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Biochemistry

एक्स वीवो माउस में पोर्टल नस के माध्यम से हेपेटिक छिड़काव

Published: March 9, 2022 doi: 10.3791/63154
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida

Summary

प्रोटोकॉल पोर्टल नस छिड़काव के माध्यम से चयापचय अध्ययन के लिए एक बरकरार माउस जिगर लकीर की एक सीधी विधि का वर्णन करता है।

Abstract

मधुमेह, पूर्व-मधुमेह, गैर-मादक फैटी यकृत रोग (एनएएफएलडी), और गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) जैसे चयापचय संबंधी रोग तेजी से आम हो रहे हैं। पूर्व विवो यकृत छिड़काव परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) का उपयोग करके यकृत चयापचय के व्यापक विश्लेषण की अनुमति देते हैं, पोषण संबंधी स्थितियों में जिन्हें कड़ाई से नियंत्रित किया जा सकता है। जैसा कि सिलिको सिमुलेशन में हार्मोन क्रियाओं और दवा हस्तक्षेप के प्रभावों का आकलन करने का मुख्य रूप से सैद्धांतिक साधन बना हुआ है, संक्रमित यकृत यकृत चयापचय को समझने के लिए सबसे मूल्यवान परीक्षण बिस्तरों में से एक बना हुआ है। चूंकि ये अध्ययन यकृत शरीर विज्ञान में बुनियादी अंतर्दृष्टि का मार्गदर्शन करते हैं, परिणाम सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने चाहिए। पूर्व विवो यकृत छिड़काव की प्रजनन क्षमता में सबसे बड़ा कारक सर्जरी की गुणवत्ता है। इसलिए, हमने सीटू एनएमआर प्रयोगों के संदर्भ में पूर्व विवो माउस यकृत छिड़काव करने के लिए एक संगठित और सुव्यवस्थित विधि पेश की है। हम एक अद्वितीय अनुप्रयोग का भी वर्णन करते हैं और इन अध्ययनों में सामना किए जाने वाले सामान्य मुद्दों पर चर्चा करते हैं। समग्र उद्देश्य एक तकनीक के लिए एक सीधी मार्गदर्शिका प्रदान करना है जिसे हमने कई वर्षों में परिष्कृत किया है जिसे हम सीटू एनएमआर प्रयोगों के संदर्भ में यकृत लकीर और छिड़काव में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए सुनहरा मानक मानते हैं। चुंबक के लिए क्षेत्र के केंद्र की दूरी के साथ-साथ एनएमआर प्रयोग के दौरान हस्तक्षेप करने के लिए ऊतक की दुर्गमता हमारे तरीकों को उपन्यास बनाती है।

Introduction

पूर्व विवो छिड़काव यकृत चयापचय के अध्ययन में महत्वपूर्ण हैं, और पोर्टल नस के माध्यम से छिड़काव इन अध्ययनों के लिए मानक है। अलगाव में यकृत चयापचय का अध्ययन करने के लिए, अन्य अंगों (यानी, पूरे शरीर के चयापचय) में चयापचय से उत्पन्न जटिलताओं से बचने और हार्मोन की उपलब्धता (इंसुलिन, ग्लूकागन, आदि) पर नियंत्रण रखने के लिए यकृत को शरीर से उच्छेदन किया जाना चाहिए। हेपेटिक चयापचय के साथ-साथ दवा कार्रवाई के तंत्र पर मधुमेह, एनएएफएलडी और एनएएसएच जैसी बीमारियों के प्रभावों को समझने के लिए यह दृष्टिकोण आवश्यक हो सकता है। यह लेख यकृत लकीर और छिड़काव के लिए एक गाइड के रूप में कार्य करता है। हमने पर्याप्त कठोरता और प्रजनन क्षमता के साथ इन चयापचय यकृत अध्ययनों को करने के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया विकसित की है। यदि सर्जरी सही ढंग से नहीं की जाती है, तो प्राप्त चयापचय डेटा में स्पष्ट परिवर्तनशीलता होती है। हम एक परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोमीटर में सीटू में चयापचय अध्ययन के संदर्भ में पोर्टल नस कैथीटेराइजेशन और यकृत लकीर करने के लिए एक संगठित विधि का वर्णन करते हैं, जैसा कि साहित्य 1,2,3,4,5 में वर्णित है।

वर्तमान में, एनएमआर के भीतर एक ग्लास कॉलम का उपयोग करके एक पूर्व विवो हेपेटिक छिड़काव का वर्णन करने वाला कोई साहित्य नहीं है। न ही कोई वीडियो या पाठ प्रकाशन माउस जिगर के साथ प्रक्रिया को करने के तरीके का एक स्पष्ट उदाहरण प्रदान करता है, विशेष रूप से, यह दर्शाता है कि पोर्टल नस को कैथेटरीकृत कैसे किया जाए, यकृत को उच्छेदन किया जाए, स्थानांतरित किया जाए, और यकृत को ग्लास कॉलम पर लटका दिया जाए। चूंकि आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस का उपयोग यकृत चयापचय का अध्ययन करने के लिए सर्वव्यापी रूप से किया जाता है, यह एक आवश्यक प्रक्रिया है जो पूर्ण विवरण के योग्य है। लिवर छिड़काव सर्जरी नई नहीं हैं, लेकिन यह लेख इस प्रक्रिया में रुचि रखने वाले सभी लोगों की सहायता के लिए इस पत्र में वर्णित तकनीकी उत्कृष्टता का प्रदर्शन करने वाले वीडियो के साथ एक स्वर्ण मानक विधि है। यहां प्रस्तुत विधि को रोग मॉडल में मेटाबोलाइट्स के कार्य और कारोबार का पता लगाने के लिए वास्तविक समय के चयापचय पर सबसे अच्छा लागू किया जाएगा।

यह विधि 100 सेमी पानी-जैकेट वाले ग्लास कॉलम का उपयोग करती है, जो यकृत को एनएमआर ट्यूब के अंदर परफ्यूसेट द्वारा समझाए गए प्रवेशनी के तल पर लटकने की अनुमति देती है। कांच की जैकेट में गर्म पानी का उपयोग परफ्यूसेट तापमान को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है। पीएच नियंत्रण के लिए एक पतली परत ऑक्सीजनेटर को 95% / 5% ओ2 / सीओ2 के साथ दबाव डाला जाता है। तीन अलग-अलग पंपों का उपयोग करके, परफ्यूसेट कॉलम ऊंचाई निर्धारित की जाती है, जो यकृत को निरंतर दबाव प्रदान करती है। प्रवाह दरों को निरंतर दबाव (चित्रा 1) के आवेदन से परे नियंत्रित नहीं किया जाता है। जिगर के उचित रूप से काम करने की पुष्टि करने के लिए, प्रवाह दर के साथ ऑक्सीजन माप लिया जाता है। हमारे हाथों में, पूर्व शर्त का यह सेट यकृत चयापचय समारोह के मूल्यांकन के लिए अत्यधिक दोहराने योग्य एनएमआर प्रयोगों की ओर जाता है।

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Protocol

चूहों से जुड़े प्रयोगों को फ्लोरिडा इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (प्रोटोकॉल नंबर # 201909320) विश्वविद्यालय के अनुपालन में संभाला गया था। इस्तेमाल किया गया माउस तनाव सी 57 बीएल / 6 जे था; सभी चूहे नर थे। यह विधि आम तौर पर अन्य मानक माउस उपभेदों का उपयोग करके अध्ययनों के लिए भी लागू होती है। यह सर्जरी एक साथ काम करने वाले दो व्यक्तियों द्वारा बेहतर तरीके से की जाती है।

1. प्रारंभिक सेट-अप

  1. क्रेब्स-हेन्सेलेट इलेक्ट्रोलाइट्स6 (25 एमएम एनएएचसीओ3, 112 एमएम एनएसीएल, 4.7 एमएम केसीएल, एमजीएसओ 4, केएच 2 पीओ4, और 0.5 एमएम सोडियम-ईडीटीए, 1.25 एमएम सीएसीएल2), 6 एमएम सोडियम लैक्टेट, 0.6 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम प्रोपियोनेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम प्रोपियोनेट, 0.2 एमएम सोडियम प्रोपियोनेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम प्रोपियोनेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम प्रोपियोनेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम प्रोपियोनेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम प्रोपियोनेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 0.2 एमएम सोडियम प्रोपियोनेट, 0.2 एमएम सोडियम पाइरूवेट,0.2एमएम सोडियम पाइर और 0.63 एमएम मिश्रित फैटी एसिड (पामिटिक एसिड (कुल का 22.1%), पामिटोलिक एसिड (5.2%), स्टीयरिक एसिड (2.7%), ओलिक एसिड (27%), लिनोलेइक एसिड (37.7%), γ-लिनोलेनिक एसिड (2.4%), और डीकोसाहेक्सानोइक एसिड (2.8%) के साथ-साथ 2% (डब्ल्यू / एचसीएल (और एनएओएच, यदि आवश्यक हो) का उपयोग करके परफ्यूसेट के अंतिम पीएच को 7.3 तक सेट करें।

2. प्री-सर्जरी सेट-अप

  1. 23 जी सुई के साथ दो 1 एमएल सिरिंज इकट्ठा करें जो 19.05 मिमी लंबे हैं। एमएल हेपरिन के 0.01 एमएल और पानी में खारा (0.9% (डब्ल्यू / वी) एनएसीएल के 0.19 एमएल के साथ एक सिरिंज भरें; तालिका 1)।
  2. 2% लिडोकेन के 0.2 एमएल और 0.9% खारा (तालिका 1) के 0.6 एमएल के साथ दूसरी सिरिंज भरें। 27 जी 38.1 मिमी सुई के साथ एक और 1 एमएल सिरिंज में, परफ्यूसेट से भरें और 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।

3. परफ्यूसेट कॉलम सेट-अप

  1. पानी के स्नान (चित्रा 1 बी) में 500 मिलीलीटर परफ्यूसेट युक्त कांच की बोतल सेट करें। पानी के स्नान को चालू करें और तापमान ~ 42 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। पानी के स्नान में उच्च तापमान छिड़काव स्तंभ में 37 डिग्री सेल्सियस को बनाए रखने में सक्षम बनाता है।
  2. एक बार जब पानी 42 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हो जाता है, तो पतली फिल्म ऑक्सीजनेटर और पानी-जैकेट वाले 100 सेमी ग्लास कॉलम (चित्रा 1 ए-ई) में बोतल से परफ्यूसेट को प्रसारित करने के लिए दो पंपों को चालू करें।
  3. ऑक्सीजनेटर7 (चित्रा 1 सी) पर दबाव डालने के लिए ऑक्सीजन गैस (95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड) को चालू करें। मिनट की प्रवाह दर को प्राप्त करने के लिए परफ्यूसेट कॉलम ऊंचाई समायोजित करें कैथेटर संलग्न (प्रवाह दर माप के लिए चरण 9 देखें) 5,8,9।
    नोट: प्रवाह दर उस दर को संदर्भित करती है जिस पर यकृत द्वारा परफ्यूसेट को निष्कासित किया जा रहा है।

4. माउस का एनेस्थेटाइजेशन

  1. आईएसीयूसी प्रोटोकॉल और अन्य उपयुक्त सुरक्षा दिशानिर्देशों द्वारा आवश्यक पीपीई डॉन करें।
    नोट: निम्नलिखित चरणों को चूहों के लिए अनुकूलित किया गया है जो 9 - 13 सप्ताह पुराने हैं।
  2. आइसोफ्लुरेन कक्ष में माउस रखें। डिलीवरी गैस को 100% ऑक्सीजन, 1 एल / मिनट की प्रवाह दर, और आइसोफ्लुरेन को 2% 10 तक घुमाएं। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सांस धीमी न हो जाए और स्थिर न हो जाए।
    नोट: माउस के लिए एक स्थिर सर्जिकल विमान तक पहुंचने के लिए, जैसा कि धीमी और स्थिर श्वसन दर और पैर की अंगुली चुटकी पलटा की कमी से प्रमाणित है, ऑक्सीजन प्रवाह दर को ~ 1.5 एल / मिनट से ~ 3 एल / मिनट और आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 1 - 3% से समायोजित किया जा सकता है। वाहक गैस और आइसोफ्लुरेन एकाग्रता की डिलीवरी दर जानवर की उम्र और वजन और शोर और प्रकाश जैसे कारकों पर निर्भर करती है।
  3. 70% अल्कोहल के साथ पेट कीटाणुरहित करें। पेट की वसा परत (चित्रा 2) में एक गहरी चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से हेपरिन का प्रशासन करें। 10 मिनट के लिए संज्ञाहरण कक्ष में माउस वापस रखें।
    नोट: शेविंग की आवश्यकता नहीं है क्योंकि यह प्रक्रिया टर्मिनल है।

5. सेलियोटॉमी

  1. संज्ञाहरण कक्ष से सर्जरी मंच के लिए माउस स्थानांतरण और लापरवाह स्थिति (चित्रा 3) में जगह।
  2. माउस की नाक को एक नाक शंकु में रखें और पंजे को नीचे टेप करें। ध्यान रखें कि गर्दन पर कोई तनाव न लगाएं जिससे घुटन हो सकती है।
  3. पूर्वकाल इलियाक शिखा क्षेत्र11 (चित्रा 3) में द्विपक्षीय रूप से एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से लिडोकेन का प्रशासन करें। सभी दर्द सजगता की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण करें।
  4. आंतरिक अंगों (चित्रा 4) को बेनकाब करने के लिए सेलियोटॉमी करें। एक 3 सेमी चौड़ा चीरा (माउस के पूरे पेट की चौड़ाई) बनाओ।
    नोट: चौड़ाई उम्र और माउस के आहार के साथ बदल जाएगा।
  5. एक हेमोस्टैट का उपयोग करके चीरा का विस्तार करें जो एक्सफोइड प्रक्रिया (चित्रा 4) पर क्लैंप करके कर्षण खींचता है।

6. पोर्टल नस का कैन्युलेशन

  1. पोर्टल नस को कवर करने वाली छोटी और बड़ी आंतों को साफ करने के लिए एक कपास-इत्तला दे दी आवेदक का उपयोग करें। जिगर (चित्रा 4 ए) के समीपस्थ पोर्टल नस के मेहराब के नीचे एक रेशम सीवन की स्थिति।
  2. संरचनात्मक संरचना के आधार पर, जिगर (चित्रा 4 ए) 12,13 से बाहर का अवर मेसेन्टेरिक नस के समीपस्थ या डिस्टल दूसरा रेशम सीवन रखें। दोनों टांके के लिए 2-0 सीवन का उपयोग करें।
  3. एक बार टांके जगह में हैं, एक 22 जी कैथेटर14 (चित्रा 4 बी) के साथ पोर्टल नस cannulate। कैथेटर डालने पर, बेवल को इंगित रखें। पोर्टल नस को 15 ° कोण से अधिक नहीं दर्ज करें।
  4. कैथेटर टेपर पिछले पहले सीवन टाई। पोर्टल नस कैन्युलेटेड होने के बाद, रेशम सीवन (चित्रा 4 बी) के साथ पोर्टल नस की शाखा से कैथेटर 2-3 मिमी डिस्टल लंगर।
    नोट: सहायक को कैथेटर को हटाने या पोर्टल नस के फाड़ने से रोकने के लिए कंधों और कलाई को रोल करना चाहिए। प्रत्येक सिवनी के लिए दो समुद्री मील की आवश्यकता होती है।
  5. इसके बाद, दूसरे सीवन के साथ कैथेटर के निचले हिस्से को सुरक्षित करें। सर्जिकल सहायक की मदद से, पोर्टल नस और आसपास के ऊतकों के डिस्टल हिस्से में कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए सिवनी के साथ एक गाँठ बांधें।

7. जिगर के बाद पोर्टल शिरा कैन्युलेशन की लकीर

  1. कैथेटर सुरक्षित होने के बाद, रक्त और हवा के बुलबुले को फ्लश करने के लिए कैथेटर में 38.1 मिमी लंबा है जो 27 जी सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज डालें।
    नोट: आमतौर पर दबाव से कैथेटर से रक्त का बैकफ्लो होता है।
  2. एक निश्चित स्टॉपकॉक के साथ एक 1 मिमी आईडी एक्स 5 मिमी ओडी सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग करें ताकि छिड़काव कॉलम (चित्रा 1 ए) को कैथेटर में जोड़ा जा सके जो छिड़काव की शुरुआत को चिह्नित करने वाले यकृत में बफर के प्रवाह की अनुमति देता है। छिड़काव की शुरुआत को चिह्नित करने के लिए इस बिंदु पर एक टाइमर शुरू करें।
  3. अवर वेना कावा में कैंची का उपयोग करके चीरा बनाकर संवहनी दबाव में वृद्धि से छुटकारा पाएं।
  4. लाल से पीले पीले रंग में जिगर के रंग में समरूप परिवर्तन को देखकर जिगर के माध्यम से परफ्यूसेट के प्रवाह की पुष्टि करें। एक बार प्रवाह की पुष्टि हो जाने के बाद, पेट, छोटी आंत, बड़ी आंत, और आसपास के ऊतकों से सही गुर्दे का उत्पादन करें।
  5. सर्जिकल सहायक की मदद से, पेट और वक्ष गुहा के चारों ओर जिगर पैंतरेबाज़ी के रूप में सर्जन पार्श्विका पेरिटोनियम और थोरैसिक ऊतक के माध्यम से काटने जिगर उच्छेदन के लिए उच्छेदन
  6. अंत में, जिगर को ऊपर की ओर उठाएं और कैंची के साथ जिगर को जगह में रखने वाले शेष संयोजी ऊतकों को काट लें। देखने में आसानी के लिए धीरे-धीरे जिगर में हेरफेर करें। एनएमआर ट्यूब के भीतर इसे एनकैप्सुलेट करने से पहले परफ्यूसेट के साथ कुल्ला करके जिगर से चिपकने वाले किसी भी फर को हटा दें।
    नोट: इस प्रक्रिया में, केवल जिगर को हटा दिया जाता है। अन्य सभी अंग जानवर के शरीर में छोड़ दिए जाते हैं। पित्त नली को प्रयोग के प्रोटोकॉल के आधार पर हटाया जा सकता है। हालांकि इस प्रयोग के लिए इसे जगह-जगह छोड़ दिया गया था।

8. स्तंभ से जिगर फांसी

  1. एक बार जब सर्जन सहायक को जिगर और टयूबिंग सौंपता है, तो सहायक कैथेटर और कॉलम से टयूबिंग को डिस्कनेक्ट कर देता है।
  2. कैथेटर के शीर्ष पर एक मेनिस्कस का गठन होने तक परफ्यूसेट के साथ कैथेटर भरें। जिगर के लिए स्तंभ के लिए कैथेटर संलग्न करने के लिए लटका और perfuse.
    नोट: कैथेटर पर perfusate का मनका जिगर के लिए पर्याप्त मात्रा में कार्य करने के लिए जब तक अपने जुड़े हुए है प्रदान करता है. जिगर से जुड़े कैथेटर को कॉलम के नीचे फिट किया जाता है।
  3. जिगर (चित्रा 5) को समाहित करने के लिए 100 सेमी ग्लास कॉलम पर एक 20 मिमी एनएमआर ट्यूब पेंच। जिगर और पोर्टल नस के मरोड़ से बचने के लिए, धीरे-धीरे एनएमआर ट्यूब पर पेंच। यदि मरोड़ होता है और प्रवाह बंद हो जाता है, तो एनएमआर ट्यूब को खोलें और फिर से शुरू करें। यह रोड़ा का उपाय करेगा और प्रवाह वापस आ जाएगा।
  4. अध्ययन के विवरण के आधार पर 30-60 मिनट के लिए जिगर को प्रभावित करें।
    नोट: समय छिड़काव प्रयोग पर आधारित है। इस प्रयोग के लिए, चयापचय कारोबार 30 मिनट के भीतर मापा गया था। जिगर छिड़काव एक स्थिर राज्य तक पहुँचने के लिए 10 मिनट तक ले जा सकते हैं। स्थिर-राज्य का समय एक बार अवर वेना कावा काट दिया गया है और यकृत प्रवाह स्थापित होने के बाद शुरू होता है।

9. प्रवाह माप

  1. एक शीर्ष लोडिंग संतुलन पर एक वजन नाव रखें और संतुलन को शून्य करें। रोलर पंप से टयूबिंग को एनएमआर से वजन नाव में खींचने वाले प्रभावी परफ्यूसेट को खींचें और टाइमर शुरू करें।
  2. 1 मिनट से अधिक संचित तरल के द्रव्यमान का वजन करें जो यकृत की प्रवाह दर उत्पन्न करता है। संग्रह कंटेनर में ट्यूब को वापस रखें।

10. ऑक्सीजन मापन

नोट: ऑक्सीजन मीटर माप निर्माता के निर्देशों15 के अनुसार स्थापित किए गए थे।

  1. प्लैटिनम गुंबद पर 50% केसीएल संतृप्त समाधान के 20 μL युक्त इलेक्ट्रोड रखें और इलेक्ट्रोड के निचले प्लैटिनम रिंग के चारों ओर पांच 10 μL बूंदों को रखें।
  2. सिगरेट पेपर से चिपकने वाला निकालें। सिगरेट पेपर के ऊपर पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन झिल्ली का एक टुकड़ा बिछाएं।
  3. इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर दो टुकड़ों को रखें। इलेक्ट्रोड के शीर्ष के चारों ओर एक छोटा सा ओ-रिंग फिट करें। इलेक्ट्रोड पर निचले प्लैटिनम रिंग पर फ्लैट रखने के लिए पेपर को ट्रिम करें।
    नोट: कुछ ओवरहैंग स्वीकार्य है। इलेक्ट्रोड की चांदी को कवर करना आवश्यक है।
  4. इलेक्ट्रोड पर बड़ा ओ-रिंग रखें। इलेक्ट्रोड को पानी के कक्ष में जोड़ें और इलेक्ट्रोड को जगह में रखने के लिए आधार को कस लें। पानी के स्नान को चालू करें और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की अनुमति दें।
  5. ऑक्सीजन मीटर सॉफ्टवेयर खोलें। एयर-सैचुरेटेड वॉटर > कैलिब्रेट पर क्लिक करें। 75 और तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए हलचल की गति सेट करें।
  6. पानी के साथ आधे रास्ते में एक 50 मिलीलीटर शीशी भरें और 2 मिनट के लिए सख्ती से हिलाएं। यह वायु-संतृप्त पानी है, इसे 100% मानक के रूप में उपयोग करें। ऑक्सीजन मीटर चैम्बर को ~ 2 एमएल पानी से भरें और दो-टुकड़े स्टॉपर को रखें।
  7. स्क्रीन पर ठीक क्लिक करें और सिग्नल को पठार की अनुमति दें। एक बार जब सिग्नल पठार पर पहुंच जाता है, तो ठीक क्लिक करें। कक्ष में तरल का निपटान करें और टिशू पेपर के साथ सूखा।
  8. चरण 10.6-10.7 दोहराएं लेकिन 200 एमएम सोडियम सल्फाइट (0% मानक) के साथ। कैलिब्रेशन सहेजें पर क्लिक करें।
    नोट: 0% मानक के लिए कोई जोरदार मिलाते हुए की आवश्यकता नहीं है।
  9. छिड़काव के दौरान, दो 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। परिसंचारी परफ्यूसेट (ऑक्सीजन में) के लिए एक सिरिंज और एनएमआर ट्यूब (ऑक्सीजन आउट) से अभिवाही परफ्यूसेट के लिए दूसरा।
  10. जब दोनों में और बाहर माप के लिए परफ्यूसेट तैयार करते हैं, तो हर बार 3-4 एमएल खींचें।
    नोट: इस स्तंभ में कांच टयूबिंग है जो एनएमआर ट्यूब में पहुंच के लिए अनुमति देने के लिए जिगर के माध्यम से बहने वाले परफ्यूसेट को वापस लेने के लिए है।
  11. परिसंचारी परफ्यूसेट को मापें, पहले चरण 10.6 में पानी के रूप में और चरण 10.7 में निपटान करें। अपवर्तक परफ्यूसेट के लिए एक ही चरण को दोहराएं।
  12. हर 10 मिनट में ऑक्सीजन माप करें।

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Representative Results

जिगर समारोह मुख्य रूप से ऑक्सीजन की खपत और प्रवाह दर द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। 4-8 एमएल / मिनट की प्रवाह दर और 1 μmol / min.g की ऑक्सीजन की खपत विशिष्ट है। ये उपाय विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों और जैविक मतभेदों के आधार पर भिन्न होंगे।

उपयोग किए जाने वाले आइसोफ्लुरेन की सटीक मात्रा उपयोग की जा रही संज्ञाहरण प्रणाली के प्रकार के साथ-साथ माउस के पर्यावरण और आयु / वजन पर निर्भर करेगी। सर्जरी के दौरान, आइसोफ्लुरेन और डिलीवरी गैस नहीं बदलती है, हालांकि सर्जिकल क्षेत्र (जैसे, पृष्ठभूमि शोर) 10 की बारीकियों के आधार पर कुछ परिवर्तन आवश्यक हो सकते हैं। जब हेपरिन को गहरे चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया जाता है, तो कार्रवाई की शुरुआत में 20-40 मिनट तक की देरी हो सकती है। हेपरिन प्रशासन के बाद 10 मिनट की प्रतीक्षा अवधि कार्रवाई16 की शुरुआत सुनिश्चित करती है। लिडोकेन में कार्रवाई11 की 2 मिनट की शुरुआत है।

कैथेटर डालने पर, बेवल को इंगित रखें, और पोर्टल नस से 15 डिग्री से अधिक कोण पर प्रवेश न करें। दोनों टांके में दो समुद्री मील होते हैं। पहले सिवनी कैथेटर टेपर पिछले बंधे होना चाहिए. यदि पोर्टल नस का कैन्युलेशन सफल होता है, तो यकृत फ्लश से ब्लीच करता है। जैसा कि सर्जन यकृत को उच्छेदन कर रहा है, सहायक एक कपास-इत्तला दे दी आवेदक के साथ उच्छेदित सामग्री को साफ करता है। जिगर को दूषित करने से रोकने और लोबों को निक्स को रोकने के लिए, पेट के माध्यम से कटौती न करें। पोर्टल नस को हटाने या फाड़ने से रोकने के लिए कैथेटर को पकड़ते समय पोर्टल नस या यकृत पर बहुत अधिक तनाव लागू न करें।

छिड़काव हार्डवेयर सेटअप विस्तार (चित्रा 1) के लिए व्यापक ध्यान देने की आवश्यकता है। हेपरिन इंजेक्शन (चित्रा 2) प्रयोग के लिए आवश्यक हैं। यदि रक्त जमावट करता है, तो यह कैथेटर को रोक देगा जो पोर्टल नस में डाला जाता है, प्रवाह को रोकता है। लिडोकेन इंजेक्शन (चित्रा 3) दर्द से राहत के लिए क्षेत्र को असंवेदनशील बनाने में सहायता करने के लिए है। तालिका 1 खारा के साथ हेपरिन और लिडोकेन के लिए एक सरल खुराक चार्ट प्रदान करता है। सेलियोटॉमी और स्यूटरिंग (चित्रा 4) एक सफल पोर्टल नस कैथीटेराइजेशन, यकृत लकीर, और छिड़काव रिग में सफल हस्तांतरण के लिए आवश्यक हैं। प्रवाह दर और ऑक्सीजन की खपत माप जिगर के स्वास्थ्य और कार्य (चित्रा 6) की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण हैं। खिलाया और उपवास यकृत के बीच ओ2 खपत में अक्सर थोड़ा अंतर होता है, जिसे हम उपवास यकृत में ग्लूकोनोजेनेसिस द्वारा लगाए गए ऊर्जा की मांगों में वृद्धि के लिए श्रेय देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1. छिड़काव स्तंभ और पंप. एक। एक 100 सेमी पानी-जैकेट ग्लास कॉलम जिसमें यकृत नीचे लटकता है। B. पानी का पंप कांच के स्तंभ के माध्यम से पानी को प्रसारित करता है और परफ्यूसेट को गर्म करता है। ग्लास पतली परत ऑक्सीजनेटर को 95% / 5% ओ 2/ सीओ 2 के साथ दबाव डाला जाता है जो परफ्यूसेट को ऑक्सीजन देता है। डी. बॉल-असर पंप पानी के स्नान से पतली परत ऑक्सीजनेटर और ग्लास कॉलम में फैलता है। E. बॉल-बेयरिंग पंप परफ्यूसेट को डिलीवरी पंप से कॉलम में वितरित किया जा रहा है, जो परफ्यूसेट को ऑक्सीजनयुक्त रखता है और 8 एमएल / मिनट के प्रवाह को बनाए रखता है। बॉल-असर पंप एनएमआर ट्यूब से प्रभावी परफ्यूसेट को हटा देता है। जिगर की प्रवाह दर प्राप्त करने के लिए एनएमआर ट्यूब से परफ्यूसेट का वजन करने के लिए वजन पैमाने। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2. हेपरिन इंजेक्शन। हेपरिन का गहरा चमड़े के नीचे इंजेक्शन माउस की निचली पेट की वसा परत में दिया जाता है। माउस उठाते समय यह महत्वपूर्ण है, सुई को आसानी से त्वचा में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए त्वचा को तंग खींचने के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. लिडोकेन इंजेक्शन। माउस को सर्जिकल प्लेटफ़ॉर्म पर लापरवाह स्थिति में रखा जाता है, जिसमें इसके पंजे नीचे टेप किए जाते हैं और नाक शंकु में नाक होती है। लिडोकेन को इलियाक क्रेस्ट क्षेत्र में चमड़े के नीचे प्रशासित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4. सेलियोटॉमी और सीवन। सेलियोटॉमी आंतरिक अंगों को उजागर करता है, और एक हेमोस्टैट चीरा को आगे खोलने में मदद करने के लिए एक्सफोइड प्रक्रिया के माध्यम से कर्षण खींचता है। पोर्टल नस के चारों ओर दो टांके रखे जाते हैं, कैथेटर डाला जाता है, और टांके बंधे होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5. एनएमआर ट्यूब। जिगर कैथेटर के साथ शरीर से हटा दिया जो तब कांच के स्तंभ से जुड़े सिलिकॉन टयूबिंग से जुड़ा हुआ है। जिगर को स्तंभ से लटका दिया जाता है और एनएमआर ट्यूब द्वारा समझाया जाता है। एक 20 मिमी एनएमआर ट्यूब को तब जिगर को घेरने वाले कॉलम पर सावधानीपूर्वक खराब कर दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6. ऑक्सीजन की खपत और प्रवाह दर। यकृत ऑक्सीजन की खपत और खिलाया और उपवास यकृत के बीच प्रवाह दर माप की तुलना से प्रतिनिधि डेटा। एन = 3 और त्रुटि सलाखों मानक विचलन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हेपरिन 1000 इकाइयां / खारा 0.9% कुल
0.01 एमएल 0.19 एमएल 0.2 एमएल
लिडोकेन 2% खारा 0.9% कुल
0.2 एमएल 0.6 एमएल 0.8 एमएल

तालिका 1. खारा के साथ हेपरिन और लिडोकेन खुराक। तालिका हेपरिन और लिडोकेन की एकाग्रता और खारा के साथ प्रत्येक दवा की खुराक प्रदर्शित करती है।

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Discussion

यह शल्य चिकित्सा प्रक्रिया चुनौतीपूर्ण है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए व्यापक अभ्यास की आवश्यकता होती है। आइसोफ्लुरेन और वाहक गैस को यथासंभव शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के माध्यम से जानवर की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए आवश्यकतानुसार समायोजित किया जाना चाहिए। पर्यावरण, दिन का समय, उम्र, वजन, और कई अन्य कारक संज्ञाहरण को प्रभावित करेंगे। वजन, आहार, चूहों और उम्र का तनाव सर्जरी को प्रभावित कर सकता है क्योंकि वसा का निर्माण पोर्टल नस को देखने में हस्तक्षेप कर सकता है। पंजे को नीचे टैप करते समय, इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि गर्दन पर कोई तनाव न लागू हो जिसके परिणामस्वरूप घुटन हो सकती है। इसके अलावा, मोटा माउस तंग सिवनी कैथेटर के आसपास होने के लिए कैथेटर और लिपिड द्वारा प्रेरित नस के बीच घर्षण के कम गुणांक का सामना करने की आवश्यकता होगी। हेपरिन के लिए कार्रवाई के समय की शुरुआत आवश्यक है क्योंकि आइसोफ्लुरेन के अत्यधिक संपर्क मेंअंगों 17 में कलाकृतियों का उत्पादन होता है। हेपरिन और लिडोकेन इंजेक्शन के प्रशासन के लिए 23 जी सुई 19.05 मिमी लंबाई की आवश्यकता होती है, जिससे इंजेक्शन के दौरान आंतरिक अंगों को कोई आघात नहीं मिलता है। सिवनी पाश कैथेटर के टेपर पर होना चाहिए, या यह कड़ा होने पर नस को रोक देगा। एक बार कैथेटर डाला जाता है तो आमतौर पर दबाव से कैथेटर से रक्त का बैकफ्लो होता है, जो सही प्लेसमेंट का सकारात्मक संकेत है। कैथेटर दृश्य पुष्टि के लिए ऊपर की ओर खींचा जा सकता है कि कैथेटर टिप पहले सिवनी अतीत में काफी दूर है। कलाई और कंधों को रोल करने से यह सुनिश्चित होगा कि सहायक द्वारा सिवनी को बांधने पर सिवनी पतला टिप से स्लाइड नहीं करेगी। सिलिकॉन छिड़काव टयूबिंग से स्तंभ के लिए जिगर को स्थानांतरित करते समय परफ्यूसेट का एक मनका कैथेटर के शीर्ष पर छोड़ दिया जाता है। परफ्यूसेट मनका कैथेटर में प्रवेश करने और यकृत में जाने से किसी भी हवा के बुलबुले को रोक देगा। कैथेटर के शीर्ष पर परफ्यूसेट का मेनिस्कस यकृत को इसके जुड़े होने तक कार्य करने के लिए पर्याप्त मात्रा प्रदान करता है। जिगर और पोर्टल नस के मरोड़ से बचने के लिए, एनएमआर ट्यूब को धीरे-धीरे खराब कर दिया जाता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली छिड़काव प्रणाली को दबाव वाल्व की आवश्यकता नहीं होती है। पंपों की प्रवाह दरों को इस तरह से बनाए रखा जाता है कि ग्लास परफ्यूजन कॉलम में ~ 12 सेमी की ऊंचाई पर परफ्यूसेट होता है। जिगर गुरुत्वाकर्षण द्वारा क्रेब्स बफर लेता है, जिगर की प्रवाह दर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ने के साथ दो पंपों के बीच किसी भी दबाव के अंतर को अस्वीकार करता है। चूंकि जिगर गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से संक्रमित होता है, इसलिए यकृत द्वारा उठाए गए परफ्यूसेट की मात्रा यकृत की प्राकृतिक जैविक गतिविधि द्वारा निर्धारित की जाती है। छिड़काव दबाव के लिए कोई डेटा एकत्र नहीं किया गया था क्योंकि पोर्टल नस दबाव इस प्रणाली में औसत दर्जे का नहीं है।

सेलियोटॉमी का पहला चीरा एक उद्घाटन बनाने के लिए उथला है, और बाद में कटौती यकृत के लोबों को निकिंग से बचने के लिए गहरी है। सेलियोटॉमी के लिए चीरा की समग्र लंबाई इस उम्र और आकार के चूहों के लिए 3 सेमी है लेकिन तनाव, उम्र और वजन के आधार पर बदल जाएगी। हालांकि वर्णित अध्ययन में 9-13 सप्ताह पुराने चूहों का उपयोग किया जाता है, पुराने, या छोटे चूहों का अध्ययन चूहों के साथ-साथ चूहों का भी किया जा सकता है। एनएमआर ट्यूब और पोर्टल शिरा कैथेटर के आकार को चिंता के अध्ययन के लिए यकृत और पोर्टल नस के संरचनात्मक आकार के आधार पर बदलने की आवश्यकता होगी। यदि पोर्टल नस सीधे नहीं है, तो एक कपास-इत्तला दे दी आवेदक कैथेटर डालने पर नस में हेरफेर करने में सहायता कर सकता है। यद्यपि पित्त नली को हटाया नहीं जाता है, अगर इसकी अनुपस्थिति के लिए एक प्रयोगात्मक आवश्यकता होती है तो नलिका को ठीक चिमटी के साथ हटाया जा सकता है। टांके लगाते समय पोर्टल नस के अत्यधिक हेरफेर से कैथेटर प्लेसमेंट को और अधिक कठिन बनाने वाले कसना का कारण होगा। जिगर से चिपकने वाले किसी भी फर को कैथेटर को कॉलम में फिट करने और एनएमआर ट्यूब के भीतर इसे एनकैप्सुलेट करने से पहले परफ्यूसेट के साथ धोया जाता है। छिड़काव के लिए 30 मिनट की समय सीमा 20 मिनट से 60 मिनट तक बदल दी जा सकती है, लेकिन छिड़काव के प्रारंभिक 10 मिनट के बाद सभी विश्वसनीय डेटा एकत्र किए जाएंगे।

सफल यकृत ऊतक लकीर का एक मार्कर छिड़काव के बाद जिगर कोई विकृति या किसी अन्य अखंडता के मुद्दों है। यह सजातीय रूप से पीला पीला है। यदि ऊतक सर्जरी के दौरान घायल हो गया था जैसे कि निक इसके चारों ओर गहरे पीले रंग के धब्बे होंगे। इसके अलावा, यदि जिगर छिड़काव से क्षतिग्रस्त हो गया था, तो यह perfuse नहीं होगा। यदि ऊतक क्रेब्स बफर के खराब छिड़काव का अनुभव करता है, तो ऊतक मृत्यु के लिए अग्रणी भुखमरी के परिणामस्वरूप पूरे अंग में गहरे पीले रंग की लकीरें होंगी। जिगर के स्वास्थ्य की निगरानी की एक और विधि यकृत ऑक्सीजन की खपत (चित्रा 6) है। यह दिखाया गया है कि चूहों के यकृत में उच्च लिपिड और ग्लाइकोजन मात्रा होती है लेकिन समान कुल प्रोटीन मात्रा होती है, इसलिए यह उम्मीद की जाती थी कि यकृत ऑक्सीजन की खपत जब यकृत द्रव्यमान के लिए सामान्यीकृत होती है तो इसका समान मूल्य होगा। एक तीसरी विधि चयापचय कारोबार के वास्तविक समय के डेटा का एनएमआर डेटा है।

विधि की मुख्य सीमा टर्मिनल सर्जरी ही है। चूहों, उपकरणों, समय और कर्मियों में पर्याप्त लागत है। इसलिए, इन प्रक्रियाओं को करते समय और डेटा एकत्र करते समय अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए। माउस मॉडल के भीतर जैविक भिन्नता सर्जरी में कठिनाई उत्पन्न कर सकती है। इसके अलावा, ऑप्टिकल संवर्द्धन से बचना अनिवार्य है। कोई ऑप्टिकल संवर्द्धन की आवश्यकता नहीं है क्योंकि सभी शरीर रचना विज्ञान नग्न आंखों को दिखाई दे रहा है। ऑप्टिकल संवर्द्धन त्रुटियों के होने की क्षमता को बढ़ाते हैं क्योंकि सर्जन और सहायक के पास देखने का एक सीमित क्षेत्र होता है, जिससे जिगर में निक्स या पोर्टल नस पर अनपेक्षित तनाव होता है, जिससे कैथेटर बाहर निकलने पर विफलता होती है। इन विधियों के उचित कार्यान्वयन के परिणामस्वरूप सी 57 बीएल / 6 जे माउस में > 95% सर्जरी सफलता दर होगी। विचार करने के लिए एक और सीमा यकृत के लिए एक स्थिर स्थिति तक पहुंचने के लिए आवश्यक 10 मिनट की अवधि है। यह यहां वर्णित अध्ययन के लिए एक सीमा नहीं है, न ही कई अन्य लोगों में, लेकिन किसी भी प्रयोग के लिए प्रारंभिक 10 मिनट के डेटा की गारंटी देने के लिए यह विधि पर्याप्त नहीं होगी। पूरे शरीर के चयापचय से जुड़े जटिल हार्मोनल हस्ताक्षर की कमी भी एक सीमा के रूप में कार्य करती है, हालांकि ग्लूकागन, इंसुलिन आदि, और उसके किसी भी संयोजन को परफ्यूसेट में वापस जोड़ा जा सकता है।

इस तकनीक के लिए कई संभावित भविष्य के अनुप्रयोग हैं। चूंकि एनएएसएच के उपचार के लिए अधिक फार्मास्यूटिकल्स विकसित किए जाते हैं, इसलिए यकृत ऊर्जा चयापचय का आकलन करने के लिए मानक तरीकों को व्यापक अनुप्रयोग मिल सकता है। चूंकि एनएएसएच यकृत कैंसर से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है, इसलिए इन कैंसर के मॉडल भी अध्ययन के लिए विषय हैं।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है। अध्ययन के डिजाइन में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी; डेटा के संग्रह, विश्लेषण या व्याख्या में; पांडुलिपि के लेखन में; या परिणामों को प्रकाशित करने के निर्णय में।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर 01-डीके 105346, पी 41-जीएम 122698, 5 यू 2 सी-डीके 11 9 88 9) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम का एक हिस्सा राष्ट्रीय उच्च चुंबकीय क्षेत्र प्रयोगशाला के उन्नत चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएमआरआईएस) सुविधा में मैककेनाइट ब्रेन इंस्टीट्यूट में किया गया था, जिसे राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन सहकारी समझौते संख्या द्वारा समर्थित किया गया है। डीएमआर -1644779 और फ्लोरिडा राज्य।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe N/A N/A Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column N/A N/A Custom Made
2-0 Silk Suture Braintree Scientific N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety Terumo SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles Exel International 26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles Exel International 26426
4x4 in. Surgical Platform N/A N/A Custom Made
70% Alcohol Wipe N/A N/A Non-specific Brand
Circulating Water Bath MS Lauda N/A Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator N/A N/A Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " Roboz RS-6702
Dumont #5/45 Forceps Fine Scientific Tools 11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps Fine Scientific Tools 11274-20
Hemostats Fine Scientific Tools 13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL RX Generics 71288-0402-02
Isoflurane Patterson Veterinary 14043-0704-06
Lidocaine HCl 2% VEDCO Inc. 50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator Radnoti N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " Roboz RS-6013
Oxygen Meter System Hanstech Instruments Ltd. N/A
Saline 0.9% Solution N/A N/A Saline is made in lab
Scale N/A N/A Non-specific Brand
 Variable Speed Analog Console Pump Systems Cole Palmer N/A Models are custom per application
Weigh boats N/A N/A Non-specific Brand

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References

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जैव रसायन अंक 181 जिगर छिड़काव लकीर सेलियोटॉमी पोर्टल नस चयापचय
<em>एक्स वीवो</em> माउस में पोर्टल नस के माध्यम से हेपेटिक छिड़काव
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Giacalone, A. G., Merritt, M. E.,… More

Giacalone, A. G., Merritt, M. E., Ragavan, M. Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse. J. Vis. Exp. (181), e63154, doi:10.3791/63154 (2022).

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