Summary
Målet med denne protokollen er å oppdage fenoliske metabolitter i plasma ved hjelp av en semi-målrettet kromatografi-massespektrometrimetode.
Abstract
En gruppe på 23 eldre personer fikk funksjonelle måltider (en drikk og en muffin) spesielt formulert for forebygging av sarkopeni (aldersrelatert tap av muskelmasse). Plasmaprøver ble tatt i begynnelsen av intervensjonen og etter 30 dager med å konsumere funksjonelle måltider. En semi-målrettet ultra-høy ytelse kromatografi kombinert med tandemmasse (UPLC-MS / MS) analyse ble utført for å identifisere fenolforbindelser og deres metabolitter. Plasmaproteiner ble utfelt med etanol og prøvene ble konsentrert og resuspendert i mobilfasen (1:1 acetonitril: vann) før injeksjon i UPLC-MS/MS-instrumentet. Separasjon ble utført med en C18 omvendt fase kolonne, og forbindelser ble identifisert ved hjelp av deres eksperimentelle masse, isotopisk distribusjon og fragmentmønster. Interesseforbindelser ble sammenlignet med databanker og det interne semi-målrettede biblioteket. Foreløpige resultater viste at de viktigste metabolittene identifisert etter intervensjonen var fenylacetic acid, glycitin, 3-hydroksyfenylvalerinsyre og gomisin M2.
Introduction
Sarkopeni er en progressiv skjelettsykdom relatert til et akselerert tap av muskler i den eldre befolkningen. Denne tilstanden øker risikoen for fall og fører til begrensede aktiviteter i dagliglivet. Sarcopenia er til stede hos ca. 5%-10% av personer over 65 år og ca 50% av personer i alderen 80 år eller eldre1. Ingen spesifikke legemidler er godkjent for behandling av sarkopeni, så forebygging med fysisk aktivitet og et velbalansert kosthold er viktig1,2. Ernæringsmessige inngrep med spesielt formulert mat beriket med meieriprotein og essensielle aminosyrer har vist positive resultater for å forhindre sarkopeni2. I andre studier har forfattere inkludert vitaminer og antioksidanter, som vitamin E og isoflavoner, i kostholdet, og øker fordelene for muskeløkning på midjen og hoftene3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) er et tre som vokser i de meksikanske tropiske regionene; det har blitt konsumert av mayakulturer på grunn av sin høye næringsverdi4. Det er en god kilde til protein, fiber, mineraler og fenoliske antioksidanter, som klorogensyre5. Siden det kan males i pulver og brukes i bakeprodukter eller konsumeres i drikkevarer, har nyere studier evaluert inkorporering av Ramón frømel (RSF) i forskjellige matvarer for å forbedre næringsverdien. En RSF-supplert cappuccino-smaksatt drikke ble formulert, som var høy i kostfiber og hadde mer enn 6 g protein per porsjon, og ble sterkt akseptert av forbrukerne; Dermed ble det ansett som et potensielt alternativ for å oppfylle spesielle kostholdskrav6. I en oppfølgingsstudie ble RSF også brukt til å formulere en muffins og en ny drikk rik på protein, kostfiber, mikronæringsstoffer og fenoliske antioksidanter. Muffins og drikke ble brukt i en kostholdsintervensjon for eldre personer, som konsumerte begge produktene to ganger per dag i 30 dager. Etter denne perioden forbedret deltakernes ernæringsmessige og sarkopeniske status, og det totale fenoliske innholdet av plasma økte7. Imidlertid ble bestemmelsen av totale fenolforbindelser i plasma utført av en spektrofotometrisk metode, så identifisering av de faktiske fenolforbindelser som ble absorbert var ikke mulig; Videre er denne metoden ikke helt spesifikk for fenolforbindelser, så noe overestimering kan forekomme8.
Identifisering og kvantifisering av fenolforbindelser som absorberes etter forbruk av matvarer rik på disse antioksidanter er en vanskelig oppgave, men er nødvendig for å demonstrere den biologiske aktiviteten til disse fytokjemikaliene. Biotilgjengeligheten av de fleste fenolforbindelser er lav; mindre enn 5% av dem kan bli funnet uten strukturell transformasjon i plasma. Fenolforbindelser gjennomgår flere biotransformasjoner, for eksempel metylering, sulfonering eller glukuronidering, som utføres av enterocytter og hepatocytter9. Fenolforbindelser er også biotransformert av mikrobiota til bakterielle katabolitter som kan utøve sine gunstige effekter i kroppen etter å ha blitt absorbert i plasma10. For eksempel er fenylacetisk syre et produkt av bakteriell transformasjon av flavonoider og oligomeriske proanthocyanidiner, noe som kan hemme opptil 40% av bakteriene (Escherichia coli) vedheft i urinveiene etter tranebærforbruk11.
Det strukturelle mangfoldet av naturlig forekommende fenolforbindelser, lagt til mangfoldet av deres metabolitter og deres lave biotilgjengelighet, gjør deres identifikasjon i plasma enda mer utfordrende. Metabolomisk profilering, ved hjelp av spektroskopiske analyseplattformer som kjernemagnetisk resonans (NMR) og tandemmassespektroskopi (MS/MS), er sannsynligvis den beste tilnærmingen for å oppnå dette målet; Dessverre er utstyret ikke lett tilgjengelig, og utviklingen av analyseprotokoller er fortsatt begrenset12. Flere studier har rapportert MS/MS kombinert med et separasjonssystem (som flytende kromatografi) som en strategi for å redusere kompleksiteten i massespektra i metabolomiske studier. Den nylige introduksjonen av ultra-høy ytelse flytende kromatografi (UPLC) separasjonsmetoder har redusert analysetiden og økt oppløsningen og følsomheten sammenlignet med konvensjonelle høyytelses væskeprotokoller, så UPLC-MS / MS-systemer har raskt blitt allment akseptert av det analytiske metabolomics samfunnet13. På denne måten har noen studier undersøkt fenoliske metabolitter og påvist glukuronderte derivater fra koffeinsyre, quercetin og ferulinsyre, samt sulfonerte derivater fra syringssyre og vanillsyre i plasma av individer etter tranebærinntak14. Tidligere protokoller har til hensikt å finne fenolforbindelser og fenoliske metabolitter i biofluider som plasma. Disse protokollene var basert på identifisering og kvantifisering av høyytelses væskekromatografi (HPLC) koblet til en UV-vis-detektor15. Likevel krever slike protokoller bruk av autentiske standarder for å vurdere absolutt identifikasjon og nøyaktig kvantifisering. Et bredt spekter av studier har identifisert de vanligste metabolittene i biofluider (sulfonerte, glukuroniserte og metylerte former) av UPLC-MS og UPLC-MS/MS; En stor del av bakteriemetabolittene er imidlertid ikke rapportert på grunn av mangel på databaser som inneholder fullstendig informasjon16. Metabolittidentifikasjon er komplisert av kostnaden og kommersiell tilgjengelighet av metabolittstandarder. Derfor kan den beste strategien være umålt eller semi-målrettet MS / MS metabolittanalyse, som er avhengig av bruk av molekylær funksjonsinformasjon (m / z, monoisotopisk eksakt masse, isotopisk distribusjon og fragmenteringsmønster) for å bestemme den kjemiske identiteten og sammenligner den med fritt tilgjengelige online databaser som inneholder polyfenolmetabolitter identifisert i biofluider etter forbruket av polypolyfenol-richts12 . De viktigste databasene som brukes i UPLC-MS/MS-studier for identifisering av fenolforbindelser og deres metabolitter er Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library og andre komplementære databaser, for eksempel PubChem, ChemSpider og Phenol Explorer17.
I den nåværende studien ble det utviklet en semi-målrettet UPLC-MS/MS-metode for å analysere plasmaprøvene til gruppen eldre som er involvert i den RSF-inneholdende muffins- og drikkeforbruksstudien7. Data fra forskjellige gratis online databaser av plasmametabolitter ble samlet inn og integrert i en spesialisert database. Denne databasen kan nås automatisk av utstyrsprogramvaren for å identifisere de polyfenolic metabolittene i de fem plasmaprøvene før og etter den 30-dagers ernæringsmessige intervensjonen. Dette gjøres for å identifisere de viktigste fenolforbindelser, eller deres metabolitter, som absorberes fra de spesielt formulerte funksjonelle matvarer designet for forebygging av sarkopeni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Plasmaprøvene som ble brukt i denne protokollen ble samlet inn i en tidligere studie etter alle de etiske retningslinjene og godkjent av Institutional Ethics and Bioethics Committee (CIEB-2018-1-37) fra Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Den komplette protokollen for utvinning og identifisering av fenolforbindelser og metabolitter i plasma av UPLC-MS/MS er representert i figur 1.
Figur 1: Skjematisk representasjon av utvinning og identifisering av fenolforbindelser og metabolitter i plasma ved den semi-målrettede UPLC-MS/MS-metoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Prøvepreparering
- Oppbevar plasmaprøvene ved -80 °C til analyse.
- Avriming av plasmaprøvene ved romtemperatur i 15 min.
MERK: Prøvene kan plasseres i et vannbad ved 37 °C for å akselerere prosessen (5 min). - Legg 200 μL plasmaprøve i en 2 ml mikrotube og bland med 1000 μL rent etanol. Virvel plasmaprøven i 30 s.
MERK: Bruk alltid hansker når du arbeider med plasmaprøver. - Sentrifuger prøven på 6580 x g i 5 min. Etter sentrifugering, samle supernatanten med en mikropipette eller Pasteur pipette og legg den i et nytt mikrorør. Oppbevar supernatanten ved 4 °C.
- Bland pelletsen fra forrige trinn med 1000 μL 100% etanol, virvel i 30 s, og sentrifuger deretter ved 6580 x g i 5 minutter.
MERK: Pellet er sterkt pakket og må resuspenderes godt for å sikre kontakt mellom prøven og ren etanol. Det anbefales å bruke en mikropipette til å skylle pelletsen med etanol. - Etter sentrifugering, samle supernatanten og bland med supernatanten som tidligere er hentet fra trinn 1.4. i et 2 ml mikrorør.
- Fjern etanol fra prøven ved å bruke rent nitrogen (99,997 %) ved 135 psi. Hold nålen 1 cm unna toppen av mikrorøret for å forhindre prøvetap og skyll til prøven er tørr. Ingen varme er nødvendig for å fordampe etanol.
MERK: Nitrogenstrømmen må være lav for å forhindre prøvetap. Når etanolen er tørket, hold nitrogenstrømmen i minst 5 minutter for å sikre prøvetørhet. Protokollen kan stanses midlertidig på dette tidspunktet. prøvene må oppbevares ved -20 °C. Unngå å oppbevare prøvene i mer enn 12 timer. - Resuspend de tørre prøvene i 100 μL av en blanding av acetonitril: vann i en andel på 50:50 (v:v).
- Filtrer prøven gjennom en 0,45 μm nylonsprøytemembran direkte inn i en HPLC hetteglassmikroinnsats.
MERK: Prøvene i hetteglasset kan oppbevares ved -20 °C før analyse. Oppbevar prøvene i ikke mer enn 8 timer. Det anbefales å injisere prøvene i UPLC-systemet rett etter filtrering.
2. UPLC-MS/MS-analyse
- Injiser 3 μL prøve på et UPLC utstyrt med en C18 omvendt fasekolonne (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Still inn autosamplertemperaturen ved 20 °C og kolonnetermostaten ved 25 °C. Injiser hver prøve i triplikat.
- Bruk 0,1% (v:v) maursyre i vann som løsningsmiddel A, og 100% acetonitril som løsningsmiddel B. Still inn strømningshastigheten på 0,4 ml/min og et graderingsprogram på følgende måte: 0-1 min 10 % B, 1-4 min 30 % B, 4–6 min 38 % B, 6–8 min 60 % B, 8–8,5 min 60 % B, 8,5–9 min 10 % B (tabell 1).
- Sett massespektrometeret til negativ modusionisering. Bruk nitrogen som tørkegass ved 340 °C og en strømningshastighet på 13 l/min. Still inn forstøvertrykket på 60 psi. Still inn kapillærspenningen på 4000 V, fragmentorspenningen ved 175 V og skimmerspenningen ved 65 V. Bruk kollisjonsenergi ved 20 V (tabell 2).
- Skann massene mellom 100-1100 masse-til-ladeforhold (m/z) og, for MS/MS, skann masser mellom 50-1000 m/z (tabell 2). Sett datainnsamling til auto MS/MS-modus. Bruk følgende referansemasse: 119.036 og 966.0007.
| Tid (min) | Løsningsmiddel A (0,1 % maursyre i HPLC-vann) | Oppløsningsvæske B (100 % acetonitril) |
| 0 til 1 | 90 | 10 |
| 1 til 4 | 70 | 30 |
| 4 til 6 | 62 | 38 |
| 6 til 8 | 40 | 60 |
| 8 til 8,5 | 40 | 60 |
| 8,5 til 9 | 90 | 10 |
Tabell 1: Mobil fasegradient som brukes til separasjon av fenolforbindelser av UPLC.
| Iioniseringsmodus | Negativ |
| Tørkegass | Nitrogen ved 340 °C, strømningshastighet 13 l/min |
| Forstøvertrykk | 60 psi |
| Kapillær spenning | 175 V |
| MS-skanning masser | 100-1100 m/z |
| MS/MS-skanning masser | 50-1000 m/z |
Tabell 2: Ioniseringsparametere for MS/MS-analysen.
3. Databasebygging
- Søk etter fenolforbindelser, fenoliske metabolitter eller andre forbindelser av interesse for den vitenskapelige litteraturen.
- Åpne databasebehandlingsprogramvaren som er inkludert i UPLC-systemet. Velg fil | Nytt PCDL-| (Personal Database Compound Library) Opprett ny PCDL. Velg type PCDL: LC/MS Metabolomics. Angi et navn for PCDL. Velg deretter Opprett.
- Velg PCDL på verktøylinjen, og velg deretter Tillat redigering . Klikk deretter knappen Søk etter forbindelser .
MERK: Siden det er en ny PCDL, vil tabellresultatene være tomme. Dette vil endres når nye forbindelser er lagt inn i PCDL.- Legg til forbindelser i det spesialiserte biblioteket for personlige databaser ved å kopiere dem fra instrumentets generelle bibliotek. Åpne instrumentets eksisterende database som er inkludert i programvaren for databasebehandling. Klikk knappen Søk etter forbindelser. I alternativet Enkelt søk skriver du inn det sammensatte søkekriteriet for å finne rentesammensetningen.
MERK: Forbindelser kan bli funnet ved navn, molekylær formel, eksakt masse og oppbevaringstid. - I tabellen over sammensatte resultater velger du rentesammensetningen. Hvis du vil merke mer enn én forbindelse, klikker du den første forbindelsen, holder nede CTRL-tasten og klikker deretter hver sammensetning av interesse. Høyreklikk deretter på alle uthevede forbindelser og velg Legg til PCDL.
- I det nye vinduet søker du etter og velger den spesialiserte personlige databasefilen. Merk av i boksene Inkluder spektra for forbindelser hvis de finnes , og Inkluder informasjon om ionmobilitet for forbindelser hvis de finnes. Klikk Tilføy - knappen. I den nye dialogboksen velger du Ja for å kontrollere de nye forbindelsene som er lagt til. Velg Nei hvis du vil fortsette å søke etter flere forbindelser av interesse.
- Legg til forbindelser i det spesialiserte biblioteket for personlige databaser ved å kopiere dem fra instrumentets generelle bibliotek. Åpne instrumentets eksisterende database som er inkludert i programvaren for databasebehandling. Klikk knappen Søk etter forbindelser. I alternativet Enkelt søk skriver du inn det sammensatte søkekriteriet for å finne rentesammensetningen.
- Hvis forbindelsene av interesse ikke er tilgjengelige i instrumentets generelle bibliotek, legg til nye forbindelser manuelt.
- Åpne den spesialiserte personlige databasen. Når du er åpnet, følger du trinn 3.3. Velg alternativet Rediger forbindelser . Klikk Legg til ny .
- I den øvre delen av vinduet fyller du ut informasjonen for den nye forbindelsen. Fyll ut formelen, navnet, IUPAC-navnet, CAS-nummeret, Chemspider ID og andre identifikatorer.
- Bruk informasjonen som er tilgjengelig i de gratis online bibliotekene (Chemspider, PubChem og Phenol Explorer) for å fylle ut informasjonen for den nye forbindelsen av interesse. Når du er ferdig, klikker du på knappen Lagre som ny for å lagre den nye sammensatte informasjonen i den spesialiserte personlige databasen.
MERK: Når du legger til informasjon fra gratis biblioteker, må du huske å inkludere sammensatt informasjon uten tilstedeværelse av klorid- eller jodioner. Dette kan endre den eksakte masse- og molekylære formelen av interesseforbindelsen.
- Gjenta prosessen med alle forbindelser av interesse for å fullføre den spesialiserte personlige databasen.
4. Dataanalyse
- Bruk instrumentets kvalitative lederprogramvare for å identifisere fenolforbindelser og fenoliske metabolitter som finnes i prøvene.
- Åpne eksempelfilen. I kromatogrampanelet velger du Definer kromatogrammer og trekker ut det totale ionkromatogrammet (TIC), det ekstraherte ionkromatogrammet til MS (EIC) og EIC for MS/MS. Velg alternativet for integrert kromatogram.
- Velg Søk etter formelalternativer i panelet Søk etter forbindelser. Velg Formelkilde i det nye vinduet, og velg deretter alternativet Database/bibliotek. Finn den personlige databasen som tidligere ble opprettet, og klikk på Åpne.
- Velg Formelmatching-alternativet , og angi en massesamsvartoleranse på 5 deler per million (ppm).
MERK: En annen samsvarstoleranse for massene kan stilles inn til 22:00; Denne forskjellen avhenger av massespektrometeret som brukes. - Velg alternativet Negative ioner , og velg bare dialogboksen -H . I alternativet Resultater merker du av for Trekk ut EIC, Trekk ut renset spektrum, Trekk ut rå spektrum og inkluder dialogboksene Struktur .
- Velg alternativet Resultatfiltre . Merk av for Varsle hvis poengsummen er , og sett poengsumkampen til 80,00 %. Ikke match hvis poengsummen er og sett poengsummen til 75,00%.
MERK: Kamp-/ikke-samsvarspoengene kan endres til lavere verdier om nødvendig. Dette vil redusere nøyaktigheten av identifikasjonen. - Klikk på Finn forbindelser etter formel for å identifisere forbindelser av interesse i prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den trinnvise prosessen for identifisering av fenoliske metabolitter gjennom den semi-målrettede UPLC-MS/MS-analysen, i negativ modus, av plasmaprøver er avbildet i figur 2. For det første ble det totale ionkromatogrammet (TIC) fra plasmafenolics ekstraktet (oppnådd etter proteinutfelling av den totale plasmaprøven) oppnådd gjennom instrumentets kvalitative programvare. Deretter ble det ekstraherte ionkromatogrammet brukt, og det eksakte masse- og fragmenteringsmønsteret (MS / MS-analyse) av hvert signal (eller molekylær funksjon) ble sammenlignet med de i en bestemt personlig database opprettet også i instrumentets programvare. Signaler med et masseslag på mindre enn 5 ppm ble tildelt en molekylær formel fra databasen. Til slutt ble den isotopiske fordelingen av hvert signal sammenlignet med den tildelte molekylære formelen for å oppnå den endelige foreløpige identifikasjonen. Forbindelser som a) bare ble identifisert i én replikering eller b) presenterte et område som var lavere enn 10 000, og ble behandlet som falske identifikasjoner. Fra denne analysen ble totalt 25 fenolforbindelser og metabolitter identifisert i plasmaprøvene (tabell 3). I denne listen ble både fenolforbindelser og deres metabolitter, som 3-hidroxyfenylvalerinsyre og isopropyl 3-(3,4-dihydroksyfenyl)-2-hydroksypropanoat, funnet. Siden den negative ioniseringsmodusen er best egnet for alle klasser av fenolforbindelser, unntatt antocyaniner, kunne disse forbindelsene ikke oppdages med den nåværende metoden. Hvis antocyaniner er viktige komponenter i matmatrisen, bør den positive modusen også brukes.
| Fenoliske metabolitter | R.T. (min) | Formel | Forløper | Eksperimentell masse | Denoriske massen | Forskjell (ppm) | |
| 2,3-Dihydroksybenzosyre | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-Hydroksyhippurinsyre | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihydroksytoluen | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-Hydroksyfenylvalerinsyre | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-dihydroksyfenyl)-valerigsyre | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hydroksyenterodiol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Benzosyre | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Karnossyre | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Carnosol | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Katekol | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glycitin | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hesperetin | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Hippurinsyre | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Homovanillsyre | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Isopropyl 3-(3,4-Dihydroksyfenyl)-2-hydroksypropanoat | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Fenylacetic syre | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Phloretisk syre | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Protocatechuic aldehyd | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanillin | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatechin 3'-O-glukuronid | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidon | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolithin C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tabell 3: Foreløpig identifisering av fenolforbindelser og metabolitter i plasmaprøver ved hjelp av den semi-målrettede UPLC-MS/MS-metoden.
For å evaluere effektiviteten av den designede metoden for identifisering av de viktigste fenolforbindelser, eller deres metabolitter, som ble absorbert fra RSF-inneholdende muffins og drikke, ble fem aleatory prøver av studiedeltakerne, oppnådd før og etter 30-dagers intervensjon, analysert. Den relative overfloden av hver forbindelse ble beregnet ved å dele området under kurven (AUC) etter behandling av AUC før behandling. Fra denne analysen var det mulig å observere at noen forbindelser bare dukket opp i prøvene som ble oppnådd før behandlingen, andre forble uendret, mens noen av dem økte etter forbruk av funksjonelle matvarer. Tabell 4 viser listen over 12 fenolforbindelser som viste en økning i plasma etter 30-dagersforbruket av RSF-inneholdende matvarer. Fenylacetic acid var den eneste metabolitten som ble funnet konsekvent i høyere konsentrasjoner etter behandlingen. Glycitin, en glykosylert isoflavon og 3-hydroksyfenylvalerinsyre (en fenolisk metabolitt) økte i tre av de fem prøvene, men reduserte i de to andre. Gomisin M2, en lignan, ble oppdaget i tre av de fem prøvene først etter ernæringsintervensjonen. De andre fenolforbindelser (som hesperetin, secoisolariciresinol og vanillin) og metabolitter (som 2-hydroksyhippurinsyre) ble funnet bare i en prøve og bare etter behandlingen.
| Prøve (AUC etter behandling med met/AUC før behandling) | |||||||
| Sammensatt | Formel | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-Hydroksyhippurinsyre | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| 3-Hydroksyfenylvalerinsyre | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hydroksyenterodiol | C18H22O5 | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glycitin | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hesperetin | C16H14O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Fenylacetic syre | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Phloretisk syre | C9H10O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Protocatechuic aldehyd | C7H6O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinol | C20H26O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanillin | C8H8O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tabell 4: Liste over fenolforbindelser som økte i plasma av eldre individer etter 30-dagers forbruk av foSF-inneholdende matvarer. Data er forholdet mellom overflod (AUC) av hver forbindelse etter behandling sammenlignet med deres overflod før behandlingen. T indikerer at forbindelsen bare ble identifisert i prøven etter behandlingen. Nd: ikke oppdaget.
Figur 2: Protokoll for identifisering av fenolforbindelser metabolitter ved semi-målrettet UPLC-MS/MS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifisering og kvantifisering av de bioaktive fytokjemikaliene som absorberes etter forbruk av mat eller kosttilskudd, er avgjørende for å demonstrere og forstå helsemessige fordeler ved disse forbindelsene og matvarene som inneholder dem. I det nåværende arbeidet ble UPLC-MS / MS-metoden utviklet, kun rettet mot identifisering av de viktigste fenolforbindelser og deres metabolitter som økte i konsentrasjon i plasma etter en 30-dagers ernæringsmessig intervensjon med to matvarer spesielt formulert for eldre. Det ble antatt at hvis en forbindelse økte eller dukket opp i plasma først etter intervensjonsperioden, hadde den forbindelsen blitt absorbert og / eller biotransformert fra maten som brukes i intervensjonen.
UPLC-MS/MS er en av de foretrukne teknologiene for metabolomiske studier der mange lavmolekylære forbindelser analyseres samtidig i komplekse prøver for å vurdere effekten av noe behandling eller miljøendring13. Dette kan gjøres gjennom målrettede og ikke-målrettede (eller globale) metoder. Målrettede analyser fokuserer på et kjent, lite antall metabolitter av interesse. De er det beste alternativet for å kvantifisere forbindelser med tilgjengelige standarder, noe som gir den beste spesifisiteten og følsomheten; Imidlertid må disse metodene optimaliseres grundig for de valgte metabolittene og er ikke i stand til å oppdage uventede forbindelser i prøvene12. I andre studier har HPLC kombinert med en UV-vis-detektor blitt brukt til å identifisere fenolsyrer og metabolitter i plasma, men denne typen studier har brukt analytiske standarder for å identifisere og kvantifisere forbindelsen av interesse15. I en annen studie ble tillegg av en intern standard foreslått18; Imidlertid ble bare feruliske og koffeinsyrer og deres metabolitter analysert i dette arbeidet. På den annen side er syntesen av interne standarder for fenoliske metabolitter foreslått som et alternativ til mangelen på kommersielle analytiske standarder19. Likevel er syntesen av et stort utvalg av fenolforbindelser vanskelig, tidkrevende og dyrt. Ikke-målrettede metoder forsøker å oppdage og identifisere så mange molekylære forbindelser som mulig og er først og fremst hypotesegenererende12. De kan identifisere flere hundre forbindelser i ett utvalg ved å tildele formler til påvisbare kromatografiske signaler med karakteristiske trekk, for eksempel m / z eller målt nøyaktig masse, kromatografisk oppbevaringstid, isotopisk fingeravtrykk, etc., slik at dataene som genereres av disse analysene er svært rikelige og kan være vanskelige å tolke20 . Siden målet med den nåværende metoden ikke var å oppnå en full metabolsk profil av plasmaprøvene (som ville være en umålt tilnærming), men å identifisere de viktigste fenolforbindelser og fenoliske metabolitter (tidligere ukjente) i dem, ble en semi-målrettet tilnærming designet. For dette ble alle de identifiserte signalene hentet ut automatisk med instrumentets programvare og deretter sammenlignet med en selvopprettet database som inneholdt 645 fenolforbindelser og deres metabolitter, som ble hentet fra gratis online databaser. Databasen inkluderte referanse MS/MS fragmentering mønstre av forbindelsene som ble brukt til tildeling av sammensatt navn og formel, noe som gir mer nøyaktig identifisering av forbindelser i prøve12.
De mest kritiske trinnene i protokollen var 1) prøveforbehandling (ekstraksjon og konsentrasjon av fenolforbindelser og metabolitter fra plasmaprøver); 2) bygging av en komplett og spesifikk database for semi-målrettet analyse av prøvene og identifisering av alle mulige forbindelser som tilhører en bestemt sammensatt klasse; og 3) valg av parametrene som brukes av instrumentets kvalitative programvare (massematchtoleranse ppm, og score%) for å nøyaktig identifisere forbindelsene i prøven. I prøvebehandling må det tas forsiktighet for å unngå tap av forbindelsene av interesse, gjenopprette dem ved høy sluttkonsentrasjon og kunne eliminere forstyrrende forbindelser. Ved opprettelsen av den spesifikke databasen er det viktig å gjennomføre et grundig litteratursøk og deretter bruke gratis online databaser for å skaffe spesifikke kjemiske data som skal brukes til sammensatt identifikasjon i prøven. Valget av de beste verdiene for massematch og poengsum krevde tidligere validering av analysemetoden ved hjelp av standarder og kjente prøver21,22.
Når protokollen ble implementert, var de vanlige problemene og deres anbefalte løsninger følgende: 1) Ingen forbindelser ble identifisert i prøvene. Dette skyldtes den lave konsentrasjonen av forbindelsene og kunne løses ved å tørke prøven og løse den opp i et mindre volum. 2) Signaler dukket opp i TIC, men forbindelser ble ikke identifisert. Dette kan skyldes en svikt i massekalibrering, så forskjellen mellom eksperimentelle og teoretiske masser var høy. I dette tilfellet bør instrumentets massekalibrering utføres i henhold til produsenten og modellen av utstyret. En annen grunn kan være en ufullstendig personlig database, så det er viktig å hele tiden sjekke og vedlikeholde databasen. Masser av forbindelser som mistenkes å være av interesse kan kontrolleres og sammenlignes med fritt tilgjengelige online databaser eller ny vitenskapelig litteratur. 3) Signaler dukket opp i blanke løp. Dette indikerer forurensning og kan løses ved å rengjøre autosampler nålen og kolonnen. Standard rengjøringsprotokoll er å utføre noen kjøringer ved hjelp av metanol, deretter isopropanol, og til slutt acetonitrile som mobilfasen. Deretter blir kolonnen omkonlibrert, og kjører mobilfasen i minst 30 minutter.
De største vanskelighetene i utviklingen av denne typen metode er 1) den lave biotilgjengeligheten, generelt sett, av alle fytokjemikalier, inkludert fenolforbindelser, som oversettes til svært lave plasmakonsentrasjoner16; 2) det høye mangfoldet av fenolforbindelser tilstede i matvarer, som økes av stoffskiftet og biotransformasjonen som forekommer i menneskelige enterocytter og hepatocytter og den koloniske mikrobiota23; 3) mangelen på standarder (noen standarder eksisterer, men er svært vanskelig å oppnå) for mange forbindelser, spesielt for metabolittene, og eksistensen av noen ukjente eller ukarakteriserte forbindelser23; og 4) variable responser blant individer, både i absorpsjon og metabolisme av fytokjemikalier14. For å overvinne problemet med lave plasmakonsentrasjoner av fenoliske metabolitter, bør de ekstraheres og konsentreres. Dette kan oppnås ved mikrofastfaseutvinning14 eller, som i det nåværende arbeidet, ved tilsetning av løsningsmidler som utfeller proteiner og oppløser fenolforbindelser og metabolitter, etterfulgt av løsningsmiddelfordampning og resuspension i et mindre volum19. Denne teknikken er enkel, økonomisk og tilstrekkelig for et lite antall prøver. Imidlertid kan utvinningen av forbindelser av interesse lett forbedres ved å bruke større plasmavolumer, slik at den endelige konsentrasjonen av alle forbindelsene ville være høyere. Det høye mangfoldet av fenoliske metabolitter og mangel på standarder er grunnen til at en semi målrettet tilnærming ble brukt til å identifisere forbindelsene som ble økt av intervensjonen før de forsøkte å kvantifisere dem. Ved å bruke en spesiallaget database i stedet for en helt umålt analyse, var det mulig å ignorere de mange primære metabolittene i plasma, med fokus bare på fenolforbindelser og deres metabolitter. En viktig begrensning i denne databasen, spesifikk for fenolforbindelser og deres menneskelige metabolitter, var mangelen på massespektral informasjon for mange forbindelser og deres metabolitter, noe som reduserer nøyaktigheten av den sammensatte identifikasjonen.
Stor variasjon blant individer observeres regelmessig i studier som evaluerer absorpsjon og metabolisme av fenolforbindelser, både kvantitativt og kvalitativt. I de nåværende resultatene presenterte en person 18 forbindelser i plasmaprøven tatt etter intervensjonen, mens de andre bare viste 9 eller 10. Videre ble mange fenolforbindelser og metabolitter bare funnet i baseline-prøvene (før intervensjonen), og de varierte også blant individer. Totalt sett viste mer enn halvparten av de identifiserte forbindelsene høyere konsentrasjoner (AUC) før enn etter intervensjonen eller ble funnet bare i preintervensjonsprøvene. Derfor var det nødvendig å sammenligne individuelle prøver tatt før og etter intervensjonen for å forstå hvilke forbindelser som faktisk ble økt av den. Den eneste metabolitten som konsekvent økte etter behandlingen var fenylacetic acid, en mikrobiell katabolitt av flavan-3-ols24 som har blitt funnet i plasma av individer i akutte studier av forbruket av fenolrik mat14,25. De fleste studiene som har identifisert og kvantifisert fenoliske metabolitter i plasma var akutte studier, der de sammensatte konsentrasjonene ble overvåket i løpet av 24 timer etter forbruk av det fenolrike måltidet, og observerte at konsentrasjonene etter 24 timer var nær basalverdien19,25. Derfor er det forståelig at prøvene analysert i det nåværende arbeidet viste lave tall og konsentrasjoner av fenoliske metabolitter. Nylig evaluerte Zhang et al.25 forbruket av rød bringebær, både i akutte studier og etter 4 uker med tilskudd. De observerte at både akutte og kroniske intervensjoner økte fenolforbindelser og deres metabolitter, mens etter 4-ukers tilskudd økte den basale plasmakonsentrasjonen av noen metabolitter (urolithins, cinnamic, fenylpropionic og hippuric acids) og av andre redusert (konjugert anthocyanin derivater).
En avsluttende undersøkelse av metoden utviklet i denne artikkelen viser at den i de fleste deler var godt egnet for målet den ble opprettet for. Prøveforbehandlingen var enkel og effektiv, og UPLC-separasjon og semi-målrettet MS/MS-identifisering av fenoliske metabolitter ble oppnådd. Denne semi-målrettede metoden kan være nyttig som en første screening tilnærming for å identifisere fenolforbindelser som kan absorberes fra ulike matmatriser, samt fenoliske metabolitter som er tilstede i humant plasma. Videre er protokollen nyttig fordi den tillater identifikasjon når ingen standarder fra fenolforbindelser eller metabolitter er tilgjengelige. Til slutt bruker metoden en liten plasmamengde, noe som er kritisk i de fleste in vivo-studier der plasmaprøver er knappe. Det anbefales imidlertid at for fremtidige studier bør en akutt studie utføres før kronisk inngrep for bedre å identifisere de viktigste fenolforbindelser og metabolitter absorbert fra de spesielt formulerte matvarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for den økonomiske støtten fra CONACYT, Mexico (CB- 2016-01-286449) og UACJ-PIVA (Prosjekter 313-17-16 og 335-18-13). OAMB ønsker å takke CONACYT for hans ph.d.-stipend. Teknisk støtte fra Multimedia Production-kontoret fra UACJ er takknemlig anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
