الأكسجين الرقيق والعمود الزجاجي المغطى بالماء مقاس 100 سم (الشكل 1A-E).
- قم بتشغيل غاز الأكسجين (95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون) للضغط على جهاز الأكسجين7 (الشكل 1C). اضبط ارتفاع عمود البيرفوسات لتحقيق معدل تدفق يبلغ 8 مل / دقيقة مع توصيل القسطرة (انظر الخطوة 9 لقياس معدل التدفق)5،8،9.
ملاحظة: يشير معدل التدفق إلى المعدل الذي يتم به طرد البيرفوسات بواسطة الكبد.
4. تخدير الفأر
- دون معدات الوقاية الشخصية كما هو مطلوب من قبل بروتوكول IACUC وغيرها من إرشادات السلامة المناسبة.
ملاحظة: تم تحسين الخطوات التالية للفئران التي يتراوح عمرها بين 9 و 13 أسبوعا. - ضع الماوس في غرفة الايزوفلوران. حول غاز التوصيل إلى أكسجين 100٪ ، بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة ، والأيزوفلوران إلى 2٪ 10. انتظر حتى يتباطأ التنفس ويكون ثابتا.
ملاحظة: لكي يصل الماوس إلى مستوى جراحي مستقر ، كما يتضح من معدل التنفس البطيء والثابت وعدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم ، يمكن ضبط معدل تدفق الأكسجين إلى ~ 1.5 لتر / دقيقة إلى ~ 3 لتر / دقيقة وتركيز الأيزوفلوران من 1 - 3٪. يعتمد معدل توصيل الغاز الناقل وتركيز الأيزوفلوران على عمر الحيوان ووزنه وعوامل مثل الضوضاء والضوء. - تطهير البطن مع 70 ٪ من الكحول. إدارة الهيبارين من خلال حقن عميق تحت الجلد في طبقة الدهون في البطن (الشكل 2). ضع الماوس مرة أخرى في غرفة التخدير لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: الحلاقة غير مطلوبة لأن هذا الإجراء طرفي.
5. بضع القرنية
- انقل الفأر من غرفة التخدير إلى منصة الجراحة وضعه في وضع ضعيف (الشكل 3).
- ضع أنف الماوس في مخروط الأنف وقم بربط الكفوف لأسفل. احرص على عدم وضع أي ضغط على الرقبة قد يؤدي إلى الاختناق.
- إعطاء يدوكائين من خلال حقن تحت الجلد ثنائيا في منطقة القمة الحرقفية الأمامية11 (الشكل 3). قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم للتأكد من عدم وجود جميع ردود الفعل المؤلمة.
- إجراء بضع الاضطرابات الهضمية لفضح الأعضاء الداخلية (الشكل 4). قم بعمل شق بعرض 3 سم (عرض بطن الماوس بأكمله).
ملاحظة: سيتغير العرض مع عمر الماوس ونظامه الغذائي. - قم بتوسيع الشق باستخدام مرقئ يسحب الجر عن طريق تثبيت عملية الخناق (الشكل 4).
6. تعليب الوريد البابي
- استخدم قضيب ذو رأس قطني لتنظيف الأمعاء الدقيقة والغليظة التي تغطي الوريد البابي. ضع خياطة حريرية تحت قوس الوريد البابي القريب من الكبد (الشكل 4A).
- اعتمادا على البنية التشريحية ، ضع خياطة الحرير الثانية القريبة أو البعيدة من الوريد المساريقي السفلي البعيد عن الكبد (الشكل 4A)12,13. استخدم خياطة 2-0 لكلا الغرزتين.
- بمجرد أن تكون الغرز في مكانها ، قم بتقليب الوريد البابي باستخدام قسطرة 22G14 (الشكل 4B). عند إدخال القسطرة، حافظ على الشطبة مدببة لأعلى. أدخل الوريد البابي بزاوية لا تزيد عن 15 درجة.
- اربط الخيط الأول بعد نقرة القسطرة. بعد أن يتم تعليب الوريد البابي ، قم بتثبيت القسطرة 2-3 مم بعيدة عن فرع الوريد البابي باستخدام خياطة الحرير (الشكل 4B).
ملاحظة: يجب على المساعد لف الكتفين والمعصمين لمنع إزاحة القسطرة أو تمزق الوريد البابي. كل خياطة تتطلب عقدتين. - بعد ذلك ، قم بتأمين الجزء السفلي من القسطرة باستخدام الخياطة الثانية. بمساعدة المساعد الجراحي ، اربط عقدة مع الخيط لتثبيت القسطرة على الجزء البعيد من الوريد البابي والأنسجة المحيطة.
7. استئصال الكبد بعد بوابة الوريد القنية
- بعد تأمين القسطرة، أدخل حقنة سعة 1 مل بإبرة 27G يبلغ طولها 38.1 مم في القسطرة لتدفق فقاعات الدم والهواء.
ملاحظة: عادة ما يكون هناك تدفق عكسي للدم من القسطرة من الضغط. - استخدم أنبوب سيليكون O.D. مقاس 1 مم × 5 مم مع سدادة ثابتة لإقران عمود التروية (الشكل 1A) بالقسطرة مما يسمح بتدفق المخزن المؤقت إلى الكبد بمناسبة بداية التروية. ابدأ تشغيل مؤقت في هذه المرحلة للاحتفال ببداية التروية.
- تخفيف الضغط الوعائي المتزايد عن طريق إجراء شق ، باستخدام مقص ، في الوريد الأجوف السفلي.
- تأكد من تدفق العطر عبر الكبد من خلال ملاحظة التغير المتجانس في لون الكبد من الوردي / الأحمر إلى الأصفر الشاحب. بمجرد تأكيد التدفق ، قم باستئصال المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة والكلى اليمنى من الأنسجة المحيطة.
- بمساعدة المساعد الجراحي ، قم بمناورة الكبد حول تجويف البطن والصدر حيث يقوم الجراح بقطع الصفاق الجداري والأنسجة الصدرية لاستئصال الكبد
- أخيرا ، ارفع الكبد لأعلى واقطع الأنسجة الضامة المتبقية التي تثبت الكبد في مكانه باستخدام المقص. تعامل ببطء مع الكبد لسهولة الرؤية. قم بإزالة أي فرو يلتصق بالكبد عن طريق الشطف بالعطر قبل تغليفه داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي.
ملاحظة: في هذا الإجراء، تتم إزالة الكبد فقط. يتم ترك جميع الأعضاء الأخرى في جسم الحيوان. يمكن إزالة القناة الصفراوية بناء على بروتوكول التجربة. على الرغم من أنه بالنسبة لهذه التجربة ، فقد تم تركها في مكانها.
8. تعليق الكبد من العمود
- بمجرد أن يسلم الجراح الكبد والأنابيب إلى المساعد ، يقوم المساعد بفصل الأنبوب عن القسطرة والعمود.
- املأ القسطرة بالعطريات حتى يتم تشكيل الغضروف المفصلي في الجزء العلوي من القسطرة. قم بتوصيل القسطرة بالعمود حتى يعلق الكبد ويتلصص.
ملاحظة: توفر حبة البيرفوسات الموجودة على القسطرة حجما كافيا للكبد ليعمل حتى يتم توصيله. يتم تركيب القسطرة المتصلة بالكبد في أسفل العمود. - قم بربط أنبوب NMR مقاس 20 مم على العمود الزجاجي مقاس 100 سم لتغليف الكبد (الشكل 5). لتجنب التواء الكبد والوريد البابي ، قم بالمسمار ببطء على أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. في حالة حدوث التواء وتوقف التدفق ، قم بفك أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وإعادة ضبطه. هذا سوف يعالج الانسداد وسيعود التدفق.
- قم بفحص الكبد لمدة 30-60 دقيقة بناء على تفاصيل الدراسة.
ملاحظة: يعتمد الوقت على تجربة التروية. بالنسبة لهذه التجربة ، تم قياس معدل دوران التمثيل الغذائي في غضون 30 دقيقة. يمكن أن يستغرق تروية الكبد ما يصل إلى 10 دقائق للوصول إلى حالة مستقرة. يبدأ وقت الحالة المستقرة بمجرد قطع الوريد الأجوف السفلي وإنشاء التدفق الكبدي.
9. قياس التدفق
- ضع قارب وزن على ميزان تحميل علوي وصفر الرصيد. ضع الأنابيب من مضخة الأسطوانة التي تسحب العطر من الرنين المغناطيسي النووي إلى قارب الوزن وابدأ تشغيل المؤقت.
- وزن كتلة السائل المتراكمة على مدى 1 دقيقة مما يؤدي إلى معدل تدفق الكبد. ضع الأنبوب مرة أخرى في حاوية النفايات / التجميع.
10. قياس الأكسجين
ملاحظة: تم إعداد قياسات مقياس الأكسجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعةرقم 15.
- ضع القطب الذي يحتوي على 20 ميكرولتر من محلول مشبع KCl بنسبة 50٪ على القبة البلاتينية وضع خمس قطرات 10 ميكرولتر حول الحلقة البلاتينية السفلية للقطب الكهربائي.
- قم بإزالة المادة اللاصقة من ورق السجائر. ضع قطعة من غشاء البولي تترافلورو إيثيلين فوق ورق السجائر.
- ضع القطعتين فوق القطب الكهربائي. تناسب حلقة O صغيرة حول الجزء العلوي من القطب الكهربائي. قم بقص الورق لوضعه بشكل مسطح على الحلقة البلاتينية السفلية على القطب الكهربائي.
ملاحظة: بعض التراكم مقبول. من الضروري تغطية فضة القطب الكهربائي. - ضع الحلقة O الأكبر على القطب الكهربائي. قم بإقران القطب الكهربائي بغرفة الماء وشد القاعدة لتثبيت القطب الكهربائي في مكانه. قم بتشغيل الحمام المائي واتركه يسخن حتى 37 درجة مئوية.
- افتح برنامج مقياس الأكسجين. انقر على معايرة > المياه المشبعة بالهواء. اضبط سرعة التحريك على 75 ودرجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
- املأ قارورة سعة 50 مل في منتصف الطريق بالماء ورجها بقوة لمدة 2 دقيقة. هذا هو الماء المشبع بالهواء ، استخدمه كمعيار 100٪. املأ غرفة مقياس الأكسجين ب ~ 2 مل من الماء وضع السدادة المكونة من قطعتين.
- انقر فوق موافق على الشاشة واسمح للإشارة بالاستقراء. بمجرد وصول الإشارة إلى هضبة، انقر فوق موافق. تخلص من السائل في الغرفة وجففه بالمناديل الورقية.
- كرر الخطوات 10.6-10.7 ولكن مع 200 مللي متر كبريتيت الصوديوم (0٪ قياسي). انقر على حفظ المعايرة.
ملاحظة: لا حاجة إلى اهتزاز قوي لمعيار 0٪. - أثناء التروية ، استخدم حقنتين سعة 5 مل. حقنة واحدة لتدوير البيرفوسات (الأكسجين في) والثانية للفوسات efferent من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي (الأكسجين خارج).
- عند إعداد البيرفوسات لكل من القياسات الداخلة والخارجة ، ارسم 3-4 مل في كل مرة.
ملاحظة: يحتوي هذا العمود على أنابيب زجاجية للسماح بالوصول إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي لسحب العطر الذي تدفق عبر الكبد. - قم بقياس العطر المتداول ، أولا تماما مثل الماء في الخطوة 10.6 وتخلص منه في الخطوة 10.7. كرر نفس الخطوات للفوسات العطرية.
- قم بإجراء قياسات الأكسجين كل 10 دقائق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تقييم وظائف الكبد في المقام الأول من خلال استهلاك الأكسجين ومعدل التدفق. معدل التدفق من 4-8 مل / دقيقة واستهلاك الأكسجين من 1 ميكرومول / min.g نموذجي. وستختلف هذه التدابير تبعا لظروف تجريبية محددة واختلافات بيولوجية.
تعتمد الكمية الدقيقة من الأيزوفلوران المستخدمة على نوع نظام التخدير المستخدم وكذلك البيئة وعمر / وزن الماوس. أثناء الجراحة، لا يتغير الإيسوفلوران وغاز الولادة، على الرغم من أن بعض التغييرات قد تكون ضرورية اعتمادا على تفاصيل المنطقة الجراحية (على سبيل المثال، ضوضاء الخلفية)10. عندما يتم حقن الهيبارين بعمق تحت الجلد ، يمكن أن يتأخر بدء العمل لمدة تصل إلى 20-40 دقيقة. فترة انتظار مدتها 10 دقائق بعد إعطاء الهيبارين تضمن بدء العمل16. ليدوكائين لديه 2 دقيقة بداية الإجراء11.
عند إدخال القسطرة ، حافظ على الشطبة مدببة لأعلى ، وأدخل بزاوية لا تزيد عن 15 درجة من الوريد البابي. كل من الغرز لها عقدتان. يجب ربط الخيط الأول بعد نقرة القسطرة. إذا نجحت تعليب الوريد البابي ، فإن الكبد يبيض من التدفق. بينما يقوم الجراح باستئصال الكبد ، يقوم المساعد بمسح المحتويات التي تم استئصالها باستخدام قضيب ذو رأس قطني. لمنع تلوث الكبد ومنع النكات إلى الفصوص ، لا تقطع المعدة. لا تضع الكثير من التوتر على الوريد البابي أو الكبد عند الإمساك بالقسطرة لمنع إزاحة الوريد البابي أو تمزيقه.
يتطلب إعداد أجهزة التروية اهتماما واسعا بالتفاصيل (الشكل 1). حقن الهيبارين (الشكل 2) ضرورية للتجربة. إذا تخثر الدم ، فسوف يسد القسطرة التي يتم إدخالها في الوريد البابي ، مما يمنع التدفق. حقن ليدوكائين (الشكل 3) هو للمساعدة في إزالة حساسية المنطقة لتخفيف الألم. ويقدم الجدول 1 مخططا بسيطا لجرعات الهيبارين والليدوكائين ذي المحلول الملحي. يعد استئصال السلوت والخياطة (الشكل 4) ضروريين لنجاح قسطرة الوريد البابي ، واستئصال الكبد ، والنقل الناجح إلى جهاز التروية. يعد معدل التدفق وقياسات استهلاك الأكسجين أمرا حيويا لمراقبة صحة الكبد ووظيفته (الشكل 6). غالبا ما يكون هناك اختلاف طفيف في استهلاك O2 بين الكبد الذي يتم تغذيته والصيام ، والذي نعزوه إلى زيادة الطلب على الطاقة التي يفرضها تكوين الجلوكوز في الكبد الصائم.
الشكل 1. عمود التروية والمضخات. A. عمود زجاجي مغطى بالماء يبلغ طوله 100 سم يتدلى فيه الكبد في الأسفل. B. تقوم مضخة المياه بتدوير المياه عبر العمود الزجاجي وتسخين العطر. C. يتم ضغط الأكسجين الزجاجي ذو الطبقة الرقيقة مع 95٪ / 5٪ O2 / CO2 أكسجين العطر. د. تقوم المضخة الحاملة للكرة بتدوير البيرفوسات من الحمام المائي إلى جهاز الأكسجين ذي الطبقة الرقيقة والعمود الزجاجي. E. تقوم المضخة الحاملة للكرة بتدوير البيرفوسات التي يتم تسليمها في العمود من مضخة التسليم للحفاظ على أكسجة البيرفوسات والحفاظ على تدفق 8 مل / دقيقة F. تزيل المضخة الحاملة للكرات الفينت من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. ز. مقياس الوزن لوزن البيرفوسات من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي للحصول على معدل تدفق الكبد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. حقن الهيبارين. يتم إعطاء الحقن العميق تحت الجلد للهيبارين في الطبقة الدهنية السفلية للبطن من الماوس. من المهم عند التقاط الماوس ، سحب الجلد بإحكام للسماح للإبرة باختراق الجلد بسهولة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. حقن يدوكائين. يتم وضع الماوس في وضع ضعيف على المنصة الجراحية مع تسجيل الكفوف لأسفل والأنف في مخروط الأنف. يدار يدوكائين تحت الجلد في منطقة القمة الحرقفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. بضع القرنية وخياطة. يكشف بضع الاضطرابات الهضمية الأعضاء الداخلية ، ويسحب المرقئ الجر من خلال عملية الخناق للمساعدة في فتح الشق أكثر. يتم وضع غرزتين حول الوريد البابي ، ويتم إدخال القسطرة ، ويتم ربط الغرز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. تتم إزالة الكبد من الجسم مع القسطرة التي يتم توصيلها بعد ذلك بأنابيب السيليكون المتصلة بالعمود الزجاجي. يتم تعليق الكبد من العمود وتغليفه بواسطة أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. ثم يتم تثبيت أنبوب NMR 20 مم بعناية على العمود الذي يغلف الكبد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. استهلاك الأكسجين ومعدل التدفق. بيانات تمثيلية من مقارنة استهلاك الأكسجين الكبدي وقياسات معدل التدفق بين الكبد الذي يتم تغذيته والصيام. N = 3 وأشرطة الخطأ هي انحراف معياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الهيبارين 1000 وحدة / مل | محلول ملحي 0.9٪ | مجموع |
| 0.01 مل | 0.19 مل | 0.2 مل |
| يدوكائين 2٪ | محلول ملحي 0.9٪ | مجموع |
| 0.2 مل | 0.6 مل | 0.8 مل |
الجدول 1. جرعة الهيبارين ويدوكائين مع المالحة. يعرض الجدول تركيز الهيبارين والليدوكائين وجرعة كل دواء مع محلول ملحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الإجراء الجراحي صعب ويتطلب ممارسة واسعة النطاق لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. يجب تعديل الإيسوفلوران والغاز الناقل حسب الحاجة للحفاظ على صلاحية الحيوان من خلال أكبر قدر ممكن من الإجراء الجراحي. البيئة والوقت من اليوم والعمر والوزن والعديد من العوامل الأخرى ستؤثر على التخدير. يمكن أن يؤثر الوزن والنظام الغذائي وسلالة الفئران والعمر على الجراحة لأن تراكم الدهون يمكن أن يتداخل مع تصور الوريد البابي. عند تسجيل الكفوف لأسفل ، يجب توخي الحذر لعدم تطبيق أي ضغط على الرقبة قد يؤدي إلى الاختناق. علاوة على ذلك ، كلما كان الفأر أكثر بدانة كلما كان الخيط أكثر إحكاما ، يجب أن يكون حول القسطرة لمواجهة انخفاض معامل الاحتكاك بين القسطرة والوريد الناجم عن الدهون. بداية وقت عمل الهيبارين أمر ضروري لأن التعرض المفرط للأيزوفلوران ينتج عنه قطع أثرية في الأعضاء17. يتطلب إعطاء حقن الهيبارين والليدوكائين إبرة 23G بطول 19.05 مم ، مما يضمن عدم حدوث صدمة للأعضاء الداخلية أثناء الحقن. يجب أن تكون حلقة الخياطة فوق مستدق القسطرة ، أو أنها ستسد الوريد عند تشديدها. بمجرد إدخال القسطرة ، عادة ما يكون هناك تدفق عكسي للدم من القسطرة من الضغط ، وهي علامة إيجابية على الوضع الصحيح. يمكن سحب القسطرة لأعلى للتأكيد البصري على أن طرف القسطرة قد تجاوز بما فيه الكفاية الخياطة الأولى. سيضمن لف المعصمين والكتفين عدم انزلاق الخيط من الطرف المدبب عندما يربط المساعد الخياطة. عند نقل الكبد من أنبوب تروية السيليكون إلى العمود ، يتم ترك حبة من البيرفوسات فوق القسطرة. ستمنع حبة النفخ أي فقاعات هواء من دخول القسطرة والدخول إلى الكبد. يوفر الغضروف المفصلي للبيرفوسات الموجود أعلى القسطرة حجما كافيا للكبد ليعمل حتى يتم توصيله. لتجنب التواء الكبد والوريد البابي ، يتم تثبيت أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ببطء. بالإضافة إلى ذلك ، لا يتطلب نظام التروية المستخدم في هذه التجربة صمام ضغط. يتم الحفاظ على معدلات تدفق المضخات بحيث يحتوي عمود التروية الزجاجية على الفوسات على ارتفاع ~ 12 سم. يأخذ الكبد مخزن كريبس العازل عن طريق الجاذبية، مما يلغي أي فرق في الضغط بين المضختين دون أي تأثير على معدل تدفق الكبد. نظرا لأن الكبد يتم تشغيله من خلال الجاذبية ، يتم تعيين كمية العطر التي يتناولها الكبد من خلال النشاط البيولوجي الطبيعي للكبد. لم يتم جمع أي بيانات عن ضغط التروية لأن ضغط الوريد البابي غير قابل للقياس في هذا النظام.
الشق الأول من بضع الاضطرابات الهضمية ضحل لإنشاء فتحة ، والجروح اللاحقة أعمق لتجنب ضرب فصوص الكبد. الطول الإجمالي للشق لاستئصال السيلوتومي هو 3 سم للفئران من هذا العمر والحجم ولكن سوف تتغير بناء على الإجهاد والعمر والوزن. على الرغم من أن الدراسة الموصوفة تستخدم الفئران التي يتراوح عمرها بين 9 و 13 أسبوعا ، إلا أنه يمكن دراسة الفئران الأكبر سنا أو الأصغر سنا وكذلك الجرذان. يجب تغيير حجم أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وقسطرة الوريد البابي بناء على الحجم التشريحي للكبد والوريد البابي لدراسة القلق. إذا لم يكن الوريد البابي مستقيما، يمكن أن يساعد قضيب ذو رأس قطني في التلاعب بالوريد عند إدخال القسطرة. على الرغم من عدم إزالة القناة الصفراوية ، إذا كانت هناك حاجة تجريبية لغيابها ، فيمكن إزالة القناة باستخدام ملاقط دقيقة. سيؤدي التلاعب المفرط في الوريد البابي عند وضع الغرز إلى انقباض يجعل وضع القسطرة أكثر صعوبة. يتم شطف أي فراء يلتصق بالكبد بالنفخات قبل الضغط على تركيب القسطرة على العمود وتغليفها داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. يمكن تغيير الإطار الزمني البالغ 30 دقيقة للتروية من 20 دقيقة إلى 60 دقيقة ، ولكن سيتم جمع جميع البيانات الموثوقة بعد 10 دقائق الأولية من التروية.
علامة على استئصال الأنسجة الكبدية الناجحة هي بعد التروية أن الكبد ليس لديه تشوهات أو أي مشاكل أخرى تتعلق بالنزاهة. إنه أصفر شاحب متجانس في جميع الأنحاء. إذا أصيب النسيج أثناء الجراحة مثل ، فسيكون له بقع صفراء داكنة حوله. أيضا ، إذا كان الكبد تالفا من التروية ، فلن ينفذ. إذا عانى النسيج من ضعف تروية المخزن المؤقت كريبس ، فستكون هناك خطوط صفراء داكنة في جميع أنحاء العضو نتيجة للمجاعة مما يؤدي إلى موت الأنسجة. طريقة أخرى لمراقبة صحة الكبد هي استهلاك الأكسجين الكبدي (الشكل 6). وقد تبين أن كبد الفئران يحتوي على كميات أعلى من الدهون والجليكوجين ولكن لديها كميات بروتين إجمالية مماثلة ، لذلك كان من المتوقع أن يكون لاستهلاك الأكسجين الكبدي عند تطبيعه إلى كتلة الكبد قيمة مماثلة. الطريقة الثالثة هي بيانات الرنين المغناطيسي النووي للبيانات في الوقت الحقيقي لدوران التمثيل الغذائي.
القيد الرئيسي لهذه الطريقة هو الجراحة الطرفية نفسها. هناك تكلفة كبيرة في الفئران والمعدات والوقت والموظفين. لذلك ، يجب توخي أقصى درجات الحذر عند تنفيذ هذه الإجراءات وجمع البيانات. التباين البيولوجي داخل نموذج الفأر يمكن أن يولد صعوبة في الجراحة. علاوة على ذلك ، من الضروري تجنب التحسينات البصرية. ليست هناك حاجة إلى تحسينات بصرية لأن جميع التشريح مرئية للعين المجردة. تزيد التحسينات البصرية من احتمال حدوث أخطاء لأن الجراح والمساعد لديهما مجال رؤية محدود ، مما يؤدي إلى حدوث تقلصات في الكبد أو توتر غير مقصود على الوريد البابي ، مما يتسبب في فشل إذا انسحبت القسطرة. سيؤدي التنفيذ السليم لهذه الطرق إلى > معدل نجاح الجراحة بنسبة 95٪ في الماوس C57BL / 6J. هناك قيد آخر يجب مراعاته وهو فترة 10 دقائق المطلوبة للوصول إلى حالة مستقرة. إنها ليست قيدا على الدراسة الموصوفة هنا ، ولا في العديد من الدراسات الأخرى ، ولكن بالنسبة لأي تجربة تبرر 10 دقائق أولية من البيانات ، لن تكفي هذه الطريقة. كما أن عدم وجود التوقيع الهرموني المعقد المرتبط باستقلاب الجسم بأكمله يعمل أيضا كقيد ، على الرغم من أن الجلوكاجون والأنسولين وما إلى ذلك ، وأي مزيج منهما ، يمكن إضافته مرة أخرى إلى العطر.
هناك العديد من التطبيقات المستقبلية المحتملة لهذه التقنية. مع تطوير المزيد من المستحضرات الصيدلانية لعلاج NASH ، يمكن أن تجد الطرق القياسية لتقييم استقلاب طاقة الكبد تطبيقا واسعا. نظرا لأن NASH يرتبط ارتباطا وثيقا بسرطان الكبد ، فإن نماذج هذه السرطانات هي أيضا مواضيع للدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح. ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة؛ في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها؛ في كتابة المخطوطة ؛ أو في قرار نشر النتائج.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R01-DK105346 ، P41-GM122698 ، 5U2C-DK119889). تم تنفيذ جزء من هذا العمل في معهد McKnight Brain Institute في مرفق التصوير بالرنين المغناطيسي المتقدم والتحليل الطيفي (AMRIS) التابع للمختبر الوطني للمجال المغناطيسي العالي ، والذي تدعمه الاتفاقية التعاونية لمؤسسة العلوم الوطنية رقم . DMR-1644779 وولاية فلوريدا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022).
- Thorpe, D. R. A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006).
- Heparin. , DrugBank Online. Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
